專利名稱：：一種槲寄生多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種多糖，具體地說是涉及一種中藥槲寄生多糖co/om&wpolysaccharide(簡(jiǎn)稱VCP)及它的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：槲寄生(F"wwco/ora&柳(Kom.)Nakai)為桑寄生科(Lorantheceae)半寄生常綠小灌木植物，又稱冬青，北寄生、柳寄生等。槲寄生在我國(guó)為傳統(tǒng)中藥，應(yīng)用歷史很悠久。其干燥莖枝為中國(guó)藥典收載的較常用中藥"槲寄生"，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、養(yǎng)血安胎和降血壓的功能。用于治療風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、下肢麻木、胎動(dòng)不安、先兆流產(chǎn)和高血壓等癥。其近緣植物白果槲寄生為歐洲民間藥用植物，英、德、法、荷蘭比利時(shí)等歐洲國(guó)家己有數(shù)萬(wàn)名癌癥患者利用槲寄生水提物治療乳癌、胃癌及結(jié)腸癌等各種腫瘤，且療效顯著。英國(guó)一家制藥公司已率先開發(fā)出白果槲寄生植物提取物(商品名為Iscardo)，其主要成分就是白果槲寄生多糖。有研究表明槲寄生多糖可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-a和IL-1。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)槲寄生多糖提取物能抑制人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[參見吳勇,何承敏等.槲寄生多糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-a和IL-1的影響.湖北中醫(yī)雜志,2003,25:1;李霞,豐平等.方劑槲芪散及君藥槲寄生提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的的抑制作用.世界華人消化雜志，2006,14:20]。而對(duì)槲寄生多糖結(jié)構(gòu)的研究還未有報(bào)道。近年來我們從中藥槲寄生中經(jīng)提取純化獲得了一種多糖(簡(jiǎn)稱VCP)并對(duì)其理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性進(jìn)行了比較廣泛的深入研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種槲寄生多糖，它的制備方法及在制備藥物中的用途。本發(fā)明的具體的技術(shù)方案如下-一種槲寄生多糖，它由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸構(gòu)成，分子量為Uxl063.4xl06Da，端基碳為a-構(gòu)型，旋光度01=+134.6°~+167.3°，多糖的基本骨架由1—5糖苷鍵連接的阿拉伯糖和1—6糖苷鍵連接的半乳糖構(gòu)成。所說的槲寄生多糖的結(jié)構(gòu)式見圖l。本發(fā)明所說的槲寄生多糖中不含蛋白質(zhì)和核酸。一種上述槲寄生多糖的制備方法，它由下列步驟組成步驟l.制備槲寄生水提取液；步驟2.將步驟1所得的水提取液濃縮后，用乙醇沉淀，沉淀經(jīng)洗滌后，冷凍干燥得VCP粗品；步驟3.將步驟2所得的VCP粗品溶于蒸餾水，去除沉淀后用Sevag液萃取，保留水層，步驟4.將步驟3所得的水溶液對(duì)自來水透析，透析液濃縮后，冷凍干燥得初步純化的VCP，步驟5.取步驟4中得到的VCP，充分溶解后，用離子交換柱(DEAE-52)和分子篩柱層析分離純化得產(chǎn)品。具體的操作步驟為步驟l.稱取中藥槲寄生粉末，加水，609(TC水浴提取25h,間歇攪拌，紗布濾去殘?jiān)?0008000rmp離心去沉淀，步驟2.將步驟1所得的提取液濃縮，加入35倍體積乙醇，4'C放置1224h，離心，沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得VCP粗品。步驟3.將步驟2所得的VCP粗品加蒸餾水充分溶解，離心，去除沉淀，加入15倍體積的Sevag液(氯仿正丁醇=3:15:1)，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機(jī)溶劑層及中間層，保留水層，反復(fù)萃取25次，步驟4.將步驟3所得的水溶液對(duì)自來水透析2448h，透析液濃縮，冷凍干燥得初步純化的VCP,步驟5.將步驟4中得到的VCP充分溶解，上己平衡好的離子交換柱(DEAE-52)，先以蒸餾水洗滌，再以02mol/LNaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱層析(S印hadex-GlOO)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的VCP。在上述步驟1中，最好是每500克槲寄生加水2500~5000ml提取。本發(fā)明的VCP對(duì)Hela細(xì)胞和小鼠移植瘤S180有明顯的抑制作用，因此本發(fā)明的VCP可以應(yīng)用于制備治療腫瘤的藥物。圖1:VCP的重復(fù)單元；圖2:VCP的高效液相色譜純度鑒定圖譜；圖3:VCP的單糖組分的薄層層析圖譜；圖4:VCP的甲基化分析步驟示意圖5:VCP的紅外光譜分析圖譜；圖6:VCP的碳核磁共振譜圖7:VCP對(duì)Hela的抑制作用；具體實(shí)施例方式實(shí)施例l.VCP的提取、分離純化、鑒定稱取中藥槲寄生粉末500g，加水2500ml，60'C水浴提取2h，間歇攪拌，紗布濾去殘?jiān)?000rpm離心去沉淀，提取液濃縮至500ml，加入3倍體積的乙醇，4'C放置12h，離心，沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得VCP粗品。200ml蒸餾水溶解粗多糖粉末，充分溶解后離心，去除沉淀。加入等體積的Sevag液(氯仿:正丁醇=3:1)，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機(jī)層及中間層，保留水層，反復(fù)萃取2次。將所得的水溶液對(duì)蒸餾水透析24h，濃縮，冷凍干燥得初步純化的VCP。取VCP100mg，用蒸餾水充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-52)，先以100ml蒸餾水洗滌，再以02mol/LNaCl梯度洗脫，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同的組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱(Sephadex-G100)層析，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的VCP。HPLC純度鑒定采用ShodexSUGARKS-805(8mmlDX300mmlD)高效液相色譜柱和示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為H20，VCPlmg/ml20pl，流速lml/min。結(jié)果見圖2。HPLC純度鑒定結(jié)果為一個(gè)對(duì)稱峰，表明所得的多糖為單一組分。實(shí)施例2.VCP的提取、分離純化、鑒定稱取中藥槲寄生粉末500g，加水1000ml，7(TC水浴提取3h，間歇攪拌，紗布濾去殘?jiān)?000rpm離心去沉淀，提取液濃縮至750ml,加入4倍體積的乙醇，4t:放置18h，離心，沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得VCP粗品。500ml蒸餾水溶解粗多糖粉末，充分溶解后離心，去除沉淀。加入3倍體積的Sevag液(氯仿:正丁醇=4:1)，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機(jī)層及中間層，保留水層，反復(fù)萃取3次。將所得的水溶液對(duì)蒸餾水透析36h，濃縮，冷凍干燥得初步純化的VCP。取VCP100mg，用蒸餾水充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-52;)，先以200ml蒸餾水洗滌，再以02mol/LNaCl梯度洗脫，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同的組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱(Sephadex-G100)層析，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的VCP。純度與實(shí)例l的相同。實(shí)施例3.VCP的提取、分離純化、鑒定稱取中藥槲寄生粉末500g，加水5000ml，90。C水浴提取5h，間歇攪拌，紗布濾去殘?jiān)?000ipm離心去沉淀，提取液濃縮至1000ml，加入5倍體積的乙醇，4。C放置24h，離心，沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得VCP粗品。800ml蒸餾水溶解粗多糖粉末，充分溶解后離心，去除沉淀。加入5倍體積的Sevag液(氯仿:正丁醇=5:1)，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機(jī)層及中間層，保留水層，反復(fù)萃取5次。將所得的水溶液對(duì)蒸餾水透析48h，濃縮，冷凍干燥得初步純化的VCP。取VCP100mg，用蒸餾水充分溶解，上已平衡好的離子交換柱(DEAE-52)，先以50ml蒸餾水洗滌，再以02mol/LNaCl梯度洗脫，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同的組分。離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱(S印hadex-G100)層析，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，冷凍干燥，即得本發(fā)明的VCP。純度與實(shí)例l的相同。實(shí)施例4.VCP重均分子量測(cè)定采用AgilentllOO高效液相色譜儀，色譜柱為測(cè)多糖的專用凝膠柱ShodexSUGARKS-805(8mmIDx300mmID)，分離范圍上限為500><104道爾頓，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。流動(dòng)相為H20:柱溫3(TC:流速lml/min。取分子量不同的右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別用流動(dòng)相制成每mL中約含lmg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液100pL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程lgMw二8.635-0.3776tR(Mw為標(biāo)樣的已知重均分子量；tR為標(biāo)樣的保留時(shí)間)。取VCPlmg，溶于lmL水，上樣lOOpL,記錄色譜圖。取3批樣品分別進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表1。VCP多糖的重均分子量為1X106Da。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>單糖組分分析實(shí)施例5.多糖VCP的薄層層析(TLC)稱取多糖樣品5mg，置于干凈的安瓿中，加入2mo1/1三氟乙酸2ml，封管。IO(TC水解8h后，將三氟乙酸蒸干，用甲醇洗45次后，用蒸餾水溶解，備用。稱取鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各20mg，分別置于lml蒸餾水中，從中各吸取0.2ml溶液混合均勻作為混合糖。硅膠板在使用前105'C活化lh。點(diǎn)樣。按正丁醇乙酸水=4:2:l配成展開劑置于層析缸中，放入以活化好的板，飽和10min后，上行展開。展開完畢后，取出，以苯胺-鄰苯二甲酸溶液為顯色劑顯色后，于ll(TC加熱10min。結(jié)果見圖3。實(shí)施例6.VCP中糖醛酸和葡萄糖含量的測(cè)定糖醛酸含量的測(cè)定精密量取標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸溶液(0.1mg/mL)0，0.2，0.4，0.6，0.8，l.Oml于帶塞試管中，補(bǔ)足蒸餾水至lml，在冰浴中預(yù)冷后逐滴加入1.5ml濃硫酸溶液。振搖混合，在85'C水浴保持20min。冷卻至室溫，每管加入50^0.15%的間羥聯(lián)苯-0.5%氫氧化鈉溶液。搖勻后在530nm處測(cè)定光吸收，以"O"管作空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為避免樣品中非己糖醛酸成分與四硼酸鈉溶液反應(yīng)的干擾，可作一樣品對(duì)照，即以50.1^0.5%氫氧化鈉代替間羥聯(lián)苯溶液，測(cè)得光吸收值從樣品吸收值中扣除。取VCP配成lmg/ml的溶液，吸取0.5ml，補(bǔ)足蒸餾水至lml,余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，再由回歸方程算出相應(yīng)濃度。葡萄糖含量的測(cè)定精確配制100嗎/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸溶液，分別吸取O，0.2，0.4，0.6,0.8，l.Oml標(biāo)準(zhǔn)溶液置帶塞試管中，補(bǔ)足蒸餾水至lmL，加入2mg/mL蒽酮試劑4mL，混勻，沸水裕煮5min。冷卻后測(cè)定620nm處的吸光度。以"O"管作空白對(duì)照，以吸光度對(duì)葡萄糖濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。取VCP配成lmg/ml的溶液，吸取0.1ml，補(bǔ)足蒸餾水至lml，余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。由于糖醛酸的存在對(duì)硫酸蒽酮法測(cè)定葡萄糖的含量存在一定的干擾，為此首先采用間羥聯(lián)苯法("0.0053x-0.0008，產(chǎn)0.9998)測(cè)定糖醛酸的含量，再根據(jù)糖醛酸-硫酸蒽酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0021x-0.0004，產(chǎn)0.9998)得到糖醛酸吸光度值的貢獻(xiàn)，總糖的吸光度與之的差值即為葡萄糖顯色所致，再根據(jù)葡萄糖-硫酸蒽酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(y-0.0059x-0.0031，^0.9995)計(jì)算出總糖中葡萄糖的含量。由實(shí)驗(yàn)可得總糖含量為68.32°/。，糖醛酸含量為10.87%。實(shí)施例7.VCP的糖醇乙?；苌锏臍庀喾治龇Q取多糖10mg于安瓿中，加入2mo1/1的三氟乙酸2ml，封口，于IO(TC水解8h，水解產(chǎn)物于蒸發(fā)皿中蒸干后加入甲醇56次反復(fù)蒸干后溶于2ml水中，加入5mg硼氫化鈉和3mg內(nèi)標(biāo)物肌醇，充分溶解后，65。C放置30min，水解液減壓蒸干。然后加少量強(qiáng)酸型離子交換樹脂732H+攪拌數(shù)分鐘后，檢查溶液呈酸性時(shí)過濾，樹脂用少量水反復(fù)洗3次，合并濾液在水溶液上蒸干，所得殘余物加3ml甲醇溶解并蒸干，反復(fù)4次以上以除去硼化物，最后使還原產(chǎn)物于小安瓿管中徹底干燥。在上述還原產(chǎn)物中加入醋酐和無(wú)水吡啶各0.3ml，封口，于100。C水浴乙酰化20inin，冷卻，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入0.5ml水，濃縮后反復(fù)加水2-3次直至蒸干，殘?jiān)胠ml三氯甲垸提取，提取液用lml水洗，三氯甲烷溶液減壓蒸干后，再用0.2ml三氯甲垸重溶。標(biāo)準(zhǔn)單糖(D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)按相同方法處理。氣相條件為VarianCP3800(Hewlett-PackardComponent,USA)，VF-5ms石英毛細(xì)管柱(30cmXO.25mmXO.25nm)和FID檢測(cè)器。分流-不分流進(jìn)樣口，迸樣口溫度25(TC。升溫程序120。C至25(TC。，8°C/min;250。C至28(TC，20°C/min。保留2min。FID檢測(cè)器，載氣為He，流速1.0ml/min，檢測(cè)器溫度30(TC。結(jié)果見表2。表2.VCP氣相色譜分析保留時(shí)間(min)8.698.919.4410.6511.1829.5631.27D-鼠李糖+D-阿拉伯糖+D-甘露糖+D-半乳糖+D-葡萄糖+D-葡萄糖醛酸+D-半乳糖醛酸+VCP+++相鄰單糖基連接方式分析實(shí)施例8.甲基化分析稱取20mg徹底干燥糖樣，溶于6ml無(wú)水二甲亞砜(DMSO)，充氮?dú)夥夤埽暡ㄕ袷?0min,加入200mg精細(xì)研磨的NaOH，充氮?dú)饷芊?，超聲波振?0min，放置90min,逐滴加入CH3I2ml，超聲波振蕩30min，放置30min，減壓蒸餾除去剩余的CH3I。后續(xù)步驟見圖4。重復(fù)上述甲基化步驟一次，經(jīng)紅外光譜分析，在3500cm"附近無(wú)吸收峰，表明多糖上的羥基已經(jīng)完全甲基化。上述甲基化樣品中加入90%(V/V)甲酸3ml，封口，水解6h，減壓蒸發(fā)至干，加入2mo1/1的三氟乙酸，封口，于10(TC水解8h，乙?；?，進(jìn)行氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析。結(jié)果見表3。表3.VCP甲基化反應(yīng)氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)果甲基化糖摩爾比連接方式2，3,5德3-Ara0.53TerminalAra2,3-Me2-Ara41,5-linkedAra2,3，4-Me3-Gal1.541,6-linkedGal2,4-Me3-Gal0.86l，3，6-linkedGal2,3,4,6-Me4-GalA0.791，4-linkedGalA2，3,4,6-Me4-Glc0.38TerminalGlc2,3,4,6-Me4-GlcA0.42TerminalGlcA實(shí)施例9過碘酸氧化與Smith降解將Nal04配成15mmol/l溶液，稀釋250倍，再稀釋成10個(gè)不同濃度，于223nm處測(cè)吸收值，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取VCP10mg，加10mlNalO4置4t;暗處，間或振搖，間隔時(shí)間取樣，稀釋250倍，在223nm處測(cè)吸收值，直至數(shù)值不再下降為止。由標(biāo)準(zhǔn)曲線査出NaICV消耗量。量取0.1mol/l的NaOH儲(chǔ)備液25ml加新煮沸過的冷蒸餾水定容至250ml。精密稱取三份干燥恒重的鄰苯二甲酸氫鉀，每份50mg，分別加40ml新煮沸過的冷蒸餾水溶解，冷卻后加酚酞指示液2滴，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。高碘酸反應(yīng)終止后，以溴甲酚紫作為指示劑，用上述標(biāo)定過的0.008974mol/l的NaOH溶液測(cè)定甲酸釋放量。VCP經(jīng)15mM高碘酸完全氧化后，加入適量乙二醇攪拌30min以還原剩余的高碘酸。裝入透析袋，對(duì)流水48h，蒸餾水透析12h，于70'C減壓濃縮至最小體積，用NaBH4于室溫暗處還原18h，用0.1mol/l乙酸調(diào)節(jié)至pH5.5，以分解剩余的硼氫化物，對(duì)蒸餾水透析24h后冷凍干燥。將所得的多糖醇用2mo1/1的三氟乙酸于IO(TC水解8h，水解液減壓蒸干，進(jìn)行薄層層析。VCP經(jīng)高碘酸氧化，72h可反應(yīng)完全，高碘酸的消耗達(dá)到穩(wěn)定由Nal04標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0603x-0.0031，F(xiàn)0.9998)測(cè)得每mol多糖消耗為0.984mol高碘酸量并有0.256mol甲酸生成。Smith降解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析主要產(chǎn)物為赤鮮醇和甘油。端基碳構(gòu)型分析實(shí)施例10.VCP比旋測(cè)定將VCP干燥失重后，精密稱取25mg，定容至25ml，用0.8nm的濾膜過濾，取續(xù)濾液依法測(cè)定旋光度，由公式[(X]dSx/1c計(jì)算比旋[a:旋光度；L:玻璃管長(zhǎng)度(dm;);c:溶液濃度(g/m1)]。取5批樣品分別進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表4。多糖VCP具有較高的正性比旋，表明VCP的端基碳為a-構(gòu)型。表4.VCP比旋測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例u.紅外光譜分析VCP經(jīng)干燥后稱取lmg，用溴化鉀壓片法在NicoIet-170X型紅外光譜儀上于^(KMOOcm-1區(qū)間掃描。VCP的紅外光譜圖如圖5所示。在35003200cm"出現(xiàn)一種寬峰，是O-H的伸縮振動(dòng)。在30002800cm"的弱吸收峰是糖類C-H伸縮振動(dòng)，14001200cnT1的一些峰是C-H的變角振動(dòng)。這兩組峰是糖類化合物的特征吸收。1200cm—1出現(xiàn)的峰則可能是多糖水化物的吸收峰。UOO-lOOOcm-1的吸收峰是由C-0的伸縮振動(dòng)所引起的。11001010cm"中有三個(gè)弱的吸收峰是吡喃型糖基的特征吸收。864cm—1的吸收是ot-端基差向異構(gòu)C-H變角振動(dòng)的特征吸收，表明VCP的端基碳為a-構(gòu)型，這與比旋測(cè)定結(jié)果一致。763cm'1的吸收是由D-葡萄吡喃環(huán)的對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)所引起的。實(shí)施例12.核磁共振分析取純化的VCP15mg，溶于氘代水(020)，60。C于Varian500兆核磁共振儀上進(jìn)行分析。結(jié)果見圖6。多糖VCP所測(cè)得的核磁共振信號(hào)歸屬見表5。表5.VCP的13C-NMR信號(hào)歸屬殘基化學(xué)位移(ppm)C-lC-2C-3C-4C-5C-6TerminalAra109.681.476.583.761.21,5-linkedAra108.380.976.582.668.7l，6-linkedGal104.271.673.569.574.570.11,3,6-IinkedGal104.070.780.869.274.270.71,4-linkedGalA103.971.672.882.474.5185.8TerminalGlc99.771.673.470.871.661.2TerminalGlcA99.771.673.470.872.9183.7根據(jù)以上結(jié)果推斷多糖VCP的重復(fù)單元如圖1。實(shí)施例13.VCP對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用將培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞用小牛血清調(diào)整至一定濃度，將190ulHela細(xì)胞溶液加到96孔板中，在37'C溫度,100。/。相對(duì)濕度,含5%C02的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。將多糖配成5個(gè)稀釋的濃度,終濃度分別是300pg/mU00ng/ml,lOpg/ml,lng/ml,0.1ng/ml。將lOul稀釋好的多糖溶液加入到上述96孔板中，培養(yǎng)48小時(shí),加lOul5%MTT到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸去上清，加150ulDMSO，振蕩，1小時(shí)后在570nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)OD值。計(jì)算抑瘤率公式-[l-(A-空白)/(CK-空白)]xlOO%結(jié)果見圖7。Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，多糖的5個(gè)濃度均有不同程度的抑制作用。實(shí)施例14.VCP對(duì)小鼠移植瘤SI80的抑制作用將培養(yǎng)好的S180腹水瘤注射到小鼠體內(nèi)，一周后隨機(jī)分為5組，每組8只，空白對(duì)照組與5-Fu(20mg/kg)組分別為陰、陽(yáng)性對(duì)照組，VCP組設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組(320,160，80/kg)。從注射腹水細(xì)胞開始，每?jī)商旆Q一次體重，并注意觀察小鼠的毛色、飲食及活動(dòng)情況，做好記錄。注射給藥，每天一次，共給藥7次。末此次給藥之后24小時(shí)，小鼠眼眶靜脈取血，用H柳a-screen18測(cè)定樣品的血常規(guī)，進(jìn)行白細(xì)胞、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、然后頸椎脫臼處死，分別取胸腺、肝和脾，稱重，計(jì)算各項(xiàng)指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)-胸腺(脾)重(mg)/體重(g)。結(jié)果見表6，表7。與空白對(duì)照組相比，多糖VCP組及5-Fu組都能顯著影響小鼠體重的增長(zhǎng)，以及胸腺指數(shù)、脾指數(shù)。表6.對(duì)小鼠體重的影響試驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)0246810陰性組17.53±0.218.06±2.11S.63土1.518.23±1.316.86±0.616.13±1.8陽(yáng)性組17.86±2.318.15土2.218.65±1.318.83土3.420.32±0.2**20.22±0.3*氺高劑量組17.95土1.718.32±2.318.87±1.318.93±0.218.23±0.816.93±1.6**中劑量組17.87土1.618.01士2.418.65±1.920.98±1.921.03±0.223.21土0.9低劑量組18.02±0.718.32±1.718.57土1.518.62±0.217.23土1.417.82±0.3**P<0.05,**P<0.01表7.對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響試驗(yàn)組胸腺指數(shù)(mg/g)脾指數(shù)(mg/g)陰性組0.96±0.122.78±0.19陽(yáng)性組1.67±0.253.98±0.21高劑量組1.13±0.31**2.98±0.03*中劑量組1.35±0.18**3.21±0.26**低劑量組1.09士0.03811*P<0.05,**P<0.0權(quán)利要求1.一種槲寄生多糖，其特征在于，它由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸構(gòu)成，分子量為1.1×106～3.4×106Da，端基碳為α-構(gòu)型，旋光度[α]Dt＝+134.6°～+167.3°，多糖的基本骨架由1→5糖苷鍵連接的阿拉伯糖和1→6糖苷鍵連接的半乳糖構(gòu)成。2、—種權(quán)利要求1所述的槲寄生多糖的制備方法，其特征是它由下列步驟組成-步驟l.制備槲寄生水提取液；步驟2.將步驟1所得的水提取液濃縮后，用乙醇沉淀，沉淀經(jīng)洗滌后，冷凍干燥得槲寄生多糖粗品；步驟3.將步驟2所得的槲寄生多糖粗品溶于蒸餾水，去除沉淀后用Sevag液萃取，保留水層，步驟4.將步驟3所得的水溶液對(duì)自來水透析，透析液濃縮后，冷凍干燥得初步純化的槲寄生多糖，步驟5.取步驟4中得到的多糖VCP，充分溶解后，用離子交換柱和分子篩柱層析分離純化得產(chǎn)品。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的槲寄生多糖的制備方法，其特征是，步驟l為槲寄生粉末在6090。C水浴中用水提取25h，離心去沉淀，得槲寄生水提取液。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的槲寄生多糖的制備方法，其特征是，步驟2為將步驟l所得的提取液濃縮后，加入35倍體積乙醇，4'C放置1224h，離心，沉淀依次以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得槲寄生多糖粗品。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的槲寄生多糖的制備方法，其特征是，步驟3為將步驟2所得的VCP粗品充分溶于蒸餾水，離心，去除沉淀，加入l5倍體積的Sevag液，劇烈振蕩，靜置分層，除去下層有機(jī)溶劑層及中間層，保留水層，反復(fù)萃取25次，6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的槲寄生多糖的制備方法，其特征是，步驟4為，將步驟3所得的水溶液對(duì)自來水透析2448h，透析液濃縮后，冷凍干燥得初步純化的槲寄生多糖。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的槲寄生多糖的制備方法，其特征是，步驟5為將步驟4中得到的槲寄生多糖充分溶解，上離子交換柱DEAE-52，先以蒸餾水洗滌，再以02mol/LNaCl溶液梯度洗脫，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分；離子交換柱分離所得多糖組分上分子篩柱層析Sephadex-G100，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，冷凍干燥，即得產(chǎn)品。8、權(quán)利要求1所述的槲寄生多糖在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種槲寄生多糖，它由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸構(gòu)成，分子量為1.1×10⁶～3.4×10⁶Da，端基碳為α-構(gòu)型，旋光度[α]_D^t＝+134.6°～+167.3°，多糖的基本骨架由1→5糖苷鍵連接的阿拉伯糖和1→6糖苷鍵連接的半乳糖構(gòu)成。本發(fā)明的槲寄生多糖通過水提醇沉，離子交換層析和分子篩層析進(jìn)一步純化得到。本發(fā)明的槲寄生多糖對(duì)Hela細(xì)胞和小鼠移植瘤S-180有明顯的抑制作用，因此本發(fā)明的多糖可以應(yīng)用于制備治療腫瘤的藥物。文檔編號(hào)C08B37/00GK101486772SQ20091002503公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年2月13日優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日發(fā)明者吳子剛,張宇思,偉王,盛曉玲,龔祝南申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)