c-KIT抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域的抗體，包含這些抗體的藥物組合物，及其在治療癌癥中的用途。
【專利說明】c-KIT抗體及其用途
[0001]本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人C-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域的抗體，包含這些抗體的藥物組合物，及所述抗體在治療與C-Kit的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或病癥(如腫瘤、癌癥和/或細(xì)胞增殖性病癥)中的用途。
[0002]c-Kit是受體酪氨酸激酶，也被稱為例如干細(xì)胞因子(SCF)受體或⑶-117。c_Kit及其配體——SCF，介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，包括造血、黑素原生成、紅細(xì)胞生成、精子發(fā)生、腫瘤發(fā)生、纖維化、炎癥、肥大細(xì)胞分化和增殖，和免疫過程。
[0003]GLEEVEC⑧(甲磺酸伊馬替尼(imatinib))和SUTENT ? (蘋果酸舒尼替尼(sunitinib))是批準(zhǔn)并上市銷售的藥物小分子產(chǎn)品，其抑制包括c-Kit在內(nèi)的多種受體酪氨酸激酶。然而，目前明確的是，這類療法一般對其獲批的適應(yīng)癥具有有限的好處，因為腫瘤細(xì)胞經(jīng)常具有或快速出現(xiàn)由突變介導(dǎo)的藥物抗性。
[0004]之前已報道過人C-Kit的抗體。然而，已知的C-Kit抗體在用于治療癌癥時不甚理想，因為它們抑制腫瘤細(xì)胞的c-Kit內(nèi)化，刺激c-Kit激動劑活性(例如c-Kit磷酸化)，或缺少其他對于其有效用作治療性抗癌劑最佳的因素。例如，WO 2007/127317公開了人源化c-Kit抗體及其相關(guān)數(shù)據(jù)，主要涉及抗體對肥大細(xì)胞、造血、黑素原生成和精子發(fā)生的效應(yīng)。應(yīng)注意的是，WO 2007/127317描述的抗體被報道為“在M07e細(xì)胞中強力抑制SCF介導(dǎo)的c-Kit磷酸化和內(nèi)化”。
[0005]因此，本發(fā)明提供了特異性靶向人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的備選單克隆抗體。本發(fā)明還提供了特異性靶向人c-Kit的ECD的單克隆抗體，所述抗體在腫瘤細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞膜結(jié)合的c-Kit內(nèi)化和/或降解,而不誘導(dǎo)c-Kit激動劑活性(例如，c-Kit磷酸化)，和/或具有其他對于有效用作治療性抗癌劑有利的臨床因素(例如，改良的溶解度、體外或體內(nèi)穩(wěn)定性，或其他藥物動力學(xué)特性)。預(yù)期這類抗體對治療癌癥更有效，并有利地延遲或預(yù)防產(chǎn)生由突變介導(dǎo)的藥物抗性和/或治療對已知療法具有抗性的癌癥。因此，本文描述的c-Kit抗體滿足了本領(lǐng)域的關(guān)鍵需求。
[0006]本發(fā)明的一個方面涉及抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中HCVR包含CDRHl、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3 氨基酸序列，其中 CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQID NO:2)，CDRH3 是HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO:3)，CDRLl 是RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是 DASSLES (SEQ ID NO:5)，并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)。
[0007]本發(fā)明的另一個方面涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含抗體，和至少一種可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2), CDRH3是 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3), CDRLl 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:4), CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5),并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)。[0008]在一個方面，本發(fā)明提供了抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中 CDRHl 是 SYffIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2),CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5)，并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)，所述抗體用于療法。[0009]本發(fā)明的另一個方面提供了抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中 CDRHl 是 SYffIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2),CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5)，并且CDRL3 是CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)，所述抗體用于治療癌癥。
[0010]本發(fā)明的另一個方面提供了抗體用于生產(chǎn)用于治療癌癥、腫瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物的用途，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRHl是SYWIG (SEQ IDNO:1)，CDRH2 是 IIYP ⑶ SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO: 2)，CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO:
3)，CDRLl是 RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是 DASSLES (SEQ ID NO:5)，并且 CDRL3 是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO:6)。
[0011]本發(fā)明的另一個方面提供了治療有需要的人的癌癥的方法，所述方法包括向所述人施用治療有效量的抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRHl是SYWIG(SEQID NO:1)，CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2)，CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ IDNO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是 DASSLES (SEQ ID NO:5)，并且 CDRL3是 CQQFNSYPLT(SEQ ID NO:6)。
[0012]在一個方面，本發(fā)明提供了治療有需要的人的癌癥的方法，所述方法包括向所述人施用治療有效量的抗體，與治療有效量的至少一種其他治療劑的組合，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRHl、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3 氨基酸序列，其中 CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQID NO:2)，CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:
4)，CDRL2是 DASSLES (SEQ ID NO:5)并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)。在優(yōu)選的實施方案中，其他治療劑是抗癌劑。
[0013]本發(fā)明的另一個方面提供了編碼本發(fā)明的C-Kit抗體的分離的核酸分子，包含所述核酸分子的表達(dá)載體，和包含所述核酸分子的宿主細(xì)胞。
附圖簡介
[0014]圖1描述了在用抗c-Kit mAb, CK6體外處理細(xì)胞之前和之后，在人腫瘤細(xì)胞系，Mo7e和GIST882的總細(xì)胞裂解液中檢測到的總c-Kit的western印跡?？筩_Kit mAb CK6以時間依賴性的方式顯著誘導(dǎo)由人腫瘤細(xì)胞表達(dá)的c-Kit的降解。
[0015]圖2描述了在用或不用c-Kit mAb,CK6的條件下，在人腫瘤細(xì)胞系，GIST882的總細(xì)胞裂解液中檢測到的總c-Kit的western印跡。沒有觀察到抗c_Kit mAb CK6以時間依賴性的方式顯著誘導(dǎo)由GIST882人腫瘤細(xì)胞表達(dá)的c-Kit的降解。
[0016]圖3描述了在用或不用c-Kit mAb, CK6的條件下，在人腫瘤細(xì)胞系，Mo7e的總細(xì)胞裂解液中檢測到的總c-Kit的western印跡。沒有觀察到抗c_Kit mAb CK6以時間依賴性的方式顯著誘導(dǎo)由Mo7e人腫瘤細(xì)胞表達(dá)的c-Kit的降解。
[0017]圖4描述了在用或不用C-Kit mAb,CK6的條件下，在人腫瘤細(xì)胞系，Malm_3M的總細(xì)胞裂解液中檢測到的總c-Kit的western印跡。沒有觀察到抗c_Kit mAb CK6以時間依賴性的方式顯著誘導(dǎo)由Malm-3M人腫瘤細(xì)胞表達(dá)的c-Kit的降解。
[0018]發(fā)明詳述
[0019]本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人C-Kit的ECD的抗體，所述抗體可用于例如治療與c-Kit表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或病癥，如腫瘤、癌癥和/或細(xì)胞增殖性病癥。
[0020]除非另外指出，否則術(shù)語“抗體”在本文中用于指單克隆抗體。“單克隆抗體”及其縮寫“mAb”意在指源自單個拷貝或克隆的抗體，包括例如任何真核、原核或噬菌體的克隆，而不限它的生產(chǎn)方法。作為本文使用的術(shù)語，抗體可以是完整的抗體(包含完全或全長Fe區(qū))，或包含抗原結(jié)合部分的其部分或片段，例如，結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶的Fab片段、Fab’片段或F(ab，)2片段。例如，本發(fā)明涵蓋的、能夠結(jié)合c-Kit的ECD的 抗體片段包括但不限于二價片段，如具有完整的鏈間二硫鍵的(Fab' )2 ;單價片段，如，指由LCVR-CL和HCVR-CHl結(jié)構(gòu)域組成的抗體的片段且不保留重鏈鉸鏈區(qū)(例如，通過木瓜蛋白酶消化)的Fab(抗原結(jié)合片段)，保留了重鏈鉸鏈區(qū)的Fab，F(xiàn)acb(例如，血纖維蛋白溶酶消化)，F(xiàn)(ab' )2，缺少二硫鍵的Fab'，pFc'(例如，通過胃蛋白酶或血纖維蛋白溶酶消化)，F(xiàn)d(例如，通過胃蛋白酶消化、部分還原和重凝聚)和Fv或 scFv (例如,通過分子生物學(xué)技術(shù)；參見 Pluckthun, The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編著，Springer-Verlag, New York,第 269-315頁，1994)?？贵w片段還意在包括，例如特異性結(jié)合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的ECD的結(jié)構(gòu)域刪除的抗體、線性抗體、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、多價單鏈抗體、由抗體片段形成的多特異性抗體，包括二價體、三價體等。應(yīng)理解，除非另外指出，否則不論是否指明抗原結(jié)合片段或部分，用于本文中的術(shù)語“抗體”都包括了這類片段或部分及其單鏈形式。
[0021]輕鏈可以包含一個可變結(jié)構(gòu)域(在本文中縮寫為LCVR)和/或一個恒定結(jié)構(gòu)域(在本文中縮寫為CL)。人抗體(免疫球蛋白)的輕鏈?zhǔn)莐appa (K)輕鏈或IambdaO )輕鏈。本文中使用的表達(dá)方式LCVR意在包括來自kappa型輕鏈(VK)或來自lambda型輕鏈(VA)的可變區(qū)。取決于抗體類型或同種型，重鏈還可包含一個可變結(jié)構(gòu)域(在本文中縮寫為HCVR)和/或3或4個恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3和CH4 ;在本文中統(tǒng)一縮寫為CH)。人IgGl是本發(fā)明抗體的優(yōu)選同種型。
[0022]在每個LCVR和HCVR中都發(fā)現(xiàn)了被稱為超變區(qū)或互補決定區(qū)(CDR)的3個區(qū)域，所述區(qū)域被稱為框架區(qū)(在本文中縮寫為FR)的變化較少的區(qū)域支持。根據(jù)Kabat規(guī)則(Kabat 等人，Ann.NY Acad.Sc1.190:382-93 (1971) ；Kabat 等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department of Health and HumanServices, NIH Publication N0.91-3242 (1991))對特別 CDR 區(qū)或結(jié)構(gòu)域的氨基酸命名。每個HCVR和LCVR都包括3個⑶R和4個FR，按下列順序從氨基端至羧基端排列:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。由LCVR和HCVR結(jié)構(gòu)域組成的抗體部分被命名為Fv(可變片段)，并且構(gòu)成了抗原結(jié)合位點。單鏈Fv(ScFv)是在一條多肽鏈上含有LCVR結(jié)構(gòu)域和HCVR結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中一個結(jié)構(gòu)域的N端和其他結(jié)構(gòu)域的C端被靈活的接頭連接。
[0023]用于本文中的術(shù)語“人抗體”包括具有與人種系免疫球蛋白序列(如Kabat等人中所述，見上文)對應(yīng)的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。
[0024]抗體特異性指抗體對抗原的特定表位的選擇性識別。可以基于親和力和/或親合力確定本發(fā)明的抗體對c-Kit的特異性。親和力由抗原與抗體的解離的平衡常數(shù)(KD)表示，測量了抗原決定簇和抗體結(jié)合位點之間的結(jié)合強度。可以使用表面等離子體共振(SPR)生物傳感器(如the BIAcore ? 3000)測量本文公開的抗體的結(jié)合動力學(xué)和親和力。
BIAcore⑩系統(tǒng)利用了 SPR的光學(xué)特性，檢測葡聚糖生物傳感器基質(zhì)中的相互作用的分子的蛋白質(zhì)濃度改變?；救缦挛膶嵤├?所述，可以通過SPR生物傳感器確定抗c-Kit單克隆抗體的結(jié)合動力學(xué)(包括KD值)。
[0025]除非另外指出，否則當(dāng)涉及c-Kit抗體對c-Kit的ECD的親和力時,本文中使用的詞組“特異性結(jié)合”意在表示通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法確定，小于約ΖχΙΟ,Μ，優(yōu)選在約2χ10^10Μ至約2χ10_12Μ之間的KD，包括使用基本如本文所述的SPR生物傳感器。
[0026]本發(fā)明的一個方面涉及抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID Ν0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2), CDRH3是 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3), CDRLl 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:4), CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5)并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含LCVR，其中LCVR氨基酸序列是
[0027]AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:13)，
[0028]和HCVR，其中HCVR氨基酸序列是
[0029]QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYP⑶SDTRYSPSFQGQVTISAGKSISTAYLQffSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIffGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:7)。
[0030]在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈氨基酸序列是SEQID NO:9，輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:15。
[0031]在其他實施方案中，本發(fā)明的抗體包含2條重鏈和2條輕鏈，其中每條重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:9，每條輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:15。
[0032]本發(fā)明的另一個方面涉及抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和CDRH3氨基酸序列，LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRHl是SYWIG (SEQID NO:1)，CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2)，CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ IDNO:3)，CDRL1 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:4)，CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5)，并且 CDRL3是CQQFNSYPLT(SEQ ID NO:6)，且其中抗體具有選自以下的至少ー個特性:I)抑制人c_Kit與人SCF結(jié)合；2)完全拮抗人c-Kit ；3)抑制SCF依賴性的信號傳遞途徑；4)抑制人c-Kit的不依賴SCF的激活；5)誘導(dǎo)人c-Kit內(nèi)化；6)誘導(dǎo)人c-Kit降解；7)體外抑制腫瘤細(xì)胞生長；8)體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長；和9)以小于約2x10—、的Kd與人c-Kit的E⑶結(jié)合。優(yōu)選地，這類抗體具有選自I)至9)的至少2個特性。更優(yōu)選地，這類抗體具有選自I)至9)的至少3個特性。甚至更優(yōu)選地，這類抗體具有選自I)至9)的至少4個特性。甚至更優(yōu)選地，這類抗體具有選自I)至9)的至少5個特性。最優(yōu)選地，這類抗體具有特性I)至9)。
[0033]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體，由SPR在25°C確定的，所述抗體以小于約SxKTwM,優(yōu)選在約2x10,11和約2x10_12M之間，更優(yōu)選在約IOOpM和約5pM之間，甚至更優(yōu)選在約IOOpM和約IOpM之間，甚至更優(yōu)選在約75pM和約25pM之間，甚至更優(yōu)選在約75pM和約50pM之間，或最優(yōu)選在約70pM和約60pM之間的Kd特異性結(jié)合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶。
[0034]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶，其中抗體與c-Kit的E⑶的結(jié)合誘導(dǎo)c-Kit內(nèi)化。優(yōu)選地，在基本如下文實施例6所述的c-Kit內(nèi)化的體外測定中，通過FACS確定，在用約I U g/ml所述抗體在37°C處理腫瘤細(xì)胞約I小時后，抗體與c-Kit受體的ECD的結(jié)合誘導(dǎo)至少50%的在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的c-Kit內(nèi)化。更優(yōu)選地，在基本如下文實施例6所述的c-Kit內(nèi)化的體外測定中，通過FACS確定，在用約I y g/ml所述抗體在37°C處理腫瘤細(xì)胞約6小時后，抗體與c-Kit受體的E⑶結(jié)合誘導(dǎo)至少75%的在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的c-Kit內(nèi)化。
[0035]在一些實施方案中， 本發(fā)明提供了抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的ECD，其中抗體與c-Kit的ECD的結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞膜結(jié)合的c-Kit的降解。優(yōu)選地,在基本如下文實施例7所述的c-Kit降解的體外測定中確定，在用約100ng/ml所述抗體在37°C處理腫瘤細(xì)胞約12小時后,抗體與c-Kit的E⑶的結(jié)合誘導(dǎo)至少50%的由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞膜結(jié)合的c-Kit的降解。更優(yōu)選地，在基本如下文實施例7所述的c-Kit降解的體外測定中確定,在用約100ng/ml所述抗體在37°C處理腫瘤細(xì)胞約24小時后，抗體與c-Kit的E⑶的結(jié)合誘導(dǎo)至少75%的由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞膜結(jié)合的c-Kit的降解。
[0036]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的ECD，其中在基于腫瘤細(xì)胞的體外測定中，抗體與c-Kit的ECD的結(jié)合抑制SCF誘導(dǎo)的c-Kit和/或MAPK磷酸化。優(yōu)選地，在基于腫瘤細(xì)胞的體外測定中，c-Kit抗體抑制SCF誘導(dǎo)的c-Kit和/或MAPK磷酸化，其IC5tl小于約InM，更優(yōu)選在約InM和約IpM之間，甚至更優(yōu)選在約500pM和約5pM之間，甚至更優(yōu)選在約500pM和約IOpM之間，甚至更優(yōu)選在約500pM和約IOOpM之間，甚至更優(yōu)選在約500pM和約250pM之間，或最優(yōu)選約300pM。
[0037]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的ECD，其中，在基本如下文實施例11所述實施的體內(nèi)測定中，抗體與c-Kit的ECD的結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞生長。優(yōu)選的，在基本如下文實施例11所述實施的體內(nèi)測定中，抗體與c-Kit的ECD的結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞生長至少約30%。更優(yōu)選地，在基本如下文實施例11所述實施的體內(nèi)測定中，抗體與c-Kit的ECD的結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞生長至少約50%。甚至更優(yōu)選地，在基本如下文實施例11所述實施的體內(nèi)測定中，抗體與c-Kit的ECD的結(jié)合抑制白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、尤文氏肉瘤、腎癌和/或神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞生長至少約30%，或者甚至更優(yōu)選至少約60%。
[0038]在ー個方面，本發(fā)明提供了治療與增加的配體依賴性或配體非依賴性C-Kit活性相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括向需要這類治療的人施用治療有效量的抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID NO:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的ECD，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含CDRHl、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3 氨基酸序列，其中 CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQID NO: 2)，CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:4)，CDRL2 是 DASSLES (SEQ ID NO:5)并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)。在ー個實施方案中，所述病癥是癌癥。
[0039]“病癥”或“疾病”是可受益于本發(fā)明的抗體或方法治療的任何病況。這包括慢性和急性病癥或疾病，所述病癥或疾病包括使人易于發(fā)生所討論的病癥的那些病理學(xué)病況。例如，待用本發(fā)明的抗體治療的病癥包括惡性和良性腫瘤；癌、白血病、胚細(xì)胞瘤和肉瘤，包括但不限于白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。優(yōu)選地，待用本發(fā)明的抗體治療的病癥包括c-Kit依賴性惡性和良性腫瘤；c-Kit依賴性癌、白血病、胚細(xì)胞瘤和肉瘤，包括但不限于c-Kit依賴性白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0040]本發(fā)明的另ー個方面涉及在人中治療癌癥的方法，包括向所述需要這類治療的所述人施用有效量的本發(fā)明的c-Kit抗體，其中癌癥選自白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。優(yōu)選地，癌癥是c-Kit依賴性的。
[0041]在ー個方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的C-Kit抗體，和至少ー種可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0042]在ー個方面，本發(fā)明提供了本文描述的C-Kit抗體，其用于療法。
[0043]在ー個方面，本發(fā)明提供了本文描述的任何C-Kit抗體，其用于治療癌癥。
[0044]在ー個方面，本發(fā)明提供了本文描述的任何C-Kit抗體，其用于治療癌癥，其中癌癥選自白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。優(yōu)選地，癌癥是c-Kit依賴性的。
[0045]在其他方面，本發(fā)明提供了本文描述的C-Kit抗體在生產(chǎn)用于治療癌癥、腫瘤和/或細(xì)胞増殖性病癥的藥物中的用途。優(yōu)選地，癌癥是c-Kit依賴性的。
[0046]在ー個方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，所述方法包括施用治療有效量的本文描述的c-Kit抗體與有效量的另ー種治療劑(如抗血管發(fā)生劑、另ー種抗體、化療劑、細(xì)胞毒性劑、免疫抑制劑、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性放射療法、皮質(zhì)類固醇或止吐藥)的組合。例如，本文描述的c-Kit抗體可與ー種或多種不同的抗癌劑和/或抗血管發(fā)生劑組合，用于治療多種腫瘤性或非腫瘤性病況。在多個實施方案中，本發(fā)明的c-Kit抗體可以在開始用ー種或多種其他治療劑(如其他抗癌劑)的治療之前、過程中、幾乎同時或之后施用。優(yōu)選地，至少ー種其他抗癌劑選自伊馬替尼、舒尼替尼、阿糖孢苷(cytarabine) (araC)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine) (DTIC)、順鉬和依托泊苷(etoposide)。
[0047]本發(fā)明的另ー個方面涉及編碼任何上述C-Kit抗體的分離的核酸分子，包含所述核酸分子的表達(dá)載體，和包含所述核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了純化任何上述c-Kit抗體的方法。
[0048]本發(fā)明的另ー個方面涉及抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2), CDRH3是 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3), CDRLl 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:4), CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5)并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)，并且其中抗體的結(jié)合誘導(dǎo)c-Kit內(nèi)化和/或誘導(dǎo)c-Kit的降解和/或降低的c-Kit和/或MAPK的磷酸化。
[0049]本發(fā)明的另ー個方面涉及抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中CDRHl 是 SYWIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYPGDSDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2), CDRH3是 HGRGYNGYEGAFDI(SEQ ID NO:3), CD RLl 是 RASQGISSALA(SEQ ID NO:4), CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5)并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)，并且其中抗體的結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞的體外生長和/或降低腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長。
[0050]本發(fā)明的另ー個方面涉及抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQ ID N0:20中的氨基酸序列組成的人c-Kit的E⑶，所述抗體包含HCVR和LCVR，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和CDRH3氨基酸序列，LCVR包含CDRLl、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其中CDRHl是SYWIG(SEQID NO:1)，CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2)，CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ IDNO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是 DASSLES (SEQ ID NO:5)并且 CDRL3是CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)，并且其中抗體的結(jié)合誘導(dǎo)c_Kit的內(nèi)化和/或降解，和/或降低c-Kit和/或MAPK的磷酸化，抑制腫瘤細(xì)胞的體外生長和/或降低腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長。
[0051]用于轉(zhuǎn)化載體和表達(dá)本發(fā)明的抗體的優(yōu)選的宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例如，NSO細(xì)胞(非分泌型(0)小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、293、SP20和CHO細(xì)胞，和淋巴組織起源的其他細(xì)胞系，如淋巴瘤、骨髄瘤或雜交瘤細(xì)胞?？梢詡溥x地使用其他的真核宿主，如酵母。
[0052]涉及c-Kit抗體吋，“分離的”抗體是已經(jīng)被鑒別并與其天然環(huán)境的組分分開和/或從所述組分中回收的抗體。其天然環(huán)境的污染組分是將干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且包括酶、激素，和其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體將被純化至(I)通過Lowry方法確定的大于以抗體重量計的95%，和最優(yōu)選大于以重量計的99%，(2)利用旋杯測序儀足以獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染，在還原或非還原條件下的SDS-PAGE為均質(zhì)。涉及本發(fā)明的c-Kit抗體時，術(shù)語“分離的”可包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的抗體，因為抗體的天然環(huán)境中的至少ー種組分是不存在的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法分離或純化本發(fā)明的C-Kit抗體，包括通過硫酸銨或硫酸鈉沉淀，再進(jìn)行生理鹽水透析、離子交換層析、親和或免疫親和層析，包括但不限于蛋白-A親和層析、以及凝膠過濾或區(qū)域電泳。
[0053]此外，本發(fā)明提供了含有與控制序列(如表達(dá)序列、啟動子和/或增強子序列)有效連接的前述多核苷酸序列的表達(dá)載體。已研發(fā)了多種用于在原核系統(tǒng)(如細(xì)菌)和真核系統(tǒng)(包括但不限于酵母和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)體系)中有效率合成抗體多肽的表達(dá)載體。本發(fā)明的載體可包含染色體的、非染色體的，和合成的DNA序列的區(qū)段。
[0054]本發(fā)明還提供了含有前述重組載體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的抗體可以在雜交瘤以外的細(xì)胞系中表達(dá)。包含編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的序列的核酸可用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細(xì)胞。[0055]特別優(yōu)選的細(xì)胞系是基于目標(biāo)蛋白的高水平表達(dá)、組成型表達(dá)和來自宿主蛋白質(zhì)的最低污染來選擇的?？捎米鞅磉_(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系是本領(lǐng)域普遍已知的，包括許多永生化的細(xì)胞系，例如但不限于C0S-7細(xì)胞、中華田鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)和其他許多包括淋巴樣起源的細(xì)胞系，如淋巴瘤、骨髄瘤或雜交瘤細(xì)胞。
[0056]本發(fā)明還提供了通過向人施用有效量的本文描述的C-Kit抗體，治療人的腫瘤生長和/或癌癥的方法。根據(jù)本發(fā)明待治療的合適病況涉及表達(dá)人c-Kit的細(xì)胞。盡管不欲受任何特定機制的約束，本方法仍提供了對癌細(xì)胞生長的治療，包括例如，c-Kit依賴性的腫瘤性生長。
[0057]在本發(fā)明的上下文中，“治療”指治療性處理，包括抑制、減慢、減輕或逆轉(zhuǎn)潛在病況或與疾病或病癥相關(guān)的不理想的生理改變的進(jìn)程，改善病況的臨床癥狀，或預(yù)防出現(xiàn)病況的臨床癥狀。有益或理想的臨床結(jié)果包括但不限于減輕癥狀、消除疾病或病癥的程度、穩(wěn)定疾病或病癥(即，其中疾病或病癥不惡化)、延遲或減慢疾病或病癥的進(jìn)展、改善或減輕疾病或病癥，和(部分或完全)免除疾病或病癥，不論是可檢測的或不可檢測的。治療還可意指相比不接受治療時的預(yù)期存活，延長存活。需要治療的是已經(jīng)患病的。在一個實施方案中，本發(fā)明可用作藥物。
[0058]在本發(fā)明的方法中，向有需要的人施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。此外，本發(fā)明的藥物組合物可包括治療有效量的本發(fā)明的c-Kit抗體。“治療有效量”或“有效劑量”指有效實現(xiàn)理想的治療結(jié)果所必需的劑量和時間段的量。治療有效量的抗體可以根據(jù)因素不同，所述因素如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，和抗體或抗體部分引發(fā)個體中理想應(yīng)答的能力。其他因素包括施用、靶位點、患者的生理狀態(tài)、患者是人或動物、施用的其他藥物，和治療是預(yù)防性或治療性的。治療有效量還是抗體或抗體部分的任何毒性或有害效應(yīng)被治療上的有益效應(yīng)超越的量。雖然本文描述的c-Kit抗體對于向人施用是特別有效的，但仍可向其他哺乳動物施用，以及用于治療目的。
[0059]可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最優(yōu)理想的應(yīng)答(例如治療或預(yù)防性應(yīng)答)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法滴定治療劑量，以使得安全性和療效最佳。給藥方案的范圍通常是從單次大丸劑量或連續(xù)灌注，至每天多次施用(例如，每4-6小吋)，或根據(jù)治療醫(yī)師和患者的病況提示。可以由治療患者的醫(yī)生確定給藥量和頻率、然而應(yīng)注意到，本發(fā)明不限于任何特定的劑量。
[0060]本發(fā)明的抗C-Kit抗體可以與抗腫瘤劑組合施用，所述抗腫瘤劑包括但不限于阿糖孢苷(即，araC)、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、順鉬或依托泊苷。
[0061]在本發(fā)明中，可以使用任何合適的方法或途徑以施用本發(fā)明的C-Kit抗體，和任選地，共同施用抗腫瘤劑和/或其他受體的拮抗劑。在本發(fā)明的組合療法中，可以在開始用另ー種活性劑的療法之前、過程中、幾乎同時或之后施用c-Kit抗體。
[0062]當(dāng)用于治療性處理的目的時，優(yōu)選將本發(fā)明的C-Kit抗體配制成藥物組合物。這類藥物組合物及其制備方法是本領(lǐng)域普遍已知的。參見例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy (A.Gennaro 等人編著，第 21 版，Mack Publishing C0., 2005)。
[0063]實施例1:抗人c-Kit的人單克隆抗體
[0064]抗人c-Kit mAb，CK6的⑶R的氨基酸序列顯示在表1中。
[0065]表1
[0066]
【權(quán)利要求】
1.抗體，所述抗體特異性結(jié)合由如SEQID NO:20中的氨基酸序列組成的人C-Kit的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)，所述抗體包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中HCVR包含⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3氨基酸序列，并且LCVR包含⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3氨基酸序列，其中 CDRHl 是 SYffIG(SEQ ID NO:1), CDRH2 是 IIYP⑶SDTRYSPSFQG(SEQ ID NO:2),CDRH3 是 HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO:3)，CDRLl 是 RASQGISSALA (SEQ ID NO:4)，CDRL2 是DASSLES (SEQ ID NO:5),并且 CDRL3 是 CQQFNSYPLT (SEQ ID NO:6)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中LCVR氨基酸序列是SEQID NO: 13，并且HCVR氨基酸序列是 SEQ ID NO:7o
3.權(quán)利要求1-2中任一項的抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:9并且輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:150
4.權(quán)利要求1-3中任一項的抗體，所述抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:9并且每條輕鏈氨基酸序列是SEQ ID Ν0:15。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的抗體的抗原結(jié)合片段。
6.藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-5中任一項的抗體，和至少一種可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
7.權(quán)利要求1-5中任一項的抗體，所述抗體用于療法。
8.權(quán)利要求1-5中任一項的抗體，所述抗體用于治療癌癥。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中癌癥選自由白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、尤文氏肉瘤、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組成的組。`
10.權(quán)利要求1-9中任一項的抗體，其中抗體與另一種抗癌劑組合施用。
11.治療有需要的人的癌癥的方法，所述方法包括向所述人施用有效量的權(quán)利要求1-5中任一項的抗體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中癌癥選自由白血病、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、GIST、尤文氏肉瘤、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤組成的組。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中抗體與另一種抗癌劑組合施用，所述另一種抗癌劑選自由伊馬替尼、舒尼替尼、阿糖孢苷(araC)、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、順鉬和依托泊苷組成的組。
【文檔編號】C07K16/28GK103533960SQ201280022747
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月12日
【發(fā)明者】M·艾瑪圖利, L·A·布里恩（尼布里南）, K·帕茲 申請人:英克隆有限責(zé)任公司