專利名稱：：使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的重組載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的重組載體、通過由該載體轉(zhuǎn)化所得的蛋白水解酶基因表達、分泌亢進的曲霉、通過被轉(zhuǎn)化的曲霉生產(chǎn)蛋白水解酶的方法等。
背景技術(shù)：
：米曲霉(A/7erg7'〃MSO，flg)和醬油曲霉(J57^g/〃M51，'"e)曲霉在醬油、酒、豆醬等釀造食品的制造中可工業(yè)化應(yīng)用。并且近年來如對其他生物一樣，人們還了解了米曲霉基因組序列(日本特開2005-176602號公報)，對其基因的功能性分析的重要性日益提高。上述曲霉生產(chǎn)、分泌各種酶類(蛋白水解酶、淀粉酶類等)，由于其優(yōu)異的淀粉糖化能力和蛋白質(zhì)分解能力等，廣泛應(yīng)用于釀造食品的制造中。目前，如專利文獻l-3所述，對控制曲霉基因表達的各種轉(zhuǎn)錄因子進行了分析。專利文獻1:日本特開2003-240號公報專利文獻2:日本特開2003-70484號公報專利文獻3:日本特開2003-235584號公報專利文獻4:日本特開2005-176602號公報
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供新的使曲霉蛋白水解酶分泌增多的重組載體；以及通過使用該重組載體，在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)下對所含蛋白質(zhì)物質(zhì)的分解效率提高的曲霉。本發(fā)明涉及以下各種方案的發(fā)明。(1)重組載體，該重組載體含有SEQIDNO.l、2、3或4所示的堿基序列組成的DNA。(2)重組載體，該重組載體含有編碼具備使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白質(zhì)的DNA，上述DNA可與由下述石威基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，所述的i咸基序列是與SEQIDNO.l、2、3或4所示的石威基序列組成的DNA互補的石威基序列。(3)重組載體，該重組載體含有編碼具備使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白質(zhì)的DNA，上述DNA由與SEQIDNO.l、2、3或4所示的石威基序列組成的DNA顯示80%或以上的序列同源性的堿基序列組成。(4)曲霉，其特征在于該曲霉被上述l、2或3的重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化，與親抹比較，其蛋白水解酶分泌能力增加。(5)蛋白水解酶的生產(chǎn)方法，其特征在于將上述4的曲霉在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使蛋白水解酶分泌到培養(yǎng)基中，然后從培養(yǎng)基中收集蛋白水解酶。(6)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的制備方法，其特征在于培養(yǎng)上述4的曲霉，將所得培養(yǎng)物與含有蛋白質(zhì)的原料混合，分解原料中的蛋白質(zhì)。(7)調(diào)味液的制備方法，其特征在于培養(yǎng)上述4的曲霉，將所得培養(yǎng)物與含明膠的原料混合，分解原料中的明膠。(8)DNA，該DNA為以下(a)、(b)或(c)的DNA:(a)SEQIDNO.l、2、3或4所示堿基序列組成的DNA;(b)編碼具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能蛋白質(zhì)的所述的堿基序列是與SEQIDNO.l、2、3或4所示的堿基序列組成的DNA互補的石咸基序列；(c)編碼具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能蛋白質(zhì)的DNA，上述DNA由與(a)的堿基序列的DNA顯示80%或以上的序列同源性的石威基序列組成。(9)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為以下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由SEQIDNO.l、2、3或4所示堿基序列組成的DNA編碼的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)的氨基酸序列中通過使一個或多個氨基酸缺失、置換或附加所得的氨基酸序列組成的、具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的活性的蛋白質(zhì)。發(fā)明效果通過使用本發(fā)明的重組載體，可以使曲霉的蛋白水解酶分泌增多。通過使用由該重組載體轉(zhuǎn)化的曲霉，可以使在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中含有蛋白質(zhì)的物質(zhì)的分解效率提高。附圖簡述圖1是表示在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)化菌)中，轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒插入到轉(zhuǎn)化體的基因組上的niaD基因區(qū)的、由Southern分析結(jié)果得到的電泳照片。圖2表示對麥麩培養(yǎng)基中的野生林和本發(fā)明的轉(zhuǎn)化林的蛋白水解酶活性的比較結(jié)果。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的重組載體中所含有的SEQIDNO.l、2、3或4所示的堿基序列組成的DNA來自曲霉的基因組，如以下實施例具體所述，根據(jù)米曲霉全部基因組信息(日本特開2005-172206號公報)，依據(jù)同源性檢索、基序檢索、以及已知基因的注解或文獻信息、基序的種類等信息，推定其為編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因的DNA,如實施例所示，通過使用適當(dāng)引物的PCR，可以由曲霉的基因組DNA等中獲得。本發(fā)明中的"SEQIDNO.l、2、3或4所示石威基序列組成的DNA，，中也包含只由編碼氨基酸區(qū)的堿基序列(即只結(jié)合有外顯子部分的堿基序列)組成的cDNA。上述cDNA可以使用根據(jù)本說明書中公開的堿基序列信息制備的適當(dāng)?shù)囊?，以曲霉的mRNA為模板，通過PCR等獲得。本發(fā)明相關(guān)的DNA還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任意方法化學(xué)合成獲得。本發(fā)明的重組載體含有編碼具備使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白質(zhì)的DNA,該DNA可以是與由互補于上述DNA的堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA,也可以由與上述DNA顯示約80%或以上、優(yōu)選約95%或以上的序列同源性的石威基序列組成的DNA。這里，雜交可才艮才居Molecularcloninngthird.ed.(ColdSpringHaeborLab.Press,2001)所記載的方法等、本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法或與其類似的方法進行。使用市售的文庫時，可按照所附使用說明書的方法進行。雜交可才艮才居CurrentprotocolsinMolecularbiology(editedbyErederickM.Ausubel等人.，1987)所記載的方法等、本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法或與其類似的方法進行。使用市售的文庫時，可按照所附使用說明書的方法進行。本說明書中，"嚴(yán)格條件下"可例舉在溫度60。C-68。C下、鈉濃度150-190mM、優(yōu)選600-900mM、pH6-8的條件。如含有與該DNA的全部堿基序列的同源性程度總體平均在約80%或以上，優(yōu)選約95%或以上的堿基序列的DNA等，所述的堿基序列為與含有SEQIDNO.l-SEQIDN0.4表示的》威基序列的DNA互補的堿基序列。堿基序列間的相同性可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的算法、例如Balast確定。因此，本發(fā)明涉及編碼具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的蛋白質(zhì)的DNA，該DNA是含有SEQIDNO.l-SEQIDN0.4所示堿基序列的DNA,與互補于該DNA的堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA，也可以是由與上述DNA顯示約80%或以上、優(yōu)選約95%或以上的序列同源性的石咸基序列組成的DNA;本發(fā)明還涉及由SEQIDNO.l、2、3或4所示的堿基序列的DNA所編碼的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，以及與由這些氨基酸序列組成的、具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的活性的蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)。為了確定兩種堿基序列或氨基酸序列的序列同源性，序列在適宜狀態(tài)下進行前處理。例如，向一種序列中插入缺口(gap)，由此使其與另一序列的比對最佳化。然后對各位點的氨基酸殘基或堿基進行比較。第一序列的某一位點與第二序列對應(yīng)的位點同樣地存在某種氨基酸殘基或堿基時，該序列在該位點為相同。兩種序列的序列同源性是以序列間相同的位點數(shù)占總位點(全部氨基酸或全部石咸基)數(shù)的百分比表示。根據(jù)上述原理，兩種堿基序列或氨基酸序列的序列同源性例如通過Karlin和Altschul算法(Proc.麵.Acad.Sci.USA87:2264-2268、1990和Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877、1993)確定。使用上述算法的BLAST程序或FASTA程序主要是對于所給予的序列，從數(shù)據(jù)庫中檢索顯示高序列同源性的序列來使用。這例如可利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)3占。如上所述，顯示上述堿基序列的序列同源性或所編碼的氨基酸序列的序列同源性的DNA可以以雜交作為指標(biāo)，通過本領(lǐng)域研究人員通常采用的方法、例如通過使用上述BLAST軟件的檢索，從通過基因組堿基序列分析等得到的功能未知的DNA組或公共數(shù)據(jù)庫中容易地發(fā)現(xiàn)。并且本發(fā)明的基因可通過各種公知的突變導(dǎo)入方法獲得。本發(fā)明的重組載體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的適當(dāng)?shù)幕蚬こ虒W(xué)方法，通過將上述DNA與載體連接來制備。載體只要是將上述DNA插入到要轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化的宿主微生物的基因組上適當(dāng)?shù)奈恢?，結(jié)果與親林相比可以使宿主微生物的蛋白水解酶分泌能力增強，則其結(jié)構(gòu)和種類等沒有特別限定。例如可以使用質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、染色體整合型、人工染色體等載體。公知的任意的標(biāo)志基因。標(biāo)志基因例如象URA3、niaD等，可以是與宿主的營養(yǎng)缺陷型互補的基因，或?qū)Π笨ㄇ嗝顾?、卡那霉素或寡霉素等藥物具有抗性的基因等。重組載體優(yōu)選含有可在宿主細(xì)胞中表達本發(fā)明的基因的啟動子及其它調(diào)控序列(例如增強子序列、終止子序列、聚腺普酸化序列等)，進一步優(yōu)選含有用于插入目標(biāo)DNA插入的多克隆。這些重組載體中所含的各要素是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，例如具體可如實施例所示，有米曲霉的淀粉酶基因啟動子、米曲霉的淀粉酶終止子、作為標(biāo)志基因的米曲霉的niaD基因。轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化可通過公知的適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行。例如可以采用使用原生質(zhì)體化后使用聚乙二醇和氯化鈣的方法(Mol.Gen.Genet.，218，99-104(1989))。轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的重組載體的曲霉與親林相比，蛋白水解酶分泌增多。本說明書中，"使蛋白水解酶的分泌增多"或"蛋白水解酶的分泌增加，，其最終結(jié)果(現(xiàn)象)是蛋白水解酶分泌到菌體外的分泌量(分泌性能)增大，其原因、機理例如可能是蛋白水解酶的表達量(生產(chǎn)量)本身增加，以及所生產(chǎn)的該酶向菌體外分泌的量(分泌能力)增加等。并且，如以下實施例所述，這里的"增大"是指可以采用用明膠或偶氮酪蛋白作為蛋白質(zhì)的測定方法，由本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化的菌體培養(yǎng)基中的蛋白水解酶量(活性)與親抹相比顯著增加。因此如以下實施例所述，該載體所含的各序列所編碼的蛋白質(zhì)可預(yù)測為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但并不僅限于具有與蛋白水解酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件結(jié)合、促進該蛋白水解酶的表達的功能，在用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化的曲霉中，其還可以具有促進表達的蛋白水解酶分泌到菌體外的功能。曲霉是曲霉屬的微生物(菌類)的總稱，其代表性的例子除上述已述的米曲霉、醬油曲霉(As;e/^7/^sc/ae)之外，還特別有在食品、釀造領(lǐng)域中使用的菌泡盛曲霉G^/7^"'〃M和黑色曲霉04印wg"/wm'gw)等。另外，使用曲霉以外的在食品、釀造、化學(xué)、醫(yī)療領(lǐng)域中使用的工業(yè)上有用的絲菌等，實質(zhì)上也可以獲得同樣的效果。這些菌的市售商品是購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)等各種7>共保藏纟幾構(gòu)。"蛋白水解酶"也被稱為蛋白酶，是包含主要分解蛋白質(zhì)的蛋白酶、或內(nèi)肽酶、分解成小肽鏈的肽酶等的總稱。將與親林相比蛋白水解酶分泌能力增加的本發(fā)明的曲霉按照本發(fā)明領(lǐng)域人員所公知的任意方法進行培養(yǎng)，可以生產(chǎn)其所分泌的蛋白水解酶。例如，將本發(fā)明的曲霉在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使蛋白水解酶分泌到培養(yǎng)基中，然后由培養(yǎng)基中收集蛋白水解酶。上述生產(chǎn)方法中，培養(yǎng)體系、培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)溫度、時間等培養(yǎng)條件可以以下實施例等作為參考，由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)設(shè)定。根據(jù)本發(fā)明可培養(yǎng)曲霉，將所得培養(yǎng)物與含有蛋白質(zhì)的原料混合，分解原料中的蛋白質(zhì)，由此可制備蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物。在該方法中使用的原料所含的蛋白質(zhì)的種類沒有特別限定，例如有明膠、膠原和麥谷蛋白等。例如含有明膠、膠原和麥谷蛋白等的原料的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物可用作調(diào)味液。特征在于通過重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化，與親抹相比，蛋白水解酶分泌能力增加的本發(fā)明的曲霉的具體例子是COO1、C002、C003和C004，于2005年9月9日保藏在郵政編碼305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所在的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心，保藏號分別為FERMP-20659、FERMP-20660、FERMP-20661、FERMP-20662,然后于2006年8月30日根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約轉(zhuǎn)移保藏，保藏號分別為FERMBP-10668、FERMBP-10669、FERMBP-10670、FERMBP-1067L以下根據(jù)實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于此。實施例1(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的推定和提取)按照以下方法，由米曲霉的全基因組信息(參照日本特開2005-176602號公報)，提取推定為編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的序列。該步驟無需進行詳細(xì)的探討，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可能性的均作為基本的提取對象。(1)提取根據(jù)同源性檢索推定為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的序列將根據(jù)基因自動預(yù)測軟件推定為基因序列的DNA序列從米曲霉的全部基因組信息中全部提取，將這些DNA序列作為自動預(yù)測基因序列(以下稱為"自動預(yù)測基因序列")。測基因產(chǎn)物序列"、)作工為基礎(chǔ)序列，使工用同源性檢索軟件BLAST對已知蛋白質(zhì)的公共數(shù)據(jù)庫(NCBI的非重復(fù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫nr)進行同源性檢索。對同源性檢索得到的序列的功能相關(guān)信息進行整理，對這些序列相關(guān)的基因功能信息進行關(guān)鍵詞檢索，選擇含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相關(guān)的關(guān)鍵詞的自動預(yù)測基因序列。(2)編碼氨基酸序列的DNA序列的^r索(該氨基酸序列被推定為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)相關(guān)的基序)對于自動預(yù)測基因產(chǎn)物序列，使用基序檢索軟件(HMMER)進行基序檢索(Pfam)，選擇編碼被推定包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相關(guān)基序的氨基酸序列的自動預(yù)測基因序列。(3)與已知轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子序列具有同源性的DNA序列的檢索以曲霉或曲霉以外的絲狀菌相關(guān)的已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的氨基酸序列作為問詢序列，使用同源性檢索軟件BLAST對本實驗得到的自動預(yù)測基因產(chǎn)物序列進行同源性檢索。使用同樣的問詢序列，使用BLAST(tblast)對曲霉的基因組重疊群序列進行同源性檢索，由此可以對通過自動預(yù)測未預(yù)測到的基因、或者在自動預(yù)測中以使DNA結(jié)合區(qū)等保守性高的區(qū)域有缺損的形式進行預(yù)測的基因進行檢索。由這些方法，從自動預(yù)測基因序列中提取了共667個候選基因(以下稱為"候選基因")。(候選基因的縮小范圍檢索和基因區(qū)的計算機分析)對于上述提取的被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的候選基因，依次進行基因區(qū)域的推定。在推定之前，根據(jù)相同的已知基因的注解或文獻信息、基序的種類等信息，研究是否適合作為強制表達的分析對象，將只有通過雜合復(fù)合物才能發(fā)揮功能的基因等不適合的基因排除?；騾^(qū)域的推定主要是通過與相同的已知基因比較來進行。與相同的已知基因進行的比較是使用BLAST、FASTA和ALN(Bioinfomatics200016:190-202)進行。如果與已知基因的同源性受限于無法推定5，端，為了進行5，RACE,要準(zhǔn)備同源部分的比對信息。如果預(yù)測的3，末端比原本基因區(qū)域短，則是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的C末端一側(cè)被截短，預(yù)測過長時，則可以認(rèn)為翻譯在原本C末端終止。因此，無法預(yù)測3，末端時，可以根據(jù)同源部分的距離、或相鄰基因的位置關(guān)系等，將自原本的3，末端至足夠的下游的部分作為摻入到強制表達載體中的區(qū)域。通過上述方法，由在前項提取時與已知基因的同源性高的依次進行基因區(qū)域的推定。對于全長均為計算機推定的基因和部分通過5，RACE使5，末端明確的基因共300個基因，得到了的用于制備強制表達抹的預(yù)測序列。實施例2(表達用質(zhì)粒的制備)作為用于使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因在曲霉內(nèi)表達的表達質(zhì)粒，構(gòu)建了質(zhì)粒pAPTLN。質(zhì)粒pAPTLN中，含有米曲霉淀粉酶基因啟動子和構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子、用于插入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的多克隆位點作為表達單元，此外還含有米曲霉niaD基因的質(zhì)粒作為標(biāo)志基因。挖取5x105個在瓊脂平板培養(yǎng)基上生長的構(gòu)巢曲霉IAM2130抹孢子，使其懸浮于300ial加入到無菌樣i量管中的NucleiLysisSolution緩沖液(Promega制備)。向懸浮孢子的纟敖量管中加入1g玻璃珠BZ-06(7X7》林式會社制備)，使用TissueLyser(QIAGEN制備)，以25次/秒處理3分鐘，重復(fù)2次。在65。C下加溫15分鐘后，在室溫下》文置5分鐘。加入1.5ia1RNA酶溶液(IOmg/ml)，在37°C下加溫1小時。加入100ial蛋白沉淀溶液，劇烈振蕩20秒，然后以13,500rpm離心5分鐘。將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另外的微量管中，加入350jul異丙醇，顛倒混合。然后以12,000rpm離心3分鐘。將所得沉淀用70%乙醇洗滌和干燥處理，然后懸浮于100nl的TE緩沖液[10mMTris-HCl(pH7.5),lmMEDTA]，得到基因組DNA溶液。以所得基因組DNA為模板，使用下述引物進行PCR，進行構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子區(qū)域的擴增。5，一gggtagtcgtacccgatgatgaaac—3，(SEQIDNO.5)5，一agcctaggccgctgcaggcag—3，(SEQIDNO.6)PCR反應(yīng)是使用TaKaRaLATaq(夕力，」4才抹式會社制造)，使用PTC-200(MJResearch制備)進行。反應(yīng)液的組成如下。(試劑使用量終濃度)TaKaRaLATaq:0.5|u110xLAPCR緩沖液II:5|lU:1x25mMMgCl2:5ja1:2.5mMdNTP混合液8各0.4mM模板DNA(0.5|Lig):1ja1引物1lalx2種類各0.2jnM無菌水28.5Ml合計液量50|nl將50jal上述反應(yīng)液在0.2ml反應(yīng)管中混合，設(shè)置于PPC-200中，通過設(shè)定以下溫度進行PCR。95°C、2分鐘1個循環(huán)95。C30秒、58。C30秒、72。C2分鐘30個循環(huán)72°C3分鐘1個循環(huán)將反應(yīng)液用乙醇沉淀處理，然后將沉淀懸浮于20julTE緩沖液中。再用Pstl消化，然后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，切取目標(biāo)擴增產(chǎn)物。切出的擴增產(chǎn)物用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)進行純化，得到構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子。將質(zhì)粒pUC19用Smal和Pstl處理，然后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)回收約2.7kb的DNA片段，將回收的DNA片段與構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,得到質(zhì)粒pAT,該質(zhì)粒pAT是在pUC19的位于多克隆位點內(nèi)的Smal-Pstl位點插入構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子得到的。將pAT用Smal和HindIII進行消化，用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)，回收含有構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子的DNA片段。將質(zhì)粒pMAR5(Biosci，Biotech.Biochem.,56(10)，1674-1675，1992)用Smal和HindIII消化，然后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)回收除去了argB基因和米曲霉淀粉酶基因終止子的DNA片段。將來自pAT和pMAR5的兩種DNA片段連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,得到含有米曲霉淀粉酶基因啟動子和構(gòu)巢曲霉淀粉酶基因終止子的質(zhì)粒pAPT。將100Ml含有下述兩種合成DNA(各100iuM)的TE緩沖液煮沸5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫，制成多克隆位點接頭。將pAPT用EcoRI和Smal消化，然后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)，回收除去了多克隆位點的DNA片段。將多克隆位點接頭與回收的DNA片段連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,得到質(zhì)粒pAPTL。將質(zhì)粒pST14[(Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104)用HindIII消化，然后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)回收含有米曲霉niaD基因的DNA片段。將回收的含有niaD基因的DNA片段插入到pAPTL的HindIII位點，得到了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因表達用的質(zhì)粒pAPTLN。(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因表達用重組載體的制備)根據(jù)預(yù)測為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的DNA序列，通過PCR獲得各轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因。首先制備米曲霉RIB40的基因組DNA。接著以制備的基因組DNA為模板，參考預(yù)測基因的起始密碼子上游100bp的DNA序列和終止密碼子附近的DNA序列制備兩種引物，通過PCR獲得各轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因。參考起始密碼子上游的DNA序列制備引物時，導(dǎo)入限制酶識別序列，該限制酶識別序列位于pAPTLN的多克隆位點上，且要擴增的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因序列內(nèi)不存在識別序列。擴增的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因用在制備的引物中導(dǎo)入了識別序列的限制酶進行處理，然后插入到pAPTLN的多克隆位點(導(dǎo)入的限制酶位點和Saml位點之間)，制成用于各轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因表達的重組質(zhì)粒載體。以下給出轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因表達用質(zhì)粒載體的一個制備例子。采用上述方法，以由米曲霉RIB40菌林制備的基因組DNA為模板，使用下述引物進行PCR，得到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C001(SEQIDNO.l)。5，一atacaggcattctatcgataaaatgtttcc—3，(SEQIDNO.7)5,—gggctacatctgctgttgtagaagttgc—3，(SEQIDNO.8)PCR反應(yīng)是使用TOYOBOKOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO制備)，使用PPC-200(MJResearch制備)進行。反應(yīng)液的組成如下。(試劑使用量終濃度)KOD誦Plus-DNA聚合酶1jli1KOD-Plus-的10xPCR緩沖液5|i1:1x25mMMgCl2:2ja1:1mM2mMdNTP混合液5|a1:各0.2mM模板DNA(0.2jug):1ju1引物1julx2種類各0.3|aM無菌水34ilU合計液量50jul將50jul上述反應(yīng)液在0.2ml反應(yīng)管中混合，裝于PPC-200中，通過設(shè)定以下溫度進行PCR。94°C、2分鐘1個循環(huán)94。C15秒、58。C30秒、68。C4分鐘30個循環(huán)68°C3分鐘1個循環(huán)將反應(yīng)液進行乙醇沉淀處理，然后將沉淀懸浮于20ial的TE緩沖液[IOmMTris-HCl(pH7.5),1mMEDTA]。再用Clal消化，然后用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳，切取目標(biāo)擴增產(chǎn)物。切取的擴增產(chǎn)物用凝膠純化試劑盒(QIAGEN制備)純化，然后插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Smal位點，得到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C001表達用質(zhì)粒pCOOl。采用同樣方法得到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C002表達用質(zhì)粒pC002、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C003表達用質(zhì)粒pC003、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C004表達用質(zhì)粒pC004。擴增轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C002(SEQIDNO.2)時，使用導(dǎo)入了Nhel識別序列代替Clal的下述兩種引物進行擴增、純化，然后插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Smal位點。5，一tcatacaagctagcaaaatggcggaga—3，(SEQIDNO.9)S'—gggctcgataacttmactcccgtgata—S'(SEQIDNO,10)擴增轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C003(SEQIDN0.3)時，使用導(dǎo)入了Clal和Spel識別序列的下述兩種引物進行擴增、純化，然后插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Spel位點。5,—ccatcgataatattagtatgctgaatga—3,(SEQIDNO.11)5,—ggactagttcaggtctttcgaatgtcagga—3'(SEQIDNO.12)擴增轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因C004(SEQIDNO,4)時，使用導(dǎo)入了Clal和Spel識別序列的下述兩種引物進行擴增、純化，然后插入到pAPTLN的多克隆位點上的Clal-Spel位點。5，一ccatcgataagtaaaaggatgttattagat—3，(SEQIDNO.13)5，—ggactagtttaatccgttctcatggccgaa—3，(SEQIDNO.14)實施例3(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因強制表達曲霉的獲得)將按照Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104記載的方法由RIB326菌抹獲得的niaD缺損菌林用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因表達用質(zhì)粒pCOOl、pC002、pC003、pC004轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法是通過在原生質(zhì)體化后使用聚乙二醇和氯化釣的方法(Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104)進行。使用各5Mg質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化，在極限培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化體，各得到約200個集落。其中，對于每種質(zhì)粒，對15個集落在極限培養(yǎng)基中反復(fù)進行單一分生孢子分離，使轉(zhuǎn)化穩(wěn)定。接著，將各轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因的成熟區(qū)域作為探針，進行DNA分析，由各轉(zhuǎn)化體中選擇以下的菌株轉(zhuǎn)化中使用的質(zhì)粒插入到了轉(zhuǎn)化體的基因組上的niaD基因區(qū)域。將各選擇株命名為C001、C002、C003、C004。DNA分析的結(jié)果如圖1所示。實施例4(曲霉的培養(yǎng)方法和菌體外酶活性的測定)(1)明膠培養(yǎng)基中曲霉的培養(yǎng)方法和與明膠分解相關(guān)的蛋白水解酶活性的測定將各轉(zhuǎn)化體在含有明膠的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，確認(rèn)明膠分解能力。各轉(zhuǎn)化體的明膠分解能力的評價是與明膠分解產(chǎn)生的培養(yǎng)基中的谷氨酸濃度作為對照比較進行。在瓊脂極限培養(yǎng)基上生長的各轉(zhuǎn)化體的孢子用3ml的無菌水挖取，接種于裝入到150ml容量三角燒瓶中的40ml明膠培養(yǎng)基(2%明膠、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4、0.05%KC1、0.001%FeS047H20、0.3%NaCO3、3%麥芽糖，pH6.0)(1x107個孢子/40ml明膠培養(yǎng)基)。在30。C下以150rpm振蕩培養(yǎng)115小時，然后使用弋7廿L-谷氨酸測定試劑盒(Y^廿醬油抹式會社制備)測定培養(yǎng)上清中的谷氨酸量。另外，以上述明膠分解能力為指標(biāo)，測定培養(yǎng)上清中蛋白質(zhì)分解酶活性。作為對照，在每個實驗時將RIB326菌林niaD缺損林用pAPTLN轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所得的niaD+菌抹。在轉(zhuǎn)化體中，被認(rèn)為明膠分解能力最高的C004培養(yǎng)上清中的谷氨酸量和蛋白水解酶活性以相對于對照的相對值表示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)與麥麩培養(yǎng)基中曲霉野生菌抹在培養(yǎng)方法和本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體蛋白水解酶活性方面的比較麥麩將去離子水以5:4的比例混合，在室溫下放置30分鐘，然后以5g分別分注到150ml容量的三角燒瓶中，高壓釜滅菌15分鐘。接著，將預(yù)先用血細(xì)胞計測定了孢子數(shù)的野生米曲霉RIB326菌林或強制表達林的孢子懸浮液接種于麥麩培養(yǎng)基中，1g麥麩培養(yǎng)基中接種5x105個孢子。在30。C下培養(yǎng)4天。培養(yǎng)開始后第24小時和第48小時進行混合，然后靜置至培養(yǎng)終止。酶液如下獲得。向培養(yǎng)結(jié)束后的麥麩培養(yǎng)基中加入50ml去離子水和500jil甲苯，在室溫下振蕩2小時，將懸浮液用No.2濾紙過濾(7卜"、':^^7夕制造)，得到濾液，以此作為酶液。如以下計算式表示，蛋白水解酶活性是以野生林的酶活性為1時按照比率進行比較。酶活性比率=強制表達抹(試樣的吸光度-空白的吸光度)/野生抹)(試樣的吸光度-空白的吸光度)。蛋白水解酶活性測定如下進行。求出試樣和空白的吸光度。向預(yù)先加溫至30。C的2ml底物液(P/。偶氮酪氨酸、0.05M磷酸緩沖液pH7.0)中加入20jlU酵液，混合。接著將其在30°C下反應(yīng)20分鐘，然后加入21111反應(yīng)中止液(10%三氯乙酸)，中止反應(yīng)。在30°C下放置20分鐘，將生成的沉淀用No.5C濾紙過濾，測定濾紙的吸光度(410nm)?？瞻资窃谔砑用敢褐疤砑臃磻?yīng)中止液，進行同樣的揭:作。對野生株與強制表達抹的蛋白水解酶活性進行比較，結(jié)果可以確認(rèn)，C002、COOl、C003顯示為野生抹的3倍的蛋白水解酶活性(圖2)。對于C004,顯示為野生抹的2.2倍的蛋白水解酶活性。由以上結(jié)果表明，用含有COOl、C002、C003、C004的各DNA序列的本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的曲霉相對于曲霉原林，蛋白水解酶分泌顯著增加。在液體培養(yǎng)基的明膠培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基的麥麩培養(yǎng)基中，蛋白水解酶活性分別增大，產(chǎn)業(yè)實用性高。其中，本發(fā)明的COOl、C002、C003、C004的DNA序列如序列表1-4所示(從序列表最初至第101號表示起始密碼子的先頭堿基，由結(jié)束至第101號表示終止密碼子的最終堿基)。C001具有C2H2型鋅指基序，與構(gòu)巢曲霉的steA基因在氨基酸水平顯示81%相同的同源性。有報道稱steA基因在構(gòu)巢曲霉中是作為有性生殖所必須的基因(Vallim等人，MolMicrobiol.36(2):290曙301)。C002具有Zn2-Cys6(霉菌雙核鋅集群(Fungalzincbinuclearcluster))型的鋅指基序，與煙曲霉的編碼推定的C6指狀結(jié)構(gòu)域蛋白的、功能未知的基因在氨基酸水平顯示67%相同的同源性。與C002顯示同源性的基因中，在已經(jīng)報導(dǎo)了其功能并顯示最高同源性的是血紅叢赤殼(A^"n'a/aem^ococca)的與角質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)的naf基因，其同源性在氨基酸水平不過只有31%相同。C003是Zn2-Cys6(霉菌雙核鋅集群(Fungalzincbinuclearcluster))型的zincfinger基序，與煙曲霉的編碼推定的C6指狀結(jié)構(gòu)域蛋白的功能未知的基因(與上述C002中顯示最高同源性的基因為不同的基因)在氨基酸水平顯示55%相同的同源性。在與C002顯示同源性的基因中，在已經(jīng)報導(dǎo)了其功能并顯示最高同源性的是構(gòu)巢曲霉的與硝酸同化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)的nirA基因，其同源性在氨基酸水平上不過只有22%(以上的同源性是根據(jù)BLAST(blastp)，以NCBI的nr數(shù)據(jù)庫為對象顯示同源性檢索結(jié)果)。C004具有C2H2型的鋅指基序，與構(gòu)巢曲霉的amdX基因在氨基酸水平顯示73%相同的同源性。有報道稱，amdX基因在構(gòu)巢曲霉作為編碼乙酰淀粉酶的amdS基因的轉(zhuǎn)錄活化因子(Murphy等人、MolMicrobiol.23(3):591-602，(1997))。因此，這些以往公知的基因中，根據(jù)其基因序列和同源基因的功能，并未顯示通過強制表達可以使蛋白水解酶活性增大。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明在調(diào)味品的食品制造或消化劑等藥品制造、洗滌劑用的蛋白水解酶生產(chǎn)等工業(yè)中極為有用。權(quán)利要求1.重組載體，該重組載體含有SEQIDNO.1、2、3或4所示的堿基序列組成的DNA。全文摘要在調(diào)味品的食品制造或消化劑等藥品制造、洗滌劑用的蛋白水解酶生產(chǎn)等中，可以使固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)下的曲霉的蛋白水解酶活性提高。本發(fā)明提供具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的重組載體，由該載體轉(zhuǎn)化的使蛋白水解酶基因表達、分泌亢進的曲霉，通過轉(zhuǎn)化的曲霉生產(chǎn)蛋白水解酶的方法等。文檔編號C07K14/38GK101273129SQ200680035259公開日2008年9月24日申請日期2006年9月19日優(yōu)先權(quán)日2005年9月26日發(fā)明者伊藤享,佐野元昭,內(nèi)川知美,岡千壽,前田浩,增田力,松島健一朗,海附玄龍,田中昭光,田井中均,町田雅之,畑本修申請人:財團法人野田產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究所;龜甲萬株式會社