專利名稱：一種甲殼低聚糖的制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲殼低聚糖的制備方法及應用，特別是涉及一種采用復合酶水解法的甲殼低聚糖的制備方法和甲殼低聚糖的應用，屬于甲殼素深加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲殼低聚糖(chitooligosaccharides)是一類由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)和/或D-氨基葡萄糖(GA)通過β-1，4糖苷鍵連結(jié)起來的水溶性低聚糖，可通過水解甲殼素(chitin)或殼聚糖(chitosan)來制備。甲殼素和殼聚糖可從蝦蟹、昆蟲的外殼和真菌的細胞壁中經(jīng)酸堿處理而得到。這是一種再生資源，地球上資源總量僅次于纖維素。但其結(jié)構(gòu)與纖維素相比，除羥基外還含有乙酰氨基或游離氨基，其功能性質(zhì)和用途更加重要和廣泛，被譽為“二十一世紀的生物材料”。因甲殼素或殼聚糖不溶于水，在人體內(nèi)不容易被消化吸收，使其應用以及一些重要的生理活性受到限制。
大量研究表明水溶性甲殼低聚糖具有獨特的生理活性和優(yōu)越的功能性質(zhì)。它能提高機體的免疫能力，增強機體的抗病性和抗感染能力；具有強的抗腫瘤作用，對腫瘤細胞的生長和癌細胞的轉(zhuǎn)移有明顯的抑制效果；它還是很有效的雙歧桿菌增殖因子，可增殖腸道內(nèi)有益菌如雙歧桿菌等。此外，它還能促進植物細胞的活化，刺激植物生長，提高植物的抗病性；它還具有顯著的抗菌性和吸濕保濕作用。因此，甲殼低聚糖在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品等領(lǐng)域有廣闊的應用前景。
甲殼低聚糖常見的制備方法有化學法和酶法。化學法一般將甲殼素或殼聚糖用濃鹽酸加熱水解或利用過氧化氫或HNO2氧化降解，因反應劇烈，不易控制，副產(chǎn)物多，產(chǎn)物分離純化困難，得率低。酶法因反應條件溫和，選擇性強，避免了低聚糖的破壞，受到廣泛重視和研究。酶法降解殼聚糖或甲殼素的一種方法是采用專一性水解酶如殼聚糖酶或甲殼素酶。目前，用微生物生產(chǎn)的這類酶活性偏低，且大多以復雜的酶系存在，分離純化困難，成本高，難以用于甲殼低聚糖的商業(yè)化生產(chǎn)。另一種酶降解方式是采用非專一性水解酶。此類酶對甲殼素或殼聚糖有降解作用，但并非以其為天然底物。盡管非專一性酶對甲殼素或殼聚糖的水解作用機理還不十分清楚，但由于這些酶易從商業(yè)上得到，價格低廉，因此代替甲殼素酶和殼聚糖酶，可為甲殼低聚糖的生產(chǎn)開創(chuàng)一條具有商業(yè)化價值的新途徑。
有關(guān)甲殼低聚糖的文獻報道很多，國內(nèi)大多是綜述文章，介紹甲殼低聚糖的生理活性和一般制備方法。國外曾報道了木瓜蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶對殼聚糖的不同水解作用，但主要研究集中在水解特性方面。要應用這些非專一性水解酶來工業(yè)化生產(chǎn)甲殼低聚糖還存在一些難題一是非專一性酶對殼聚糖的水解程度有限，若單純使用一種非專一性酶，一方面酶使用量大(一般在20％以上，酶底比達0.2～0.3∶1)，另一方面產(chǎn)物得率也低(20％～40％)，并且產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量偏大，通常只能達到10000左右，而生理活性較高的甲殼低聚糖相對分子質(zhì)量在5000以下；二是由于殼聚糖不溶于水，在酸溶液中溶解后溶液粘度大，溶解量有限，一般酶作用的底物濃度只有1～3％，這樣使產(chǎn)物的分離純化及濃縮干燥的處理量增大，從而造成生產(chǎn)成本增大；三是水解產(chǎn)物的分離純化方法雖有應用超濾分離，但對因酸溶解帶來的過量酸和過度水解產(chǎn)物單糖不能被除去，產(chǎn)品純度和質(zhì)量不高。其工藝不夠完善，難以被應用于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
(1)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明旨在綜合國內(nèi)外研究基礎上，著重研究利用非專一性酶對殼聚糖的不同水解作用，尋找各種酶水解之間的協(xié)同互補效應，從而組成具有更大水解效果的復合酶來提高殼聚糖被水解的程度，并降低酶用量；同時，研究原料預處理方式對殼聚糖濃度的提高和水解程度的有利影響。此外，研究利用超濾結(jié)合離子交換或納濾技術(shù)等方法來分離純化水解產(chǎn)物，形成甲殼低聚糖的生產(chǎn)工藝。
(2)技術(shù)方案本發(fā)明所述一種甲殼低聚糖的制備方法是以殼聚糖為原料，經(jīng)混合酸溶解和加熱預處理，用復合酶水解、滅酶、過濾、超濾、離子交換處理或納濾技術(shù)處理、真空濃縮、干燥、制得產(chǎn)品甲殼低聚糖。工藝過程如下述。
原料殼聚糖用蝦或蟹殼以及包括昆蟲外殼和菌絲體，經(jīng)酸堿處理后得到。其主要指標應符合下列標準水分≤12％，脫乙?；取?0％，灰分含量≤3％，砷(以As計)≤2.0mg/kg，鉛(以Pb計)≤10mg/kg。
酸溶解和加熱預處理在反應罐中先加入1～5％(w/w)醋酸溶液，邊攪拌邊投放殼聚糖，同時加入2～5％(W/W)鹽酸溶液，并加熱至40～90℃，在高速攪拌下1～2h使其全部溶解，配制成5～10％(w/w)殼聚糖溶液。
殼聚糖溶液的濃度高低對甲殼低聚糖的生產(chǎn)有較重要的經(jīng)濟意義。因殼聚糖是大分子，在酸溶液中溶解后，其粘度隨著濃度的增加而增高，特別是濃度達到5％以上時，溶液的粘度呈指數(shù)增加，外觀呈粘稠凝膠狀，難以攪拌，此時殼聚糖難以再溶解，濃度不能增加；另外，如果此時加酶液進行酶解，將會因過粘而嚴重影響酶液的擴散，不利于酶解反應的進行。有必要在酶水解之前降低體系的粘度。
殼聚糖在酸溶液中，因酸的催化作用，其β-1，4糖苷鍵會發(fā)生水解斷裂而使溶液粘度降低，其水解程度取決于酸濃度、溫度和時間。由于殼聚糖分子中含有游離氨基，在酸溶液中帶正電，而使該糖基的糖苷鍵難以被水解。如果酸濃度太低，則粘度降低很慢，溶解量增加有限；但如果酸濃度太高，易產(chǎn)生過度水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量500以下的小分子或單糖。因此，本方法的預處理目的是既使其有一定程度的水解，降低溶液粘度；同時又不使水解過度而產(chǎn)生小分子單糖。經(jīng)過試驗，選擇用醋酸和鹽酸的混合酸溶液對殼聚糖溶液進行酸溶解和加熱處理，并且確定了上述合適的酸濃度和預處理溫度，從而使殼聚糖溶液的濃度從一般的1～3％提高到10％，這樣可有利于酶水解反應的進行，從而可在工業(yè)生產(chǎn)中應用。
復合酶水解將殼聚糖溶液調(diào)節(jié)pH2.5～5.5，復合酶用少量水溶解后加入到殼聚糖溶液中，復合酶用量為殼聚糖量的0.3～3％(w/w)，即酶底比為0.003～0.03∶1。在40～65℃攪拌反應1～5h，直到溶液變??；所用復合酶為多糖水解酶系、蛋白酶、脂肪酶三類酶中三種不同酶種組成的復合酶，其組成為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(1±0.2)(重量比)。多糖水解酶系可以是纖維素酶，淀粉酶，果膠酶等，蛋白酶為木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。根據(jù)水解產(chǎn)物分子大小的要求，復合酶可選擇其中兩類或三類中的三種不同酶種組成。
非專一性水解酶降解殼聚糖的有關(guān)機理還不十分清楚。殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中存在4種類型的糖苷鍵，即NAG-NAG，NAG-GA，GA-GA，GA-NAG。有人提出中性蛋白酶降解殼聚糖時，打斷NAG和GA之間的糖苷鍵。我們通過研究殼聚糖溶液在不同種類酶分別水解作用下的粘度變化曲線，發(fā)現(xiàn)其共同點是在酶水解初期溶液粘度快速下降，而隨后反應緩慢，說明這些酶主要以內(nèi)切方式作用于殼聚糖，使分子鏈上β-1，4糖苷鍵被打斷，高聚物變成低聚物。但不同種類的酶其水解程度不一樣，說明它們可能作用于不同部位的糖苷鍵。將其中不同種類的酶復合共同作用于殼聚糖，能增強水解作用，表明不同種類的酶水解作用的協(xié)同和互補效應比較顯著。
我們還比較了三種酶先后分3次加入和三種酶同時一次加入對殼聚糖的水解作用，見表1。
表1三種酶水解作用的協(xié)同和互補效應

從表中看出三種酶同時一次加入比先后分次加入其水解程度要相應增加，增加程度達37.7，比分次加入增加53％。
同時，還考察了酶劑量、不同pH條件、不同溫度、不同反應時間對酶水解殼聚糖的影響，確定了合適的條件。酶用量為殼聚糖的3％(w/w)，即相當于3mg/ml酶劑量，10％殼聚糖溶液濃度相當于約100mg/ml底物量。反應初期30min內(nèi)，水解速度很快，隨后反應速度減慢，這與單一酶水解作用特點相似；當反應5h后，反應基本趨于平衡。
滅酶將反應液加熱至90℃，保持10分鐘后，再冷卻至40℃。
過濾將酶解反應液過濾除去不溶物。
殼聚糖在酸溶解處理和酶解過程中，添加了一定量的酸、堿和酶制劑，這部分添加物會影響甲殼低聚糖的質(zhì)量指標，因此有必要對甲殼低聚糖溶液進行分離純化，脫除過量的酸、鹽以及少量未水解的大分子等物質(zhì)，以保證甲殼低聚糖的純度。
超濾過濾液用超濾進行分離。膜分子量截留值為5000～10000，以除去蛋白質(zhì)及大分子。超濾設備操作簡單，方便實用，占地面積小，超濾過程中沒有物相的變化，不會給產(chǎn)品帶來任何副作用，可以在分子級內(nèi)進行物質(zhì)的分離。采用膜分子截留值5000和10000對殼聚糖水解液進行脫除蛋白質(zhì)，分別測定透過液和截留液中的蛋白質(zhì)含量，計算得到蛋白質(zhì)脫除率分別達到92.2％和88.5％，表明超濾能有效地脫除蛋白質(zhì)，能純化甲殼低聚糖。
離子交換處理超濾液在室溫下用離子交換柱以強堿性陰離子交換樹脂如717型進行離子交換，使流出液的pH值達到5.5～6.5，用水洗脫離子交換樹脂后，再用酸堿液進行樹脂再生。應用酶法制得的水解液，由于預處理過程中添加了一定量的酸，這些酸會與甲殼低聚糖分子中的游離氨基結(jié)合成鹽，其余部分的酸為游離酸。采用離子交換樹脂法對超濾液進一步處理，主要是為了脫除游離酸和部分陰離子。分析表明，經(jīng)處理后的產(chǎn)品甲殼低聚糖保留率達到89％以上，陰離子脫除率達88％，游離酸已基本脫除。離子交換樹脂法是工業(yè)上最為常用的一種分離方法，操作簡單，成本低。因此，選用此法對殼聚糖水解液進行脫除陰離子和脫鹽純化處理，同時對超濾液中殘留的少量蛋白質(zhì)也可被樹脂吸附脫除。
真空濃縮將離子交換流出液用真空吸入薄膜蒸發(fā)器中進行濃縮，直至濃縮液的可溶性固形物濃度達到20％～40％。
干燥將濃縮液在離心噴霧干燥機中進行加熱脫水，控制流速，得到產(chǎn)品甲殼低聚糖粉末。進風溫度160～180℃，出風溫度70～80℃。
若上述純化過程中不用離子交換樹脂處理，也可采用納濾技術(shù)對超濾液進行處理。納濾是膜分離領(lǐng)域中一個新興的物理分離技術(shù)，其分離性能介于反滲透和超濾之間，是近年來國際上發(fā)展較快的膜分離種類之一。納濾膜的孔徑范圍在幾個納米左右，其截留分子質(zhì)量通常為200～1000道爾頓，在壓力驅(qū)動下允許一些無機鹽和小分子有機物透過膜，既能使大分子有機物和小分子有機物分離，也能使有機物和無機物分離，兼使有機物濃縮。用納濾技術(shù)處理同樣能脫鹽、脫除游離酸和部分陰離子，并還能除去單糖等相對分子質(zhì)量500以下的小分子。取納濾截留液進行真空濃縮、干燥，可得到純度很高的甲殼低聚糖。甲殼低聚糖納濾純化的工藝條件為操作壓力1.5～2.0MPa，溫度25～50℃。
用本發(fā)明方法制備的甲殼低聚糖，它的主要應用為以殼聚糖為主要原料，經(jīng)酶解，過濾，濃縮，干燥所得的以甲殼低聚糖為主要成分的粉劑充填入膠囊殼或壓片制成具有調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)節(jié)血脂作用的功能性食品或保健食品。此外，經(jīng)該方法制備的甲殼低聚糖純度高、質(zhì)量高，也可應用于醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中。
(3)有益效果生產(chǎn)甲殼低聚糖的原料為殼聚糖或甲殼素，是從蝦蟹加工下腳料中提取得到的。我國有很長的海岸線，海洋漁業(yè)和淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展很快，蝦蟹甲殼資源非常豐富。自90年代以來，我國沿海地區(qū)及全國各地都建成了許多甲殼素加工廠，年產(chǎn)量估計近十萬噸。目前甲殼素主要作為化工或醫(yī)藥原料供出口，或者僅加工成氨基葡萄糖鹽類，附加值低，整體技術(shù)水平不高。而研究以殼聚糖為原料生產(chǎn)甲殼低聚糖，該產(chǎn)品附加值大，技術(shù)含量高。所以本發(fā)明對有效利用甲殼素資源，提高我國甲殼素工業(yè)水平，促進我國甲殼素工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義；同時，也為我國國民經(jīng)濟的發(fā)展和社會服務作出貢獻。
從商業(yè)酶制劑中找到幾種對殼聚糖具有水解作用的非專一性酶，并發(fā)現(xiàn)由這些酶組成的幾類復合酶具有顯著的協(xié)同互補水解作用，確定了這些復合酶水解殼聚糖的最適條件。以這幾種復合酶在合適水解條件下，可大大提高殼聚糖的水解程度，使產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量在5000以下，酶的用量降低到3％以下，為商業(yè)化生產(chǎn)甲殼低聚糖提供了可行性。
將殼聚糖溶于醋酸和鹽酸混合酸溶液中，采用溫和的預處理方式，使殼聚糖溶液的粘度降低，溶解量增加，從而使殼聚糖溶液的濃度從一般的1～3％提高到10％，使酶解反應底物濃度增加了3倍以上。在這樣的處理條件下，酶水解產(chǎn)物中單糖含量＜5％。由于反應物濃度的提高，從而可以節(jié)省能源，降低生產(chǎn)成本。
采用超濾結(jié)合離子交換樹脂或納濾技術(shù)的分離純化方法，可除去甲殼低聚糖中蛋白質(zhì)、鹽類和單糖，使甲殼低聚糖的純度達到96％以上(以氨基葡萄糖含量計)。
以殼聚糖為原料，采用商業(yè)酶制劑組成的復合酶進行水解，形成了甲殼低聚糖的酶法生產(chǎn)工藝，已通過了500L的中試，甲殼低聚糖產(chǎn)品得率達到83％。產(chǎn)品經(jīng)理化分析測定，水溶性99.9％，單糖含量3.5％，水分4.5％，灰分0.46％，脫乙酰化度81％，聚合度為2～15，分子量分布500～3000。


附圖 甲殼低聚糖的制備工藝流程框圖。
具體實施例方式
實施例1以殼聚糖原料30kg溶于3％醋酸和2％的鹽酸溶液500L中，加熱至60～90℃，不斷攪拌直到殼聚糖溶解。將殼聚糖溶液調(diào)pH3.5，復合酶組成用果膠酶、胃蛋白酶、脂肪酶各0.3kg以少量水溶解后加入到殼聚糖溶液中，40℃攪拌反應5h，酶解反應結(jié)束，滅酶，過濾，濾液用超濾進行分離，膜分子截留值為5000。超濾液在室溫下用離子交換柱以強堿性陰離子交換樹脂717型進行離子交換，使流出液的pH值達到5.5～6.5。離子交換流出液進行真空濃縮、干燥，制得產(chǎn)品甲殼低聚糖粉末。
實施例2殼聚糖原料50kg，酸溶解和加熱預處理時，先用3％醋酸溶液來溶解殼聚糖，同時加入4％鹽酸溶液，并加熱升溫至90℃，來降低殼聚糖溶液粘度，其余條件同實施例1。
實施例3復合酶組成用纖維素酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶，其余同實施例1。
實施例4復合酶組成用淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，其余同實施例1。
實施例5復合酶組成用果膠酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，其余同實施例1。
實施例6
酶解反應及之前的處理同實施例2。分離純化處理條件采用超濾和納濾技術(shù)處理，納濾操作的壓力1.5～2.0MPa，通量5～10L/min，溫度35～50℃。為了提高純化效果，可加入純水稀釋幾次。隨著純化倍數(shù)的遞增，截流液中小分子單糖、鹽類不斷減少，甲殼低聚糖純度不斷提高，最終產(chǎn)品單糖含量少于1％，灰分小于0.3％。
權(quán)利要求
1.一種甲殼低聚糖的制備方法，其特征是以殼聚糖為原料，經(jīng)混合酸溶解和加熱預處理，用復合酶水解，滅酶，過濾，超濾、離子交換或納濾處理，真空濃縮，干燥，制得產(chǎn)品甲殼低聚糖；(1)原料殼聚糖用蝦或蟹殼以及包括昆蟲外殼和菌絲體，經(jīng)酸堿處理后得到；(2)酸溶解和加熱預處理在反應罐中先加入稀醋酸溶液，邊攪拌邊投放殼聚糖，同時加入稀鹽酸溶液，并加熱至40～90℃，在高速攪拌下使殼聚糖全部溶解，配制成5～10％(w/w)殼聚糖溶液；(3)復合酶水解將殼聚糖溶液調(diào)節(jié)pH2.5～5.5，復合酶用少量水溶解后加入到殼聚糖溶液中，復合酶用量為殼聚糖量的0.3～3％(w/w)，在40～65℃攪拌反應1～5h，直到溶液變?。凰脧秃厦笧槎嗵撬饷赶?、蛋白酶、脂肪酶三類酶中的三種不同酶種組成的復合酶，其組成為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(1±0.2)(重量比)；(4)滅酶將反應液加熱至90℃，保持10分鐘后，再冷卻至40℃；(5)過濾將酶解反應液過濾，除去不溶物；(6)超濾過濾液用超濾進行分離，膜分子量截留值為5000～10000，以除去蛋白質(zhì)及大分子；(7)離子交換超濾液在室溫下用離子交換柱以強堿性陰離子交換樹脂717型進行離子交換，使流出液的pH值達到5.5～6.5，以除去游離酸、鹽類和部分陰離子，用水洗脫離子交換樹脂后，再用酸堿液進行樹脂再生；(8)真空濃縮將離子交換流出液用真空吸入薄膜蒸發(fā)器中進行濃縮，直至濃縮液的可溶性固形物濃度達到20％～40％；(9)干燥將濃縮液在離心噴霧干燥機中進行加熱脫水，得到產(chǎn)品甲殼低聚糖粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲殼低聚糖的制備方法，其特征是酸溶解和加熱預處理時采用1～5％(W/W)醋酸和2～5％(W/W)鹽酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲殼低聚糖的制備方法，其特征是所用復合酶可以是多糖水解酶系的纖維素酶、淀粉酶、果膠酶，蛋白酶的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及脂肪酶，根據(jù)水解產(chǎn)物分子大小的要求，復合酶可選擇其中兩類或三類中的三種不同酶種組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲殼低聚糖的制備方法，其特征是產(chǎn)品的分離純化可以將超濾以后的濾液直接進行納濾處理，用納濾膜進行分離純化，納濾純化的工藝條件為操作壓力1.5～2.0MPa，溫度25～50℃。
5.一種甲殼低聚糖的應用，其特征是以殼聚糖為主要原料，經(jīng)酶解，過濾，濃縮，干燥所得的以甲殼低聚糖為主要成分的粉劑充填入膠囊殼或壓片制成具有調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)節(jié)血脂作用的功能性食品或保健食品。
全文摘要
一種甲殼低聚糖的制備方法及應用，屬于甲殼素深加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明解決了采用非專一性酶來提高殼聚糖被水解的程度和水解產(chǎn)物的分離純化。本發(fā)明的要點是以殼聚糖為原料，經(jīng)加酸溶解和加熱預處理以提高殼聚糖溶液的濃度和有利于水解，用多糖水解酶系、蛋白酶、脂肪酶三種非專一性酶組成復合酶對殼聚糖進行酶水解，滅酶，過濾，濾液進行超濾，離子交換或納濾技術(shù)方法來分離純化水解產(chǎn)物，真空濃縮，干燥，制得產(chǎn)品甲殼低聚糖粉末。本產(chǎn)品可應用于制備具有調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)節(jié)血脂作用的功能性食品或保健食品。用本發(fā)明方法制備的甲殼低聚糖附加值大，技術(shù)含量高。本發(fā)明所用酶易從商業(yè)上得到，價格低廉，為甲殼低聚糖的生產(chǎn)開創(chuàng)了一條具有商業(yè)化價值的新途徑，對有效利用甲殼素資源，促進甲殼素加工工業(yè)的發(fā)展有重要意義。
文檔編號C08B37/08GK1425696SQ03112619
公開日2003年6月25日 申請日期2003年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月7日
發(fā)明者夏文水, 陳潔, 張家驪 申請人:江南大學