專利名稱：對人癌細胞新粘蛋白樣糖蛋白抗原的特異性單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種同人類癌抗原結合的單克隆抗體，特別是涉及一種同存在于人類乳腺癌和其它腺癌癌細胞表面和/或細胞質(zhì)內(nèi)，以及正常人乳腺上皮細胞表面上的特大分子量的粘蛋白樣糖蛋白復合物特異性結合的單克隆抗體。
已經(jīng)制備出能識別存在于正常人乳腺上皮細胞表面上的大分子量的粘蛋白樣糖蛋白復合物的單克隆抗體。可詳見如下報道Petersonetal.，ImperialCancerResearchFund，London，England，March2-3(1981);Taylor-Papadimitrionetal.，Int.J.Cancer，2817-21(1981);Cerianietal.，SomaticCellGenetics，9415-427(1983)。另外一些研究人員既用人乳脂肪球作為免疫劑制備單克隆抗體;見如下報道;Taylor-Papadimitrionetal.，Int.J.Cancer，2817-21(1981);Cerianietal.，SomticCellGenetics，9415-427(1983)，和以不同的乳腺腫瘤細胞作為免疫劑制備單克隆抗體。詳見Papsideroetal.，CancerResearch，431741-1747(1983);Kufeetal.，Hybridoma，3223-232(1984);Frankeletal.，J.Biol.ResponseMod，4273-286(1985);Colcheretal.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，783199-3203(1981);Fosteretal.，VirchowsArch，394279-293(1982);Ellisetal.，Histopathology，8501-516(1984);Ashalletal.，lancet，21-11(1982)上述單克隆抗體也用于識別一種粘蛋白樣糖蛋白。按照Shimizu等人的報告(Shimizuetal.，BiochemJ.，233727-730(1985)發(fā)現(xiàn)這些單克隆抗體能識別約250，000道爾頓至超過一百萬道爾頓大小的粘蛋白樣糖蛋白，這取決于免疫原的制備。
在人乳脂肪球膜的大分子量的粘蛋白樣糖蛋白生化研究中，Shimizu等人(Shimizu，etal.，Biochem.J.233725-730(1986))建議這些糖蛋白是含有至少三個不同成分的復合物，而這三個成分至少分別代表三個不同的分子實體。因此，人乳脂肪球膜的粘蛋白樣糖蛋白顯示為大分子復合物，由于它們的大小，該復合物被認為具有無數(shù)的抗原決定簇。人們已制備出能同正常乳腺上皮細胞和惡性乳腺癌細胞的粘蛋白樣糖蛋白結合的單克隆抗體，如Ceriani等人描述的Mc5單克隆抗體(Cerianietal.，SomaticCellGenetics，9415-427(1983))。另外，一種對豚鼠乳脂肪球膜特異性的單克隆抗體D-274被用于判斷人乳腺浸潤導管型癌和良性纖維囊性病中的大于400，000道爾頓的粘蛋白樣糖蛋白的分布。參見(Greenwaltetal.，AmJ.Pathol.，118351-359(1985))。
現(xiàn)有技術中已制備的單克隆抗體將同正常人乳腺上皮細胞，乳腺癌細胞以及其它組織的某些上皮細胞結合。提供一種在正常乳腺上皮細胞表面和其它組織的某些癌細胞及人乳腺細胞表面和/或細胞質(zhì)內(nèi)表達的獨特的抗原決定基相結合的單克隆抗體將會大大地有益于腫癌細胞的鑒定、診斷、預后和治療。
一種同人乳腺癌細胞和其它腺癌癌細胞的表面和/或細胞質(zhì)內(nèi)的，以及同正常人乳腺上皮細胞表面的新穎的粘蛋白樣糖蛋白抗原相結合的單克隆抗體，該單克隆抗體不與心臟、肝臟、卵巢、脾臟、睪丸、腦、前列腺、甲狀腺、膀胱、結腸、食管和子宮正常組相結合。
被這種單克隆抗體識別的抗原被稱作BrE2，其特征在于具有大于400，000道爾頓的大分子量。BrE2單克隆抗體的特異性有利于在評估和治療乳腺癌時進行鑒別診斷、預后、診斷以及可能的治療中加以應用。
用正常去脂人乳脂肪球做成免疫制劑，制備BrE2單克隆抗體。
用Kohler和Milstein描述的標準工作程序(Kohler&Milstein，Nature，256495-493(1975))制備本發(fā)明的單克隆抗體。使用Ceriani等人描述的制備方法制備的完全去脂人乳脂肪球(HMFG)免疫宿主動物。(Cerianietal.，Prcc.Natl.AcadSciUSA.74582-586(1977))。宿主動物是新西蘭小黑鼠(NZBmice)，在適當時間的保溫之后，采集小鼠脾細胞。
然后，使用熟知的聚乙烯二醇技術將采集到的小鼠脾細胞同P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞進行融合。用Ceriani等人(Cerianietal.，SomatciCellGenetics，9415-427(1983))描述的在微量滴定盤的孔內(nèi)采用固相放免結合測定法和用HMFG以及HMFG成分的ELISA測定法完成篩選鑒定產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤或雜交細胞系。然后，篩選出對宮頸癌和結腸癌細胞系上HMFG陽性的各孔。找到一種未被這些癌細胞系染色的單克隆抗體，并且分離出產(chǎn)生那種抗體的雜交細胞。這樣單克隆抗體被認為是抗-BrE2(Anti-BrE2)。用Towbin等人報告的WesternBlottest(法)(Towbinetal.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，764350-4354(1979)和Ceriani等人報告的固相結合測定法(Cerianietal.，MonoclonalAntibodiesandFunctionalCellLines，PlenumPress，NewYork，398-402(1984)測定經(jīng)BrE2單克隆抗體鑒定的抗原的分子量。
在WesternBlot試驗法中，用7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離HMFG，然后將HMFG電印跡法轉(zhuǎn)到硝化纖維素膜上。將硝化纖維素膜切成條狀，恒溫保溫該條。高分子量標準品同時在凝膠上平行段泳動。
在固相結合測定法中，如LaemmliVK在自然雜志227期第680頁(1970)描述那樣，HMFG在7%聚丙烯酰胺凝膠上電泳。凝膠道被切成許多片段，洗脫該切片，然后將洗提液干燥在微量滴定板上。使用放免結合測定技術檢測單克隆抗體的結合情況。在使用WesternBlot試驗法和固相結合測定法電泳HMFG的時侯，只能在聚丙烯酰胺凝膠的原點找到BrE2單克隆抗體鑒定一種物質(zhì)。因此，由BrE2單克隆抗體識別的粘蛋白樣糖蛋白抗原也保留在原點，而不穿透聚丙烯酰胺凝膠。使用固相結合測定法在少于7%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳HMFG。然后用高分子量標準品計算由BrE2單克隆抗體識別的粘蛋白樣糖蛋白抗原的分子量。這樣抗原的分子量估計超過400，000道爾頓。在BrE2和Mc5單克隆抗體之間進行一些實驗，以判斷它們對于糖蛋白抗原的競爭。發(fā)現(xiàn)BrE2單克隆抗體對與Mc5單克隆抗體結合的同一抗原決定簇不具有競爭性結合。
用BrE2單克隆抗體對含有乳腺癌細胞或分子的體液分析表明，我們確定對小于400，000道爾頓分子量的糖蛋白分子實體也發(fā)生結合。推測被BrE2單克隆抗體結合的高分子量的粘蛋白樣糖蛋白抗原在體液中已經(jīng)變性，如變成碎片。顯然，BrE2單克隆抗體可識別一個共通的抗原決定簇，它既存在于高分子量抗原，也存在于分子實體或片段上，這方可說明此現(xiàn)象。所以，雖然BrE2單克隆抗體特異性地結合超過400，000道爾頓的高分子量抗原，它也結合這樣一種分子實體上的共通抗原決定基。這可能是因為高分子量的抗原為一種分子實體的復合物。
可用小鼠IgG1免疫球蛋白試劑盒鑒定BrE2單克隆抗體同型物。
為了進一步確定BrE2單克隆抗體的組織特異性，廣泛地研究了其與組織學切片的結合。采用標準免疫過氧化酶分析法以研究其與人正常和癌組織的組織切片的結合。按BattiforaH，(BaltiforaH，Lab.Invert.，55244-248(1986))報告的方法制備多種腫瘤組織塊。通過將各種固定的組織用腹膜或小腸纏起包埋在石蠟內(nèi)以制備每一種組織塊。然后組織塊切片以供結合研究。用這種方式，大量的不同組織用單一染色進行評價。
顯示，BrE2單克隆抗體特性的乳腺組織塊含有21種不同的標本，這些標本采自正常乳腺、22個腺瘤和33個乳腺癌。用BrE2單抗染色所有的受試組織。
BrE2單克隆抗體也被用于試驗大量不同的正常和腫瘤組織試驗組。不僅是正常的的乳腺組織和乳腺癌。BrE2單克隆抗體結合到肺泡襯細胞、腎遠端曲管、胰腺上皮的尖端以及胃粘膜全層的正?？椏?。BrE2單克隆抗體不與心、肝、脾、卵巢、睪丸、腦、前列腺、甲狀腺、膀胱、結腸、食管和子宮的正常組織結合。
BrE2單克隆抗體不僅同原發(fā)性乳腺癌(或稱乳腺源)結合外，還同幾種其它腺癌結合。在絕大多數(shù)的腫瘤中，可見尖端膜和細胞質(zhì)的染色。BrE2單克隆抗體也同絕大多數(shù)肺和卵巢的腺癌結合。一種能產(chǎn)生BrE2單克隆抗體的雜交細胞樣品已保藏在美國細胞培養(yǎng)物保藏機構(ATCC)，地址，美國馬里蘭州12301，RockVille，帕克勞恩道，12301號。保藏號NOHB9795，所述的雜交瘤細胞系已于1988年8月16日寄往ATCC，ATCC收到日為1988年8月17日。這種能產(chǎn)生BrE2單克隆抗體的雜交細胞樣品已保藏在武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心于1989年7月11日收到上述樣品，其保藏號為。
BrE2單克隆抗體是獨一無二與眾不同的，因為它的高度特異性，即對存在于正常乳腺上皮細胞表面，乳腺癌細胞質(zhì)內(nèi)或細胞表面上的特大分子量的粘蛋白樣糖蛋白復合物具有顯著的特異性，而上述單克隆抗體對心臟、肝臟、卵巢、脾、睪丸、腦、前列腺、甲狀腺、膀胱、結腸、食管和子管等正常組織不具有特異性。這樣，可以有幾種方式使用BrE2單克隆抗體。它可以用作抗乳腺抗體混合抗體(cock tail)的一個組分使用，每個組分具有不同的結合特異性。由于所述的合劑(cock tail)由對不同細胞和組織特異性的單克隆抗體組成，所以它可用于乳癌的診斷和治療，以及研究細胞分化和細胞分型的特異性。例如，所述的單克隆抗體可用某種可檢測的標記，如瑩光分子或染料或腫瘤顯像用的放射活性示蹤劑，進行標記。最適合的追蹤劑是碘131，銦111或者锝99。治療用時，可以結合或者未結合形式的單克隆抗體在幾種單抗合劑中使用，也可分別使用。BrE2單克隆抗體的適合的結合物包括化療藥物，毒素或者放射性同位素。如放射性同位素碘131可直接同BrE2單克隆抗體結合。如銦111或釔99放射性同位素可經(jīng)使用螯合物或其它已知方法間接地同BrE2單克隆抗體結合?？梢砸詥慰购蟿┗蚍謩e劑形使用(用藥)結合或未結合的BrE2單克隆抗體。
BrE2單克隆抗體可用在體外診斷的免疫測定，在測定中用許多微球中來結合在其表面上的抗原或抗體，并進行適當?shù)臉擞?。其標記物可根?jù)本文中討論的和現(xiàn)有技術中已知的標記物中選擇。例如，在體外應用時，按照所列文獻中的測定指令，BrE2單克隆抗體可以測定盒的形式并配有其它的成分，用來完成生物學樣品的測定。在體內(nèi)用診斷和治療同樣也可行。可用流式細胞測定法檢測分析細胞分化和細胞特異性。BrE2單克隆抗體也可用作腫瘤組織病理學中的預后研究工具，以判斷如惡性腫瘤的后果，惡性腫瘤擴散的可能性或者其惡性的分期。這些在體內(nèi)和體外應用并不排除BrE2單克隆抗體其它方面的應用。
權利要求
1.一種經(jīng)雜交瘤技術制備的，對人乳腺癌細胞質(zhì)內(nèi)及細胞表面，人類其它腺癌癌細胞質(zhì)內(nèi)及細胞表面和人類正常乳腺上皮細胞表面上的特有的抗原決定簇能產(chǎn)生特異性的單克隆抗體的細胞系。
2.按權利要求1所述的細胞系，其中所述的抗原在人類乳腺癌細胞和人類正常乳腺上皮細胞的粘蛋白樣糖蛋白分子復合物上被表達。
3.按權利要求2所述的細胞系，其中所述的單克隆抗體生產(chǎn)細胞是用去脂人乳脂肪球免疫過的小鼠脾細胞。
4.按權利要求2所述的細胞系，其中所述的單克隆抗體生產(chǎn)細胞是用正常人全乳脂肪球膜免疫過的小鼠脾細胞。
5.按權利要求2所述的細胞系，其中所述的單克隆抗體生產(chǎn)細胞是用正常人乳脂肪球成分免疫過的小鼠脾細胞。
6.按權利要求1所述的細胞系，其中在心臟、肝臟、脾、卵巢、睪丸、腦、前列腺、甲狀腺、膀胱、結腸、食管和子宮的正常組織細胞表面，使用所述單克隆抗體不能測定到所述的抗原。
7.按權利要求6所述的細胞系，其中所述的單克隆抗體同肺泡襯細胞，腎遠端曲管，胰腺泡上皮以及胃粘膜的正常上皮細胞相結合。
8.按權利要求1所述的細胞系，其中所述的單克隆抗體同乳腺、肺和卵巢的腺癌上皮細胞結合。
9.一種經(jīng)雜交瘤技術制備的，具有美國細胞培養(yǎng)物保藏機構(ATCC)保藏樣品基本特征的細胞系，該保藏機構地址在，美國，馬里蘭州20852，洛克維莉、帕克勞恩道，12301號，保藏號為HB9795。
10.一種同人類乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞的高分子量粘蛋白樣糖蛋白復合分子上的抗原決定簇特異性結合的單克隆抗體，其特征在于A.所述抗原是同BrE2抗原相同的，具有超過400，000道爾頓分子量的抗原，它可以使用抗原電泳和比較其同已知分子量的標記蛋白的移動加以鑒別。B.它可在乳腺癌細胞質(zhì)內(nèi)和/或表面上和正常乳腺上皮細胞的表面上表達。C.它屬于1gG1小鼠同型物。
11.按權利要求10所述的單克隆抗體，其中所述的抗原也在具有小于400，000道爾頓分子量并同所述單克隆抗體相結合的分子實體的表面上表達一個抗原決定基。
12.按權利要求10所述的經(jīng)雜交瘤制備的單克隆抗體，具有美國細胞培養(yǎng)物保藏機構(ATCC)保藏樣品的基本相同特征，該機構的地址在美國，馬里蘭州，20852，洛克維莉，帕克勞恩道，12301號，保藏號為HB9795。
13.按權利要求10所述的單克隆抗體，其中在心臟、肝臟、脾、卵巢、睪丸、腦、前列腺、甲狀腺、膀胱、結腸、食管和子宮正常上皮細胞上不能檢測到所述的BrE2抗原。
14.按權利要求10所述的單克隆抗體，其中在乳腺、肺泡襯細胞、腎遠端曲管、胰腺上皮和胃粘膜正常上皮細胞質(zhì)內(nèi)和/或表面上可檢測到所述的BrE2抗原。
15.按權利要求10所述的單克隆抗體，其中在乳腺、肺和卵巢的腺癌上皮細胞的細胞質(zhì)內(nèi)和/或表面上可檢測到所述的BrE2抗原。
16.一種檢測在生物樣品中含BrE2抗原人癌細胞或分子中ErE2抗原的方法，該方法涉及將偶聯(lián)標記的同BrE2抗原特異性結合單克隆抗體和所述的生物學樣品暫時接觸，在足以形成所述單克隆抗體和抗原之間的免疫復合物的條件下，檢測在底物反應可測產(chǎn)物上的免疫復合物。
17.按權利要求16所述的方法，其中檢測到的所述單克隆抗體和抗原免疫復合物包括一個與BrE2單克隆抗體結合的表達一個普通抗原決定基的抗原分子實體。
18.按權利要求16所述的方法，其中所述的標記物被包裹在微球體的表面上。
19.按權利要求16所述的方法，其中從放射活性成分，瑩光染料和酶中選擇所述的標記物。
20.一種同某種化療劑，光活性毒素或放射活性劑結合的BrE2單克隆抗體特異性結合的小鼠IgG1同型物的鼠單克隆抗體。
21.一種在生物學樣品中檢測BrE2抗原是否存在于含BrE2抗原人類乳腺癌細胞或分子上的方法，該方法包括，將該生物學樣品同與BrE2抗原特異性結合的帶標記的單克隆抗體暫時接觸，在足以完成免疫反應的條件下，假如如此，該單克隆抗體同該抗原發(fā)生反應，然后檢測反應中生成的免疫復合物。
22.按權利要求21所述的方法，其中從染料、瑩光染料、放射活性成分和酶中選擇所述的標記物。
23.一種從懷疑患有所述腫瘤患者身上檢測癌瘤的方法，該方法包括暫時向該患者注入同某種放射活性成分衍生后的BrE2抗原特異性結合的單克隆抗體，在該單克隆抗體和所述腫瘤之間足以形成免疫復合物的條件下，用衍生后的單克隆抗體標記該腫瘤以檢測到所述的腫瘤。
24.按權利要求23所述的方法，其中所述的放射活性成分是碘131、銦111或锝99。
25.按權利要求23所述的方法，其中所述的被檢測到的癌瘤是乳癌。
26.按權利要求23所述的方法，其中所述的被檢測到的癌瘤是肺癌和卵巢癌。
27.一種在懷疑患有所述腫瘤的患者體內(nèi)殺死人乳腺癌腫瘤細胞的方法，該方法包括暫時向患者體內(nèi)注入可同BrE2抗原和含BrE2抗原的細胞特異性結合物的一種單克隆抗體-毒素合劑，在所述單克隆抗體-毒素合劑同所述腫瘤之間足以形成免疫復合物的條件下，引起腫瘤的死亡。
28.按權利要求25所述的方法，其中所述的毒劑是放射活性劑。
29.按權利要求27所述的方法，其中所述的被殺的癌瘤是乳癌。
30.按權利要求27所述的方法，其中的被殺死的癌瘤是肺癌或卵巢癌。
31.一種經(jīng)雜交瘤技術制備，具有中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的樣品基本特征的細胞系，該中心地址在中國武漢珞珈山武漢大學院內(nèi)，保藏號。
全文摘要
一種能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞系。該抗體可同人乳癌細胞和其它腺癌細胞表面和/或細胞質(zhì)內(nèi)以及正常人乳上皮細胞表面的特有的抗原決定簇結合。用選擇一組免疫原和常規(guī)骨髓瘤細胞系同收集的小鼠脾細胞融合的免疫小鼠制備本發(fā)明的細胞系。
文檔編號C07K16/30GK1040623SQ8910497
公開日1990年3月21日 申請日期1989年7月24日 優(yōu)先權日1988年8月26日
發(fā)明者羅伯托·L·瑟列尼, 杰里·A·彼得森 申請人:約翰繆爾紀念醫(yī)院約翰繆爾癌與老年研究所