專利名稱：：有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗體，尤其是涉及一種具有高特異性和靈敏度的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：目前，有害赤潮藻的抗體制備已有報(bào)道。亓海剛等(亓海剛，米鐵柱，辛澤毓，等.赤潮異彎藻抗體的制備及酶聯(lián)免疫檢測方法的建立[J].海洋學(xué)報(bào)，2006，28(5):167-172)報(bào)道了制備赤潮異彎藻抗體。向軍儉等(向軍儉，凌欽婕，呂頌輝，等.四種赤潮藻多克隆抗體的制備及特異性分析[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(5):700-704)制備了四種赤潮藻的抗體血清及赤潮藻的單克隆抗體。向軍儉等(向軍儉，朱小兵，呂頌輝，等.五種赤潮藻單克隆抗體的制備[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(3):103-108)還制備了五種赤潮藻單克隆抗體。但是涉及有害赤潮生物細(xì)胞表面抗體制備的相關(guān)技術(shù)鮮有報(bào)道，并且在有害赤潮生物細(xì)胞表面抗體制備過程中經(jīng)常被細(xì)胞內(nèi)蛋白污染，很難獲得特異型高的抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的有害赤潮生物細(xì)胞表面抗體制備過程中容易被細(xì)胞內(nèi)蛋白污染，很難獲得特異型高的抗體等問題，提供一種有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體及其制備方法。本發(fā)明所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體為機(jī)體在赤潮藻表面抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。本發(fā)明所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法包括以下步驟-1)制備抗原抗原是一種能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)，用多聚甲醛分別固定東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞表面蛋白，然后用PBS洗滌藻細(xì)胞，得不被胞內(nèi)蛋白污染的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原；2)注射抗原將東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原與完全福式佐劑混合，將混合液注射入43)強(qiáng)化注射注射抗原后再強(qiáng)化注射，強(qiáng)化注射時(shí)東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原與不完全福式佐劑混合，其它操作與步驟2相同；4)檢測抗體效價(jià)于收集抗體血清之前的38天收集新西蘭白兔耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況；5)收集抗體血清最后一次注射后的第35天收集實(shí)驗(yàn)兔的全血液，靜置，離心，收集血清后分裝，貯存。按質(zhì)量百分比，多聚甲醛的濃度最好為0.5%。用PBS洗滌藻細(xì)胞最好至少2次?？乖且环N能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等。按體積比，東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原完全福式佐劑最好為1:1，所述新西蘭白兔最好是年齡為36個(gè)月的新西蘭白兔；所述注射可采用皮下注射，注射的部位最好為腋窩與腹股溝，注射的量最好每只兔子每次注入的藻個(gè)體數(shù)分別為1.0xl(^個(gè)東海原甲藻和2.0><106個(gè)亞歷山大藻。強(qiáng)化注射最好24次，每次強(qiáng)化注射的間隔時(shí)間為510天(以初次注射為第0天)。檢測抗體產(chǎn)生情況可采用酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)檢測。收集實(shí)驗(yàn)兔的全血液可采用頸部動脈取血的方法，靜置的時(shí)間最好為30min2h。本發(fā)明采用0.5%的多聚甲醛分別固定東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞表面蛋白，然后用PBS洗滌藻細(xì)胞，可以得到不被胞內(nèi)蛋白污染的抗原。東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞膜會破碎，細(xì)胞內(nèi)的蛋白溢出，并隨著PBS洗脫掉，細(xì)胞內(nèi)的蛋白不會作為抗原而產(chǎn)生抗體，從而不會污染細(xì)胞表面抗原產(chǎn)生的抗體。采用PBS緩沖液洗漆抗原，可以使得細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白洗滌出來，包括一些毒素等。這是因?yàn)樵寮?xì)胞洗過多聚甲醛固定后，會導(dǎo)致藻細(xì)胞的質(zhì)膜部分穿孔，從而使得細(xì)胞內(nèi)的蛋白跑出。PBS的洗滌過程不會洗脫掉細(xì)胞表面蛋白，因?yàn)檫@些蛋白經(jīng)過多聚甲醛的固定，對蛋白質(zhì)交聯(lián)從而起到固定作用，保持細(xì)胞表面蛋白穩(wěn)定、形態(tài)結(jié)構(gòu)完好。PBS洗滌抗原的步驟是非常重要的，沒有洗滌的抗原會因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的蛋白在免疫過程中形成抗體，從而會引起后面細(xì)胞表面蛋白的交叉反應(yīng)。本發(fā)明方法的有益效果是，用多聚甲醛固定蛋白質(zhì)的同時(shí)，使細(xì)胞表面各成分交聯(lián)，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)度，并且用PBS很容易的洗滌除去胞內(nèi)蛋白及其他污染，制備了無交叉反應(yīng)的高特異性有害赤潮藻表面抗體。對于藻類赤潮，利用該抗體可以迅速的檢測相對應(yīng)的赤潮藻種，檢測極限可以達(dá)到十幾個(gè)細(xì)胞。圖l是東海原甲藻抗體免疫熒光識別細(xì)胞表面蛋白圖。在圖1中，A、B、C是東海原甲藻全細(xì)胞、細(xì)胞殼壁、細(xì)胞質(zhì)體免疫熒光圖，D、E、F是東海原甲藻全細(xì)胞、細(xì)胞殼壁、細(xì)胞質(zhì)體明場圖；標(biāo)尺為2tim。圖2是鏈狀亞歷山大藻抗體免疫熒光識別細(xì)胞表面蛋白圖。在圖2中，G、H、I是鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞、細(xì)胞殼壁、細(xì)胞質(zhì)體免疫熒光，J、K、F是鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞、細(xì)胞殼壁、細(xì)胞質(zhì)體明場圖；標(biāo)尺為4nm。圖3是東海原甲藻抗體免疫印跡識別細(xì)胞表面蛋白圖。在圖3中，A是鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞表面蛋白銀染圖，B是鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞表面蛋白免疫印跡圖。圖4是鏈狀亞歷山大藻抗體免疫印跡識別細(xì)胞表面蛋白圖。在圖4中，C是東海原甲藻細(xì)胞殼表面蛋白銀染圖，D是東海原甲藻細(xì)胞表面蛋白免疫印跡圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明方法采用0.5%的多聚甲醛分別固定東海原甲藻(尸raroce欣"附A"g/^e"5e)和鏈狀亞歷山大藻C4/m^n'鵬c她"e/to)細(xì)胞表面蛋白，細(xì)胞用0.5%多聚甲醛固定2h或4。C過夜后，以10,000g離心力收集藻液，去除固定液后，用PBS緩沖液洗滌3次，然后將藻液懸浮于PBS緩沖液(磷酸緩沖液)中。將制備的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原與等體積的完全福式佐劑完全混合。然后將混合液注射入選取的年齡為36個(gè)月的新西蘭白兔內(nèi)。注射采用皮下注射，注射點(diǎn)分別為腋窩與腹股溝。每只兔子每次注入的藻個(gè)體數(shù)分別為1.0x107個(gè)東海原甲藻和2.0x106個(gè)亞歷山大藻。強(qiáng)化注射時(shí)間分別是在第14、21、49天(以初次注射為第0天)。強(qiáng)化注射時(shí)全細(xì)胞抗原與不完全福式佐劑混合，其它操作與上相同。于第35天收集兔子耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況。第59天，采用頸部動脈取血的方法收集實(shí)驗(yàn)兔的全血液。兔全血液收集后于室溫靜置30min2h后離心，收集血清后分裝、貯存于一20。C冰箱中。東海原甲藻抗體與其它藻種的免疫熒光交叉反應(yīng)結(jié)果參見表1，鏈狀亞歷山大藻抗體與其它藻種的免疫熒光交叉反應(yīng)結(jié)果參見表2。表1和表2中免疫熒光標(biāo)記強(qiáng)度"3+"代表強(qiáng)標(biāo)記，"+，，代表低標(biāo)記，"-"代表無標(biāo)記，表1和2中沒有中等標(biāo)記。6表l藻種名稱稀釋度i:畫E&慮麵CCMPPfrfe對i蹦附March，1998HK鵬'w"譲HKi附/owwDYW爿.efl敏e/to爿.柳.w幽附C力/,C&ae阮emssp+++3+3+7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體，其特征在于為機(jī)體在赤潮藻表面抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備抗原抗原是一種能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)，用多聚甲醛分別固定東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞表面蛋白，然后用PBS洗滌藻細(xì)胞，得不被胞內(nèi)蛋白污染的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原；2)注射抗原-將東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原與完全福式佐劑混合，將混合液注射入新西蘭白兔內(nèi)3)強(qiáng)化注射注射抗原后再強(qiáng)化注射，強(qiáng)化注射時(shí)東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原與不完全福式佐劑混合，其它操作與步驟2)相同；4)檢測抗體效價(jià)于收集抗體血清之前的38天收集新西蘭白兔耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況；5)收集抗體血清最后一次注射后的第35天收集實(shí)驗(yàn)兔的全血液，靜置，離心，收集血清后分裝，貯存。3.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于按質(zhì)量百分比，多聚甲醛的濃度為0.5%。4.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于用PBS洗滌藻細(xì)胞至少2次。5.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于抗原是一種能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)。6.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于按體積比，東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原完全福式佐劑為1:1。7.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于所述新西蘭白兔是年齡為36個(gè)月的新西蘭白兔。8.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于所述注射采用皮下注射，注射的部位為腋窩與腹股溝，注射的量每只兔子每次注入的藻個(gè)體數(shù)分別為1.(^107個(gè)東海原甲藻和2.0xl()S個(gè)亞歷山大藻。9.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于強(qiáng)化注射24次，每次強(qiáng)化注射的間隔時(shí)間為510天。10.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于檢測抗體產(chǎn)生情況采用酶聯(lián)免疫檢測方法檢測；收集實(shí)驗(yàn)兔的全血液采用頸部動脈取血的方法，靜置的時(shí)間為30min2h。全文摘要有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體及其制備方法，涉及一種抗體。提供一種有害赤潮生物細(xì)胞表面特異性抗體及其制備方法?？贵w為機(jī)體在赤潮藻表面抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。先制備不被胞內(nèi)蛋白污染的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細(xì)胞表面抗原，再與完全福式佐劑混合，將混合液注射入新西蘭白兔內(nèi)，注射抗原后再強(qiáng)化注射；于收集抗體血清之前的3～8天收集新西蘭白兔耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況；最后一次注射后的第3～5天收集實(shí)驗(yàn)兔的全血液，靜置，離心，收集血清后分裝，貯存。對于藻類赤潮，利用該抗體可以迅速的檢測相對應(yīng)的赤潮藻種，檢測極限可以達(dá)到十幾個(gè)細(xì)胞。文檔編號C07K16/14GK101486765SQ200910111080公開日2009年7月22日申請日期2009年2月20日優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日發(fā)明者成李,洪華生,王大志,荔陳,黃旭光申請人:廈門大學(xué)