專利名稱：一種從沙蜇刺絲囊毒素內(nèi)分離溶血毒素蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，具體的說是一種從沙蜇(Stomolophus meleagris L. Agassiz)刺絲囊細胞毒素中分離純化溶血毒素蛋白的方法。
背景技術：
水母(jellyfish)是一種膠質(zhì)狀的浮游動物，主要包括四大類群刺胞動物門的水螅水母類、管水母類、缽水母類以及櫛水母門的櫛水母類。水母種類繁多，分布廣泛， 世界上已記錄的水母種類大約有1000種左右，其中我國海域已知的約有400種。我國是海岸線非常長的國家之一，從北到南地跨寒溫帶、溫帶、亞熱帶和熱帶，而在我國的沿海地區(qū)幾乎均有大量水母分布，其中以沙蜇數(shù)量尤為豐富。沙蜇(Stomolophus meleagris L. Agassiz)，是大型缽水母，傘徑180-980mm。隸屬于腔腸動物門(Coelenterata)，缽水母綱(^cyphomedusae)，根口水母目(Rhizostomeae), 口冠水母科(Stomolophidea)，口冠水母屬(Stomolophus)。近年來，水母經(jīng)常暴發(fā)，造成眾多游泳者被蜇傷，輕者皮膚出現(xiàn)皮疹、 紅腫、瘙癢，令被蜇傷者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能夠給人們帶來如此大的危害，最主要的原因是存在于水母觸手上的刺絲囊細胞內(nèi)含有大量的水母毒素。 水母毒素主要是蛋白類物質(zhì)，其中包含多種具有不同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、心臟血管毒性、肝臟毒性等，而水母毒素作為一類結(jié)構新穎的蛋白，為開發(fā)新型的海洋藥物提供了重要的先導化合物。
但是，到目前為止對水母毒素的研究主要集中在水母粗毒方面，其主要原因有以下幾方面第一，水母粗毒素中含有許多種蛋白組分，其中某些組分之間的性質(zhì)(如分子量、帶電荷數(shù)、疏水性等)非常相近，這就給水母毒素的分離純化帶來了很大的麻煩；第二， 水母毒素是蛋白類物質(zhì)，具有熱敏感性，容易受到溫度等環(huán)境因素的影響而致使其活性降低甚至喪失，這就造成在分離純化過程中很難保持其活性。第三，水母種類的不同，其生理結(jié)構以及體內(nèi)所含的毒素成分和活性也存在較大的差異，這就致使不同種類水母毒素的分離純化工作難以直接效仿，只能通過繁雜的實驗摸索才能獲得。所以，水母毒素的分離純化工作具有很大的難度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從沙蜇刺絲囊毒素內(nèi)分離溶血毒素蛋白的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為
一種從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白的方法，
1)將處理后的沙蜇刺絲囊細胞上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)含DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，采用洗脫液以UmLmirT1流速進行純化分離，收集洗脫液在低溫下用3 漲的超濾管進行濃縮，待用；所述洗脫液為含不同濃度NaCl的磷酸緩沖液，NaCl 濃度分別為0,0. 1,0. 2,0. 3和2M ；收集采用含0. 2M NaCl的磷酸緩沖液洗脫下的組分；
2)將上述所得洗脫組分經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)凝膠色譜柱SuperdeUOO采用0. 15M NaCl，10 50mM，pH7. OPBS緩沖液以0. 2 1. OmLmirT1流速進行分離純化，收集洗脫體積處于60 SOmL的洗脫液，而后在2 6°C下用3 漲的超濾管進行濃縮，濃縮后即得到從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白。
所述處理后的沙蜇刺絲囊細胞上清液將沙蜇刺絲囊細胞加入預冷緩沖液中破碎，破碎后2 6°C離心，收集上清液于2 6°C下用磷酸緩沖液透析過夜，然后低溫離心， 收集上清液，待用。
所述沙蜇刺絲囊細胞將置于-80 -20°c低溫的沙蜇觸手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的標準分樣篩濾去觸手殘片，而后在2 6°C下10000 15000g 離心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷凍干燥，待用。
所述沙蜇刺絲囊細胞加入pH7. 0，濃度10 30mM的2 6°C下預冷磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200 400kw下破碎20 60min中，工作/間隙為k/30s ；所述收集上清液于2 6°C下用pH7. 0，濃度10 30mM磷酸緩沖液透析過夜。
所述采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱進行分離純化，其中洗脫液為含不同濃度NaCl的磷酸緩沖液，即洗脫液為OM NaCl的pH7. 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、0. IM NaCl 的 ρΗ7· 0，濃度 10 30mM 的磷酸緩沖液(PBS)、0· 2M NaCl 的 ρΗ7· 0， 濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、0. 3M NaCl的pH7. 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液 (PBS)和2M NaCl的ρΗ7· 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)。
所述微孔濾膜過濾為采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾。
本發(fā)明的優(yōu)點
1.本發(fā)明從沙蜇毒素中分離純化溶血毒素蛋白的方法，為水母毒素蛋白的純化提供了方法指導。
2.本發(fā)明采用陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow和凝膠過濾樹脂 SuperdeX200分離溶血毒素蛋白，具有流速快、分辨率高、產(chǎn)率高的特點，而且分離步驟少， 只經(jīng)過兩步柱層析分離就能夠得到較純的溶血毒素蛋白，有效地縮短了分離時間，減少了溶血毒素蛋白的活性損失。


圖1為本發(fā)明實施例提供的陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow分離沙蜇毒素的分步洗脫層析圖。
圖2本發(fā)明實施例提供的凝膠過濾樹脂SuperdeX200分離上一步中溶血組分的洗脫層析圖。
圖3分離到的溶血蛋白的非變性電泳圖片。
圖4分離到的溶血蛋白的溶血梯度圖具體實施例
實施例1
1)沙蜇毒素刺絲囊細胞的制備將Ikg冰凍的沙蜇觸手于2°C下自溶過夜后，用濾篩過濾去除沙蜇觸手殘片，收集上清液倒掉。然后1000g，2°C下冷凍高速離心5min并收集下層沉淀，用生理鹽水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于4°C反復洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2)沙蜇毒素的提取稱取沙蜇刺絲囊細胞5mg，加入20mL pH7. 0，IOmM在2°C下預冷的磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴中用超聲波功率為200kw下破碎20min中，工作/間隙為5s/30s。然后2°C, IOOOOg離心5min待用。
3)陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow分離沙蜇毒素
①上樣前樣品的預處理取上述提取到的沙蜇毒素于2。C pH7. 0，IOmM磷酸緩沖液中透析過夜，然后2°C下IOOOOg離心5min，取上清，用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱，分離時采用分步洗脫，流速為ImLmirT1，洗脫液分別為0、0. 1、0. 2、0. 3和2M NaCl的pH7.0，濃度IOmM的磷酸緩沖液(PBS)，然后收集溶血組分即收集0. 2M NaCl的洗脫液(參見圖1)。
4)凝膠過濾交換樹脂SuperdeX200分離上一步中溶血組分
①上樣前樣品的預處理將上步分離得到的溶血組分在2°C用I超濾管濃縮后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上凝膠過濾柱SuperdeX200，洗脫液為 PH7. 0，IOmM PBS,流速為0. ZmLmirT1，收集洗脫體積為60_80mL的洗脫液，2°C下用I的超濾管進行濃縮(參見圖2)。并且利用標準蛋白Blue deXtran2000 (葡聚糖2000, 2000kDa)， Ferritin hors (馬脾鐵蛋白，450kDa)，Catalase bovine (牛過氧化氫酶，240kDa)， Aldolase rabbit (兔酸縮醇，160kDa) ,Albumin egg(卵清蛋白，45kDa) ,Chymotrypsinogen A (糜蛋白酶原，25kDa) Cytochrome C (細胞色素c，12. 4kDa)進行分子量校正，結(jié)果顯示該溶血毒素蛋白分子量約為450kDa。(參見圖2)
5) Native-PAGE檢測溶血毒素蛋白純度將步驟4)分離到的DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱溶血洗脫峰進行Native-PAGE電泳檢測其純度，具體如下利用4%濃縮膠和7. 5%分離膠以及Tris-Gly電泳緩沖液(不含SDS)在4°C進行電泳。其中濃縮膠， 分離膠中也均不含有SDS，上樣緩沖液中不含有SDS和DTT或β-巰基乙醇等還原劑。電泳結(jié)束后利用銀染法對膠進行染色，結(jié)果顯示該蛋白的純度在90%左右。(參見圖3)
6)溶血活性的檢測將健康雞的新鮮血液用等滲液(0. 145Μ NaCl 20mMpH 7. 4PBS)稀釋10倍后，IOOOg離心15min，棄上清，然后重復三次，收集底部紅細胞并用等滲液稀釋至0.05%紅細胞懸浮液待用。分別取100 μ L步驟4)洗脫峰濃縮液加入到 0. 5mL0. 05%雞血紅細胞懸浮液中，用等滲液稀釋至終體積為5mL，37°C下反應30min，反應結(jié)束后IOOOg離心15min，取上清液于415nm處測定吸光度，以未加毒素組為空白對照，以直接用水稀釋0. 5mL0. 05%雞血紅細胞懸浮液至5ml為100%溶血的陽性對照，實驗結(jié)果顯示該溶血蛋白的半溶血率約為70μ g/mL。(參見圖4)
實施例2
1)沙蜇毒素刺絲囊細胞的制備將^^冰凍的沙蜇觸手于4°C下自溶過夜后，用濾篩過濾去除沙蜇觸手殘片，收集上清液倒掉。然后1200g，4°C下冷凍高速離心15min并收集下層沉淀，用生理鹽水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于4°C反復洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2)沙蜇毒素的提取稱取沙蜇刺絲囊細胞20mg，加入30mL pH7. 0，20mM在2°C下預冷的磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴中用超聲波功率為300kw下破碎40min中，工作/ 間隙為5s/30s。然后2°C，12000g離心IOmin待用。
3)陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow分離沙蜇毒素
①上樣前樣品的預處理取上述提取到的沙蜇毒素于2。C pH7. 0，20mM磷酸緩沖液中透析過夜，然后4°C下12000g離心5min，取上清，用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱，分離時采用分步洗脫，流速為ZmLmirT1，洗脫液為0,0. 1,0. 2,0. 3和2M NaCl的ρΗ7· 0，濃度 20mM的磷酸緩沖液(PBS)，然后收集溶血組分即收集0. 2M NaCl的洗脫液。
4)凝膠過濾交換樹脂SuperdeX200分離上一步中溶血組分
①上樣前樣品的預處理將上步分離得到的溶血組分在4°C用漲超濾管濃縮后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上凝膠過濾柱SuperdeX200，洗脫液為 PH7. 0，20mM PBS,流速為0. SmLmin"1,收集洗脫體積為60_80mL的洗脫液，4°C下用漲的超濾管進行濃縮。并且利用標準蛋白Blue dextran2000(葡聚糖2000，2000kDa)，F(xiàn)erritin hors(馬脾鐵蛋白，450kDa)，Catalase bovine (牛過氧化氫酶，240kDa)，Aldolase rabbit (兔酸縮醇，160kDa)，Albumin egg (卵清蛋白，45kDa)， Chymotrypsinogen A (魔蛋白酶原，25kDa) Cytochrome C (細胞色素c，12. 4kDa)進行分子量校正，結(jié)果顯示該溶血毒素蛋白分子量約為450kDa。(參見圖2)
5)Native-PAGE檢測溶血毒素蛋白純度將步驟4)分離到的DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱溶血洗脫峰進行Native-PAGE電泳檢測其純度，具體如下利用4%濃縮膠和7. 5%分離膠以及Tris-Gly電泳緩沖液(不含SDS)在4°C進行電泳。其中濃縮膠， 分離膠中也均不含有SDS，上樣緩沖液中不含有SDS和DTT或β-巰基乙醇等還原劑。電泳結(jié)束后利用銀染法對膠進行染色，結(jié)果顯示該蛋白的純度在90%左右。(參見圖3)
6)溶血活性的檢測將健康雞的新鮮血液用等滲液(0. 145Μ NaCl 20mMpH 7. 4PBS)稀釋10倍后，IOOOg離心15min，棄上清，然后重復三次，收集底部紅細胞并用等滲液稀釋至0.05%紅細胞懸浮液待用。分別取100 μ L步驟4)洗脫峰濃縮液加入到 0. 5mL0. 05%雞血紅細胞懸浮液中，用等滲液稀釋至終體積為5mL，37°C下反應30min，反應結(jié)束后IOOOg離心15min，取上清液于415nm處測定吸光度，以未加毒素組為空白對照，以直接用水稀釋0. 5mL0. 05%雞血紅細胞懸浮液至5ml為100%溶血的陽性對照，實驗結(jié)果顯示該溶血蛋白的半溶血率約為70μ g/mL。(參見圖4)
實施例3
1)沙蜇毒素刺絲囊細胞的制備將3kg冰凍的沙蜇觸手于6°C下自溶過夜后，用濾篩過濾去除沙蜇觸手殘片，收集上清液倒掉。然后1500g，6°C下冷凍高速離心20min并收集下層沉淀，用生理鹽水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于6°C反復洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2)沙蜇毒素的提取稱取沙蜇刺絲囊細胞30mg，加入40mL pH7. 0，30mM在6°C下預冷的磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴中用超聲波功率為400kw下破碎60min中，工作/ 間隙為5s/30s。然后6°C，15000g離心20min待用。
3)陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow分離沙蜇毒素
①上樣前樣品的預處理取上述提取到的沙蜇毒素于6°CpH7.0，30mM磷酸緩沖液中透析過夜，然后6°C下15000g離心5min，取上清，用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱，分離時采用分步洗脫，流速為SmLmirT1，洗脫液為0,0. 1,0. 2,0. 3和2M NaCl的ρΗ7· 0，濃度 20mM的磷酸緩沖液(PBS)，然后收集溶血組分即收集0. 2M NaCl的洗脫液。
4)凝膠過濾樹脂SuperdeX200分離上一步中溶血組分
①上樣前樣品的預處理將上步分離得到的溶血組分在6°C用IOK超濾管濃縮后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。
②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上凝膠過濾柱SuperdeX200，洗脫液為 pH7. 0,30mM PBS，流速為lmLmirT1，收集洗脫體積為60_80mL的洗脫液，6°C下用IOK的超濾管進行濃縮。并且利用標準蛋白Blue dextran2000(葡聚糖2000，2000kDa)，F(xiàn)erritin hors(馬脾鐵蛋白，450kDa)，Catalase bovine (牛過氧化氫酶，240kDa)，Aldolase rabbit (兔酸縮醇，160kDa)，Albumin egg (卵清蛋白，45kDa)， Chymotrypsinogen A (魔蛋白酶原，25kDa) Cytochrome C (細胞色素c，12. 4kDa)進行分子量校正，結(jié)果顯示該溶血毒素蛋白分子量約為450kDa。(參見圖2)
5)Native-PAGE檢測溶血毒素蛋白純度將步驟4)分離到的DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱溶血洗脫峰進行Native-PAGE電泳檢測其純度，具體如下利用4%濃縮膠和7. 5%分離膠以及Tris-Gly電泳緩沖液(不含SDS)在4°C進行電泳。其中濃縮膠， 分離膠中也均不含有SDS，上樣緩沖液中不含有SDS和DTT或β-巰基乙醇等還原劑。電泳結(jié)束后利用銀染法對膠進行染色，結(jié)果顯示該蛋白的純度在90%左右。(參見圖3)
6)溶血活性的檢測將健康雞的新鮮血液用等滲液(0. 145Μ NaCl 20mMpH 7. 4PBS)稀釋10倍后，IOOOg離心15min，棄上清，然后重復三次，收集底部紅細胞并用等滲液稀釋至0.05%紅細胞懸浮液待用。分別取100 μ L步驟4)洗脫峰濃縮液加入到 0. 5mL0. 05%雞血紅細胞懸浮液中，用等滲液稀釋至終體積為5mL，37°C下反應30min，反應結(jié)束后IOOOg離心15min，取上清液于415nm處測定吸光度，以未加毒素組為空白對照，以直接用水稀釋0. 5mL0. 05%雞血紅細胞懸浮液至5ml為100%溶血的陽性對照，實驗結(jié)果顯示該溶血蛋白的半溶血率約為70 μ g/mL。(參見圖4)
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白的方法，其特征在于1)將處理后的沙蜇刺絲囊細胞上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)含DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱，采用洗脫液以UmLmirT1流速進行純化分離，收集洗脫液在低溫下用3 漲的超濾管進行濃縮，待用；所述洗脫液為含不同濃度NaCl的磷酸緩沖液，NaCl 濃度分別為0,0. 1,0. 2,0. 3和2M ；收集采用含0. 2M NaCl的磷酸緩沖液洗脫下的組分；2)將上述所得洗脫組分經(jīng)微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)凝膠色譜柱SuperdeUOO采用0.15M NaCl，10 50mM，pH7. OPBS緩沖液以0. 2 1. OmLmirT1流速進行分離純化，收集洗脫體積處于60 SOmL的洗脫液，而后在2 6°C下用3 漲的超濾管進行濃縮，濃縮后即得到從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白。
2.按權利要求1所述的從沙蜇刺絲囊毒素內(nèi)分離溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述處理后的沙蜇刺絲囊細胞上清液將沙蜇刺絲囊細胞加入預冷緩沖液中破碎，破碎后 2 6°C離心，收集上清液于2 6°C下用磷酸緩沖液透析過夜，然后低溫離心，收集上清液， 待用。
3.按權利要求2所述的從沙蜇刺絲囊毒素內(nèi)分離溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述沙蜇刺絲囊細胞將置于-80 _20°C低溫的沙蜇觸手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的標準分樣篩濾去觸手殘片，而后在2 6°C下10000 15000g離心5 20min,收集下部沉淀，2 6°C冷凍干燥，待用。
4.按權利要求2所述的從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述沙蜇刺絲囊細胞加入PH7. 0，濃度10 30mM的2 6°C下預冷磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200 400kw下破碎20 60min中，工作/間隙為k/30s ； 所述收集上清液于2 6°C下用pH7. 0，濃度10 30mM磷酸緩沖液透析過夜。
5.按權利要求1所述的從沙蜇刺絲囊毒素內(nèi)分離溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱進行分離純化，其中洗脫液為含不同濃度NaCl的磷酸緩沖液，即洗脫液為OMNaCl的pH7. 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、 0. IM NaCl的ρΗ7· 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、0· 2M NaCl的ρΗ7· 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、0· 3M NaCl的ρΗ7· 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)和2M NaCl的ρΗ7· 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)。
6.按權利要求1所述的從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白的方法，其特征在于 所述微孔濾膜過濾為采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物技術領域，具體的說是一種分離純化沙蜇毒素內(nèi)溶血毒素蛋白的方法。其分離方法如下沙蜇刺絲囊細胞經(jīng)超聲破碎提取得到水母粗毒素，透析除鹽后先后依次經(jīng)過陰離子和凝膠過濾色譜層析分離純化，最終得到一種具有溶血活性的水母毒素蛋白，并且測定其半溶血率約為70μg/mL，分子量約為450kDa。本發(fā)明具快速、簡便的特點，為獲得沙蜇毒素溶血毒素蛋白提供了重要的方法指導。
文檔編號C07K1/34GK102516380SQ20111041495
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權日2011年12月13日
發(fā)明者于華華, 劉松, 孟祥濤, 崔金會, 李克成, 李冰, 李榮鋒, 李鵬程, 秦玉坤, 邢榮娥 申請人:中國科學院海洋研究所