Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554菌株及其產(chǎn)物放線菌素D制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及Streptomyces?parvulus?OUCMDZ-2554菌株及其產(chǎn)物放線菌素D制備方法和應(yīng)用。菌株保藏編號為CGMCC7907。Streptomycesparvulus?OUCMDZ-2554高產(chǎn)單一化合物放線菌素D，產(chǎn)量為0.25mg/mL。此菌株首次在國內(nèi)分到，產(chǎn)量高，培養(yǎng)基僅用一種營養(yǎng)成分，成本低，制備簡單，易于操作，發(fā)酵周期短，可通過大規(guī)模發(fā)酵方式實現(xiàn)活性物質(zhì)的大量生產(chǎn)，從根本上解決藥源問題，也可以為該類化合物的結(jié)構(gòu)修飾及構(gòu)效關(guān)系研究提供前體。
【專利說明】Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554 菌株及其產(chǎn)物放線菌素D制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及用鏈霉菌Streptomyces parvulus 0UCMDZ-2554(來源于黃河三角洲)及其制備放線菌素D的方法和應(yīng)用(菌株保藏編號=CGMCC 7907，保藏日期:2013年7月10日，保藏地點:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)。
【背景技術(shù)】:
[0002]癌癥一直以來嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命，對開發(fā)高效、低毒的抗腫瘤藥物的要求變得日益迫切。微生物尤其是鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物一直是新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉，隨著對陸棲微生物的大量開發(fā)，這幾年來，人們逐漸開始轉(zhuǎn)向特殊生境微生物次生代謝產(chǎn)物。
[0003]黃河三角洲來源既不同于陸地又有異于海洋的獨特的生存環(huán)境的微生物，該鹽堿地土壤鹽度高，透氣性差，養(yǎng)分少，對土壤微生物產(chǎn)生一定程度的抑制作用，導(dǎo)致微生物缺乏賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)和環(huán)境條件。由于極端微生物的生存環(huán)境特殊，定然會成為開發(fā)藥物先導(dǎo)化合物的重要資源。為繼續(xù)開展這一特殊環(huán)境來源的微生物活性產(chǎn)物的研究(曲鵬，劉培培，付鵬，等.黃河三角洲耐鹽真菌Penicillium chrysogenum HK14-01的次生代謝產(chǎn)物.微生物學(xué)報，2012,52(9):1103-1112 ;陳正乾，劉培培，王乂，等.黃河三角洲土曲霉Aspergillus terreus 0UCMDZ-1925中具抗菌活性的聚酮類天然產(chǎn)物.微生物學(xué)報，2013, 32 ⑵:277-285 ；Fu P, Yang CL, Wang Y, Liu PP, Qu HJ, et al.a -Pyrones anddiketopiperazine derivatives from the marine-derived actinomycete Nocardiopsisdassonvillei HR10-5.J Nat Prod，2011，74 (10): 1751-1756)，從黃河三角洲泥樣中篩選出一株鏈霉菌0UCMDZ-2554，找到了高產(chǎn)單一化合物放線菌素D (付海超，趙文英，鐘惠民，等.海綿來源放線菌sh6004發(fā)酵產(chǎn)物中的活性生物堿.中國海洋藥物，2008，27 (4):14-20)。
[0004]放線菌素D中含有一個苯氧環(huán)結(jié)構(gòu)，通過它連接兩個等位的環(huán)狀肽鏈。此肽鏈可與DNA分子的脫氧鳥嘌呤發(fā)揮特異性相互作用，使放線菌素D嵌入DNA雙螺旋的小溝中，與DNA形成復(fù)合體，阻礙RNA多聚酶的功能，抑制RNA的合成，特別是mRNA的合成。放線菌素D已經(jīng)成為較為理想的抗腫瘤藥物，用于腎母細(xì)胞瘤、絨毛膜上皮癌、惡性淋巴瘤和何杰金病等，也常與其他藥物聯(lián)合用于腫瘤的治療和研究。
[0005]目前通過發(fā)酵法得到放線菌素D的有S.parvulus、S.plicatus和S.griseoruber(ffaksman S,Selman A,Gregory F,et al.Actinomycin I1.Classificationof organisms producing different forms of actinomycin.AntibiotChemother,1954，4:1050-1056 ;Lam KS, Mamber Sff, Forenza S, Stodieck LS, et al.The effectsof space flight on the production of actinomycin D by Streptomyces plicatus.J.1nd.Microbiol.Biotechnol,2002, 29(6):299-302 ；Praveen V,Tripathi C K M,BihariV.Studies on the production of actinomycin-D by Streptomyces griseoruber—anovel source.Lett Appl Microbiol,2009,49(4):450-455)等。Streptomyces parvulusOUCMDZ-2554高產(chǎn)單一化·合物放線菌素D，此化合物合成步驟長，產(chǎn)率不高，原料價格較貴、毒性大，安全性差，所用的溶劑腐蝕性不符合綠色化學(xué)的要求(Tanaka T, Nakajima K,Okawa K.Studies on2-aziridinecarboxylic acid.1V.Totalsynthesis ofactinomycin Dvia ring-openging reaction ofaziridine.Bull Chem Socjpn，1980，53 (5):1352-1355)。然而微生物具有生長速度快、生長條件溫和、代謝過程簡單等優(yōu)點，發(fā)酵培養(yǎng)基僅用一種營養(yǎng)成分，成本低，制備簡單，易于操作，產(chǎn)量高(0.25mg/ml)，發(fā)酵周期短，可通過大規(guī)模發(fā)酵方式實現(xiàn)活性物質(zhì)的大量生產(chǎn)，從根本上解決藥源問題，也可以為該類化合物的合成及構(gòu)效關(guān)系研究提供前體。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明旨在提供S.parvulus OUCMDZ-2554及其產(chǎn)物放線菌素D制備方法及其應(yīng)用，所述放線菌素D結(jié)構(gòu)(圖1)。
[0007][0008]本發(fā)明所涉及的放線菌素D的生產(chǎn)菌是S.parvulus OUCMDZ-2554,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(編號=CGMCC 7907，保藏日期:2013年7月10日，保藏地點:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)。
[0009]本發(fā)明保護(hù)一種發(fā)酵的寡培養(yǎng)基:酵母浸膏20g、陳海水lL、pH7.5。
[0010]本發(fā)明保護(hù)一種制備放線菌素D的方法:發(fā)酵S.parvulus OUCMDZ-2554,經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以甲醇洗脫，得到放線菌素D純品。所述發(fā)酵的條件具體可為種子液搖床3天，5%的接種量，28°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，搖床11天。
[0011]本發(fā)明提供的放線菌S.parvulus 0UCMDZ-2554主產(chǎn)單一產(chǎn)物，產(chǎn)量高，分離工藝簡便，易于操作，該菌株穩(wěn)定，培養(yǎng)基僅用一種營養(yǎng)成分，成本低，可通過大規(guī)模發(fā)酵方式實現(xiàn)活性物質(zhì)的大量生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0012]圖1為放線菌素D的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0013]圖2為0UCMDZ-2554菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹狀關(guān)系圖。
[0014]圖3為放線菌素D標(biāo)準(zhǔn)品(濃度:0.5mg/mL)的HPLC。
[0015]圖4為放線菌素D的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]圖5為放線菌素D粗提液(濃度:0.4mg/mL)的HPLC分析圖。
[0017]圖6為放線菌素D純品(濃度:0.3mg/mL)的HPLC。
[0018]圖7為放線菌素D的產(chǎn)量。
[0019]圖8為放線菌素D的質(zhì)譜圖。
[0020]圖9為放線菌素D的紫外光譜圖。
【具體實施方式】:
[0021]【實施例1】0UCMDZ-2554菌株的分離和鑒定
[0022]1、菌株分離
[0023]采用平板稀釋法分離放線菌。將海泥(來源于黃河三角洲)從冰箱拿出放置一段時間，解凍，取海泥樣品lg，用無菌海水逐級稀釋到10_2，各取0.3mL均勻涂布于分離平板上(酵母浸膏0.2%、2%瓊脂、PH7.5)，每個稀釋度涂3個平板，28 °C倒置培養(yǎng)，挑取山的菌落劃線純化，純化的菌株接入斜面培養(yǎng)基[斜面培養(yǎng)基組成):可溶性淀粉2%、KNO30.1K2HPO40.05%,MgSO4.7Η200.05%,NaCl0.05%,FeSO40.001%,ρΗ7.5，瓊脂2%]，置于4°C冰箱保存。[0024]2、OUCMDZ-2554 菌株的鑒定
[0025]該放線菌菌株OUCMDZ-2554是從采自山東東營黃河三角洲的海泥中分離得到，經(jīng)多相分類學(xué)研究鑒定為Streptomyces parvulus ;并由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(編號:CGMCC7907，保藏日期:2013年7月10日，保藏地點:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)。
[0026]對OUCMDZ-2554菌株采用16S rDNA引物序列7f(5' -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3' ) U540r(5/ -AGGAGGTGATC CAGCCGCA-3')擴(kuò)增其 16SrDNA序列。以所提的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化測序后，菌株的16S rDNA序列的長度為1434bp (下圖所示)。使用軟件MEGA4分析放線菌OUCMDZ-2554的16S rDNA序列以及其它放線菌的16S rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。
[0027]該Streptomyces parvutlusOUCMDZ-2554菌株具有如下分子生物學(xué)特征:其16SrRNA 基因序列信息為:CCGCTTACACATGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCTTCACGGGCATCTGTGAAGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCCAGAGATGGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAGTCo
[0028]將基因序列與NCBI對比同源性,發(fā)現(xiàn)測試結(jié)果與Streptomyces parvulus的序列有98%的吻合度。該StreptomycesparvulusOUCMDZ-2554菌株具有如下形態(tài)學(xué)特征:氣生菌絲較短，有刺狀，菌絲黃白色或淡黃色，基內(nèi)菌絲呈黃色,產(chǎn)黃色色素；取插片觀察其顯微形態(tài)表明氣生菌絲斷裂為孢子，孢子呈圓柱形、光滑。與Streptomyces parvulus的特征十分一致，因此結(jié)合形態(tài)、生理生化特性鑒定菌株為Streptomyces parvulus。[0029]【實施例2】放線菌素D的制備和應(yīng)用
[0030]1、放線菌素D純品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
[0031]取斜面培養(yǎng)3天的S.parvulus OUCMDZ-2554適量，接種到I瓶裝有150mL培養(yǎng)液(酵母浸膏0.2%,pH7.5)的500mL三角瓶中，裝載于28°C、180轉(zhuǎn)/分鐘搖床上，搖床培養(yǎng)7天。發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏48mg。所得浸膏經(jīng)LH-20凝膠柱色譜分離(甲醇洗脫)，得到高純度放線菌素D35mg。
[0032]純度檢測:放線菌素D的結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR、MS和比旋光度鑒定；其純度用薄層色譜TLC(2種展開劑:15:1 二氯甲烷-甲醇、5:1石油醚-丙酮，3種顯色方法:254nm紫外、香草醒-濃硫酸、Dragendroff試劑,均呈單一斑點)和高效液相色譜HPLC測定:通過面積歸一法，采用5個不同的波長(201、240、280、442、460nm)測定，記錄色譜圖的時間寬度為放線菌素D出峰時間的2倍以上。結(jié)果表明:在所選定的5個波長下，放線菌素D的純度均大于98% (圖3)，符合標(biāo)準(zhǔn)品的純度要求。
[0033]標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:以上述純度大于98%的放線菌素D為標(biāo)準(zhǔn)品，通過面積歸一法，采用反相HPLC法(流動相:75 %的甲醇水溶液、流速ImL.mirT1、樣品濃度10mg/mL，依次稀釋為 1,0.8,0.5,0.1,0.08,0.05,0.01,0.008,0.005,0.001mg/mL,進(jìn)樣量 10 μ L、檢測波長443.6nm)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。放線菌素D的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y = (2E-06x) +0.0976，r2 =
0.9996，式中X為峰面積、y為放線菌素D含量；表明曲線的線性關(guān)系良好，可用于放線菌素D含量的測定。
[0034]2、發(fā)酵生 產(chǎn)
[0035]將S.parvulus OUCMDZ-2554的孢子接入到種子培養(yǎng)基[種子培養(yǎng)基組成(％ ):可溶性淀粉I %、酵母浸膏0.4 %、蛋白胨0.2 %、CaCO30.1 KBr0.01Fe2(SO4)3.4H200.004% ]，得到種子液，發(fā)酵時間為3天。從種子培養(yǎng)基中以5%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基[種子培養(yǎng)基組成):酵母浸膏0.2%，pH7.5]中，初始ρΗ7.5、裝液量150/500mL，溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵1L，搖床培養(yǎng)，發(fā)酵時間分別為1，3，5，7，9，11，13，15天。獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取六次，合并乙酸乙酯萃取液后濃縮，粗提液的HPLC圖譜見圖5，通過HPLC分析，發(fā)酵11天，產(chǎn)量最高，產(chǎn)量見圖6。
[0036]2、分離精制
[0037]將上述所有的浸膏經(jīng)凝膠S印hadex LH-20層析，用甲醇洗脫，薄層色譜檢測，得到放線菌素D純品(圖7)。
[0038]3、放線菌素D的鑒定
[0039]該化合物為橙紅色結(jié)晶性粉末，易溶于甲醇、丙酮或異丙醇，在水中幾乎不溶，熔點:246-247°C, [ a ] 25D_310。(c0.30，MeOH)。由 ESl-MS 于 m/zl256.4 給出[M+H]+，該化合物的質(zhì)譜圖見圖8，UV在201、240和445nm處有特征吸收(圖9)，表明分子中存在吩噁嗪酮發(fā)色團(tuán)。13C NMR在δ 34—40有4個N-CH3碳的吸收、在δ 165-175有12個酰胺羰基碳的吸收；結(jié)合該化合物有12個氮原子，表明其為放線菌素類化合物。其波譜數(shù)據(jù)(表1)、比旋光值與文獻(xiàn)報道的放線菌素D —致。該化合物的NMR數(shù)據(jù)見表1。
[0040]表1 放線菌素 D 的 NMR 數(shù)據(jù)(CDCl3,1H:600MHz，13C:150MHz)*
[0041]
【權(quán)利要求】
1.式I化合物為放線菌素D:

2.S.parvulus OUCMDZ-2554,菌種保藏編號:CGMCC7907，保藏日期:2013 年 7 月 10 日，保藏地點:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中國科學(xué)院微生物研究所。
3.權(quán)利要求2所述產(chǎn)生菌S.parvulus OUCMDZ-2554的培養(yǎng)基，是通過如下方法制備得到的培養(yǎng)基:酵母浸膏20g、陳海水I L、pH7.5。
4.權(quán)利要求1所述式I化合物的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)凝膠SephadexLH-20層析，以甲醇洗脫，薄層色譜檢測，得到放線菌素D純品(HPLC檢測，純度大于98% )。
5.權(quán)利要求2所述S.parvulus OUCMDZ-2554生產(chǎn)放線菌素D發(fā)酵的條件:種子液搖床3天，5%的接種量，28°C，轉(zhuǎn)速為180r/min，搖床11天。
6.權(quán)利要求2所述S.parvulus OUCMDZ-2554生產(chǎn)放線菌素D的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K7/06GK103665108SQ201310519932
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月26日
【發(fā)明者】朱偉明, 王聰, 王乂, 劉培培 申請人:中國海洋大學(xué)