專利名稱：：可溶性糖胺聚糖酶及制備和應(yīng)用可溶性糖胺聚糖酶的方法可溶性糖胺聚糖酶及制備和應(yīng)用可溶性糖胺聚糖酶的方法相關(guān)申請的交叉參考本申請是2005年9月27R提交的美國申請系列第11/238,171號的部分繼續(xù)申請，上述申請是2005年2月23日提交的美國申請系列第11/065,716的部分繼續(xù)申請，它們中的每一個(gè)均以其全部并入本文作為參考。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及糖胺聚糖酶(Glycosaminoglycanaseenzymes),包括在中性條件下具有活性(Neutral-Active)的可溶性的透明質(zhì)酸酶糖蛋白(HyaluronidaseGlycoproteins)(sHASEGPs)，以及它們的一部分，尤其是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。更具體地，本發(fā)明涉及化學(xué)修飾、藥物組合物、表達(dá)質(zhì)粒、制造方法和應(yīng)用糖胺聚糖酶(及其結(jié)構(gòu)域和編碼核酸分子)在疾病的治療中對糖胺聚糖進(jìn)行治療修飾的治療方法，以及應(yīng)用糖胺聚糖酶來增加其它分子如注射分子在動(dòng)物體內(nèi)的擴(kuò)散的方法。背景信息糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的復(fù)雜線性多糖。GAGs的特征在于N-取代己糖胺和糖醛酸構(gòu)成的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)(在透明質(zhì)素(hyaluronan，HA)、硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)、軟骨素(C)、硫酸皮膚素(dermatansulfate,DS)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)和肝素(H)的情況下)或者N-取代己糖胺和半乳糖構(gòu)成的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)(在硫酸角質(zhì)素(kemtansulfate,KS)的情況下)。除了HA，所有都以與核心蛋白質(zhì)共價(jià)連接的方式存在。GAGs及其核心蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上被稱為蛋白聚糖(PGs)。透明質(zhì)素(Hyaluronan，HA)在哺乳動(dòng)物中主要被發(fā)現(xiàn)于結(jié)締組織、皮膚、軟骨和滑液。透明質(zhì)素也是眼睛玻璃體的主要成分。在結(jié)締組織中，與透明質(zhì)素結(jié)合的水合水在組織間形成水合基質(zhì)。透明質(zhì)素在與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的生物現(xiàn)象中起到重要作用，所述生物現(xiàn)象包括快速發(fā)育、再生、修復(fù)、胚胎發(fā)生、胚胎發(fā)育、傷口復(fù)原、血管生成和腫瘤發(fā)生(Toole1991CellBiol.Extracell.Matrix,Hay(ed),PlenumP訓(xùn)，NewYork,1384-1386;Bertrandetal.1992Int.J.Cancer52:1-6;Knudsonetal,1993FASEBJ.7:1233-1241)。另外，透明質(zhì)素水平與腫瘤侵襲性有關(guān)(Ozelloetal.1960CancerRes.20:600-604;Takeuchietal.1976,CancerRes.36:2133-2139;Kimataetal.1983CancerRes.43:1347-1354)。HA在許多細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，尤其是在軟結(jié)締組織中。HA被賦予了多種生理功能，諸如在水和血漿蛋白的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中(LaurentTCetal(1992)FASEBJ6:2397-2404)。在增生的細(xì)胞中HA的產(chǎn)量增加，其在有絲分裂中可能起到作用。它還涉及到移動(dòng)(locomotion)和細(xì)胞遷移。HA在細(xì)胞調(diào)控、發(fā)育和分化中似乎起著重要作用(Laurentetal,s叩ra)。HA已被用于臨床醫(yī)學(xué)。它的組織保護(hù)特性和流變學(xué)性能已證實(shí)在眼外科(例如，在白內(nèi)障手術(shù)中保護(hù)眼角膜內(nèi)皮)中是有用的。血清HA是肝病和多種發(fā)炎狀態(tài)例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的征候。HA堆積引起的間質(zhì)水腫可能引起多種器官的功肖淺舌L(Laurentetal，supra)。透明質(zhì)素蛋白相互作用還與細(xì)胞外基質(zhì)("matrix"或"groundsubstance")的結(jié)構(gòu)有關(guān)。透明質(zhì)酸酶是一類通常在中性或酸性條件下具有活性的酶，在動(dòng)物界中隨處可見。透明質(zhì)酸酶的底物特異性和作用機(jī)理有所不同。主要有三類透明質(zhì)酸酶1.哺乳動(dòng)物型透明質(zhì)酸酶(EC3.2丄35)是內(nèi)切-P-N-乙酰己糖胺酶(endo-beta-N-acetylhexosaminidases)，以四糖和六糖作為主要終產(chǎn)物。它們具有水解活性和轉(zhuǎn)糖苷酶活性，并可降解透明質(zhì)素和硫酸軟骨素(CS)，一般是C4-S和C6-S。2.細(xì)菌透明質(zhì)酸酶(EC4.2.99.1)，降解透明質(zhì)素，以及不同程度地降解CS禾口DS。它們是內(nèi)切-P-N-乙酰己糖胺酶(endo-beta-N-acetylhexosaminidases)，通過P消除反應(yīng)來起作用，主要產(chǎn)生二糖終產(chǎn)物。3.來自水蛭、其它寄生蟲和甲殼類的透明質(zhì)酸酶(EC3.2丄36)，是內(nèi)切-P-葡糖苷酸酶(endo-beta-glucuronidases)，通過e1-3鍵的水解產(chǎn)生四糖和六糖終產(chǎn)物。哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶可進(jìn)一步分為兩類中性活性酶和酸性活性酶。在人類基因組中有六種透明質(zhì)酸酶樣基因(hyaluronidase-likegenes):HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，HYAL3尚未顯示出對任何已知的底物具有酶促活性。HYAL4是軟骨素酶，對透明質(zhì)素幾乎沒有活性。HYAL1是原型酸性活性酶(prototypicalacid-activeenzyme)，PH20是原型中性活性酶。酸性活性的透明質(zhì)酸酶，例如HYAL1和HYAL2，一般在中性pH(即，pH7)缺乏催化活性。例如，HYALl在高于pH4.5的體外環(huán)境中幾乎沒有催化活性(FrostetalAnalBiochemistry,1997)。HYAL2是酸性活性酶，其在體外具有非常低的比活性。透明質(zhì)酸酶樣酶還可被表征為，通常通過糖基磷酯酰肌醇錨被固定在質(zhì)膜上的酶，例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2003Apr15;100(8):4580-5,Phelpsetal.,Science1988)，和通常為可溶性的酶，例如人HYAL1(Frostetal,BiochemBiophysResCommun.1997Jul9;236(l):10-5)。但是，物種與物種之間存在著差異例如，牛PH20，非常松散地附于質(zhì)膜上，并沒有通過磷脂酶敏感性錨被錨定(Lalancetteetal，BiolReprod.2001Aug;65(2):628-36.)。牛透明質(zhì)酸酶的這個(gè)獨(dú)特性質(zhì)，使得可溶性牛睪丸透明質(zhì)酸酶可以作為提取物用于臨床應(yīng)用(WydaseTM,Hyalase)。其它PH20種類為脂質(zhì)錨定酶，在不使用去污劑或脂酶的情況下，通常是不可溶的。例如，人PH20通過GPI錨錨定在質(zhì)膜上。嘗試制備不會在多肽中引入脂質(zhì)錨的人PH20DNA構(gòu)建物，但這導(dǎo)致產(chǎn)生了無催化活性的酶或不可溶的酶(ArmingetalEurJBiochem.1997Augl;247(3):810-4)。自然發(fā)生的獼猴精子透明質(zhì)酸酶被發(fā)現(xiàn)有可溶性和膜結(jié)合兩種形式。64kDa膜結(jié)合形式在pH7.0具有酶活性，但54kDa形式只在pH4.0有活性(Cherretal,DevBiol.1996Apr10;175(1):142-53)。因此，PH20的可溶形式在中性條件下通常缺乏酶活性。軟骨素酶(Chondroitinases)被發(fā)現(xiàn)是遍布動(dòng)物界的酶。這些酶通過內(nèi)切糖苷酶反應(yīng)降解糖胺聚糖(glycosaminoglycans)。軟骨素酶的具體例子包括軟骨素酶ABC(源于普通變形菌(Proteusvulgaris);日本專利申請公開第6-153947號，T.Yamagata，H.Saito,O.Habuchi,andS.Suzuki,J.Biol.Chem.，243，1523(1968),S.Suzuki,H.Saito,T.Yamagata,K.Anno,N.Seno,Y.Kawai,andT.Furuhashi，J.Biol.Chem.,243,1543(1968));軟骨素酶AC(源于肝素黃桿菌(Flavobacteriumheparinum);T.Yamagata,H.Saito,O.Habuchi，andS.Suzuki,丄Biol.Chem.,243,1523(1968));軟骨素酶ACII(源于Arthrobacteraurescens;K.Hiyama，andS.Okada，丄Biol.Chem.,250，1824(1975)，K.HiyamaandS.Okada,J.Biochem.(Tokyo),80,1201(1976));透明質(zhì)酸酶ACIII(源于黃桿菌某種Hpl02;HirofumiMiyazono,HiroshiKikuchi,KeiichiYoshida,KiyoshiMorikawa，andKiyochikaTokuyasu,Seikagaku,61,1023(1989));軟骨素酶B(源于肝素黃桿菌；Y.M.MichelacciandC.P.Dietrich,Biochem.Biophys.Res.Commun.,56,973(1974)，Y.M.MichelacciandC.P.Dietrich,Biochem.J.,151,121(1975)，KenichiMaeyama,AkiraTawada，AkikoUeno,andKeiichiYoshida，Seikagaku,57，1189(1985));軟骨素酶C(源于黃桿菌某禾中Hp102;HirofiimiMiyazono,HiroshiKikuchi,KeiichiYoshida,KiyoshiMorikawa,andKiyochikaTokuyasu,Seikagaku,61,1023(1989));等等。糖蛋白是由共價(jià)結(jié)合有一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分的多肽鏈組成的。有兩大類糖蛋白，其具有通過N-糖苷鍵或O-糖苷鍵連接到其組成蛋白的碳水化合物。N-連接和O-連接的聚糖分別通過天冬酰胺-N-乙?；?D-葡糖胺和絲氨酸(蘇氨酸)-N-乙酰基-D-半乳糖胺鍵接附著于多肽上。復(fù)雜N-連接寡糖不含末端甘露糖殘基。它們只含有末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸殘基。雜合寡糖包含末端甘露糖殘基，以及末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸殘基。對于N-連接的糖蛋白，當(dāng)肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成時(shí)，寡糖前體附著到天冬酰胺的氨基基團(tuán)上。寡糖部分隨后通過刪除和添加糖組分的一系列特定的酶來進(jìn)行有序地加工。此加工發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并在通過高爾基器的順面、中間區(qū)室和反面時(shí)繼續(xù)。發(fā)明概述本文提供的是可溶性糖胺聚糖酶，尤其是可溶性中性-活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白家族的成員(本文也稱之為sHASEGPs)，優(yōu)選的成員是人類可溶性中性-活性透明質(zhì)酶糖蛋白，尤其是人類可溶性PH-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白(本文也稱之為rHuPH20s)。本文提供的可溶性中性-活性透明質(zhì)酸酶每個(gè)都是sHASEGP家族成員，它們在本文被表示為sHASEGP?？扇苄酝该髻|(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域及其應(yīng)用也被提供。盡管大量的可溶性糖胺聚糖酶(在本文中有時(shí)被稱為GAG酶)應(yīng)用和用途通過使用rHuPH20作為示例性糖胺聚糖酶(例如，用于促進(jìn)藥理學(xué)試劑和其它試劑在哺乳動(dòng)物體內(nèi)組織中的傳遞)而在本文中闡述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，其它糖胺聚糖酶例如文中描述的那些或本領(lǐng)域己知的其它糖胺聚糖酶，可被運(yùn)用于許多此類應(yīng)用中。目前優(yōu)選的可溶性糖胺聚糖酶，例如sHASEGPs，表現(xiàn)出一些透明質(zhì)酸酶活性，并且還可表現(xiàn)出其它的糖胺聚糖酶活性。人類可溶性糖胺聚糖酶目前優(yōu)選應(yīng)用于在人體中使用該酶的應(yīng)用，包括本文中描述并闡釋的許多醫(yī)學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)方面是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即，可溶的、中性-活性的透明質(zhì)酸酶活性可通過引入在人PH20cDNA的羧基末端缺少編碼氨基酸的狹窄區(qū)域的核酸，在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中以高產(chǎn)量產(chǎn)生。sHASEGP的額外修飾也被提供，以通過應(yīng)用非天然前導(dǎo)肽(non-nativeleaderpeptides)促進(jìn)分泌。進(jìn)一步提供的是修飾sHASEGP的方法，以通過用聚乙二醇(PEG)遮蔽蛋白質(zhì)來延長它的半衰期，禾口/或?qū)μ烊惶腔M(jìn)行翻譯后修飾。以前對于產(chǎn)生可溶性中性-活性人類透明質(zhì)酸酶糖蛋白的嘗試沒有成功。結(jié)論是，人類透明質(zhì)酸酶多肽的截短，導(dǎo)致中性酶活性的喪失，并使細(xì)胞無法在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中分泌重組蛋白(Arming,etalEurJBiochem1997Aug1;247(3):810-4)。產(chǎn)生中性起效的分泌型sHASEGP，對于商業(yè)生產(chǎn)和作為透明質(zhì)酸酶的治療效用是極其主要的。這里公開的本發(fā)明解決了這些以及其它挑戰(zhàn)。本發(fā)明還包括具有催化活性的人類sHASEGP糖蛋白，其中sHASEGP具有至少一個(gè)N-連接的糖部分。這里顯示的研究證明，人類PH20的催化活性需要N-連接的聚糖，而牛和蜂毒透明質(zhì)酸酶在缺少這樣的N-連接聚糖的情況下仍保留活性。缺乏N-連接部分的人類透明質(zhì)酸酶HP20結(jié)構(gòu)域是無催化活性的。因此，經(jīng)典的重組DNA技術(shù)不能生產(chǎn)有催化活性的人類sHASEGP,這與能夠在大腸桿菌中制造的蜂毒透明質(zhì)酸酶不同。本發(fā)明包括用于產(chǎn)生N-連接的sHASEGP糖蛋白多肽的方法和細(xì)胞，其通過使用能夠引入所述N-連接的糖部分的細(xì)胞或通過將所述N-連接部分引入到sHASEGP多肽上。鑒別恰當(dāng)?shù)靥腔膕HASEGPs的方法被進(jìn)一步公開。具有催化活性的聚乙二醇化(PEGylated)和/或超唾液酸化(super-sialated)sHASEGP糖蛋白也被提供。聚乙二醇化和/或超唾液酸化sHASEGPs與天然產(chǎn)生的非唾液酸化牛和綿羊睪丸sHASEGPs相比，具有更長的血清半衰期，并因此在需要延長的半衰期的情況下(例如，普遍地在靜脈內(nèi)傳遞的情形中)對于酶穩(wěn)定性和用作藥物或佐劑都是優(yōu)選的。本發(fā)明提供制備聚乙二醇化和/或超唾液酸化sHASEGPs的方法，及其組合物和應(yīng)用。并不被限于特定的應(yīng)用或作用機(jī)理，通常認(rèn)為，PEG部分與sHASEGPs及其它糖胺聚糖酶的連接，可用于有效地保護(hù)分子，降低其對蛋白酶的相對敏感性，還可潛在地降低其從身體中清除和除去的程度和速度。將這些理論和技術(shù)應(yīng)用于其它糖胺聚糖酶，聚乙二醇化、超唾液酸化和/或其它修飾形式的此類其它糖胺聚糖酶，可同樣被產(chǎn)生并應(yīng)用于本文描述和闡明的方法和技術(shù)中(例如，用于促進(jìn)藥劑和其它試劑在身體組織中的分散的技術(shù))。由天然的GPI錨缺陷型sHASEGP拼接變體編碼的蛋白質(zhì)也被提供。進(jìn)一歩提供的是sHASEGP的組合物，包括含有金屬離子的可溶性sHASEGP糖蛋白，其中金屬離子為鈣、鎂或鈉。sHASEGPs通常在上述金屬存在下具有最佳活性。由sHASEGP組成的有所述金屬離子存在的配方也被提供。為了進(jìn)一步延長半衰期而對sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶所作的修飾被提供。用聚合物如聚乙二醇和葡聚糖對sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶進(jìn)行的化學(xué)修飾被提供。這種修飾保護(hù)了sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶，使其不會被循環(huán)和免疫系統(tǒng)以及甘露糖和脫唾液酸糖蛋白的糖基化受體所除去。進(jìn)一步提供的是連接到特定官能團(tuán)的方法，所述特定官能團(tuán)例如糖基化位點(diǎn)、帶正電荷的氨基酸和半胱氨酸。調(diào)節(jié)sHASEGPs的活化、表達(dá)或活性的效應(yīng)物和條件的鑒定分析方法也在這里被提供，所述效應(yīng)物例如化合物，包括小分子，所述條件例如pH、溫度和離子強(qiáng)度。在示例性的分析中，受測化合物對sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域切割己知底物的能力的影響被評定，所述底物通常為糖胺聚糖或蛋白聚糖。調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的活性的試劑，通常為化合物，尤其是小分子，是調(diào)節(jié)sHASEGP活性的候選化合物。透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域還可被用于生產(chǎn)具有功能干擾活性(function-perturbingactivity)的透明質(zhì)酸酶特異性抗體。這里提供的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括，但不限于，N-末端glycsoyl-水解酶結(jié)構(gòu)域及其C-末端截短部分，其在體外顯示出催化活性。編碼蛋白質(zhì)和透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸分子被提供。編碼可溶性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的核酸分子以及編碼全長sHASEGP的核酸分子被提供。編碼示例性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸及下游核酸被列于SEQIDNo.6中；示例性sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域被列于SEQIDNo.1中(氨基酸35-464)。示例性全長sHASEGP的蛋白質(zhì)序列和編碼核酸序列被列于SEQIDNos.1禾tl6中。沿著編碼sHASEGP的核酸的全長或沿著全長的至少大約70%、80%或90%與該編碼sHASEGP的核酸雜交并編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其部分的核酸分子也被提供。雜交通常在至少低嚴(yán)格性(stringency)條件下發(fā)生，一般在至少中等嚴(yán)格性，經(jīng)常在高嚴(yán)格性條件下發(fā)生。分離的核酸片段是DNA，包括基因組DNA或cDNA，或是RNA，或者可以包括其它成分，例如蛋白核酸或其它核苷酸類似物。分離的核酸可包括額外的成分，例如異源的或天然的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，這些基因可與其它基因例如報(bào)告基因或其它指示基因或編碼指示蛋白的基因連接。還提供了分離的核酸分子，其包括與編碼sHASEGP的核苷酸序列或其中一部分互補(bǔ)的分子序列。還提供了它們的可用作探針或引物的片段或寡核苷酸，所述片段或寡核苷酸包含至少約10到16個(gè)核苷酸，通常至少約20個(gè)核苷酸，一般1000個(gè)核苷酸以下，通常約100個(gè)核苷酸以下，其列于SEQIDN0.6(或其互補(bǔ)物)；或包含至少約30個(gè)核苷酸(或其互補(bǔ)物)或包含沿其全長(或其至少約70%、80%或90%)與任何此類片段或寡核苷酸雜交的寡核苷酸。片段的長度取決于它們的使用目的和/或感興趣的基因組的復(fù)雜性。通常探針和引物含有大約50、150或500以下的核苷酸。還提供了含有這里提供的任何核酸分子的質(zhì)粒。含有質(zhì)粒的細(xì)胞也被提供。這些細(xì)胞包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。還提供了增強(qiáng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其使用了能夠有效分泌sHASEGPs的信號前導(dǎo)肽。這種有效促分泌的前導(dǎo)肽氨基酸序列以及與sHASEGP的融合蛋白列在SEQIDNos.43和46中。還提供了生產(chǎn)sHASEGPs的方法，其通過在sHASEGP被細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞，并回收所表達(dá)的sHASEGP多肽或糖蛋白。編碼其它sHASEGPs的核酸的分離方法也被提供。還提供了細(xì)胞，通常是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞，其中sHASEGP多肽在細(xì)胞表面被表達(dá)。這些細(xì)胞可用于藥物篩選分析以鑒別調(diào)節(jié)sHASEGP多肽活性的化合物。這些分析，包括體外結(jié)合分析，和基于轉(zhuǎn)錄的分析，其中由sHASEGP直接介導(dǎo)或間接介導(dǎo)——例如通過原生長因子(pro-growthfactor)的激活來介導(dǎo)^~—的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被評價(jià)。還提供了由此類核酸分子編碼的肽。sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或具有氨基酸改變但特異性和/或透明質(zhì)酸酶活性保持基本不變的多肽被包括在那些多肽之中。特別地，基本上純化的哺乳動(dòng)物sHASEGP糖蛋白被提供，其包括分泌的中性-活性酶。本發(fā)明還包括透明質(zhì)酸酶催化結(jié)構(gòu)域，并且可額外地包括其它結(jié)構(gòu)域。sHASEGP可形成同型二聚體，還可與一些其它蛋白質(zhì)形成異源二聚體，所述其它蛋白例如膜結(jié)合蛋白。還提供了基本上純化的糖蛋白，包括與示例性的sHASEGP具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91°/。、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其中同一性百分比使用將同一性百分比最大化的標(biāo)準(zhǔn)算法和空位罰分來確定。sHASEGPs的拼接變體被考慮，尤其是含有具有催化活性的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的拼接變體。在其它實(shí)施方式中，基本上純化的多肽被提供，所述多肽包括sHASEGP多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分，但不包括SEQIDNo.1中示出的整個(gè)氨基酸序列。包括與SEQIDNo.l或3具有至少70%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽也在其中。在特定的實(shí)施方式中，編碼真核生物透明質(zhì)酸酶糖蛋白一一其表示為真核生物sHASEGP——的核酸被提供。特別地，核酸包括SEQIDNo.6中列出的核苷酸序列，尤其是SEQIDNo.6的核苷酸106-1446所示的序列，或包括編碼具有催化活性的多肽的一部分核苷酸序列。還提供了與SEQIDN0.6或其簡并序列雜交的核酸分子，雜交在至少低嚴(yán)格性條件下進(jìn)行，一般為至少中等嚴(yán)格性，更經(jīng)常在高嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。在一種實(shí)施方式中，分離的核酸片段與含SEQIDNo.6(或其簡并物)所示的核苷酸序列的核酸分子在高嚴(yán)格性條件下雜交。全長sHASEGP被列在SEQIDNo.l中，由SEQIDN0.6或其簡并物編碼。還提供了sHASEGPs的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的突變蛋白，尤其是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域中一個(gè)或多個(gè)自由Cys殘基(g卩，不與透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域中的任何其它Cys殘基形成二硫鍵)被其它氨基酸取代的突變蛋白，盡管不是必須的，但通常為保守氨基酸替換或不削弱活性的替換，所述突變蛋白還可以是一個(gè)或多個(gè)特定糖基化位點(diǎn)被消除的突變蛋白。在此提供了sHASEGP多肽，包括但不限于其拼接變體(splicevariant),和編碼sHASEGPs的核酸，以及其結(jié)構(gòu)域、衍生物和類似物。還提供了單鏈分泌型透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其具有這樣的N-末端，該N-末端在功能上等價(jià)于通過信號肽酶的活化以形成sHASEGP而產(chǎn)生的N-末端。有七個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)，在SEQIDNO:1中示例的人PH20sHASEGP的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490。在Cys殘基C60-C351之間和Cys殘基C224-C238之間形成二硫鍵，以形成核心透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。但是，對于中性酶催化活性，在羧基末端需要額外的半光氨酸，這樣，在SEQIDNo.l中從氨基酸36到Cys464的sHASEGP結(jié)構(gòu)域包含了最小范圍的活性人PH20sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，N-連接糖基化位點(diǎn)N-490對于合適的sHASEGP活性來說不是必需的。正如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可對本文描述并闡明的這些組成作出次要的變化，這并不實(shí)質(zhì)地消除它們的有用活性，或在一些情況下，這并不實(shí)質(zhì)地降低(或可能甚至提高)它們的有用活性，因此，這些變化可在文中描述的各種用途中類似地加以使用。一些sHASEGPs(例如,包括SEQIDNo.l的氨基酸序列的sHASEGP)的N-連接糖基化作用對其催化活性和穩(wěn)定性是非常重要的。盡管改變用于修飾糖蛋白的聚糖的類型可對蛋白質(zhì)的抗原性、結(jié)構(gòu)折疊、可溶性和穩(wěn)定性產(chǎn)生重大影響，但大多數(shù)酶被認(rèn)為不需要為了最佳酶活性而進(jìn)行糖基化作用。因此，就此方面而言，此類sHASEGPs是獨(dú)特的，原因是N-連接糖基化的去除可導(dǎo)致透明質(zhì)酸酶活性幾乎完全失活。對于這種sHASEGPs，N-連接聚糖的存在對于產(chǎn)生活性酶是非常重要的。適于在sHASEGPs上引入關(guān)鍵的N-連接糖基化殘基的蛋白表達(dá)系統(tǒng)被包括。另外，在存在能夠引入N-連接聚糖的提取物的情況下去糖基化的sHASEGP多肽的引入被包括。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，通過唾液酸化作用封端的復(fù)合糖基化(complexglycosylation)被描述，而用自由甘露糖殘基封端的其它糖基化也被考慮。優(yōu)選地，唾液酸殘基在sHASEGPs上的N-連接糖基化作用的末端殘基中被發(fā)現(xiàn)。N-連接寡糖歸為幾種主要類型(寡甘露糖型(oligomannose)、復(fù)合型(complex)、雜合型(hybrid)、硫酸化型(sulfated)),它們都具有通過在-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)中的Asn殘基的酰胺氮連接的(Man)3-GlcNAc-GlcNAo核。在-Asn-Xaa-Cys-位點(diǎn)的糖基化作用已在凝結(jié)蛋白C(coagulationproteinC)中被報(bào)道。N-連接位點(diǎn)通常是通過在測序過程中"空白"循環(huán)的出現(xiàn)而被間接認(rèn)定的。正面的鑒定可在用PHGaseF將寡糖釋放后進(jìn)行，PHGaseF將糖基化的Asn轉(zhuǎn)化為Asp。PNGaseF釋放后，N-連接寡糖可被純化，例如，通過使用Bio-GelP-6層析，其中對一群寡糖進(jìn)行制備型高pH陰離子交換色譜(HPAEC)(Townsendetal.,(1989)Anal.Biochem.182,1-8)。某些寡糖異構(gòu)體可以使用HPAEC拆分。海藻糖殘基在HPAEC色譜圖中的洗脫位置將遷移到更早的位置，而額外的唾液酸殘基將增加保留時(shí)間。寡糖結(jié)構(gòu)已知的糖蛋白(例如，牛胎球蛋白、a-l酸性糖蛋白、卵清蛋白、RNA酶B、轉(zhuǎn)鐵蛋白)的同時(shí)處理(cocurrenttreatment),可促進(jìn)寡糖峰的指認(rèn)。收集的寡糖可通過成分分析和甲基化鍵接分析(methylationlinkageanalyses)的聯(lián)合來表征(Waegheetal.,(1983)CarbohydrRes.123,281-304.)，端基異構(gòu)構(gòu)型通過NMR光譜術(shù)來指認(rèn)(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)。在一些sHASEGPs的情況中，以這里描述的人類sHASEGPrHuPH20為例，sHASEGP可包括N-糖苷連接和O-糖苷連接。例如，rHuPH20(如在DG44CHO系3D3中產(chǎn)生的，如下面實(shí)施例中描述的)被發(fā)現(xiàn)具有O-連接寡糖和N-連接寡糖。此類sHASEGPs的糖苷修飾(例如，包括此類N-連接和/或O-連接寡糖的一個(gè)或多個(gè)添加、去除或改變的修飾)可用于產(chǎn)生糖苷變異性sHASEGPs，其表現(xiàn)出改變的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)曲線，這使得它們能滿足特定的應(yīng)用。作為例證性說明，但不限于特定的作用機(jī)理，在與細(xì)胞受體或其它受體結(jié)合時(shí)所涉及的一個(gè)或多個(gè)N-連接和/或0-連接寡糖的去除或改變(例如，通過封端(capping)或以其它方式進(jìn)行的掩蓋(de-exposing)),可以被用于改變sHASEGP與特定組織結(jié)合或被特定組織吸收的程度和/或速度，這繼而又可用來改變例如其藥動(dòng)學(xué)曲線(例如，通過增加其血清半衰期或以其它方式改變其生物吸收)。sHASEGPs的制劑也被提供。sHASEGPs可配制成例如凍干形式和穩(wěn)定溶液。含特定金屬離子的制劑對于中性pH時(shí)的最佳活性是有益的，所述金屬離子例如鈣、鎂或鈉。除了穩(wěn)定的溶液制劑，緩釋制劑在此也被考慮，用于糖胺聚糖的延時(shí)去除，或試劑(如藥理學(xué)試劑)的散布或分散的延時(shí)促進(jìn)。在此還提供了試劑盒，所述試劑盒提供了sHASEGPs的預(yù)包裝注射器，用于在眼內(nèi)外科手術(shù)中和其它小體積操作中小量sHASEGP的給藥。用于在人造再生技術(shù)程序中離體應(yīng)用的平衡鹽制劑也被提供。應(yīng)用包括sHASEGPs在內(nèi)的糖胺聚糖酶來移除糖胺聚糖的方法也被提供。包括sHASEGPs在內(nèi)的糖胺聚糖酶通過糖胺聚糖的降解在間質(zhì)空間中打開通道，其通常允許大小在約500nrn以下的分子擴(kuò)散。這些通道可保持相對開放24-48小時(shí)的時(shí)間，其取決于劑量和制劑。這種通道可用于協(xié)助外源添加的分子的擴(kuò)散，所述外源添加的分子例如流體、小分子、蛋白質(zhì)、核酸和基因療法載體以及小于大約500nm的其它分子。另外，不限于特定理論或作用機(jī)理，相信，這種通道的形成可促進(jìn)大體積流體在間質(zhì)空間中的流動(dòng)，其又可促進(jìn)溶質(zhì)(例如可檢測到的分子或其它診斷試劑、麻醉劑或其它組織改性劑(tissue-modifyingagent)、藥理學(xué)試劑或制藥學(xué)上有效的試劑、或整形試劑或其它美容化妝試劑(estheticagent))的分散或運(yùn)動(dòng)，所述溶質(zhì)在本文有時(shí)被稱為"對流轉(zhuǎn)運(yùn)(convectivetransport)"或簡稱為對流的過程中由流體有效地被載運(yùn)。這種對流轉(zhuǎn)運(yùn)可實(shí)質(zhì)性地超過分子擴(kuò)散的速度和累積作用，并可因此導(dǎo)致治療分子或其它被給予的分子更迅速和有效地布滿組織。此外，當(dāng)分子例如治療試劑或其它試劑(例如小分子藥物或較大分子或復(fù)合物)與sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)共同配制或共同給藥且都注射到相對狹小的局部位置時(shí)，例如非靜脈內(nèi)的腸胃外給藥(例如，皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)，或施于其它內(nèi)部組織內(nèi)或周圍、器官或體內(nèi)其它相對狹小的空間)，伴隨被給予的藥劑的流體可提供局部驅(qū)動(dòng)力(即，靜水壓力)和較低的流動(dòng)阻力(通過打開間質(zhì)基質(zhì)中的通道)——它們都趨于增加流體流動(dòng)，以及隨之的在流體中包含的治療試劑或其它分子的對流轉(zhuǎn)運(yùn)。正如本文更詳細(xì)討論和闡明的，且正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，關(guān)于sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶的應(yīng)用的這些方面可具有實(shí)質(zhì)的效用，用于改善生物利用度，并操縱共同配制或共同給予的試劑的其它藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)特性。sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶還可用于去除過量的糖胺聚糖，例如在缺血再灌注、發(fā)炎、動(dòng)脈硬化、浮腫、癌癥、脊髓損傷和其它形式的創(chuàng)傷之后出現(xiàn)的那些。在一些情形中，sHASEGPs和其它糖胺聚糖酶可通過靜脈內(nèi)輸注被全身性輸送。當(dāng)局部的接觸不易獲得時(shí)，例如心臟或腦中，或者在疾病遍及全身的播散性瘤的情況下，這可以是有幫助的。對于這樣的靜脈內(nèi)的應(yīng)用或其他血管內(nèi)應(yīng)用，相對于缺少末端唾液酸的天然透明質(zhì)酸酶，超唾液酸化sHASEGPs通常是優(yōu)選的，以增加血清半衰期和分布，。在一些情況下，例如脊髓損傷和其它神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、青光眼和某些其它眼部病癥、以及各種自體免疫、發(fā)炎狀況、癌癥和其它慢性進(jìn)行性疾病和狀況、和美容治療，持續(xù)遞送是優(yōu)選的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，許多不同的組合物和技術(shù)已被開發(fā)，以提供緩釋或持續(xù)釋放制劑或感興趣分子的儲庫(d印ots)。在其它適應(yīng)征中，單次的短時(shí)生效劑量是優(yōu)選的。糖胺聚糖的暫時(shí)去除可用于促進(jìn)溶液和藥物傳遞進(jìn)入和/或通過間質(zhì)空間。這對于麻醉劑的擴(kuò)散和對于治療流體、分子和蛋白質(zhì)的給藥是有用的。在sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖酶)存在下，分子的皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥，也促使它們的全身性分布更加迅速。當(dāng)靜脈內(nèi)路徑不可利用時(shí)或當(dāng)需要更迅速的全身性分子遞送時(shí)，這種方法是非常有用的。例證性地，通過皮下給藥生物利用度很低的其它大分子例如因子III(FactorIII)的遞送，可與sHASEGPs—起注射，以增加它們的利用度。sHASEGPs對卵母細(xì)胞周圍的卵丘基質(zhì)(cumulusmatrix)的酶促去除的應(yīng)用也被提供。卵丘基質(zhì)的去除使用純化的sHASEGP，其不含提取物來源的透明質(zhì)酸酶的毒性污染物，允許具有更強(qiáng)生存能力的卵母細(xì)胞的更溫和的回收。另外，sHASEGPs可以不使用牛提取物或攜帶病毒或其它病原體如傳染性海綿狀腦病的其它生物體來制造。用于眼內(nèi)應(yīng)用的小量sHASEGP的注射也可用于小空間。例如，sHASEGP和/或其它糖胺聚糖酶可被注射到眼的前房，以去除手術(shù)中施用的過量粘彈性基質(zhì)。sHASEGPs的眼內(nèi)注射還可用于降低青光眼的眼內(nèi)壓，用于溶解玻璃體聚集物或"漂物"，用于清除玻璃體出血，用于治療黃斑變性，用于促進(jìn)在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中的玻璃體視網(wǎng)膜脫離，以及與其它酶混合以促進(jìn)角膜沿矯正晶體的重新塑形。如這里描述的，sHASEGPs和/或其它糖胺聚糖酶也可被注射到眼中或以"散布劑"的形式注射到周圍的眼眶間隙，即，以便將診斷劑、麻醉劑或藥理學(xué)試劑遞送到目標(biāo)組織中的位點(diǎn)和/或周圍的位點(diǎn)。例如，在注射診斷劑、麻醉劑或藥理學(xué)試劑到特農(nóng)下隙(sub-Tenon's)或鞏膜上隙的同時(shí)或者在時(shí)間上緊接著注射sHASEGP,可用于促進(jìn)藥物向眼的內(nèi)部(例如脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和玻璃體)的鞏膜(tmnscleral)遞送。鞏膜上隙是眼球筋膜(特農(nóng)囊)和鞏膜之間的含淋巴的間隙，它是脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和眼內(nèi)部周圍相對堅(jiān)韌的保護(hù)組織。特農(nóng)下隙或鞏膜上隙，有時(shí)被稱為鞏膜周邊(perisderal)淋巴間隙，通常也是與硬膜下腔和蛛網(wǎng)膜下腔相連，且被由筋膜(fascia)到鞏膜延伸的結(jié)締組織帶貫穿。如被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，促進(jìn)組合物穿過覆蓋眼的保護(hù)性鞏膜層遞送的能力，允許多種藥理學(xué)試劑和其它試劑被方便地和有效地遞送到眼中的底層組織，如脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜或玻璃狀液。通過將本發(fā)明組合物應(yīng)用于這樣的體內(nèi)遞送路徑，甚至相對難以達(dá)到的組織，例如眼睛后部的那些，可通過最低限度侵入性的方法來治療。將認(rèn)識到，在一些情況中，使用更持久的sHASEGP例如聚乙二醇化的sHASEGP將是令人滿意的。重要的是，注意到，盡管動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶可以并已被用于治療眼的某些征狀，并作為散布因子來促進(jìn)麻醉劑和其它治療劑或藥理學(xué)試劑的遞送，但當(dāng)它們被用于治療人類時(shí)，幾個(gè)重要的考慮因素牽涉到動(dòng)物來源的酶的使用，并潛在地限制了它們的應(yīng)用或產(chǎn)生了安全問題或額外的風(fēng)險(xiǎn)。在這些考慮之中的是這樣的問題，當(dāng)應(yīng)用于體內(nèi)人類組織時(shí)，蛋白質(zhì)和存在于制劑中的其它雜質(zhì)，可導(dǎo)致免疫原性問題和/或其它問題。另外，就采用非人類動(dòng)物酶而言，甚至純化的酶本身也可進(jìn)一步導(dǎo)致免疫原性，因?yàn)樗鼈儾⒎莵碓从谌祟?。進(jìn)一步，在此方面，降解性酶例如透明質(zhì)酸酶可有效促進(jìn)其自身分散(如在文中所述)的潛力，可增加此類動(dòng)物來源的產(chǎn)品的免疫原性形式或制劑被免疫系統(tǒng)接觸的可能性。對于動(dòng)物來源和/或雜質(zhì)因素的顧慮還在許多情形中變得愈發(fā)明顯；例如，目標(biāo)組織已經(jīng)接受外科手術(shù)或其它處理的情形，試劑被引入相對的免疫禁區(qū)(immune-privilegedspace)(如，眼睛部分、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)和許多其它通常不暴露于外部環(huán)境的組織和器官)的情形，和/或病人免疫受損或處于感染所帶來的高風(fēng)險(xiǎn)的情形。此類動(dòng)物來源制劑的使用可能因此在許多應(yīng)用中被避免，在所述應(yīng)用中，感染或其它并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)消除了它們的潛在效用。在那些情形及其它情形中，本發(fā)明的重組制備的sHASEGPs的使用可以提供高效且具有良好安全性的應(yīng)用，并因此改善和擴(kuò)展能夠有益地使用這些酶的條件和情形。在非靜脈腸胃外注射(例如皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)和向非脈管空間的其它注射)的情況下，在一定體積的液體(例如，藥物學(xué)賦形劑或其它溶液)中的sHASEGP(和/或另外的糖胺聚糖酶)和另一種試劑(例如，共同制劑或混合物，其包含sHASEGP和另一種試劑例如診斷試劑、麻醉劑、藥理學(xué)試劑、美容劑(estheticagent)或其聯(lián)合)，可通過注射或灌輸被引入身體中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。不希望受理論約束，相信，幾種驅(qū)動(dòng)力可用于促進(jìn)藥理學(xué)試劑或其它試劑的遞送(其程度部分取決于例如具體的組合物、體積和給藥位置)。這些驅(qū)動(dòng)力可包括由于一定體積的流體被有效地強(qiáng)迫進(jìn)入一個(gè)受限空間(例如，上述的特農(nóng)下隙，或皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)位點(diǎn)，或其它非-IV腸胃外注射位點(diǎn))時(shí)所產(chǎn)生的液體靜壓力的增加、接著由于流體流動(dòng)隨其壓力梯度增加(并且溶解的分子或大分子復(fù)合物也隨其被運(yùn)載)而導(dǎo)致的溶質(zhì)對流輸送(或?qū)α?的增加，以及由糖胺聚糖的降解和在下游細(xì)胞間基質(zhì)或間質(zhì)空間內(nèi)伴隨的通道形成介導(dǎo)的擴(kuò)散和/或滲透的增加。在sHASEGPs被注射到眼前房以去除過量粘彈性基質(zhì)例如含糖胺聚糖的制劑(其通常在各種前段操作(anteriorsegmentprocedures)中被用作眼外科佐劑(叩thalm薩gicalaids))的情況下，將被技術(shù)人員理解的是，考慮到本申請的教導(dǎo)，sHASEGP可被用于補(bǔ)充或消除對術(shù)后程序例如沖洗(irrigation)和吸出(aspiration)的需求，沖洗和吸出通常被用來減少在手術(shù)完成后留在眼內(nèi)的被應(yīng)用的粘彈性物質(zhì)的量。粘彈性物質(zhì)在前段手術(shù)中被普遍使用，以保持深度前房，這允許進(jìn)行更有效的處理并在手術(shù)過程中潛在地保護(hù)角膜內(nèi)皮和其它組織。含有透明質(zhì)酸鹽和/或硫酸軟骨素的各種粘彈性物質(zhì)被應(yīng)用于外科手術(shù)中，例如眼前段操作(anterioreyesegmentprocedures)(參見,例如Proviso,ViscoatTM禾口Duovisc(可從AlconLaboratories,Inc.獲得，www.alconlabs.com);Healon,Healon5T,HealonGV(可從AdvancedMedicalOptics獲得，www.healon.com);AmviscTMfBAmviscTMPlus(可從Bausch&Lomb獲得，www.bausch.com);I-Vise,I-VisePlus,I-ViscTM18禾QI-VisePhaco(可從I-MEDPharma獲得，www.imedpharma.com);LALONTM(可從GeneralInnovations獲得，www.generaltrade.net))。但是，如本領(lǐng)域中已知的，外科手術(shù)處理例如白內(nèi)障手術(shù)后在前房殘留的粘彈性物質(zhì)，可導(dǎo)致從前房的外流受到不利影響(可能通過減少經(jīng)過小梁網(wǎng)的外流)，這可引起眼內(nèi)壓升高(IOPspikes),其可導(dǎo)致青光眼。因此，本發(fā)明的sHASEGPs可被引入，例如，通過作為先前應(yīng)用的含糖胺聚糖例如透明質(zhì)素的粘彈性制劑的"粘彈性物質(zhì)解毒劑(viscoelasticantidote)"注射到眼前房。為了用作這種粘彈性物質(zhì)解毒劑，sHASEGP通常將通過手術(shù)后注射到前房(進(jìn)行或不進(jìn)行前期的沖洗或吸出以去除一部分先前使用的粘彈性物質(zhì))來引入，這在前段手術(shù)例如青光眼手術(shù)和眼內(nèi)晶狀體移植(例如，通過晶狀體乳化法或囊外手術(shù))、青光眼濾過手術(shù)(濾簾切除術(shù))、角膜移植手術(shù)(例如，穿透性角膜成型術(shù))、外傷后眼手術(shù)等等之后進(jìn)行。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的，在這種情況中sHASEGP的使用量將取決于其比活性和所使用的粘彈性物質(zhì)的量，以及一些粘彈性物質(zhì)是否已先被物理性去除(例如，通過沖洗和吸出)。因此，每種應(yīng)用通常將根據(jù)具體情況被優(yōu)化，本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到本文提供的描述和例證性說明將理解這些?！┱硰椥晕镔|(zhì)，如ViscoatTM和Duovisc(可從AlconLabs獲得)包括透明質(zhì)酸鹽和硫酸軟骨素。有利地，本發(fā)明的許多sHASEGPs具有透明質(zhì)酸酶和軟骨素酶的酶活性，這使它們尤其適合這種雙配方的粘彈性物質(zhì)。包括sHASEGPs的透明質(zhì)酸酶還可與一種或多種另外的糖胺聚糖酶(例如軟骨素酶)聯(lián)合，用于例如前述的應(yīng)用或在間質(zhì)間隙中進(jìn)一步打開通道，以用于其它應(yīng)用，如文中描述和闡明的那些。就粘彈性物質(zhì)也被用于其它程序而言，本發(fā)明的sHASEGPs可同樣與用于減少或去除所用的粘彈性物質(zhì)的量的技術(shù)一起使用，或者作為上述技術(shù)的替代來使用，即，作為粘彈性物質(zhì)解毒劑。在sHASEGPs在組織例如眼中作為散布劑的應(yīng)用中，本文描述的包括一種或多種sHASEGPs的制劑通常在施用需要被遞送到目標(biāo)組織或其附近的麻醉劑、診斷試劑、藥理學(xué)試劑或其它試劑之前或同時(shí)被應(yīng)用于目標(biāo)組織。在一些情況下，sHASEGPs可被用于促進(jìn)藥理學(xué)試劑或其它試劑的遞送，其穿過第一組織到達(dá)遠(yuǎn)離第一組織的一個(gè)或多個(gè)組織。例證性地，sHASEGPs向眼周鞏膜上隙的引入，可用于促進(jìn)試劑遞送，使其穿過保護(hù)性鞏膜組織并進(jìn)入脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和玻璃體，所述sHASEGPs的引入先于或伴隨著藥理學(xué)試劑或其它試劑向鞏膜上隙的引入。以這種方式，可用于治療脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和/或玻璃體病癥的許多藥理學(xué)試劑和/或其它試劑，可被相對局部地遞送到目標(biāo)組織，但同時(shí)使用的是相對非入侵性的方法，例如特農(nóng)下注射。相似的情形存在于其它情形中，其中sHASEGPs可用于身體中的一個(gè)組織或位置，以促進(jìn)藥理學(xué)試劑或其它試劑在那種組織或位置和/或向遠(yuǎn)端位點(diǎn)(distalsites)的遞送，如文中所描述和說明的。盡管共同配制或共同施用的試劑的分散程度和速度部分取決于所涉及的組織和試劑，但這種分散通?？赏ㄟ^下列途徑被增加例如，增加所使用的sHASEGP的量、采用具有更高比活性的sHASEGP、采用更能抵抗降解或其它失活作用的sHASEGP(例如聚乙二醇化的、超唾液酸化的或其它此類修飾的sHASEGP)、提供sHASEGP的持續(xù)釋放制劑或儲庫式制劑，以及可增加所使用的sHASEGP的有效活性和/或持續(xù)時(shí)間的其它此類方法。另外，在希望sHASEGP促進(jìn)試劑向遠(yuǎn)離例如注射位點(diǎn)的組織或位置擴(kuò)散的情形中，則以大體積液體(例如將部分充滿甚至稍稍超溢注射位點(diǎn))的形式提供sHASEGP和/或試劑，可用于通過對流輸送的過程進(jìn)一步促進(jìn)分散，如本文所描述和闡明的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，sHASEGPs可因此被用于有效地促進(jìn)多種麻醉劑、診斷劑、藥理學(xué)試劑和/或其它試劑遞送到眼的后段(posteriorsegments),用以治療一些征狀，如視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、增殖性視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、發(fā)炎狀況(例如葡萄膜炎、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜炎等等)，以及變性疾病、血管病和各種腫瘤。再次如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，多種藥理學(xué)或制藥學(xué)上有效的試劑可被有效地用以治療此類后段病癥(posteriorsegmentcondition)和疾病，包括，示例性的麻醉劑和藥理學(xué)試劑，如下面描述和闡明的那些。sHASEGP與其它物質(zhì)的共制劑或共給藥也可被考慮用于小體積或快速皮下給藥的注射筆(injectablepens)。例如，Epipen、胰島素和其它流體可被配制。本發(fā)明的方法包括，在施用其它治療分子之前、同時(shí)或之后，進(jìn)行sHASEGP多肽或含sHASEGP的藥物組合物的給予。sHASEGP可在不同于治療分子給藥位置的位置給藥，或sHASEGP可在與治療分子給藥位置相同的位置給藥。不希望被理論約束，相信，sHASEGP和其它糖胺聚糖酶引起細(xì)胞間的間質(zhì)空間(interstitialspaces)中一部分糖胺聚糖降解的能力，導(dǎo)致間質(zhì)中通道的暫時(shí)開啟，這又往往增加間質(zhì)流體流動(dòng)并同時(shí)促進(jìn)間質(zhì)流體中溶解成份(例如，麻醉劑、藥物和其它藥理學(xué)試劑、標(biāo)記試劑和診斷試劑等等)的擴(kuò)散和/或?qū)α魅苜|(zhì)輸送(對流(convection))。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的sHASEGPs可被用于提高多種藥理學(xué)試劑和其它試劑的生物利用度(并有可能改善其他藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)性質(zhì))，這些試劑有用于治療或診斷各種疾病狀況或在體內(nèi)以其它方式修飾一種或多種組織。這些試劑的示例性種類包括抗癌劑、抗感染藥、麻醉劑、抗炎劑、細(xì)胞因子、抗體和其它蛋白質(zhì)、核酸、大分子復(fù)合物，和修飾細(xì)胞活性或其它生理活性的各種其它分子和藥理學(xué)試劑，包括本文描述的和本領(lǐng)域中的各種試劑(及其典型成員)。盡管甚至小分子的擴(kuò)散和對流輸送可通過開啟間質(zhì)通道和增加流體流動(dòng)來提高，但在更大藥理學(xué)試劑或其它試劑的情況下，例如在許多生物治療劑(包括抗體和其它蛋白質(zhì)、大核酸、大分子復(fù)合物(例如脂質(zhì)體和其它大分子載體)、以及基因治療載體等等)的情況下，分子大小和間質(zhì)成分例如糖胺聚糖的存在，實(shí)質(zhì)性地削弱了試劑的擴(kuò)散和/或?qū)α?。潛在地限制試劑的有效性的幾種后果被導(dǎo)致。例如，試劑的藥動(dòng)學(xué)可通過減緩吸收和由此引發(fā)的試劑分布而被削弱。另外，在給藥位點(diǎn)處或附近一部分試劑的陷埋，限制了它的生物利用度，并且還可因潛在持續(xù)的和高的局部劑量而引發(fā)毒性。關(guān)于后者，可能伴隨有疼痛或其它副作用的局部毒性，是通過非靜脈注射給藥的許多大生物分子的一個(gè)問題，所述非靜脈注射例如通過皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。結(jié)果，許多藥理學(xué)試劑具有能夠通過將該試劑與sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)共同配制或共同給藥而被提高的藥動(dòng)學(xué)(PK)和/或藥效學(xué)(PD)曲線，sHASEGP可在所述試劑之前、同時(shí)或之后提供，并可以在相同或不同的位置給藥，其參數(shù)將是在標(biāo)準(zhǔn)模型(例如通常用于評價(jià)試劑的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的動(dòng)物模型)中進(jìn)行優(yōu)化的對象。因此，通常通過腸胃外給藥的各種治療劑和藥理學(xué)試劑及其它試劑(例如整形或美容制劑(estheticformulation))中的任何一種，都可以通過使用sHASEGPs而被增加。盡管血管內(nèi)給藥，尤其是通過靜脈(IV)注射，通?？梢蕴峁┛焖俚纳锢枚?，但I(xiàn)V注射經(jīng)常是不方便的，并伴隨風(fēng)險(xiǎn)或不適用(甚至在可行的情況下也可能出現(xiàn)達(dá)不到最佳總體PK/PD曲線)。由于sHASEGPs可被用于提高通過非IV腸胃外途徑(例如皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)和將試劑遞送到間質(zhì)的其它途徑)給藥的試劑的生物利用度，通過IV注射遞送的試劑可重新配制，用以通過非IV腸胃外途徑遞送。這種重新配制可提供明顯的優(yōu)勢，例如允許IV給藥不方便、不適用、不安全、太昂貴或有其它限制的試劑被使用。將IV試劑以非IV腸胃外形式重新配制，還可允許患者自己施用試劑，并可通過避免對靜脈注射給藥的需求，允許定量給藥(dosing)被優(yōu)化(例如，依據(jù)試劑的PK/PD參數(shù)進(jìn)行更好的改變)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，可通過使用sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖酶)來改善的PK/PD參數(shù)包括如下測量，Cmax(吸收后在例如血流中達(dá)到的試劑最大濃度)、Tmax(達(dá)到最大濃度所需時(shí)間)、T1/2(濃度降至一半所需時(shí)間)、Cmin(在代謝和排泄后，試劑的最小濃度)、AUC(濃度對時(shí)間的曲線下面積，生物利用度總量的量度)、在感興趣的各種組織中的濃度(包括，例如，達(dá)到所需濃度的速度、總體水平、保持所需水平的持續(xù)時(shí)間)和Emax(達(dá)到的最大效果)。例證性地，將藥物或其它藥理學(xué)試劑與sHASEGP—起重新配制，或?qū)⒃噭┡csHASEGP(其可被局部地或全身性地引入，可在試劑給藥之前、一起或之后)共同給藥，可被用于例如增加試劑的Cmax、降低其Tmax、降低其T1/2、增加其AUC和/或增加其Emax。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，容易地并相稱地操控這些關(guān)鍵PK和PD參數(shù)的能力(例如，通過使用更多或更少的sHASEGP單位并改變給藥時(shí)間和/或位置)，使許多藥理學(xué)試劑或其他試劑的改進(jìn)可以實(shí)現(xiàn)。對這些參數(shù)水平的測評可在模型中進(jìn)行，例如用于試劑的PK7PD測量的動(dòng)物模型，并且促進(jìn)相對功效-安全特征的共制劑和/或共給藥因而可被選擇用于特定應(yīng)用。在非IV腸胃外給藥中，sHASEGPs(和/或其它糖胺聚糖酶)也可被使用，以使試劑能夠通過更方便的途徑給藥，和/或具有更高效率。例證性地(但不限于此)，通過將試劑與sHASEGP(或局部或全身，在試劑給藥之前、同時(shí)或之后)重新配制和/或共給藥，那些通常通過皮下注射給藥的試劑可改為通過皮內(nèi)注射給藥，通常通過肌肉內(nèi)注射給藥的試劑可改為通過皮下或皮內(nèi)注射給藥?；蛘撸噭┛赏ㄟ^相同途徑給藥，但通過使用sHASEGPs，其將具有改進(jìn)的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)性質(zhì)。使用sHASEGPs(和域其它糖胺聚糖酶)將IV藥物和其它試劑重新配制成非IV腸胃外給藥的形式，也使試劑能夠通過各種設(shè)計(jì)用于簡化和/或加速遞送以及幫助自給藥的新注射器件中的任何一種進(jìn)行遞送。這樣的器件包括，例如，超銳微針器件(ultra-sharpandmicroneedledevices)(例如由BectonDickinson等開發(fā)的那些)，以及無針注射器材(needle-freeinjectiondevices)(例如BiojectorTM和Bioject的其它器材；IntraJectTM和可獲自Aradigm的其它器材；MedijectorTM器材等)。許多器件(例如Biojector)對于幫助皮內(nèi)注射尤為有用，皮內(nèi)注射在使用標(biāo)準(zhǔn)針時(shí)往往需要更多的經(jīng)驗(yàn)(由于在針頭定位過程中刺透真皮并將試劑遞送到組織下層位置例如皮下層的可能)。對于一些藥理學(xué)試劑，例如疫苗(例如，基于DNA的疫苗或其它疫苗)，將試劑遞送到皮層而非皮下層是尤其有益的，因?yàn)橥哂邢鄬Ω邼舛鹊目乖蔬f細(xì)胞(APCs)存在于皮膚內(nèi)。對于那些通常通過皮內(nèi)注射(無論是通過標(biāo)準(zhǔn)針或其它更新的器材)遞送的試劑，或許多其它可以但目前沒有通過皮內(nèi)注射遞送的試劑，sHASEGP(和/或其它糖胺聚糖酶)的局部共引入(co-introduction)可用于促進(jìn)藥理學(xué)試劑或其它試劑的遞送，并促進(jìn)其在皮膚中的分散或散布。對于疫苗，在皮膚可能是主要目標(biāo)組織——其具有局部充足的APCs——的情況下，sHASEGP(和/或其它糖胺聚糖酶)可因而促進(jìn)疫苗在目標(biāo)組織中的分散，因此增加疫苗和APCs間相互作用的可能性和程度(其可顯著加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的產(chǎn)生)。對于其它試劑，皮膚可能不是主要目標(biāo)組織，而是一定劑量的試劑被引入的組織，由此期望試劑被吸收到另一組織中，通常到血流中。在后者的情形中，血流本身可以是感興趣的目標(biāo)組織(例如，對于本文描述的和本領(lǐng)域中的血液調(diào)節(jié)因子)，或血流本身可以是遞送組織，通過它試劑被輸送到遠(yuǎn)端目標(biāo)組織(例如，身體中由血液供給的組織)。在這些后者情形中的任何一種中(其中，遞送是皮內(nèi)的，但需要試劑被遞送到血流中)，sHASEGP(以及，有可能地，一定體積的液體，它通過該液體被注射)可促進(jìn)試劑首先在皮膚中的分散，以及隨后進(jìn)出皮膚的脈管系統(tǒng)，并最后進(jìn)入到更大的血液供給中，如本文描述并舉例說明的。用sHASEGPs促進(jìn)其它治療劑或藥理學(xué)試劑的藥動(dòng)學(xué)禾n/或藥效學(xué)的應(yīng)用，還可被應(yīng)用于通過不是非IV腸道外給藥途徑遞送的試劑。例如，不希望被理論所限制，相信，sHASEGPs在身體中間質(zhì)空間里的存在(其可通過局部和/或全身的sHASEGPs給藥來實(shí)現(xiàn))趨向于促進(jìn)間質(zhì)通道和增加間質(zhì)空間中的流體流動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)溶解于間質(zhì)流體中的試劑(如藥理學(xué)試劑和其它試劑)的擴(kuò)散和對流輸送。例證性地，直接向血流中給藥的試劑(例如，通過靜脈注射)，或口服(例如，并因此在胃腸道吸收后進(jìn)入血流)的試劑，仍可能受限于吸收后(post-absorption),即，它們的藥動(dòng)學(xué)的分布相(distrubutionphase)。不希望被理論限制，相信，sHASEGPs可通過增加間質(zhì)滲透性和流體流動(dòng)并因此增加試劑在間質(zhì)間隙中的擴(kuò)散和/或?qū)α?其有效地在幾乎所有藥理學(xué)遞送途徑與目標(biāo)細(xì)胞之間形成媒介)來促進(jìn)其向目標(biāo)細(xì)胞的遞送。另外，由sHASEGPs的使用導(dǎo)致的膨脹壓(oncoticpressure)改變，被認(rèn)為可有助于促進(jìn)藥理學(xué)試劑的遞送。再次，不希望被理論所限制，sHASEGP的存在和伴隨的沿脈管組織間質(zhì)側(cè)的降解，將趨于降低間質(zhì)間隙中的膨脹壓，這繼而將促進(jìn)流體從脈管到間質(zhì)間隙的濾過。降低間質(zhì)壓力的潛力，在腫瘤內(nèi)間質(zhì)壓力(TIF的腫瘤間質(zhì)壓力)被升高的許多癌癥情形中，被認(rèn)為是尤其重要的。高TIF可對從脈管向腫瘤中心的流體流動(dòng)產(chǎn)生相對阻撓，從而限制有效到達(dá)腫瘤的抗癌劑的量，尤其是瘤體中較深的位置。sHASEGPs向腫瘤間質(zhì)的引入將因此趨向于促進(jìn)局部遞送和全身可利用的抗癌試劑的遞送，當(dāng)間質(zhì)膨脹壓被降低且擴(kuò)散和/或?qū)α鬏斔捅辉黾訒r(shí)，抗癌試劑能更容易地滲透進(jìn)腫瘤。腫瘤中TIF和水力傳導(dǎo)度(K)的測量(例如，使用標(biāo)記的分子，如伊文思藍(lán)染料(Evan'sBluedye)標(biāo)記的白蛋白)可用于定量地評價(jià)各種濃度的sHASEGPs在體內(nèi)對腫瘤的流體力學(xué)的影響，如本文舉例說明的和/或本領(lǐng)域中已知的。下面的事實(shí)進(jìn)一步加劇了許多腫瘤中降低的流體動(dòng)力，并且突出了對腫瘤使用sHASEGPs的額外的可能好處許多腫瘤表現(xiàn)出糖胺聚糖的積累，尤其是透明質(zhì)素(其可能是由于作為透明質(zhì)素分解代謝主要途徑的淋巴系統(tǒng)在許多腫瘤中被削弱或缺乏)。這種過量的透明質(zhì)素可妨礙水力傳導(dǎo)度。因而，sHASEGPs的引入可用于抵消許多腫瘤中糖胺聚糖的積聚，改善腫瘤中的水力傳導(dǎo)度，并有效地使它們表現(xiàn)得更易受抗癌劑(無論是局部的或是全身遞送的)的影響。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，這里描述的原理還可被應(yīng)用于許多其它需要被遞送到身體中各位點(diǎn)的藥理學(xué)試劑和其它試劑，例如，用于疾病的預(yù)防、診斷和/或治療或以其它方式調(diào)節(jié)生理功能。這些試劑的示例性種類(及其典型成員)在本文被提供，還有許多是本領(lǐng)域已知的或正在開發(fā)的。除了它們在對各種腸胃外給藥的藥理劑和/或試劑的潛在的改進(jìn)和/或重新配制方面的應(yīng)用，sHASEGPs還可與非腸胃外試劑(例如制成片劑、液體或用于通過胃腸道攝取和典型吸收的其它形式的試劑)一起使用。例如，由于大多數(shù)非腸胃外藥物最終必須到達(dá)間質(zhì)中的細(xì)胞，以發(fā)揮它們期望的作用，sHASEGPs促進(jìn)間質(zhì)中的擴(kuò)散和/或?qū)α鬏斔偷膽?yīng)用(全身地或局部地(例如，通過sHASEGP的局部或靶向給藥))可被用于改進(jìn)非腸胃外藥物(及腸胃外藥物)到達(dá)期望目標(biāo)細(xì)胞的范圍和/或速度。另外，許多通常是非腸胃外給藥(例如，口服)的試劑可被重新配制，或它們的活性成分被重新配制，以用于腸胃外給藥，其與sHASEGPs聯(lián)合后表現(xiàn)得更有效和/或安全。為了闡明這種可廣泛應(yīng)用的方法，sHASEGPs促進(jìn)向特定組織靶向給藥的能力(例如，sHASEGPs提供向眼后部中的組織進(jìn)行鞏膜(transcleml)遞送的能力)，可被用于直接地且優(yōu)先地遞送各種試劑中的任何一種(包括以前全身性給藥的試劑)到身體中感興趣的局部位點(diǎn)。這不僅能夠在感興趣的位點(diǎn)提供更期望的和/或更快速達(dá)到的濃度，還能充分減少伴隨全身給藥可能出現(xiàn)的問題和限制，在全身給藥中，在非期望位點(diǎn)(undesiredsites)的濃度可能與期望目標(biāo)位點(diǎn)(desiredtargetsite)的濃度相同甚至超過它(這潛在地引發(fā)不希望的副作用和試劑浪費(fèi))。在一些情況下，并非廣泛使用的試劑或并非用于某些適應(yīng)癥或某些病人的試劑，例如，可以通過與sHASEGPs共同配制或共同給藥，有效地被應(yīng)用以使另外的患者受益，如本文描述和闡明的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，采用sHASEGPs來促進(jìn)、加速和/或靶向共同配制和/或共同給藥的試劑的生物分布，以及操縱它們的藥動(dòng)學(xué)或藥效學(xué)的其它方面(例如，為了改進(jìn)它們的風(fēng)險(xiǎn):益處情況或協(xié)助患者、家庭或健康護(hù)理專業(yè)人員的使用)的能力，提供了改進(jìn)用于治療、診斷或預(yù)防疾病的藥物和其它試劑的主要機(jī)會。不被一系列具體應(yīng)用所限制，糖胺聚糖酶，包括本文描述的sHASEGPs(以及其它透明質(zhì)酸酶和其它糖胺聚糖酶)，可被用于有效地實(shí)現(xiàn)許多藥理學(xué)試劑和其它試劑的大丸或大丸樣遞送，其通過非靜脈腸胃外途徑，以及通過其它給藥途徑(例如，在其離開血流后(無論它們被直接引入血流(例如通過IV給藥)或間接引入血流(例如通過口服或非IV腸胃外給藥))，通過促進(jìn)試劑向目標(biāo)組織和/或通過目標(biāo)組織的遞送)。不限于特定的作用機(jī)理或它的某個(gè)方面，相信，這些酶暫時(shí)地降解細(xì)胞之間間質(zhì)基質(zhì)成分(其構(gòu)成了身體中流體空間(fluidspace)的實(shí)質(zhì)部分，以及為了使藥理學(xué)試劑和其它試劑到達(dá)大多數(shù)目標(biāo)細(xì)胞所必須穿過的相應(yīng)大空間)的能力，能顯著促進(jìn)試劑通過幾種潛在協(xié)同的方法中的一種或多種向目標(biāo)細(xì)胞的遞送。首先，盡管大量的間質(zhì)流體表現(xiàn)出一定程度的流動(dòng)性，但這種流動(dòng)性經(jīng)常被糖胺聚糖例如透明質(zhì)素和其它間質(zhì)成分限制或阻礙。如本文描述和闡明的，糖胺聚糖酶包括sHASEGPs(及其它透明質(zhì)酸酶和其它糖胺聚糖酶)在這種間質(zhì)間隙中開啟通道的能力，能用于減小阻礙并增加由任何特定"上游"壓力導(dǎo)致的"下游"流動(dòng)的程度和速度。第二，在非IV腸胃外注注射sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)和另外的藥理學(xué)試劑或其它試劑的情況下，非IV腸胃外注射的體積可用于增加上游驅(qū)動(dòng)壓或壓位差(例如，通過增加限定空間內(nèi)的液體靜壓力)，其可進(jìn)一步促進(jìn)流動(dòng)。第三，由于包括所引入的sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)和其它試劑的流體的體積有效地壓低(drivedown)了升高的壓力梯度(即，由伴隨注射"大丸"的液體靜壓力的升高和周圍組織中間質(zhì)壓力的同時(shí)降低所導(dǎo)致的升高的梯度)，大丸(bolus)中的溶質(zhì)可被有效地運(yùn)載(例如，通過對流輸送)到相鄰的組織中。因此，這種注射流體或大丸能被有效地和相對快速地移動(dòng)到相鄰的組織中，并遞送任何在相同或臨近引入位點(diǎn)引入的藥理學(xué)試劑或其它試劑(例如，通過將試劑與sHASEGP或其它糖胺聚糖酶聯(lián)合共同配制或共同給藥)。例證性地，使用糖胺聚糖酶例如sHASEGPs在間質(zhì)間隙中打開通道，如本文描述和闡明的，可被用于增加間質(zhì)流動(dòng)流入和經(jīng)過組織例如腫瘤和其它組織，其中流動(dòng)通常被阻礙且間質(zhì)壓力被升高。如本文所描述的這些理論的說明舉例包括使用sHASEGPs在體內(nèi)降低腫瘤中的間隙壓力。增加的流動(dòng)同樣能被應(yīng)用于正常組織中，例如，以便允許將麻醉劑、診斷劑、整型試劑或其它美容試劑(esthetic),或藥理學(xué)試劑或其它試劑遞送到組織中(例如，為了修飾組織或?qū)㈤L效(depot)制劑引入組織中)。增加的流動(dòng)同樣能被應(yīng)用于第一組織或近端組織，以促進(jìn)試劑穿過該引入組織向遠(yuǎn)端組織遞送，其中遠(yuǎn)端組織本身可以是期望的目標(biāo)組織或是到達(dá)期望的目標(biāo)組織的路徑。本文所描述的這些理論的說明性舉例包括，例如，(i)應(yīng)用被引入到眼周圍的鞏膜上隙中的sHASEGPs，促進(jìn)試劑穿過鞏膜的遞送，以便靶向于眼內(nèi)部的遠(yuǎn)端目標(biāo)組織，例如視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜；和(ii)應(yīng)用被皮內(nèi)引入的sHASEGPs，以促進(jìn)試劑穿過真皮下層(subdermallayers)并進(jìn)入血流的遞送，血流本身可以是目標(biāo)組織(例如，對于血液修飾劑(blood-modifyingagent))或可以是通過它試劑能被遞送到身體中其它目標(biāo)組織的途徑。作為對用于促進(jìn)藥理學(xué)試劑和其它試劑向身體中期望組織的遞送的這些技術(shù)和組合物的進(jìn)一步說明，下面的額外例子被提供。通過本文描述和闡明的手段，藥理學(xué)試劑的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)曲線，以及其它試劑的吸收、分布和/或效力曲線，可被增強(qiáng)或以其它形式改變。另外，那些基本上或?qū)嶋H上被限于通過一種途徑(如，通過IV注射)遞送的試劑，可以通過其它更安全、更低侵入性、更低價(jià)和/或更方便的途徑來遞送。為了進(jìn)一歩舉例說明且不限于具體的應(yīng)用類型，一定體積(V)的含sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)的液體(L)可被引入身體中的組織位點(diǎn)(給藥組織(dosingtissue))。通過本文描述和闡明的手段，GAG酶可被遞送進(jìn)給藥組織并且在一定程度上穿過給藥組織。不限于具體的作用機(jī)理，GAG酶可通過液體(L)體積的對流輸送被有效地運(yùn)載進(jìn)入給藥組織。對流輸送又可被加速，這部分地通過伴隨L(其可提供驅(qū)動(dòng)壓)的液體靜壓力，部分地通過GAG酶在給藥組織的間質(zhì)空間中打開通道的能力(其可降低對流動(dòng)的下游阻礙并因而降低抵抗壓力(resistingpressure))。因此，流體驅(qū)動(dòng)壓力差異可產(chǎn)生，且在預(yù)期程度上講，其可被增加，例如，通過下述之一或兩者(i)引入并且在需要的情況下增加驅(qū)動(dòng)液體靜壓力(例如，通過將L引入限定空間并在需要的情況下增加V);和(ii)降低下游對流動(dòng)的阻礙(例如，通過引入GAG酶，并在需要的情況下增加其效力，例如可通過增加其濃度、增加其對降解的抵抗(例如，通過聚乙二醇化作用、超唾液酸化作用或其它修飾)，和/或通過對流輸送來增加它的遞送(例如，通過增加V)來實(shí)現(xiàn)))。在某些實(shí)施方式中(例如，其中需要增加的遞送范圍或速度)，V是足以臨時(shí)擴(kuò)大給藥組織中GAG酶引入位點(diǎn)的體積。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可適應(yīng)的體積(V)和所產(chǎn)生的擴(kuò)大(distension)(D)程度取決于具體組織。為了說明的目的且非限制，擴(kuò)大發(fā)生的程度依不同的情況有所不同，例如，情況(i)給藥組織是相對大的和/或快速移動(dòng)流體填充的空間(例如，與靜脈和動(dòng)脈遞送有關(guān)的血流)，在這種情況中，L可以是大的(例如，如果需要的話可以是很多毫升)，但D往往是相對最小的；(ii)給藥組織是相對較小的和/或較低速流體填充的空間(如，與鞘內(nèi)遞送有關(guān)的腦脊液)，這種情況中，L仍可以相對較大，但D可能高于最小，取決于注射的準(zhǔn)確位置和體積；(m)給藥組織是相對較小但可略微擴(kuò)大的空間(例如，眼周圍的鞏膜上隙)；或(iv)給藥組織是相對更致密的和/或具有更高抵抗壓力(resistingpressure)的更局限的空間(例如，示例性地，與皮內(nèi)遞送相關(guān)的皮膚)。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，V可在O.lml以下的體積到大于100ml的體積范圍內(nèi)變化，在許多應(yīng)用中是在約0.5ml到20ml的范圍，許多是在lml到10ml的范圍，常常是在2到5ml:但對于具體情況可以有所變化，如本文所闡明的。V還可以針對所需具體應(yīng)用在這樣的范圍內(nèi)被具體優(yōu)化；例如，就一定范圍的測試體積，比較標(biāo)準(zhǔn)的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)曲線。如考慮到這些教導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，通過將GAG酶的快速起效和重新啟動(dòng)(reinitiating)通道開啟活性(其既可促進(jìn)遞送也被它自己的遞送所促進(jìn))，與既能促進(jìn)該催化活性又能被該催化活性促進(jìn)的遞送系統(tǒng)結(jié)合，多方協(xié)同藥物遞送系統(tǒng)因而可以被產(chǎn)生；如本文進(jìn)一步描述和闡明的。在第一個(gè)例證性的方面，含sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)和一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑(一種或多種試劑(例如可檢測的分子或其它診斷試劑、麻醉劑或其它組織修飾劑、藥理學(xué)試劑或制藥上的有效試劑、整形試劑或其它美容試劑，和需要被引入到體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)組織的試劑))的一定體積(V)的液體，被引入體內(nèi)的第一組織位點(diǎn)(firsttissuesite)(給藥組織)，其本身是試劑的期望目標(biāo)組織(TargetTissue)。通過這里描述和闡明的方法，試劑被遞送進(jìn)目標(biāo)組織并遍及目標(biāo)組織，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍(extent)和/或速度(rate)。關(guān)于此方面和本文的其它例證性方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，給藥組織可以是從身體外部(例如，使用本文描述和闡明的和/或本領(lǐng)域已知的各種給藥途徑)或從身體內(nèi)部(例如，與外科手術(shù)有關(guān)，或使用各種非外科或最小侵入性的方法和器件中的任意種類來到達(dá)身體中的組織)易于到達(dá)的各種組織中的任意組織。這樣的給藥組織包括本文描述和闡明的那些以及本領(lǐng)域中已知的其它組織。關(guān)于此方面和本文的其它例證性方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解的是，目標(biāo)組織可以是GAG酶和可能其它試劑被期望遞送到的各種組織中的任意組織(例如，(i)作為診斷、預(yù)防或治療疾病癥狀(無論是內(nèi)在因素導(dǎo)致的，例如遺傳的或后天的疾病癥狀，或外在因素導(dǎo)致的，例如感染)的努力的對象的組織；(ii)需要被麻醉或以其它方式調(diào)節(jié)的組織(例如，在外科手術(shù)和/或其它處理的情況下)；(iii)期望在其中引發(fā)免疫應(yīng)答的組織(例如，與疫苗接種相關(guān))；(iv)作為將試劑釋放到其它組織的儲庫位點(diǎn)的組織；(v)為美容或整形目的而被修飾的組織-,和(vi)為了其它目的而被修飾的體內(nèi)組織或位點(diǎn))。這樣的目標(biāo)組織包括本文描述和闡明的那些，以及本領(lǐng)域中已知的其它組織。關(guān)于前述方面和本文的其它例證性方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解的是，試劑可以是各種分子、大分子和大分子復(fù)合物中的任意種類，其被用于或可以被用于改變或調(diào)節(jié)身體中的狀況(例如，(i)為了診斷、預(yù)防或治療影響目標(biāo)組織和/或臨近組織的疾病癥狀(無論是內(nèi)在因素導(dǎo)致的，例如遺傳的或后天的疾病癥狀，或外在因素導(dǎo)致的，例如感染)的目的；(ii)為了麻醉或以其它方式調(diào)節(jié)目標(biāo)組織的生理機(jī)能的目的；(iii)為了引發(fā)疫苗接種所伴隨的免疫應(yīng)答的目的；(iv)為了將目標(biāo)組織用作釋放試劑到其它組織的儲庫位點(diǎn)的目的；(v)為了美容或整形目的和/或(vi)為了通過將GAG酶和可能其它試劑遞送到體內(nèi)組織或其它位點(diǎn)所能達(dá)到的目的)。這樣的試劑包括本文描述和闡明的各個(gè)種類的試劑及其成員，以及這些種類的試劑的其它成員，以及本領(lǐng)域己知的其它種類試劑(及其成員)。方面，含sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)和一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑(Agent(s))的一定體積(V)的液體，被引入身體中的組織位點(diǎn)(給藥組織)，其與本身是期望的目標(biāo)組織(TargetTissues)的組織(組織B)臨近或最接近。通過本文描述和闡明的手段，試劑從組織A被遞送到組織B，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。在第三個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑的一定體積(V)的液體，被引入身體中的組織位點(diǎn)(給藥組織)，其最接近位于組織A和本身作為期望的目標(biāo)組織或包含期望的目標(biāo)組織(目標(biāo)組織)的另外一個(gè)或多個(gè)組織(遠(yuǎn)端組織)之間的一個(gè)或多個(gè)組織(中間組織)。通過本文描述和闡明的手段，試劑經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)中間組織，從組織A被遞送到一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)組織，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。在第四個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑的一定體積(V)的液體，被引入身體中的組織位點(diǎn)(給藥組織)，其最接近一個(gè)或多個(gè)遞送組織，例如血流、淋巴或腦脊液(遞送組織)，它們是期望的目標(biāo)組織或包括期望的目標(biāo)組織。通過本文描述和闡明的手段，試劑從組織A被遞送到一個(gè)或多個(gè)遞送組織，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。在第五個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑的一定體積(V)的液體，被引入身體中的組織位點(diǎn)(給藥組織)，其最接近一個(gè)或多個(gè)遞送組織，例如血流、淋巴或腦脊液(遞送組織)，遞送組織將流體遞送到身體中的一個(gè)或多個(gè)所需目標(biāo)組織(目標(biāo)組織)。通過本文描述和闡明的手段，試劑從組織A被遞送到一個(gè)或多個(gè)遞送組織，然后從那里被遞送到一個(gè)或多個(gè)下游目標(biāo)組織，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。-在第六個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)和一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑的一定體積(V)的液體，被引入一個(gè)或多個(gè)遞送組織，例如血流、淋巴或腦脊液(遞送組織)，遞送組織將液體提供給一個(gè)或多個(gè)所需目標(biāo)組織(例如，通過供給目標(biāo)組織的血流)。通過本文描述和闡明的方法，試劑滲入目標(biāo)組織，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。在第七個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的一定體積(V)的液體，被引入身體中的組織位點(diǎn)(組織A)，其即是所需目標(biāo)組織或臨近所需目標(biāo)組織(目標(biāo)組織)，并且一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑通過另一給藥途徑(例如，通過口服遞送或靜脈注射)被引入體內(nèi)，這使得試劑能夠到達(dá)目標(biāo)組織(例如，在吸收或注射入血液后，通過供給目標(biāo)組織的血流)。通過本文描述和闡明的方法，試劑滲入目標(biāo)組織，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。在第八個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的一定體積(V)的液體，被引入身體中的一個(gè)或多個(gè)組織位點(diǎn)(TissueSites),所述位點(diǎn)具有升高的間質(zhì)壓力。通過本文描述和闡明的方法，組織位點(diǎn)中的間質(zhì)壓力通過GAG酶的降解活性被降低。在第九個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的一定體積(V)的液體，被引入身體中的一個(gè)或多個(gè)組織位點(diǎn)，所述位點(diǎn)具有過量的透明質(zhì)素或其它糖胺聚糖。通過本文描述和闡明的方法，組織位點(diǎn)中過量的透明質(zhì)素或其它糖胺聚糖通過GAG酶的降解活性被減少。在第十個(gè)例證性的方面，含sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)(GAG酶)的一定體積(V)的液體，被引入身體中的一個(gè)或多個(gè)組織位點(diǎn)，其位于或接近于皮下輸液的期望接入點(diǎn)(accesspoint)(點(diǎn)滴位點(diǎn)(ClysisSite))。通過本文描述和闡明的方法，流體然后可以被遞送進(jìn)并經(jīng)過點(diǎn)滴位點(diǎn)，其相比沒有GAG酶的情況具有更大的范圍和/或速度。考慮到文中提供的詳細(xì)描述和例證性實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，許多種類的試劑中的任意試劑都可被共同引入(例如，通過與GAG酶共同配制和共同給藥)，各種GAG酶中的任何酶都可以被使用，其使用濃度可以是本文提供的那些范圍，但通常針對所涉及的特定組織和對象進(jìn)行優(yōu)化。在上述例證性方面中使用的液體體積(V)通常將取決于引入位點(diǎn)的性質(zhì)，并且同樣地，通常將針對所涉及的特定組織和對象進(jìn)行優(yōu)化。如本文描述和闡明的，在非IV腸胃外給藥的情況下，V可被增加(在組織位點(diǎn)的具體限制內(nèi))，以便提供增強(qiáng)的靜液驅(qū)動(dòng)壓力，其與伴隨透明質(zhì)素或其它糖胺聚糖的降解而出現(xiàn)的降低的阻礙相結(jié)合，可以有效地導(dǎo)致該體積的液體能夠作為大丸劑而發(fā)揮作用一一將其所含有的任何溶質(zhì)運(yùn)載到下游間質(zhì)空間和潛在地更遠(yuǎn)的位置。因此，本文提供的是應(yīng)用透明質(zhì)酸酶(和/或其它糖胺聚糖酶)來促進(jìn)藥理學(xué)試劑和其它試劑向體內(nèi)位點(diǎn)遞送的各種技術(shù)，以及被稱為sHASEGPs的一組真核細(xì)胞分泌的中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白，以及其功能結(jié)構(gòu)域，尤其其透明質(zhì)酸酶(或催化)結(jié)構(gòu)域，突變蛋白和其它衍生物以及其類似物。本文還提供了編碼sHASEGPs的核酸。另夕卜，提供了所述sHASEGPs(包括通過與其它試劑共同給藥)的制劑、聯(lián)合制劑和治療用途，用于治療、預(yù)防或診斷疾病，以及用作組織修飾酶。圖1為sHASEGP載體HZ24的載體圖。發(fā)明詳述A.定義除非另外指出，本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員的常規(guī)理解具有相同的含義。除非另外指出，在本文的全部公開內(nèi)容中所引用的所有專利、專利申請、公開的申請和出版物、Genbank序列、網(wǎng)址和其他公開材料通過引用方式將其整體并入本文。如果對于本文中的術(shù)語有許多定義，以這部分中的定義為主。當(dāng)引用URL或其他此種標(biāo)識或地址時(shí)，應(yīng)該理解的是，此種標(biāo)識可能變化，因特網(wǎng)上的特定信息可以來來往往，但是通過搜索因特網(wǎng)可以找到等同的信息。因此，引用是證明了這樣的信息是可獲得的且是公開傳播的。如本文中所使用的，除非另外指出，任何保護(hù)基團(tuán)、氨基酸和其他化合物的縮寫是依據(jù)它們的常規(guī)用法、公認(rèn)縮寫或IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature(參見(1972)Biochem.11:942-944)。如本文中所使用的，真核透明質(zhì)酸酶是指各種不同家族的糖胺聚糖內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶，其中，透明質(zhì)酸酶中的谷氨酸殘基通過酸-堿催化機(jī)制水解透明質(zhì)素和硫酸軟骨素的P-1，4鍵。尤其感興趣的是哺乳動(dòng)物包括人來源的可溶性中性-活性透明質(zhì)酸酶或sHASEGPs。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，一般來說，在多肽的非實(shí)質(zhì)性區(qū)域的單個(gè)氨基酸替代基本上不改變生物學(xué)活性(參見如Watsonetal.，(1987)MolecularBiologyoftheGene,4thEdition,TheBenjamin/CummingsPub.co.,p.224)。如本文中所使用的，膜錨定sHASEGP(membraneanchoredsHASEGP)是指膜錨定的透明質(zhì)酸酶家族，其具有本文中描述的共同結(jié)構(gòu)特征。如本文所描述和闡明的，通常被膜錨定的透明質(zhì)酸酶(例如，能夠分解透明質(zhì)素的糖胺聚糖酶，優(yōu)選在中性pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出至少一些活性的那些酶)可通過移除或以其它方式修飾一個(gè)或多個(gè)參與將透明質(zhì)酸酶錨定在膜中的區(qū)域，而被轉(zhuǎn)化為可溶性HASEGPs或sHASEGPs。如本文中所使用的，可溶性透明質(zhì)酸酶是指在生理?xiàng)l件下具有溶解性的多肽?？扇苄訦ASEGP例如可以通過它分配進(jìn)入加溫到37'C的TritonX-114溶液的水相而被辨別(BordieretalJBiolChem.1981Feb25;256(4):1604-7)。另一方面，脂錨定HASEGP(LipidanchoredHASEGP)將分配進(jìn)入富含去污劑的相，但在用磷脂酶C處理后，將分配進(jìn)入缺乏去污劑的相或水相中。因此，在提及例如"sHASEGP"時(shí)，包括了由sHASEGP基因家族編碼的所有糖蛋白，包括但不限于人sHASEGP、小鼠sHASEGP，或從任何其他來源獲得的等同分子，或者合成制備而得的等同分子，或者顯示出同樣活性的等同分子。示范性的sHASEGPs和/或其結(jié)構(gòu)域的編碼核酸分子序列和編碼的氨基酸序列描述于例如SEQIDNO:4中。該術(shù)語也包括具有氨基酸替代的sHASEGP,所述替代基本上不改變每一成員的活性，該術(shù)語也包含其拼接變體(splicevariants)。合適的替代，包括一一盡管不必須是——氨基酸的保守替代，是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的，并且這樣的替代可以在不消除所得分子的生物活性諸如催化活性的情況下進(jìn)行。如本文中所使用的，sHASEGP，在本文中無論什么時(shí)候被提及時(shí)，都包括下述物質(zhì)中的至少一個(gè)或所有或任何組合由SEQIDN0.6中闡述的核苷酸序列編碼的多肽，或由包括編碼SEQIDNo.l的氨基酸1-509的核苷酸的核苷酸序列編碼的多肽；由在低、中等或高嚴(yán)格條件下與SEQIDN0.6中所述的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的多肽；包括SEQIDNo.l的氨基酸1-509所述的氨基酸序列的多肽；包括與SEQIDNo.l中所述的氨基酸序列或SEQIDNo.4中的氨基酸1-448的序列具有至少約60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽。特別地，提供了sHASEGP多肽，其具有SEQIDNo.4所示的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。該多肽是單鏈多肽或雙鏈多肽。也提供了保留有透明質(zhì)酸酶活性的其更小部分。sHASEGPs的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域在尺寸上和構(gòu)成上有所變化，可以包括在表面環(huán)(surfaceloops)中的插入和刪除。因此，對于本文的目的，催化結(jié)構(gòu)域是sHASEGP的一部分，如本文中所定義，并且與以前己被鑒定的其他透明質(zhì)酸酶樣序列(hyaluronidaselikesequences)諸如HYAL1、HYAL2、HYAL3的結(jié)構(gòu)域同源；然而，過去還未發(fā)現(xiàn)，分離的單鏈形式的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域能在體外測定中發(fā)揮功能。對活性而言所必需的天冬氨酸和谷氨酸殘基存在于保守的基序(motifs)中。如本文中所使用的，"可溶性sHASEGP的中性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域(neutralhyaluronidasedomainofasolublesHASEGP)"是指sHASEGP的p-1,4內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)域，其在中性pH中顯示出透明質(zhì)酸酶活性，在所述的條件下是可溶性的，并且與透明質(zhì)酸酶糖基-水解酶家族結(jié)構(gòu)域具有同源性和共同的結(jié)構(gòu)特征，但在羧基末端含有額外的序列，這對于中性條件下的活性是必需的。因此，它至少是在標(biāo)準(zhǔn)的體外分析評價(jià)中顯示出透明質(zhì)酸酶活性并保留可溶性的結(jié)構(gòu)域的最小部分。本文中所考慮的是這樣的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域和其催化活性部分。也提供了截短形式的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，包括其最小的片段，它以單鏈形式發(fā)揮催化作用。如本文和本領(lǐng)域所使用的，中性或中性-活性是指，蛋白質(zhì)在中性pH表現(xiàn)出活性(例如，在約pH7表現(xiàn)出活性)并因此在許多生理組織的特征pH范圍內(nèi)是有活性的。還被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的是，蛋白質(zhì)通常在其最適pH附近表現(xiàn)出一定范圍的活性。中性活性蛋白的最適pH通常在pH7上下一到幾個(gè)pH單位內(nèi)，但其活性范圍可延伸到許多個(gè)pH單位之外。sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，在本文中無論什么時(shí)候被提及，都包括下述多肽中的至少一個(gè)或所有或任何組合或催化活性部分:包括SEQIDNo.l所述的氨基酸序列的N-連接糖蛋白多肽；由在低、中等或高嚴(yán)格條件下與SEQIDNO.6中所述的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的多肽;包括SEQIDNO.I中所述的氨基酸序列的多肽；包括與SEQIDNo.l中所述的氨基酸序列具有至少約70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽，禾口/或由sHASEGP的拼接變體編碼的多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，對于本文的目的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是sHASEGP的一部分，如本文中所定義，并且與其他sHASEGP的結(jié)構(gòu)域同源。對于透明質(zhì)酸酶家族的更大類別的酶，sHASEGP催化結(jié)構(gòu)域享有高度的氨基酸序列同一性。對于活性所必需的Asp和Glu殘基存在于保守基序中。至于活性形式，是指在體內(nèi)和/或體外具有活性的形式。如本文中所描述的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域也能以可溶的分泌的糖蛋白的形式存在。本文已經(jīng)顯示，至少在體外，單鏈形式的sHASEGPs和其催化結(jié)構(gòu)域或酶活性部分(通常C-末端截短)顯示出透明質(zhì)酸酶活性。因此，本文中提供的是分離形式的sHASEGPs透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，以及它們在體外藥物篩選分析中的應(yīng)用，所述體外藥物篩選分析用于鑒定調(diào)節(jié)其活性的試劑。如本文中所使用的，sHASEGP的催化活性結(jié)構(gòu)域是指中性活性的內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)域，如通過針對糖胺聚搪底物的體外活性所定義的。感興趣的sHASEGPs包括那些在體內(nèi)和體外對硫酸軟骨素和硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG's)具有活性的sHASEGPs;和那些對透明質(zhì)素具有活性的sHASEGPs。如本文中所使用的，人sHASEGP是由存在于人類基因組中的核酸諸如DNA編碼的sHASEGP,包括所有的等位基因變體和保守變異，只要它們不是在其他哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的變體就可以。如本文中所使用的，編碼sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的核酸可解釋為只編碼所述的單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其活性部分的核酸，該核酸不編碼作為連續(xù)序列的sHASEGP其他相鄰部分。如本文中所使用的，"疾病(disease)"或"紊亂(disorder)"指由例如感染或遺傳缺陷引起的生物體中的病理狀態(tài)，并表征為可檢測的癥狀。如本文中所使用的，拼接變體(splicevariant)是指對基因組核酸諸如DNA的初級轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行不同的加工而產(chǎn)生的變體，通過所述的不同的加工可以產(chǎn)生一種以上類型的mRNA。本文中提供了sHASEGPs的拼接變體。如本文中所使用的，sHASEGP蛋白的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是指顯示出中性內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性的sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，它至少是蛋白質(zhì)的最小部分，其顯示出內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性，如用標(biāo)準(zhǔn)的體外分析所評價(jià)的。示范性的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNo.4所述的氨基酸序列的至少一個(gè)足以顯示出內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性的部分。也考慮了這樣的核酸分子，其編碼在體外透明質(zhì)酸酶分析中具有內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性的多肽，與sHASEGP多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的全長具有至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，或沿著它們的全長或沿著全長的至少約70%、80%或90%與編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸雜交，尤其是在中等嚴(yán)格條件下，通常在高嚴(yán)格條件下雜交。對于例如PH20的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，N-末端區(qū)域的殘基對活性可能是關(guān)鍵的，但不是充分的。通過應(yīng)用例如本文所示的技術(shù)，可以產(chǎn)生具有催化活性的sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。作為舉例說明，盡管人PH20的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域通常需要其N-末端氨基酸以獲得活性；C-末端部分可被截短直至最后的半胱氨酸殘基，但為了獲得最佳活性，仍需要額外的氨基酸。通過用評價(jià)催化切割的體外分析來測試多肽的透明質(zhì)酸酶活性，可以被截去的數(shù)量可以經(jīng)驗(yàn)性地被確定。因此，本發(fā)明考慮了透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域特別是單鏈結(jié)構(gòu)域的較小部分，其保留透明質(zhì)酸酶活性。這樣的較小的形式一般是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的C-端截短形式。透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域在尺寸和構(gòu)成上有所變化，包括在表面環(huán)中的插入和刪除。這樣的結(jié)構(gòu)域顯示出保守的結(jié)構(gòu)，包括至少一個(gè)結(jié)構(gòu)特征，諸如質(zhì)子供體，和/或內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的其他特征。因此，對于本文目的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是sHASEGP的一個(gè)單鏈部分，如本文中所定義，但在它的結(jié)構(gòu)特征和序列類似性或同源性的保留方面與其他透明質(zhì)酸酶樣序列的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域具有同源性。作為單鏈，該糖蛋白顯示出透明質(zhì)酸酶活性。如本文中所使用的，同源性是指約大于25%的核酸序列同一性，諸如25%、40%、60%、70%、80%、卯％或95%。如果有必要的話，同源性百分比將被明確說明。術(shù)語"同源性(homology)"和"同一性(identity)"常常交換使用。一般地，將序列進(jìn)行聯(lián)配，以便獲得最高級別的匹配(參見如ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.,ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，ed.,AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Part/,Griffin,A.M,andGriffin，H.G"eds.,HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademicPress,1987禾口SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.，MStocktonPress,NewYork,1991;CarilloetAl.(1988)etal.(1988)SlamJAppliedMath48):1073)。根據(jù)序列身份，保守氨基酸的數(shù)目通過標(biāo)準(zhǔn)的聯(lián)配算法程序而被確定，其中使用由各供應(yīng)商設(shè)立的默認(rèn)空位罰值。基本上同源的核酸分子將通常沿著感興趣的核酸分子的全長或沿著全長的至少約70%、80%或90%,在中等嚴(yán)格性或高嚴(yán)格性條件下發(fā)生雜交。也考慮了這樣的核酸分子，其包含了簡并密碼子來替代雜交核酸分子中的密碼子。任意兩種核酸分子是否具有至少例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%"同一性"的核苷酸序列，可以使用已知的計(jì)算機(jī)算法諸如"FASTA"程序來確定，使用例如Pearsonetal(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444中的默認(rèn)參數(shù)(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.,etal，NucleicAcidsResearch12:387(1984》，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul，S.F"etal,JMOLECBIOL215:403(1990);GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,[ED.,]AcademicPress,SanDiego,1994，和[CARILLOetal.](988)SIAMJAppliedMath48:1073)。例如，美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫的BLAST功能可以被用于確定同一性。其他商業(yè)的或公用的程序包括DNASTAR"MEGALIGN"PROGRAM(Madison,WI)和威斯康星大學(xué)GeneticsComputerGroup(UWG)"Gap"程序(MadisonWI))。蛋白質(zhì)和/或核酸分子的同源性或同一性百分比可以例如通過使用GAP計(jì)算機(jī)程序來比較序列信息而得以測定，GAP計(jì)算機(jī)程序例如Needlemanetal.(1970),JMolBiol.48:443，按照SmithandWatermanAdv.Appl.Math(1981)2:482的修改。簡言之，GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為，相似的聯(lián)配符號(即，核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以兩條序列中較短的一條中的符號總數(shù)。GAP程序的默認(rèn)參數(shù)可以包括(1)一元比較矩陣(unarycomparisonmatrix)(對于相同的情況，所包含的值為1，對于不相同的情況，值為0)和Gribskovetal(1986)Nucl.AcidsRes.14:6745的力卩權(quán)比較矩陣(weightedcomparisonmatrix)，如SchwartzandDayhoff，eds.，AtlasOfProteinSequenceAndStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)描述；(2)每一空位的罰值為3.0，每一空位中的每一符號的附加罰值為0.10;和(3)末端空位無罰值。因此，如本文中所使用的，術(shù)語"同一性"代表了受測和參考多肽或多核苷酸之間的比較。如本文中所使用的，術(shù)語"至少90%同一性"是指相對于參考多肽的90至99.99的同一性百分比。90。/?；蚋咚降耐恍员砻鬟@樣一個(gè)事實(shí)，示例性地假設(shè)100個(gè)氨基酸長的受測和參考多肽被比較的話，在受測多肽中不超過10%(即100個(gè)中的10個(gè))的氨基酸與參考多肽的氨基酸不同。在受測和參考多核苷酸之間，可以進(jìn)行類似的比較。這樣的差異可以體現(xiàn)為在全長的氨基酸序列中隨機(jī)分布的點(diǎn)突變，或可以它們可以聚集在變化長度的一個(gè)或多個(gè)位置，最高可至所允許的最大值，例如10/100的氨基酸差異(約90%同源性)。差異可以限定為核酸或氨基酸的替代或缺失。在同源性或同一性的水平超過約85-90%時(shí)，結(jié)果應(yīng)該不依賴于程序和空位參數(shù)設(shè)置；這樣的高水平的同一性可以很容易進(jìn)行評估，通常不需要依靠軟件。如本文中所使用的，引物是指包含2個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，通常大于3個(gè)，由所述引物可以啟動(dòng)引物延伸產(chǎn)物的合成。有助于合成的實(shí)驗(yàn)條件包括存在核苷三磷酸和用于聚合反應(yīng)和延伸的試劑，諸如DNA聚合酶，以及合適的緩沖液、溫度和pH。如本文中所使用的，動(dòng)物包括任何動(dòng)物，諸如但不限于山羊、牛、鹿、綿羊、嚙齒類動(dòng)物、豬和人。非人動(dòng)物是指除了人之外的被考慮到的動(dòng)物。所提供的sHASEGPs來自任何來源，動(dòng)物、植物、原核生物和真菌。優(yōu)選的sHASEGPs是動(dòng)物來源，包括哺乳動(dòng)物來源，更優(yōu)選地，在它們用于人類的情況下，是人類來源。如本文中所使用的，遺傳療法涉及將異源核酸例如DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物特別是人的某些細(xì)胞，即靶細(xì)胞，所述動(dòng)物具有此療法所要解決的紊亂或癥狀。核酸例如DNA以這樣的方式導(dǎo)入所選擇的靶細(xì)胞，即，使得該異源核酸例如DNA被表達(dá)并且所編碼的治療性產(chǎn)物由此產(chǎn)生?？蛇x擇地，異源核酸，例如DNA，可以以某方式介導(dǎo)編碼治療性產(chǎn)物的DNA的表達(dá)，或它可以編碼某產(chǎn)物，例如肽或RNA，其以某方式直接或間接地介導(dǎo)治療性產(chǎn)物的表達(dá)。遺傳療法也可以被用來遞送編碼某基因產(chǎn)物的核酸，其替代缺陷基因，或補(bǔ)充由導(dǎo)入有所述核酸的哺乳動(dòng)物或細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物。導(dǎo)入的核酸可以編碼治療化合物，諸如其生長因子抑制劑，或腫瘤壞死因子或其抑制劑，諸如受體，這些治療化合物一般情況下不產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物宿主中，或不以治療上有效的量或不在治療上有用的時(shí)間產(chǎn)生。在導(dǎo)入到病痛的宿主的細(xì)胞中之前，編碼治療性產(chǎn)物的異源核酸例如DNA可以被修飾，以增強(qiáng)或以其它方式改變該產(chǎn)物或其表達(dá)。遺傳療法也可以涉及遞送基因表達(dá)的抑制劑或阻遏物或其他調(diào)節(jié)物。如本文中所使用的，異源核酸是這樣的核酸，該核酸編碼的蛋白質(zhì)(或者，如果是DNA，則編碼編碼蛋白質(zhì)的RNA)在正常情況下不由表達(dá)所述異源核酸的細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生，或者異源核酸介導(dǎo)內(nèi)源性核酸例如DNA的表達(dá)或編碼改變內(nèi)源性核酸例如DNA的表達(dá)的調(diào)節(jié)物，所述介導(dǎo)或改變是通過影響轉(zhuǎn)錄、翻譯或其他可調(diào)節(jié)的生物化學(xué)過程來實(shí)現(xiàn)的。異源核酸，例如DNA，也可以稱為外來核酸，例如DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將其識別為或考慮為對于表達(dá)它的細(xì)胞來說是異源的或外來的任何核酸例如DNA，均包括在本文的異源核酸之內(nèi)；異源核酸包括外源性加入的核酸，其也被內(nèi)源性表達(dá)。異源核酸的例子包括，但不限于編碼可追蹤的標(biāo)記蛋白的核酸，所述的可追蹤的標(biāo)記蛋白例如賦予藥物抗性的蛋白；編碼治療上有效的物質(zhì)的核酸，所述的治療上有效的物質(zhì)例如抗癌劑、酶和激素；和間接或直接編碼其他類型的蛋白例如抗體的核酸(例如DNA和RNA)。由異源核酸編碼的抗體可以被分泌或表達(dá)在已經(jīng)導(dǎo)入有該異源核酸的細(xì)胞的表面。通常，異源核酸對于導(dǎo)入它的細(xì)胞來說不是內(nèi)源性的，但是已經(jīng)從別的細(xì)胞獲得或通過合成制備得到?！愕?，盡管不是必須的，這樣的核酸編碼的RNA和蛋白質(zhì)在正常情況下不由表達(dá)它的細(xì)胞產(chǎn)生。如本文中所使用的，治療上有效的產(chǎn)物是由異源核酸——通常是DNA——編碼的產(chǎn)物，一旦將該核酸導(dǎo)入到宿主中后，產(chǎn)物被表達(dá)，可緩解或消除作為遺傳疾病或獲得性疾病的表現(xiàn)的癥狀，或者該產(chǎn)物治愈該疾病。如本文中所使用的，糖蛋白基本上由透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域組成的這一敘述是指，多肽的唯一sHASEGP部分是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分。該多肽可以任選地——并且一般地——將包括額外的非sHASEGP來源的氨基酸序列。如本文中所使用的，結(jié)構(gòu)域(domain)是指分子例如糖蛋白或編碼核酸的某部分，其在結(jié)構(gòu)上和/或功能上不同于該分子的其他部分。如本文中所使用的，透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)是指催化糖胺聚糖——包括透明質(zhì)素——的水解的酶。為了清楚起見，提及透明質(zhì)酸酶時(shí)，是表示所有的形式，并且特定的形式將被特別地指出。對于本文的目的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括膜結(jié)合形式和可溶形式的sHASEGP蛋白。如本文中所使用的，核酸包括DNA、RNA和其類似物，包括蛋白核酸(proteinnucleicacids，PNA)和其混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。當(dāng)提及探針或引物時(shí)一一其用可檢測的標(biāo)記諸如熒光染料或放射性標(biāo)記任選地標(biāo)記，通?？紤]單鏈分子。這樣的分子通常是這樣的長度，即，其使得在探查或起動(dòng)(priming)一個(gè)文庫時(shí)它們的靶標(biāo)是統(tǒng)計(jì)上獨(dú)特的或低拷貝數(shù)的(通常小于5，一般小于3)。如本領(lǐng)域所知的，一般地，探針或引物含有與感興趣的基因互補(bǔ)或相同的相鄰序列或幾乎相鄰序列的至少14、16、20或30個(gè)殘基。探針和引物的長度可以是IO、20、30、50、100或更多的核苷酸。如本文中所使用的，編碼sHASEGP片段或部分的核酸是指編碼僅僅所述的sHASEGP片段或部分，而不編碼sHASEGP的其他相鄰部分的核酸。如本文中所使用的，異源核酸與調(diào)控核苷酸序列或效應(yīng)子(effector)核苷酸序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)和其他信號序列的操作性連接(operativelinkage)是指此種核酸例如DNA和此種核苷酸序列之間的關(guān)系。例如，異源DNA與啟動(dòng)子的操作性連接是指DNA和啟動(dòng)子之間的功能(以及通常物理上的)關(guān)系，依據(jù)這樣的關(guān)系，此種DNA的轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶從啟動(dòng)子處啟動(dòng)，所述RNA聚合酶特異性地識別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄閱讀框中的DNA。因此，操作性連接或操作性地關(guān)聯(lián)是指，核酸例如DNA與調(diào)控核苷酸序列和效應(yīng)核苷酸序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)或其他信號序列之間的功能關(guān)系。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，可能有必要去除、添加或改變克隆的5'非翻譯部分，以消除多余的、潛在不合適的選擇性翻譯起始(即，起始)密碼子或其他序列，這樣密碼子或其他序列或在轉(zhuǎn)錄水平或在翻譯水平干擾或減少表達(dá)。可選擇地，共有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(參見如KozakJ.Biol.Chem.266:19867-19870(1991))可以緊挨著起始密碼子的5'端插入，從而可以增強(qiáng)表達(dá)。對此種修飾的愿望(或需求)可以經(jīng)驗(yàn)性地被確定。如本文中所使用的，與RNA的至少一部分相互補(bǔ)的序列，也稱為反義寡核苷酸，是指這樣的序列，其與RNA充分互補(bǔ)，能與RNA雜交，一般是在中等或高嚴(yán)格條件下雜交，形成穩(wěn)定的雙螺旋；在雙鏈SHASEGP反義核酸的情況下，可以測試雙螺旋DNA(或dsRNA)的單鏈，或可以分析三股螺旋的形成。雜交的能力取決于互補(bǔ)的程度和反義核酸的長度。一般地，雜交核酸越長，它能夠容許的與sHASEGP的編碼RNA的堿基錯(cuò)配越多，并且依然能形成穩(wěn)定的雙螺旋(或三股螺旋，如果情況合適的話)。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的程序去測定雜交復(fù)合體的熔點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定錯(cuò)配的可容忍程度。對于本文的目的，只要所得到的蛋白質(zhì)顯示有透明質(zhì)酸酶活性，氨基酸替代可以在任何的sHASEGPs和其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行。所考慮的氨基酸替代包括保守性替代，例如表l中所述的那些，以及不會消除蛋白水解活性的其它修飾。如本文中所描述的，也考慮了改變蛋白質(zhì)的特性的替代，例如去除切割位點(diǎn)和其他此類位點(diǎn)；此類替代一般是非保守的，但會容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員完成。合適的氨基酸保守性替代是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，一般可以在不消除(并且優(yōu)選地不頭'質(zhì)性地改變)所得分子的生物活性如酶活性的情況下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，一般來說，在多肽的非必需區(qū)域進(jìn)行的單個(gè)氨基酸的替代基本上不會改變生物學(xué)活性(參見如Watsonetal.MolecularBiologyoftheGene，4thEdition,1987,TheBenjamin/CummingsPub.co.,p.224)。同樣包括在此定義中的是，sHASEGP的催化活性片段，特別是單鏈透明質(zhì)酸酶部分。例如，根據(jù)下面表l所述的那些來進(jìn)行的保守的氨基酸替代表1原始?xì)埢Ｊ匦蕴娲鶤la(A)Gly;Ser,AbuArg(R)Lys,OrnAsn(N)Gin;HisCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)ASPGly(G)Ala;ProHis(H)Asn;Ginlie(I)Leu;Val;Met;Nle;NvaLeu(L);Val;Met;Nle;NvaLys(K)Arg;Gin;GluMet(M)Leu;Tyr;lie;NLeValOmLys;ArgPhe(F)Met;Leu;TyrSer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp;PheVal(V)ILE;Leu;Met;Nle;Nva。其他的替代也是允許的，并可以經(jīng)驗(yàn)性地確定，或根據(jù)己知的保守替代來確定。如本文中所使用的，Abu是2-氨基丁酸；Nle是正亮氨酸；Nva是正纈氨酸；Orn是鳥氨酸。如本文中所使用的，本文中出現(xiàn)的各種氨基酸序列中的氨基酸是根據(jù)它們公知的三字母或單字母縮寫來表示的。出現(xiàn)在各種DNA片段中的核苷酸，是用本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)的單字母標(biāo)識來表示的。如本文中所使用的，基于公開于本文中的核苷酸序列的探針或引物，包括SEQIDN0.6的至少10、14，通常至少16個(gè)連續(xù)核苷酸序列，以及甚至更優(yōu)選地，SEQIDN0.6的至少20、30、50或100個(gè)連續(xù)核苷酸序列。用于特定雜交的探針或引物的長度是感興趣的基因組的復(fù)雜度的函數(shù)。如本文中所使用的，通過給予特定的藥物組合物而導(dǎo)致的特定紊亂的癥狀的緩解是指，可歸因?yàn)榻M合物的給予或與組合物的給予相關(guān)的任何的減輕，無論是永久的還是暫時(shí)的，持續(xù)的還是瞬時(shí)的。如本文中所使用的，反義多核苷酸是指合成的核苷酸堿基序列，其與mRNA或雙鏈DNA的有義鏈相互補(bǔ)。有義和反義多核苷酸的混合物在合適的條件下導(dǎo)致兩分子的結(jié)合或雜交。當(dāng)這些多核苷酸與mRNA結(jié)合(雜交)時(shí)，蛋白質(zhì)合成(翻譯)的抑制發(fā)生。當(dāng)這些多核苷酸結(jié)合到雙鏈DNA時(shí)，RNA合成(轉(zhuǎn)錄)的抑制發(fā)生。所產(chǎn)生的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄抑制作用抑制了有義鏈編碼的蛋白質(zhì)的合成。反義核酸分子通常含有足夠數(shù)目的核苷酸來特異性地結(jié)合目標(biāo)核酸，通常至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸，常常至少14或16或30個(gè)連續(xù)的核苷酸或修飾的核苷酸，其與編碼感興趣的基因的核酸分子的編碼部分相互補(bǔ)，例如與編碼sHASEGP的單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸互補(bǔ)。如本文中所使用的，陣列是指元素例如抗體的集合，其含有3個(gè)或更多成員?？蓪ぶ逢嚵?addressablearray)是這樣的陣列，在其中，陣列的成員一般可以通過在固相支持物上的位置而被鑒定。因此，一般而言，陣列的成員被固定在固相表面的離散的可鑒定的位點(diǎn)上。如本文所使用的，抗體是指免疫球蛋白，無論是天然的或者部分或全部合成產(chǎn)生的，包括保留抗體特異性結(jié)合能力的任何衍生物。因此，抗體包括具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或基本上同源。抗體包括任何免疫球蛋白主張中的成員，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文所使用的，抗體片段是指抗體的任何衍生物，它的長度小于全長，保留了全長抗體的特異性結(jié)合能力的至少一部分?？贵w片段的例子包括，但不限于，F(xiàn)ab、Fab，、F(AB)2、單鏈Fvs(scFV)、FV、dsFV雙抗體和Fd片段。片段可以包括例如通過二硫橋連接在一起的多條鏈。一般地，抗體片段包括至少約50個(gè)氨基酸，典型地含有至少200個(gè)氨基酸。如本文所使用的，F(xiàn)v抗體片段是由一個(gè)可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)和一個(gè)可變輕鏈結(jié)構(gòu)域通過非共價(jià)相互作用聯(lián)系在一起而組成。如本文所使用的，dsFV是指具有工程制造的分子間二硫鍵的Fv。如本文所使用的，F(xiàn)(AB)2片段是用胃蛋白酶在pH4.0-4.5消化免疫球蛋白而得到的抗體片段；它可以通過重組方法來表達(dá)，從而產(chǎn)生等同的片段。如本文所使用的，F(xiàn)ab片段是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而產(chǎn)生的抗體片段；它們可通過重組的方法表達(dá)，以產(chǎn)生等同的片段。如本文所使用的，scFVs是指含有可變輕鏈V和通過多肽連接子以任何順序共價(jià)連接的可變重鏈(VH)的抗體片段。該連接子的長度可以使兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域在基本上無相互干擾的情況下連接起來。所述的連接子包括(Gly-Ser)n殘基，其中遍布著一些Glu或Lys殘基，以增加溶解性。如本文所使用的，人源化抗體是指被修飾成包含人類氨基酸序列的抗體，這樣對人體給藥時(shí)不會引起免疫反應(yīng)。這種抗體的制備方法是已知的。例如，為了產(chǎn)生這種抗體，表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤或其它原核或真核細(xì)胞如大腸桿菌或CHO細(xì)胞，可通過重組DNA技術(shù)來改變以表達(dá)此抗體，其中非可變區(qū)域的氨基酸組成是基于人抗體的。計(jì)算機(jī)程序已被設(shè)計(jì)用于識別這樣的區(qū)域。如本文所使用的，雙抗體(diabodies)是二聚的scFV;雙抗體一般具有比ScFVs短的肽連接子，且它們一般形成二聚體。如本文所使用的，通過使用重組DNA方法的重組手段的生產(chǎn)，是指使用已知的分子生物學(xué)方法來表達(dá)由克隆DNA編碼的蛋白質(zhì)。如本文所使用的，術(shù)語評估(assessing),旨在包括定量地和定性地獲得存在于樣品中的sHASEGP或其結(jié)構(gòu)域的活性的絕對值測定，還包括獲得表征活性水平的指數(shù)(index)、比率、百分比、視覺的或其它的數(shù)值。評估可以是直接或間接的，實(shí)際檢測的化學(xué)品種類不必必須是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物本身，也可以是，例如，其衍生物或一些更進(jìn)一步的物質(zhì)。如本文所使用的，生物活性是指化合物的體內(nèi)活性，或由化合物、組合物或其它混合物的體內(nèi)給藥所引起的生理應(yīng)答。因此，生物活性包括此類化合物、組合物和混合物的治療效果和藥物活性。生物活性可以釆用被設(shè)計(jì)用來測試或應(yīng)用此類活性的體外系統(tǒng)來觀察。因此，對于本文的目的，熒光素酶的生物活性是其加氧酶活性，由此，當(dāng)?shù)孜锇l(fā)生氧化時(shí)，產(chǎn)生光。如本文所使用的，功能活性(flinctionalactivity)是指顯示出與全長蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種活性的多肽或其一部分。功能活性包括，但不限于，生物學(xué)活性、催化或酶活性、抗原性(結(jié)合多肽或與多肽競爭來結(jié)合抗多肽抗體的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力、與受體或多肽配體特異結(jié)合的能力。如本文所使用的，綴合物(conjugate)是指本文提供的化合物，其包括一種或多種sHASEGPs和一種或多種尋靶試劑，其中所述一種或多種sHASEGPs包括sHASEGP，尤其是其單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。這些綴合物包括通過重組方法生產(chǎn)為融合蛋白的那些，通過化學(xué)方法生產(chǎn)的那些，例如通過化學(xué)偶聯(lián)，例如，通過偶聯(lián)到巰基，以及由其它任何方法產(chǎn)生的那些，其中至少一個(gè)sHASEGP或其結(jié)構(gòu)域通過連接子直接或間接地連接到尋靶試劑上。如本文所使用的，尋靶試劑(targetingagent)是提供綴合物與細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合的任何部分，例如，蛋白質(zhì)或其有效部分，其可內(nèi)化綴合物或其sHASEGP部分。尋靶試劑還可以是促進(jìn)或推動(dòng)例如親和分離或綴合物純化、將綴合物附著到表面或檢測綴合物或含綴合物的復(fù)合物的物質(zhì)。如本文所使用的，抗體綴合物是指其中的尋靶試劑是抗體的綴合物。如本文所使用的，分子的衍生物或類似物是指由分子衍生的一部分或分子經(jīng)修飾的形式。如本文所使用的，用于治療特定疾病的化合物的有效量，是指足以改善或以某種方式減少疾病所伴隨的癥狀的量。這個(gè)量可以作為單一劑量或根據(jù)用藥方案給藥，并因此產(chǎn)生效果。所述的量可治療疾病，但通常為了改善疾病的癥狀而給藥。反復(fù)的給藥可能是獲得理想的癥狀改善效果所必需的。如本文使用的，"等同的(equivalent)",當(dāng)用于兩個(gè)核酸序列時(shí)，是指被研究的兩個(gè)序列編碼同樣的氨基酸序列或等同的蛋白質(zhì)。當(dāng)"等同的"在用于兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽時(shí)，它是指兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽具有基本相同的氨基酸序列，其中只含有基本上不改變蛋白質(zhì)或肽的活性或功能的氨基酸替代(例如，但不限于，保守變化，如上面表l中所述的那些)。當(dāng)"等同的"用于性質(zhì)時(shí)，該性質(zhì)不必以同樣的程度存在(例如，兩個(gè)肽可表現(xiàn)出不同速度的同種酶活性)，但活性通常是基本相同的。"互補(bǔ)的(complementary)",當(dāng)涉及兩個(gè)核苷酸序列時(shí)，是指兩個(gè)核苷酸序列能夠雜交，一般在相對的核苷酸之間具有25%、15%、5%或0%以下的錯(cuò)配。如果需要，互補(bǔ)百分比將被指明。一般地，這兩個(gè)分子被選擇，以至于它們可以在高嚴(yán)格條件下雜交。如本文所使用的，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性或基因或核酸的表達(dá)的試劑，降低或增加或以其它方式改變蛋白質(zhì)的活性，或以某些方式上調(diào)或下調(diào)或以其它方式改變核酸在細(xì)胞中的表達(dá)。如本文所使用的，sHASEGP活性抑制劑包括抑制或減少sHASEGP的生產(chǎn)、翻譯后修飾、成熟或膜定位(membranelocalization)的任何物質(zhì)，或干擾或降低其蛋白水解功效的任何物質(zhì)，所述功效尤其是在體外篩選分析中的單鏈形式的蛋白水解功效。如本文中所使用的，用于治療或預(yù)防腫瘤性疾病的方法是指，任何的癥狀例如腫瘤、其轉(zhuǎn)移、腫瘤的血管化作用或表征該疾病的其他參數(shù)被降低、改善、預(yù)防、置于緩解的狀態(tài)或維持在緩解的狀態(tài)。它也指腫瘤性疾病和轉(zhuǎn)移的特征(hallmarks)可以通過該治療而被消除、減少或預(yù)防。所述特征的非限制性的例子包括基底膜(basementmembrane)和附近胞外基質(zhì)不受控制的降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分裂和組織成新的功能化毛細(xì)管，以及這樣的功能化毛細(xì)管的維持。如本文所使用的，綴合物的制藥上可接受的鹽、酯或其它衍生物，包括可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員利用已知的衍生方法容易地制備的任何鹽、酯或衍生物，這樣所產(chǎn)生的化合物能夠施用于動(dòng)物或人而基本上沒有毒性效應(yīng)，并且它們或者具有藥物學(xué)活性或者是藥物前體。如本文所使用的，藥物前體是指這樣的化合物，其通過體內(nèi)給藥后，被代謝或以其它方式轉(zhuǎn)化成化合物的生物活性形式、藥物活性形式或治療活性形式。為了生產(chǎn)藥物前體，藥物活性化合物被修飾，這樣，活性化合物通過代謝過程重新產(chǎn)生。藥物前體可被設(shè)計(jì)以改變藥物的代謝穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)運(yùn)特性，防止副作用或毒性，改善藥物的味道或改變藥物的其它特征或性質(zhì)。根據(jù)藥效過程和體內(nèi)藥物代謝的知識，一旦知道藥物活性化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)該化合物的藥物前體(見，例如，Nogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,388-392頁)。如本文所使用的，通過本文提供的篩選方法鑒定的藥物，是指用作治療劑或用作用于設(shè)計(jì)治療劑的前導(dǎo)化合物的任何候選化合物。此類化合物可以是小分子，包括小的有機(jī)分子、肽、肽模擬物、反義分子或dsRNA，例如，RNAi、抗體、抗體片段、重組抗體和其它可作為藥物候選者或前導(dǎo)化合物的此類化合物。如本文所使用的，肽模擬物(peptidomimetic)是模擬生物活性形式的特定肽的構(gòu)型及其某些立體化學(xué)特征的化合物。一般，肽模擬物被設(shè)計(jì)用于模擬化合物的某些所需性質(zhì)，而不是導(dǎo)致生物活性構(gòu)型喪失和鍵斷裂的不期望的性質(zhì)，例如柔性(flexibility)。肽模擬物可從生物活性化合物中制備，通過用生物電子等排體(bioisosteres)替換某些導(dǎo)致不期望性質(zhì)的基團(tuán)或鍵來進(jìn)行。生物電子等排體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，亞甲基生物電子等排體CH2S己在腦啡呔類似物中被用作酰胺替代物(見，例如，Spatola(1983)pp.267-357inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,Weistein,Ed,volume7，MarcelDekker,NewYork)。嗎啡，其可通過口服給藥，是內(nèi)啡肽的肽模擬物化合物。對于本文的目的，環(huán)化的肽被包括在肽模擬物中。如本文所使用的，啟動(dòng)子區(qū)域或啟動(dòng)子元件，是指控制與其可操作性連接的DNA或RNA轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA片段。啟動(dòng)子區(qū)域包括足以被RNA聚合酶識別、結(jié)合并使轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的特定序列。啟動(dòng)子區(qū)域的這一部分被稱為啟動(dòng)子。另外，啟動(dòng)子區(qū)域包括調(diào)節(jié)RNA聚合酶的此識別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性的序列。這些序列可以是順式作用的或是對反式作用因子(transactingfactor)有響應(yīng)的。啟動(dòng)子，根據(jù)調(diào)控的性質(zhì)，可以是組成型或可調(diào)型(regulated)?？紤]用于原核生物的示例性啟動(dòng)子，包括噬菌體T7和T3啟動(dòng)子。如本文中所使用的，受體是指對于給定的配體具有親和力的分子。受體可以是天然發(fā)生的或合成的分子。受體在本領(lǐng)域也可以指抗-配體(anti-ligands)。如本文中所使用的，受體和抗-配體是可互換的。受體可以在它們的未加以改變的狀態(tài)下使用，或作為與其他物質(zhì)的聚集體使用。受體可以直接地或通過特定的結(jié)合物質(zhì)或連接物而間接地，共價(jià)地或非共價(jià)地或以物理接觸的方式附著到結(jié)合組分上。受體的例子包括但不限于抗體、細(xì)胞膜受體表面受體和內(nèi)化受體(internalizingreceptors)、單克隆抗體和對諸如病毒、細(xì)胞或其他物質(zhì)上的特異性抗原決定簇具有反應(yīng)活性的抗血清、藥物、多核苷酸、核酸、肽、因子、凝集素、糖、多糖、細(xì)胞、細(xì)胞膜和細(xì)胞器。受體的例子和使用此類受體的應(yīng)用的例子，包括但不限于a)酶對微生物的存活至關(guān)重要的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或酶，其可以充當(dāng)抗生素[配體]選擇的靶標(biāo)；b)抗體抗體分子上的與感興趣的抗原的表位相結(jié)合的配體結(jié)合位點(diǎn)的鑒定可以被研究；通過模擬抗原表位的序列的測定可以開發(fā)出疫苗，其免疫原是基于一種或多種這樣的序列，或可以開發(fā)出相關(guān)的診斷試劑或化合物，它們可以用于治療例如自體免疫疾?。籆)核酸配體的鑒定，諸如蛋白質(zhì)或RNA，結(jié)合位點(diǎn)；d)催化多肽聚合物，包括能夠促進(jìn)涉及將一種或多種反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為一種或多種產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的多肽；這樣的多肽一般包括對至少一種反應(yīng)物或反應(yīng)中間產(chǎn)物具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，以及靠近該結(jié)合位點(diǎn)的活性官能毒，其中，該官能度能夠通過化學(xué)的方法修飾被結(jié)合的反應(yīng)物(參見例如美國專利5,215,899);e)激素受體以高親和力與受體相結(jié)合的配體的確定，可以用于開發(fā)激素替代療法；例如，通過對結(jié)合此類受體的配體的鑒定可以開發(fā)出控制血壓的藥物；和f)鴉片受體在腦中結(jié)合鴉片受體的配體的確定，可以用于開發(fā)出嗎啡和相關(guān)毒品的上癮性較弱的替代品。如本文中所使用的，樣品是指可能含有分析物分析所期望的分析物的任何物質(zhì)。樣品可以是生物學(xué)樣品，例如生物流體或生物組織。生物流體的例子包括尿、血、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、腦脊髓液、眼淚、粘液、精液、羊水或類似物。生物組織是細(xì)胞的聚集體，通常是與它們的胞間物質(zhì)一起形成的特定類型，其構(gòu)成人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌或病毒結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)性材料之一，包括結(jié)締組織、上皮組織、肌肉和神經(jīng)組織。生物組織的例子也包括器官、腫瘤、淋巴結(jié)、動(dòng)脈和各細(xì)胞。如本文中所使用的在測定錯(cuò)配百分比時(shí)的雜交嚴(yán)格性描述如下1)高嚴(yán)格性O(shè).lxSSPE，0.1%SDS，65°C;2)中等嚴(yán)格性0.2xSspE,0.1%SDS，50。C;3)低嚴(yán)格性1.0xSspE，0.1%SDS，50°C。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道洗滌步驟對穩(wěn)定的雜交的選擇作用，也知道SspE的成分(參見如Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,in:MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdspringHarborLaboratoryPress1989Vol3,p.B.13，也參見描述常用實(shí)驗(yàn)室溶液的大量目錄)。SspE是pH7.4的磷酸鹽緩沖的0.18NaCl。進(jìn)一步地，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道雜合子的穩(wěn)定性取決于TmT，它是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(Tm-81.5。C-16.6+0.41(。/。G+C)-600/L))，這樣，在洗滌條件中僅有的對雜交穩(wěn)定性至關(guān)重要的參數(shù)是SspE(或SSC)中的鈉離子濃度和溫度。應(yīng)該理解的是，使用其它的緩沖液、鹽和溫度，可以獲得等同的嚴(yán)格性。作為例子而不是為了限制，使用低嚴(yán)格性條件的程序如下(也參見ShiloandWeinberg,Proc.Natl.AcadSciUSA78:6789-6792(1981》含有DNA的濾膜在40°C預(yù)處理6小時(shí)，預(yù)處理在含有35%甲酰胺、5xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1%Ficoll、1%BSA和500ug/ml變性鮭魚精DNA(10x)的溶液中進(jìn)行，SSC是1.5M氯化鈉和0.15M檸檬酸鈉，調(diào)節(jié)到pH7。雜交在同樣的溶液中進(jìn)行，作下述修改0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100VG/M精子DNA、10%(wt/vol)硫酸葡聚糖和使用5-20x106cpm32P-標(biāo)記的探針。濾膜在雜交混合物中40'C溫育18-20小時(shí)，然后在55'C洗滌1.5小時(shí)，洗滌在含有2xSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS的溶液中進(jìn)行。洗滌溶液用新鮮溶液更換，在60'C再溫育1.5小時(shí)。將濾膜進(jìn)行斑點(diǎn)干燥(blotteddry)并暴露以進(jìn)行放射自顯影。如果必要，濾膜可以在65-68。C進(jìn)行第三次洗滌，并再暴光于膠片?？梢允褂玫牡蛧?yán)格性的其他條件是本領(lǐng)域已知的，例如在種間交叉雜交(cross-specieshybridizations)中所使用的。作為例子而不是為了限制，使用中等嚴(yán)格性條件的程序包括但不限于，使用此類中等嚴(yán)格性條件的程序如下含有DNA的濾膜在55'C預(yù)處理6小時(shí)，預(yù)處理在含有6xSSC、5xDenhart's溶液、0.5%SDS和100叱/ml變性鮭魚精DNA的溶液中進(jìn)行。雜交在同樣的溶液中進(jìn)行，并使用5-20x10632P標(biāo)記的探針。濾膜在55'C在雜交混合物中溫育18-20小時(shí)，然后在60'C洗滌30分鐘，洗滌2次，洗滌在含有l(wèi)xSSC和0.P/。SDS的溶液中進(jìn)行。將濾膜進(jìn)行斑點(diǎn)干燥并暴露以便放射自顯影?？梢允褂玫闹械葒?yán)格性的其他條件是本領(lǐng)域已知的。對濾膜的洗滌在37'C進(jìn)行1小時(shí)，洗滌在含有2xSSC、0.1%SDS的溶液中進(jìn)行。作為例子而不是為了限制，使用高嚴(yán)格性條件的程序描述如下含有DNA的濾膜的預(yù)雜交在65'C進(jìn)行8小時(shí)至過夜，預(yù)雜交在由6xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500ug/ml變性鮭魚精DNA組成的緩沖液中進(jìn)行。濾膜在65'C雜交48小時(shí)，雜交在含有100ug/ml變性鮭魚精DNA和5-20x106CPM32P標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合物中進(jìn)行。濾膜的洗滌在37。C進(jìn)行1小時(shí)，洗滌在含有2xSSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液中進(jìn)行。然后，在放射自顯影之前，在50'C在O.lxSSC中洗滌45分鐘?？梢允褂玫母邍?yán)格性的其他條件是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語"基本上相同的"或"基本上同源的"或"類似的"隨上下文而有所變化，這是相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所能理解的，一般是指至少60%或70%，優(yōu)選至少80%、85%，或更優(yōu)選至少卯％，最優(yōu)選至少95。/。的同一性。如本文中所使用的，與產(chǎn)物基本上相同，是指足夠地相似，以至于感興趣的特性實(shí)質(zhì)上未被改變，這樣，該基本上相同的產(chǎn)物可以用于替代所述產(chǎn)物。如本文中所使用的，基本上純化的是指具有足夠地勻質(zhì)的，用標(biāo)準(zhǔn)的分析方法進(jìn)行測定時(shí)似乎沒有易被檢測到的雜質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)的分析方法諸如薄層層析(TLC)、凝膠電泳和高效液相色譜(HPLC)，它們被本領(lǐng)域技術(shù)人員用來評估此類純度，或指具有足夠的純度，以至于經(jīng)過進(jìn)一步的純化作用，無法檢測到物理和化學(xué)特性的改變，諸如物質(zhì)的酶活性或生物活性的改變。對化合物進(jìn)行純化以產(chǎn)生化學(xué)上基本上純的化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的?；瘜W(xué)上基本上純的化合物然而可以是立體異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物。在這樣的情況下，進(jìn)一步的純化可能增加混合物的比活性。如本文中所使用的，目標(biāo)細(xì)胞(靶細(xì)胞)是指表達(dá)sHASEGP的細(xì)胞(在如本文所描述的生產(chǎn)sHASEGP的情況下)，或指在體內(nèi)被sHASEGP或共同配制或共同給藥的試劑作為目標(biāo)的細(xì)胞(在如本文所描述的使用sHASEGPs來促進(jìn)藥理學(xué)試劑和其它試劑向耙細(xì)胞的遞送的情況下)。如本文中所使用的，受測物質(zhì)(或受測化合物)是指化學(xué)上定義的化合物(例如有機(jī)分子、無機(jī)分子、有機(jī)/無機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、核酸、寡核苷酸、脂、多糖、糖類，或這些分子的雜合物諸如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如受測化合物文庫、天然提取物或培養(yǎng)上清液等)，本文中提供了它們對sHASEGP，特別是包括了透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其足以具有活性的部分的單鏈形式的效應(yīng)，這可以通過體外方法例如本文所提供的分析方法進(jìn)行測定。如本文中所使用的，術(shù)語治療劑、治療方案、輻射防護(hù)劑或化學(xué)治療劑是指常規(guī)的藥物和藥物治療，包括疫苗，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。放射治療劑是本領(lǐng)域眾所周知的。如本文中所使用的，治療是指涉及狀況、紊亂或疾病的癥狀得以改善或發(fā)生其他有利改變的任何方式。治療也包括本文的組合物的任何藥物學(xué)應(yīng)用。如本文中所使用的，載體(或質(zhì)粒)是指用于將異源核酸導(dǎo)入到細(xì)胞中以進(jìn)行其表達(dá)或復(fù)制的獨(dú)立元件。載體通常保持為附加體(episwnal)，但也可以被設(shè)計(jì)成可以使得基因或其部分被整合入基因組染色體中。也考慮人工染色體載體，諸如酵母人工染色體和哺乳動(dòng)物人工染色體。此類載體的選擇和使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。表達(dá)載體包括能夠表達(dá)DNA的載體，該DNA與調(diào)控序列可操作連接，所述調(diào)控序列諸如啟動(dòng)子區(qū)域，其能夠影響此類DNA片段的表達(dá)。因此，表達(dá)載體是指重組的DNA或RNA構(gòu)建物，諸如質(zhì)粒、噬菌體、重組病毒或其他載體，其一旦被導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞后，可以使克隆的DNA被表達(dá)。合適的表達(dá)載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，包括那些在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞中可復(fù)制的載體，和那些保持為附加體的載體或那些整合入宿主細(xì)胞基因組的載體。如本文中所使用的，蛋白質(zhì)結(jié)合序列是指這樣的蛋白質(zhì)或肽序列，其能夠特異性結(jié)合到其他蛋白質(zhì)或肽序列，一般地，是結(jié)合到一組蛋白質(zhì)或肽序列，或結(jié)合到特定的蛋白質(zhì)或肽序列。如本文中所使用的，表位標(biāo)記(epitopetag)是指對應(yīng)于表位的短的氨基酸殘基鏈，它們有利于隨后對具有該表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行生化和免疫學(xué)分析。通過將表位標(biāo)記序列包括入合適表達(dá)載體中的蛋白質(zhì)編碼序列，可以完成對表位的標(biāo)記。表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以用高特異性的抗體進(jìn)行親合純化，所述抗體是用利用標(biāo)記獲得。如本文中所使用的，金屬結(jié)合序列是指這樣的蛋白質(zhì)或肽序列，其能夠特異性結(jié)合到金屬離子，通常是結(jié)合到一組金屬離子，或結(jié)合到特定的金屬離子。如本文中所使用的，組合或聯(lián)合(combination)指兩個(gè)或更多個(gè)元素之間的任何結(jié)合。如本文中所使用的，組合物指任何混合物。它可以是溶液、懸浮液、液體、粉、糊，含水的、不含水的或其任何組合。如本文中所使用的，流體指可以流動(dòng)的任何組合物。因此流體包括半固體、膏、溶液、水混合物、膠、洗液、乳液形式的組合物，和任何其他這樣的組合物。如本文中所使用的，細(xì)胞的提取物指由裂解的或破裂的細(xì)胞制得的制備物或組分。如本文中所使用的，當(dāng)試劑是被隨意選擇而未考慮在單獨(dú)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)同與之聯(lián)系的底物、結(jié)合伴侶(bindingpartners)等的結(jié)合中所涉及的特異性序列時(shí)，該試劑被認(rèn)為是隨意選擇的。隨意選擇的試劑的例子是使用化學(xué)文庫或肽組合文庫(peptidecombinatoriallibrary),或生物體的生長肉湯或條件培養(yǎng)基。如本文中所使用的，當(dāng)試劑是在非隨機(jī)的基礎(chǔ)上被選擇，考慮到了目標(biāo)位點(diǎn)的序列和/或它的與試劑的作用相關(guān)的構(gòu)象時(shí)，該試劑被認(rèn)為是理性選擇的或設(shè)計(jì)的。如描述于實(shí)施例中的，在具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:4的糖蛋白中，提出了透明質(zhì)酸酶結(jié)合位點(diǎn)和(催化)位點(diǎn)。通過利用構(gòu)成這些位點(diǎn)的肽序列，可以被理性地選擇或理性地設(shè)計(jì)出試劑。例如，理性選擇的肽試劑可以是其氨基酸序列與ATP或鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域相同的肽。寡糖被認(rèn)為具有還原端和非還原端，無論在還原端的糖是否實(shí)際上是還原糖。根據(jù)公認(rèn)的命名法，本文在描述寡糖時(shí)將非還原端置于左邊，將還原端置于右邊。本文在描述所有的寡糖時(shí)，使用了非還原糖的名字或縮寫(例如Gal)，然后是糖苷鍵的構(gòu)型(a或j3)、環(huán)鍵(ringbond)、在該鍵中涉及的還原糖的環(huán)位置，然后是還原糖的名字或縮寫(例如GlcNAc)。兩個(gè)糖之間的連接可以表示為，例如2，3、2JWdarw.3或(2，3)。每個(gè)糖均為吡喃糖。如本文中所使用的，N-連接糖部分(N-linkedsugarmoiety)是指通過Asn殘基的酰胺氮附著到sHASEGP的寡糖。N-連接寡糖分為幾個(gè)主要的類型(甘露寡糖型、復(fù)合型、雜合型、硫酸化型)，它們?nèi)纪ㄟ^Asn殘基的酰胺氮附著有(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核，所述Asn殘基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa不是Pro)。在測序期間，N-連接位點(diǎn)常常可由"空白(blank)"循環(huán)的出現(xiàn)而間接指示出來?？梢栽谟蒔NGaseF釋放寡糖之后，進(jìn)行陽性鑒定，PNGaseF將糖基化Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。PNGaseF進(jìn)行釋放之后，N-連接的寡糖可以用Bio-GelP-6層析進(jìn)行純化，對寡糖收集物進(jìn)行制備型高pH陰離子交換層析(HPAEC)(Townsendetal.，(1989)Anal.Biochem.182,l-8)。某些寡糖異構(gòu)體可以用HPAEC拆分。在HPAEC層析譜中海藻糖殘基將較早地出現(xiàn)在洗脫位置，而其他唾液酸殘基將會增加保留時(shí)間。其寡糖結(jié)構(gòu)已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、a-l酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAseB、轉(zhuǎn)鐵蛋白)被同時(shí)進(jìn)行處理，這將CarbohydrRes.123，281-304.)，利用NMR光譜術(shù)來測定端基異構(gòu)構(gòu)型(anomericconfigurations)(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)?？蛇x擇地，寡糖可以用熒光輔助碳水化合物電泳(FACE)進(jìn)行鑒定。Callewaertetal.(2001)Glycobiology11,275-281。如本文中所使用的，術(shù)語"唾液酸"指九碳羧基化糖(carboxylatedsugars)家族的任何成員。唾液酸家族最常見的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3,5-二脫氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-l-onicacid(常常縮寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的另一個(gè)成員是N-羥乙酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中，NeuAc的N-乙?；鶊F(tuán)被羥基化。唾液酸家族的第三個(gè)成員是2-酮-3-脫氧墨nonulosonicacid(KDN)(Nadanoetal.(1986)J.Biol.Chem.261:11550-11557;Kanamorietal.(1990)J.Biol.Chem.265:21811-21819。該家族也包括9-取代的唾液酸，諸如9-0-C.sub.l-C.sub.6酰基-Neu5Ac，如9-0隱乳酰-Neu5Ac或9-0-乙酰-Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。對于唾液酸家族的綜述，參見Varki(1992)Glycobiology2:25-40;SialicAcids:Chemistry,MetabolismandFunction,R.Schauer,Ed.(Springer-Verlag,N.Y.(1992))。唾液酸化合物的合成和在唾液酸化程序中的應(yīng)用公開于1992年10月1日公開的國際申請WO92/16640中。如本文中所使用的，PNGase是指天冬酰氨肽特異性N-糖苷酶F，諸如黃桿菌maningoseptum肽-N-糖苷酶F。PNGASE酶的特征為對N-連接寡糖而不對O-連接寡糖具有特異性。PNGASE效用的表征可以用SDSPAGE電泳或熒光輔助碳水化合物電泳來定義。如本文中所使用的，末端基本上唾液酸化(substantiallyterminatedsialation)是指用唾液酸殘基作為末端糖進(jìn)行末端化處理的N-連接寡糖。末端唾液酸可以通過用神經(jīng)氨酸酶處理之后對釋放的碳水化合物進(jìn)行FACE分析來鑒定。糖蛋白在血液中的循環(huán)壽命(circulatorylifetime)很大程度取決于它的N-連接碳水化合物基團(tuán)的組成和結(jié)構(gòu)。該事實(shí)與打算經(jīng)腸胃外給藥的治療性糖蛋白直接相關(guān)。一般來說，糖蛋白的最大循環(huán)半衰期要求它的N-連接碳水化合物基團(tuán)以序列NeuAc-Gal-GlcNAc終止。如果沒有末端唾液酸(NeuAc),糖蛋白通過涉及基礎(chǔ)的N-乙酰半乳糖胺(GaINAc)或半乳糖(Gal)殘基的識別的機(jī)制，迅速從血液中清除掉(Goocheeetal.(1991)Biol/Technology9:1347-1355)。由于該原因，確保在治療性糖蛋白的N-連接碳水化合物基團(tuán)上存在末端唾液酸，對于它們的商業(yè)開發(fā)是重要的考慮因素。循環(huán)中的糖蛋白被暴露于能去除末端唾液酸殘基的唾液酸酶(或神經(jīng)氨酸酶)。通常，唾液酸的去除暴露半乳糖殘基，這些殘基被肝細(xì)胞中的半乳糖特異性受體識別并結(jié)合(綜述于AshwellandHarford(1982)Ann.Rev.Biochem.51:531)。肝臟也含有其他的糖特異性受體，其介導(dǎo)糖蛋白從循環(huán)中的清除。此類受體的特異性也包括N-乙酰葡糖胺、甘露糖、海藻糖和磷酸甘露糖。通過肝細(xì)胞的半乳糖受體而被清除的糖蛋白經(jīng)歷實(shí)質(zhì)性的降解作用，然后進(jìn)入膽汁；通過Kupffer細(xì)胞的甘露糖受體而被清除的糖蛋白進(jìn)入網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(綜述于AshwellandHarford(1982)Ann.Rev.Biochem.51:53)。如本文中所使用的，中性活性是指在pH5和8之間，在鹽小于150mM和緩沖強(qiáng)度小于50mM的條件下，sHASEGP糖蛋白在體外對糖胺聚糖底物具有催化活性。如本文中所使用的，穩(wěn)定的溶液是指在室溫保存30天之后，保留大于60%的最初活性的sHASEGP。如本文中所使用的，除非另外特別指出，單位用濁度降低單位(turbidityreducingunits,TRU)來表示。一個(gè)TRU被定義為降低透明質(zhì)酸的酸化溶液的濁度所需要的透明質(zhì)酸酶活性的量，并等同于U.S.P./NationalFormulary(NFXIII)單位(NFU)。本文中描述的ELISA樣酶分析可以通過經(jīng)U.S.P.標(biāo)準(zhǔn)化的透明質(zhì)酸酶樣品(例如USP或WHO標(biāo)準(zhǔn))標(biāo)準(zhǔn)曲線而與TRU、NFU和U.S.P.單位相關(guān)聯(lián)。因此，用ELISA樣酶分析測定的酶活性實(shí)際上是相對TRU，因?yàn)槊富钚圆皇怯脻岫扔?jì)分析實(shí)際測量得到的(Dorfmanetal.，1948,J.Biol.Chem.172:367)。如本文中所使用的，效價(jià)(potency)是用在體外降解底物所需要的sHASEGP蛋白的量來定義的，其基于濁度降低單位或相對濁度降低單位(RelativeTurbidityReducingUnit)。如本文中所使用的，比活性是指每毫克蛋白質(zhì)的活性的單位數(shù)。sHASEGP蛋白的量定義為在280nm處sHASEGP溶液的吸光度，假定摩爾消光系數(shù)為近似1.7，單位為M"cm'1。聚乙二醇(PEG)已經(jīng)被廣泛用于生物材料、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中，主要是因?yàn)镻EG是生物可相容的、無毒的、無免疫原性的和水溶性的聚合物(ZhaoandHarris,ACSSymposiumSeries680:458-72,1997)。在藥物傳送領(lǐng)域，PEG衍生物已經(jīng)被廣泛用于共價(jià)附著到蛋白質(zhì)(即"聚乙二醇化")，以減少免疫原性、蛋白水解和腎清除，并增強(qiáng)溶解性(Zalipsky,Adv.DrugDel.Rev.16:157-82,1995)。類似地，PEG已經(jīng)被附著到低分子量、相對疏水的藥物上，以增加溶解性、減少毒性和改變生物分布(biodistribution)。通常，PEG化的藥物作為溶液被注射。緊密相關(guān)的應(yīng)用是合成交聯(lián)的可降解的PEG網(wǎng)絡(luò)或制劑以用于藥物傳送，因?yàn)樵诳山到獾目扇苄运幬镙d體的設(shè)計(jì)中所使用的相同化學(xué)術(shù)的許多方面也可以用于設(shè)計(jì)可降解的凝膠(Sawhneyetal.,Macromolecules26:581-87，1993)。還知道，大分子間的復(fù)合體可以通過混合兩種互補(bǔ)的聚合物的溶液而形成。此類復(fù)合體一般通過所涉及的聚合物之間的靜電相互作用(聚陰離子-聚陽離子)和/或氫鍵(聚酸-聚堿)，和/或通過在水環(huán)境中聚合物之間的疏水相互作用而被穩(wěn)定化(Krupersetal.,Eur.PolymJ.32:785-790,1996)。例如，聚丙烯酸(PAAc)和聚氧乙烯(PEO)的混合溶液在合適的條件下，主要基于氫鍵而形成復(fù)合體。這些復(fù)合體在生理?xiàng)l件下的解離作用已經(jīng)被用于傳送游離的(即，非PEG化的)藥物。此外，互補(bǔ)聚合物的復(fù)合體已經(jīng)由均聚物和共聚物形成。在一個(gè)方面，聚乙二醇的分子量在約3kD至約50kD范圍內(nèi)，優(yōu)選約5kD至約30kD范圍內(nèi)。通過已知的化學(xué)合成技術(shù)可將PEG共價(jià)附著到藥物(稱為"PEG化"或"聚乙二醇化")。例如，在本發(fā)明的一個(gè)方面，蛋白質(zhì)的PEG化可以通過在合適的反應(yīng)條件下，通過將NHS活化的PEG與蛋白質(zhì)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。盡管已經(jīng)描述了關(guān)于PEG化作用的大量反應(yīng)，最普遍適用的那些反應(yīng)賦予了方向性、使用溫和的反應(yīng)條件，并且不需要大量的下游處理來去除毒性催化劑或副產(chǎn)物。例如，單甲氧基PEG(mPEG)只有一個(gè)活性末端羥基，因此它的使用一定程度地限制了所得到的PEG-蛋白產(chǎn)物混合物的異質(zhì)性。與末端甲氧基基團(tuán)相反的聚合物末端的羥基的激活通常是獲得有效的蛋白質(zhì)PEG化作用所必需的，目的是使得衍生的PEG更容易遭受親核攻擊。攻擊性的親核試劑通常是賴氨酰殘基的s-氨基基團(tuán)，但是其他的胺也可以反應(yīng)(例如組氨酸的N-末端a-胺或環(huán)胺)，如果局部條件是有利的話。在含有單個(gè)賴氨酸或半胱氨酸的蛋白質(zhì)中可能發(fā)生更為定向的附著。后一殘基可以被PEG-馬來酰亞胺作為目標(biāo)，用于硫醇特異性的修飾。可選擇地，PEG酰肼可以與高碘酸鹽氧化的sHASEGP反應(yīng)，并在NaCNBH3存在的條件下被還原。更特別地，PEG化的CMP糖可以與sHASEGP在合適的糖基轉(zhuǎn)移酶存在的條件下發(fā)生反應(yīng)。一種技術(shù)是"聚乙二醇化作用"技術(shù)，其中，許多聚合物分子被偶聯(lián)到被研究的多肽上。當(dāng)使用該技術(shù)時(shí)，免疫系統(tǒng)難以識別形成抗體所需的多肽表面上的表位，從而減少免疫應(yīng)答。對直接引入人體循環(huán)系統(tǒng)以給予特定的生理效應(yīng)的多肽(即藥品)，典型的潛在免疫應(yīng)答是IgG和/或IgM應(yīng)答，而通過呼吸系統(tǒng)吸入的多肽(即工業(yè)多肽)潛在地可以引起IgE應(yīng)答(即過敏應(yīng)答)。解釋減少的免疫應(yīng)答的理論之一是聚合物分子掩蔽了多肽表面上的表位，而正是這些表位對導(dǎo)致抗體形成的免疫應(yīng)答負(fù)有責(zé)任。另一理論或至少部分因素是綴合物越重，所能獲得的免疫應(yīng)答的減少程度越大。在人sHASEGPs應(yīng)用于人體的情況，如本文所述的優(yōu)選的組合，sHASEGP引起免疫應(yīng)答的傾向可以顯著的降低，與例如非人類動(dòng)物來源的酶如?；蚓d羊的透明質(zhì)酸酶相比(例如，即便那些源于動(dòng)物的酶可以從其它源于動(dòng)物的蛋白質(zhì)中完全地被純化出來，但其在實(shí)踐中是非常困難以致于不能實(shí)現(xiàn)的)。盡管人sHASEGPs表現(xiàn)出優(yōu)于動(dòng)物源產(chǎn)品的實(shí)質(zhì)的且非常重要的改進(jìn)，但對于許多應(yīng)用，其還可通過翻譯后修飾(PTMs)如PEG化而被進(jìn)一步改進(jìn)，從而增強(qiáng)其對降解或消除的抵抗能力，和/或改善其它性質(zhì)，使其對于具體應(yīng)用更加有益。例如，盡管對于人類的優(yōu)選組合物(例如，人sHASEGPs)，與動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶或非人類sHASEGPs相比，顯示出降低的免疫原性，此類人sHASEGPs的PEG化可用于例如延長它們在血流和/或身體其它組織中的半衰期。不限制于具體作用機(jī)理，通常認(rèn)為，PEG部分在sHASEGPs上的連接可用于有效地遮蔽分子，降低它對蛋白酶的相對敏感度，也可潛在地降低其從身體中清除和排出的程度和速度。偶聯(lián)到多肽的聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，具有依據(jù)本發(fā)明所限定的分子量，包括天然的和合成的均聚物，諸如多元醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)，以及進(jìn)一步地，雜聚物，即包括一個(gè)或多個(gè)不同的偶聯(lián)基團(tuán)例如羥基基團(tuán)和胺基團(tuán)的聚合物。合適的聚合物分子的例子包括選自下列的聚合物分子聚環(huán)氧烷烴(PAO)，諸如聚亞烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支鏈聚乙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯順丁烯二酸酸酐共聚物、聚苯乙烯蘋果酸酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素和羥丙基纖維素，殼聚糖的水解物，淀粉諸如羥乙基-淀粉和羥丙基-淀粉、糖原、瓊脂糖和其衍生物，瓜爾膠、普魯蘭多糖、菊糖、黃原膠、卡拉膠、果膠、海藻酸水解產(chǎn)物和生物多聚物。優(yōu)選的聚合物分子是無毒性的聚合物分子，諸如(m)聚乙二醇(mPEG)，進(jìn)一步地，它們需要相對簡單的化學(xué)過程便能夠共價(jià)偶聯(lián)到酶表面上的附著基團(tuán)。常見的聚環(huán)氧烷烴(PAO),諸如聚環(huán)氧乙烷，例如PEG，特別是mPEG，是優(yōu)選的聚合物分子，這是因?yàn)檫@些聚合物分子相比多糖例如葡聚糖、普魯蘭多糖和類似物，具有更少的能夠發(fā)生交聯(lián)的活性基團(tuán)，而交聯(lián)是不利的。對PEG化和其它類型的翻譯后修飾(PTMs)的改進(jìn)已經(jīng)非常廣泛，且現(xiàn)有大量PTM技術(shù)和試劑是本領(lǐng)域已知的，新的技術(shù)被定期開發(fā)。PEG化的技術(shù)和試劑包括，例如(i)專門化的連接子和偶聯(lián)化學(xué)(見，例如，Harris,J.M.,Adv.DrugDeliv.Rev.54:459-476(2002)以及其主要參考文獻(xiàn)所綜述的試劑和技術(shù))；(ii)支鏈的PEGs，其有效地使另外的PEG基團(tuán)可以連接到單獨(dú)的結(jié)合位點(diǎn)上(見，例如，Veronese,F.M.etal.,Bioorg,Med,Chem.Lett.12:177-180(2002));(iii)位點(diǎn)特異性(site-specific)PEG化，包括位點(diǎn)特異性單PEG化(見，例如，Chapman,A.Retal.，NatureBiotech.17:780-783(1999));禾口(iv)定點(diǎn)酶促PEG化(site-directedenzymaticPEGylation)(例如，應(yīng)用如Sato,H.,Adv.DrugDeliv.Rev.54:487-504(2002)所描述的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶反應(yīng))。從數(shù)量日益增加的供應(yīng)商那里還可獲得其它技術(shù)和試劑(見，例如，Nektar/Shearwater(www.nektar.com),Sunbio(www.sunbio.com禾口www.sunbio.com/peg-shop)，CelaresGmbH(www.celares.com)，及其它)。B.sHASEGP的組織表達(dá)情況盡管先前認(rèn)為sHASEGP是睪丸特異性的，但當(dāng)使用更靈敏的技術(shù)如RT-PCR時(shí)，發(fā)現(xiàn)人sHASEGP表達(dá)于人的多種組織中。sHASEGP轉(zhuǎn)錄物被發(fā)現(xiàn)于髓質(zhì)(腦)、微血管內(nèi)皮、前列腺、乳房、視網(wǎng)膜、收集的人黑素細(xì)胞、胎兒心臟和懷孕子宮中。sHASEGP也表達(dá)在生殖細(xì)胞腫瘤中。sHASEGP轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR檢測通常是檢測在除睪丸之外的組織中的水平所必需的。C.sHASEGP酶活性的分析透明質(zhì)酸酶活性的比濁微量滴定測定透明質(zhì)酸酶活性可以通過修改的比濁分析在酸化的血清溶液中進(jìn)行檢測。所需要的試劑如下<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>制備下述試劑醋酸鹽緩沖溶液一將14.0g的乙酸鉀和25.0mL的冰乙酸加入水中制得1000mL溶液。磷酸鹽緩沖溶液一將2.5g的磷酸二氫鈉、1.0g的無水磷酸氫鈉和8.2g的氯化鈉加入水中制得1000mL溶液。酶稀釋K:液—500mL的磷酸鹽緩沖溶液加500mL的水。酶稀釋工作液一將33mg的水解明膠加入到50mL的酶稀釋貯液中——制備后2小時(shí)內(nèi)使用。樣品穩(wěn)定緩沖溶液("SSB"Soln.)—將125的20%人血清白蛋白溶液和50的1M氯化鈣溶液加入到50mL的酶稀釋工作液中，充分混合。血清貯存液一用9體積的醋酸鹽緩沖溶液稀釋1體積的馬血清。用4N鹽酸將pH值調(diào)到3.1，并使溶液在室溫保持18至24小時(shí)。將溶液保存在4°C，并在30天內(nèi)使用。血清工作液一將10mL的血清貯液加入到30mL的醋酸鹽緩沖溶液中，調(diào)節(jié)到室溫。透明質(zhì)酸貯液一將透明質(zhì)酸鈉配制為濃度為5.0mg/mL的水溶液。透明質(zhì)酸工作液一將0.75mL的透明質(zhì)酸貯液加入到4.25mL的磷酸鹽緩沖溶液。標(biāo)準(zhǔn)品貯液一在一個(gè)容器中制備濃度為1000單位/mL的USP參照標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸酶的水溶液，分為50pL的小份，保存在-20'C。標(biāo)準(zhǔn)品工作液一將40的標(biāo)準(zhǔn)品貯液加入到960的冷酶稀釋工作液，獲得已知濃度為40單位/mL的溶液，制備后立即用于測定中。依據(jù)下述指導(dǎo)，將所有的酶樣品稀釋于"低蛋白結(jié)合(LowProteinBinding)"96-孔板中。a)該測定的最大靈敏度的范圍在10-30單位/mL之間。為了獲得在該范圍內(nèi)的結(jié)果，測定需要反復(fù)進(jìn)行，為了使次數(shù)最小化，首先確定樣品的總單位數(shù)/mL的近似值，然后選擇稀釋倍數(shù)(整數(shù))，以便最終濃度為大約20單位/ml。b)為了實(shí)施測定所需要的最小樣品體積描述如下FPLC級分-50pL，組織培養(yǎng)物上清液=1mL，純化的/濃縮的/最終步驟的材料-10pL。c)對于連續(xù)稀釋的樣品，通過將360nL的"SSB"溶液和40pL的樣品吸到各個(gè)孔中，在"低蛋白結(jié)合"96-孔板上進(jìn)行l(wèi):10的稀釋，一式三份。為了制備USP標(biāo)準(zhǔn)，按如下所述利用"低蛋白結(jié)合"96-孔板制備USP標(biāo)準(zhǔn)曲線USP標(biāo)準(zhǔn)曲線酶標(biāo)準(zhǔn)最終稀釋工作濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(UL):溶液(uL):(單位/mL):Al-A3St01010040Bl-B3St02208032C1層C3St03406024Dl-D3St04604016El-E3St0580208Fl-F3St06卯104Gl-G3St0710000為了制備1-3欄的透明質(zhì)酸對照，按如下所述在"平底"96-孔板中制備H.A.對照H.A.對照透明質(zhì)酸酶稀釋孔對照:工作溶液&L):工作溶液(uL)Hl-H3Co01060反應(yīng)板(ReactionPlate):以每孔30^L的量，使用50pL8-通道轉(zhuǎn)移移液管，將透明質(zhì)酸工作液吸放到"平底"96-孔微量滴定板，讓孔H1-H3空著。以60pL/孔的量，將酶稀釋工作液吸放到同樣的板的孔H1-H3中，作為HA對照。血清工作液將40mL的血清工作液分配入轉(zhuǎn)移盤(transferbasin),并靠近熱塊(HeatBlock)。預(yù)熱階段一旦兩種板制備完成，將含有稀釋樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、對照的低蛋白結(jié)合96-孔板，和含有透明質(zhì)酸工作液的平底96-孔板置于熱塊上，將它們在37'C溫?zé)?分鐘。通過將酶加入到底物來起始反應(yīng)使用5-50pL8-通道移液管將來自酶板的3(HiL加入到96-孔平底板(含底物)的#1欄中的所有孔中。在第一個(gè)15秒中，將酶/底物反應(yīng)混合物吹吸5次(用移液器上下吹吸溶液)，以確保樣品完全混合。將酶和底物混合之后，去除掉吸頭，將一組新的吸頭裝載于轉(zhuǎn)移移液管上以用于下一欄的操作。重新啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，在時(shí)間(t)=0:30時(shí)，對欄2重復(fù)該過程。在下一30秒間隔(t)-l:00時(shí)，對欄3重復(fù)該過程。該過程從左到右橫跨整個(gè)板重復(fù)進(jìn)行，每30秒進(jìn)行一次，直到所有的孔含有酶和底物。終止反應(yīng)當(dāng)時(shí)間達(dá)到6分鐘(t)=6:00時(shí)，使用50-300j^L8-通道轉(zhuǎn)移移液管，將240pL的血清工作液吸放到每一個(gè)孔，由臨近的5011^試劑容器吸放到96-孔平底板的欄l中。在第一個(gè)10秒中，混合物被吹吸3次(用移液器上下吹吸溶液)，以確保完全混合。該過程每30秒重復(fù)一次，從欄1進(jìn)行到欄12。一旦完成最后一欄(欄12)，將反應(yīng)板從熱塊上移去，并將板置于平板讀數(shù)器的讀數(shù)盤上，640nM。由標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生線性曲線擬合，由此可以對受測樣品進(jìn)行推導(dǎo)。透明質(zhì)酸酶的其它可供選擇的分析方法生物素化透明質(zhì)素微量滴定分析使用生物素-酰肼(Pierce)、硫代NHS(Pierce)和1-乙基二甲氨基丙基-碳二亞胺(Sigma)，使透明質(zhì)素的葡糖醛酸殘基上的自由羧基在一步反應(yīng)中被生物素化。該生物素化的HA底物在第二個(gè)反應(yīng)中，被共價(jià)偶聯(lián)到96孔微滴定板上。酶反應(yīng)完成時(shí)，殘留的底物用抗生物素蛋白-過氧化物酶反應(yīng)進(jìn)行檢測，其可以用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板讀數(shù)器讀出。因?yàn)榈孜锸潜还矁r(jià)結(jié)合于微滴定板，所以矯作結(jié)果(artifact)例如生物素化底物的pH依賴性置換沒有發(fā)生。靈敏度使得能夠?qū)碜耘囵B(yǎng)細(xì)胞和生物樣品的透明質(zhì)酸酶活性進(jìn)行快速測定，分析之間的偏差小于10%。透明質(zhì)酸酶的比活性用濁度降低單位(turbidityreducingunits,TRU)來表示。一個(gè)TRU被定義為降低透明質(zhì)酸的酸化溶液的濁度所需要的透明質(zhì)酸酶活性的量，并等同于U.S.P./NationalFormulary(NFXIII)單位(NFU)。用于純化的ELISA樣酶分析可以通過經(jīng)U.S.P.標(biāo)準(zhǔn)化的透明質(zhì)酸酶樣品(例如USP)的標(biāo)準(zhǔn)曲線而與TRU、NFU和U.S.P.單位相關(guān)聯(lián)。因此，用ELISA樣酶分析測定的酶活性實(shí)際上是相對TRU，因?yàn)槊富钚圆皇怯脻岫扔?jì)分析實(shí)際測量得到的(Dorfinanetal.,1948，J.Biol.Chem.172:367)。許多透明質(zhì)酸酶分析是基于測量新的還原性N-乙酰氨基基團(tuán)的產(chǎn)生(BonnerandCantey,Clin.Chim.Acta13:746-752,1966)，或粘性的損失(DeSaleguietal.，Arch.Biochem.Biophys121:548-554,1967)或濁度的損失(DorfmanandOtt，歷W.172:367,1948)。采用純化的底物，所有這些方法足以測定內(nèi)切葡萄糖月安活性(endoglucosamidicactivity)的存在或不存在?；旧霞兓奶前肪厶堑孜镆部梢员挥糜谀z遷移分析(GeShiftAssay)。將糖胺聚糖與重組sHASEGP混合，以測試內(nèi)切葡糖苷酶活性，所述的內(nèi)切葡糖苷酶活性導(dǎo)致底物在凝膠中的遷移率發(fā)生變化。硫酸軟骨素-4和硫酸軟骨素-6、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素可以從SigmaChemical獲得。人臍帶透明質(zhì)素可以從ICN獲得。將每一受測底物用pH3.5-7.5范圍內(nèi)的緩沖液稀釋到0.1mg/ml。10pL純化的sHASEGP樣品或來自表達(dá)sHASEGP的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與90^1的受測底物在期望的緩沖液中混合，并在37'C溫育3小時(shí)。溫育之后，樣品用樣品緩沖液(TrisEDTApH8.0、溴酚藍(lán)和甘油)中和，然后進(jìn)行電泳。通過在含有0.5%阿爾新藍(lán)的3%冰乙酸中將凝膠染色過夜，然后在7%冰乙酸中脫色，來檢測糖胺聚糖。通過比較存在和不存在酶的情況下的底物遷移率，對降解結(jié)果進(jìn)行測定。透明質(zhì)酸酶活性也可以用底物凝膠酶譜法(substrategelzymography)進(jìn)行檢測(Guentenhoneretal.,1992，Matrix388-396)。在這種測定中，將樣品應(yīng)用于含有透明質(zhì)酸的SDS-PAGE凝膠，然后通過電泳分離樣品中的蛋白。然后將該凝膠在酶分析緩沖液中溫育，隨后進(jìn)行染色，以檢測凝膠中的透明質(zhì)酸。通過底物凝膠中的透明帶(clearedzone),可以看出透明質(zhì)酸酶活性。D.sHASEGP多肽基因的鑒定和分離sHASEGP多肽基因和/或其結(jié)構(gòu)域可以通過利用本領(lǐng)域已知的DNA分離方法獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的用于鑒定編碼期望基因的核酸的任何方法都可以被使用。本領(lǐng)域可以利用的任何方法都可以用來獲得編碼sHASEGP多肽的全長(即包括整個(gè)編碼區(qū))cDNA或基因組DNA克隆。例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以用來從基因組或cDNA文庫中擴(kuò)增在正常組織中表達(dá)的序列，例如編碼sHASEGP多肽的核酸(SEQ.No:l和2)。與在鑒定的序列的3'和5'末端的序列雜交的寡核苷酸引物可以被用作引物，以便通過PCR擴(kuò)增來自合適的來源(例如睪丸、前列腺、乳腺)的核酸樣品(RNA或DNA，一般是cDNA文庫)的序列。PCR可以例如通過使用Perkin-ElmerCetus熱循環(huán)儀和Taq聚合酶(GeneAmp)來進(jìn)行。被擴(kuò)增的核酸可以包括來自真核物種的mRNA或cDNA或基因組DNA。可以選擇合成若干不同的簡并引物，以用于PCR反應(yīng)。也可以改變用于引發(fā)PCR反應(yīng)的雜交條件的嚴(yán)格性，以便擴(kuò)增核酸同源物(例如，為了從除人之外的物種獲得sHASEGP多肽序列，或?yàn)榱双@得與sHASEGP多肽同源的人序列)，這通過允許在已知的核苷酸序列和正在被分離的核酸同源物之間存在更大或更小的核苷酸序列相似性來進(jìn)行。對于種間交叉雜交(cross-specieshybridization),可以使用低至中等嚴(yán)格性的條件。對相同物種的雜交，可以使用中等嚴(yán)格至高度嚴(yán)格的條件。這些條件可以經(jīng)驗(yàn)性確定。在含有整個(gè)的或部分的被鑒定的sHASEGP多肽序列的核酸，或編碼整個(gè)的或部分的sHASEGP多肽同源物的核酸，被成功擴(kuò)增之后，該片段可以進(jìn)行分子克隆和測序，并可用作探針來分離全cDNA或基因組克隆。這又使得能夠測定該基因的全部核苷酸序列、分析它的表達(dá)，和生產(chǎn)它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物以用于功能分析。一旦核苷酸序列被確定，編碼sHASEGP多肽基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的開放閱讀框，可以用本領(lǐng)域已知的用于確定開放閱讀框的任何方法來確定，例如，使用用于核苷酸序列分析的公眾可得的計(jì)算機(jī)程序來確定開放閱讀框。一旦開放閱讀框被限定之后，確定由該開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列便是常規(guī)的了。這樣，整個(gè)sHASEGP多肽基因的核苷酸序列以及sHASEGP多肽蛋白質(zhì)和類似物的氨基酸序列得以確定。任何真核細(xì)胞都可能作為用于sHASEGP多肽基因的分子克隆的核酸來源。核酸可以從脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、人、豬、牛、貓、鳥、馬、犬以及其他靈長類來源、昆蟲、植物和其他生物體分離得到。DNA可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序從克隆的DNA(例如DNA"文庫")獲得、由化學(xué)合成獲得、由cDNA克隆獲得，或通過對從期望的細(xì)胞純化獲得的基因組DNA或其片段進(jìn)行克隆而獲得(參見如Sambrooketal.1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Glover,D.M.Ed，1985，DNACloning:APracticalApproach,MRLPress,Ltd.，Oxford,U.K.Vol,1,11)。從基因組DNA獲得的克隆除了編碼區(qū)域之外，可以含有調(diào)控DNA區(qū)域和內(nèi)含子DNA區(qū)域；從cDNA獲得的克隆將只含有外顯子序列。對于任何來源，將該基因克隆入合適的載體，以對其進(jìn)行增殖。對來自基因組DNA的基因進(jìn)行分子克隆，產(chǎn)生DNA片段，其中的一些將編碼想要的基因。使用各種限制性酶，可以將DNA在特定位點(diǎn)切割。可選擇地，可以使用DNAse在錳存在的條件下切碎DNA，或者可以用物理的方法剪切DNA，例如利用超聲波法。線性DNA片段然后可以依據(jù)大小用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行分離，包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析。—旦DNA片段被產(chǎn)生，對含有想要的基因的特定DNA片段的鑒定可以用許多方法來完成。例如，(任何物種的)sHASEGP多肽基因的一部分(例如按上面描述的方法獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，或具有已知的核苷酸序列的一部分序列的寡核苷酸)或它的特定RNA，或其片段可以被純化和標(biāo)記，所產(chǎn)生的DNA片段可以通過將核酸與標(biāo)記的探針雜交而進(jìn)行篩選(BentonandDavis,Science196:180(1977);GrunsteinandHogness,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961(1975))。與該探針基本上同源的那些DNA片段將發(fā)生雜交。也能夠通過下述方法鑒定正確的片段進(jìn)行限制性酶消化，并將依據(jù)已知的限制性圖譜——如果可獲得的話——所期望的那些片段大小與消化片段大小相比較來鑒定正確的片段；或進(jìn)行DNA序列分析，并與sHASEGP多肽的已知核苷酸序列進(jìn)行比較來鑒定正確的片段。依據(jù)該基因的特性還可以作進(jìn)一步的篩選。可選擇地，可以通過基于它的表達(dá)產(chǎn)物的物理、化學(xué)或免疫學(xué)特性的分析，來檢測該基因的存在與否。例如，雜交-選擇正確的mRNA的cDNA克隆或DNA克隆可以被選擇，其產(chǎn)生具有類似或相同的電泳遷移行為、等電聚焦行為、蛋白水解消化圖譜、抗原特性、透明質(zhì)酸酶活性的蛋白質(zhì)。如果抗sHASEGP多肽的抗體是可以利用的，可以在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)類型的程序中，通過標(biāo)記的抗體與推斷的合成sHASEGP多肽的克隆的結(jié)合來鑒定蛋白質(zhì)。分離sHASEGP多肽基因組DNA的可供選擇的方法包括，但不限于利用已知的序列通過化學(xué)的方法合成基因序列，或由cDNA制備編碼sHASEGP多肽的mRNA。例如，用于sHASEGP多肽基因的cDNA克隆的RNA可以從表達(dá)該蛋白的細(xì)胞中分離得到。然后可以將被鑒定和分離出的核酸插入到合適的克隆載體中。可以使用許多本領(lǐng)域已知的載體-宿主系統(tǒng)?？赡艿妮d體包括但不限于質(zhì)?；蛐揎椀牟《?，但是載體系統(tǒng)必須與所使用的宿主細(xì)胞相容。此類載體包括但不限于細(xì)菌噬菌體，諸如X衍生物，或質(zhì)粒，諸如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物或Bluescript載體(Stratagene，LaJolla,CA)。例如，通過將DNA片段連接入攜帶有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體中，可以將DNA片段插入到克隆載體中。如果克隆載體中不存在用于切割該DNA的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)，DNA分子的末端可以進(jìn)行酶法修飾?？蛇x擇地，通過將核苷酸序列(接頭)連接到DNA末端，可以產(chǎn)生任何想要的位點(diǎn)，這些被連接的接頭可以包括特定的化學(xué)合成的寡核苷酸，其編碼限制性核酸內(nèi)切核酸酶識別序列。在另一方法中，切割的載體和sHASEGP多肽基因可以用均聚物加尾(homopoymerictailing)的方式進(jìn)行修飾。重組分子可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔、鈣沉淀和其他方法被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，這樣，產(chǎn)生許多拷貝的基因序列。在具體的實(shí)施方案中，用整合有分離的sHASEGP多肽基因、cDNA或合成的DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，能產(chǎn)生多拷貝的基因。因此，基因可以通過下述方法大量獲得培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，從轉(zhuǎn)化子中分離重組DNA分子，并且必要時(shí)，從分離的重組DNA中回收感興趣的基因。E.含有編碼sHASEGP多肽或其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸的載體、質(zhì)粒和細(xì)胞，以及sHASEGP多肽載體和細(xì)胞的表達(dá)為了重組表達(dá)一種或多種sHASEGP多肽，含有編碼sHASEGP多肽的核苷酸序列的所有序列或部分序列的核酸可以被插入到合適的表達(dá)載體中，所述的表達(dá)載體含有用于轉(zhuǎn)錄或翻譯插入的蛋白質(zhì)編碼序列的必要元件。必要的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號也可以由sHASEGP基因的天然啟動(dòng)子和/或它們的側(cè)翼區(qū)域提供。也提供了這樣的載體，其含有編碼sHASEGPs的核酸，該核酸可以被導(dǎo)入到能夠產(chǎn)生可溶性中性活性sHASEGP的表達(dá)系統(tǒng)中。也提供了含有載體的細(xì)胞。所述細(xì)胞包括真核和原核細(xì)胞，所述載體適合用于那些細(xì)胞中。提供了含有載體的真核細(xì)胞，包括二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細(xì)胞(DG44)。合適的細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以被用來生產(chǎn)sHASEGP多肽或其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，通過下述方法(a)將上述細(xì)胞在編碼的sHASEGP多肽或sHASEGP多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域被細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)，然后(b)回收表達(dá)的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域蛋白。在示范性的實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域被分泌入培養(yǎng)基中。在一種實(shí)施方案中，提供的載體包括編碼多肽的核苷酸序列，其中，該多肽具有透明質(zhì)酸酶活性并且含有sHASEGP蛋白的僅僅透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的整個(gè)部分或一部分或其多份拷貝。也提供了這樣的載體，其包括編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域和sHASEGP蛋白的額外部分——可長達(dá)全長sHASEGP蛋白和包括全長sHASEGP蛋白質(zhì)——的核苷酸序列，也提供其多個(gè)拷貝。載體可以被選擇以便在細(xì)胞中表達(dá)sHASEGP蛋白質(zhì)或其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，或，sHASEGP蛋白可以作為分泌蛋白而被表達(dá)。可選擇地，載體可以包括對于編碼蛋白的分泌所必需的信號。當(dāng)透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域被表達(dá)時(shí)，核酸被連接到編碼分泌信號的核酸上，所述信號序列諸如釀酒酵母"acc/jaramyc"cev/s/ae)的交配因子(matingfactor)信號序列或其部分，或天然的信號序列。為了產(chǎn)生可溶性的中性活性的sHASEGP，能夠引入N-連接糖基化作用的細(xì)胞是被要求的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，二氫葉酸還原酶缺陷型哺乳動(dòng)物中國倉鼠卵巢細(xì)胞諸如DG44，用質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)，所述質(zhì)粒編碼強(qiáng)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子諸如CMV、sHASEGP編碼核酸以及跟隨著的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、小鼠二氫葉酸還原酶基因和SV40多聚腺苷酸化序列，如SEQIDN0.51所顯示。然后將此類細(xì)胞在缺少次黃嘌呤和胸苷的化學(xué)成份確知的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再用增加濃度的甲氨蝶呤進(jìn)行基因擴(kuò)增。各種宿主-載體系統(tǒng)可以被用來表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。這些包括但不限于用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物諸如含有酵母載體的酵母；或用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或黏粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。載體的表達(dá)元件在它們強(qiáng)度和特異性方面有所變化。取決于所使用的宿主-載體系統(tǒng)，大量合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種可以被使用。注意，sHASEGPDNA在細(xì)菌中的表達(dá)本身不會產(chǎn)生具有催化活性的sHASEGP，但是當(dāng)與合適的糖基化作用聯(lián)合時(shí)——可以通過人工的方法進(jìn)行這樣的糖基化作用，便能產(chǎn)生具有催化活性的sHASEGP。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的用于將核酸片段插入載體的任何方法都可以被用于構(gòu)建含有嵌合基因的表達(dá)載體，其含有合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白質(zhì)編碼序列。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。編碼sHASEGP多肽或其結(jié)構(gòu)域、衍生物、片段或同源物的核酸序列的表達(dá)可以受到另一核酸序列的調(diào)控，以便基因或其片段表達(dá)于用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中。例如，蛋白質(zhì)的表達(dá)可以受到本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制。在特定的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子對于sHASEGP多肽的基因來說不是天然的?？梢员皇褂玫膯?dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子(BernoistandChambon,Nature290:304-310(1981)、包含在勞斯肉瘤病毒的3'長末端重復(fù)序列中的啟動(dòng)子(Yamamotoetal.,Ce〃22:787-797(1980)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagneretal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinsteretal.,Nature296:39-42(1982));原核表達(dá)載體諸如e-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroffetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3727-37311978))或TAC啟動(dòng)子(Deboeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983》;也參見"UsefulProteinsfromRecombinantBacteria":inScientificAmerican242:79-94(1980));包含opaline合成酶啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體(Herrar-Estrellaetal.，Nature303:209-213(1984))或花椰菜花葉病毒35SRNA啟動(dòng)子(Garderetal.,NucleicAcidsRES.9:2871(1981))，和光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動(dòng)子(Herrera-Estrellaetal.,Nature310:115-120(1984));來自酵母和其他真菌的啟動(dòng)子元件諸如Gal4啟動(dòng)子、乙醇脫氫酶啟動(dòng)子、磷酸甘油激酶啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子，和下述的顯示出組織特異性并已被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域在胰腺腺泡細(xì)胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(SwiftEtAl.,Cell38:639-646(1984);OrnitzEtAl"ColdSpringHarborSymp.QuantBiol.50:399-409(1986);Macdonald,Hepatology7:425-515(1987));在胰腺p細(xì)胞中具有活性的胰島素基因控制區(qū)域(HanahanetAL.,Nature315:115-122(1985)),在淋巴細(xì)胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(GrosschedletAL.,Cell38:647-658(1984);Adamsetal.,Nature318:533-538(1985);AlexanderetAL.,Mol.CellBiol,7:1436-1444(1987))，在睪丸、乳房、淋巴和肥大細(xì)胞中具有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(LederetAL.,CELL45:485-495(1986))，在肝臟中具有活性的白蛋白基因控制區(qū)(PINCKERTetAL.,GenesandDevel.1:268-276(1987))，在肝臟中具有活性的a-胎蛋白基因控制區(qū)(KrumlaufetAL"Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985);HammeretAL.,Science235:53-581987))，在肝臟中具有活性的a-1抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelseyetal.，GenesAndDevel.1:161-171(1987))，在髓細(xì)胞中具有活性的卩球蛋白基因控制區(qū)(Mogrametal.,Nature315:338-340(1985);KolliasetAL.，CE〃46:89-94(1986)),在腦的少突細(xì)胞中具有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readheadetal.,Cell48:703-712(1987))，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani,Nature314:283-286(1985))，和在下丘腦的促性腺激素細(xì)胞中具有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(Masonetal.,Science234:1372-1378(,)。在特定的實(shí)施方案中，使用這樣的載體，其含有啟動(dòng)子，其可操作地連接到編碼sHASEGP多肽或其結(jié)構(gòu)域、片段、衍生物或同源物的核酸，還含有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以及任選地，一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記(例如抗生素抗性基因)。特定的起始信號是有效地翻譯sHASEGP序列所需要的。這些信號包括ATG起始密碼子和臨近的序列。對于sHASEGP，在它的起始密碼子和上游序列被插入到合適的表達(dá)載體中的情況下，可以不需要額外的翻譯控制信號。然而，在僅僅編碼序列或其一部分被插入的情況下，需要提供外源的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號，包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼子必須在正確的閱讀框中，以確保整個(gè)插入物能夠轉(zhuǎn)錄。外源的轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是各種來源的，可以天然的或合成的。通過包含適合于所使用的細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子，表達(dá)的效率可以得到增強(qiáng)(ScharfDetal(1994)ResultsProblCellDiffer20:125-62;Bittneretal(1987)MethodsinEnzymol153:516-544)。此外，可以選擇能夠調(diào)節(jié)插入的序列的表達(dá)或能以期望的方式對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工的宿主細(xì)胞菌株。對多肽的此類修飾包括但不限于乙?；饔谩Ⅳ然饔?、糖基化作用、磷酸化作用、脂化作用和酰化作用。對"前原(prepro)"形式的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割的翻譯后加工，對于正確的插入、折疊和/或功能也是重要的。不同的宿主細(xì)胞諸如CHO(DG44、DXB11CHO-Kl)、HeLa、MDCK、293、WI38等都具有實(shí)現(xiàn)這樣的翻譯后活性的特定細(xì)胞器(cellularmachinery)和特征機(jī)制(characteristicmechanisms),可以對它們加以選擇以確保對引入的外來蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和加工。為了長期地高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，穩(wěn)定表達(dá)sHASEGP的細(xì)胞系可以用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源性表達(dá)元件和選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。引入載體后，細(xì)胞可以在加富培養(yǎng)基中培養(yǎng)l-2天，再轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基。選擇性標(biāo)記的目的是賦予抗性以便進(jìn)行選擇，它的存在使得成功地表達(dá)被引入的序列的細(xì)胞能夠生長和被回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性群落(resistantclumps)可以用適合于該細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行增殖。大量的選擇系統(tǒng)可以被用于回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。這些包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(WiglerMetal(1977)CellU:223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(LowyIetal(1980)Cell22:817-23)基因，它們分別可以被用于TK-或APRT-細(xì)胞。另外，抗代謝藥、抗生素或除草劑抗性可以被用作選擇的基礎(chǔ)；例如DHFR，其賦予對甲氨蝶呤的抗性(WiglerMetal(1980)ProcNatlAcadSci77:3567-70);npt,其賦予對氨基糖苷新霉素和G-418的抗性(Colbere-GarapinFetal(1981)JMolBiol150:1-14),和als或pat,其分別賦予對氯磺隆和草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性(Muny,supra)。其他的選擇基因已經(jīng)被描述，例如，trpB，其使得細(xì)胞可以利用B引哚來替代色氨酸，或hisD，其使得細(xì)胞可以利用組氨醇來替代組氨酸(HartmanSCandRCMulligan(1988)ProcNatlAcadSci85:8047-51)。最近，使用可視化的標(biāo)記已成為流行，這樣的標(biāo)記如花青素、P葡糖醛酸酶和它的底物GUS以及熒光素酶和它的底物蟲熒光素，這不但己經(jīng)被廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化子，也被用于對通過特定的載體系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的瞬時(shí)或穩(wěn)定的蛋白表達(dá)進(jìn)行量化(RhodesCAetal(1995)MethodsMolBiol55:121-131)。對含多核苷酸序列的轉(zhuǎn)化體的鑒定盡管標(biāo)記基因表達(dá)的存在/不存在表明了感興趣的基因的存在與否，但是活性sHASEGP的存在和表達(dá)應(yīng)該被確證。例如，如果sHASEGP被插入到標(biāo)記基因序列中，含有sHASEGP的重組細(xì)胞可以通過標(biāo)記基因功能的缺乏而得以鑒定?？蛇x擇地，標(biāo)記基因可以與sHASEGP序列一前一后地置于單個(gè)啟動(dòng)子的控制之下。標(biāo)記基因因誘導(dǎo)或選擇而發(fā)生的表達(dá)通常表示與之串連的sHASEGP也被表達(dá)。通過在合適的條件下測試條件培養(yǎng)基的sHASEGP酶活性，可以檢測被適當(dāng)糖基化的具有中性活性的sHASEGP。sHASEGP的純化用sHASEGP核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在適合于表達(dá)被編碼的蛋白質(zhì)和從細(xì)胞培養(yǎng)物中對其進(jìn)行回收的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)優(yōu)選是可分泌的，但可以被包含于細(xì)胞內(nèi)，這取決于所使用的序列和/或載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，包含sHASEGP的表達(dá)載體，可以設(shè)計(jì)為具有信號序列，這有利于sHASEGP通過原核或真核細(xì)胞膜直接分泌出來。其他重組構(gòu)建可以將sHASEGP與編碼有助于可溶性蛋白的純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列連接起來(KrollDJetal(1993)DNACellBiol12:441-53;cfdiscussionofvectorsinfracontainingfusionproteins)。sHASEGP也可以與一個(gè)或多個(gè)額外的多肽結(jié)構(gòu)域一起作為重組蛋白表達(dá)，添加這些額外的多肽結(jié)構(gòu)域是為了方便蛋白純化。這樣的有助于純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬螯合肽，諸如組氨酸-色氨酸模塊，其允許在固定化的金屬上進(jìn)行純化，蛋白A結(jié)構(gòu)域，其允許在固定化的免疫球蛋白上進(jìn)行純化，以及用于FLAGS延伸/親合純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域(ImmunexCorp,SeattleWash.)。在所述純化結(jié)構(gòu)域和sHASEGP之間包含入可切割的連接子序列諸如因子Xa或腸激酶(Invitrogen,SanDiegoCalif.)，可用于幫助純化。一種這樣的表達(dá)載體提供了包含sHASEGP的融合蛋白的表達(dá)，并含有編碼6-組氨酸殘基的核酸，并接有硫氧還蛋白和腸激酶切割位點(diǎn)。所述組氨酸殘基有助于在IMIAC(固定化金屬離子親合層析)上進(jìn)行純化，如Porathetal(1992)ProteinExpressionandPurification3:263-281中所述，而腸激酶切割位點(diǎn)為由融合蛋白純化出趨化因子提供了手段。除了重組生產(chǎn)之外，sHASEGP的片段也可以使用固相技術(shù)通過直接的肽合成產(chǎn)生(cfStewartetal(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,SanFrancisco;MerrifieldJ(1963)JAmChemSoc85:2149-2154)。使用手工技術(shù)或自動(dòng)化技術(shù)，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的體外合成。自動(dòng)化合成例如可以通過使用AppliedBiosystems431A肽合成儀(PerkinElmer,FosterCityCalif.)，依據(jù)制造商提供的說明書來完成。sHASEGP的不同片段可以分別進(jìn)行化學(xué)合成，然后使用化學(xué)的方法組合起來，產(chǎn)生全長的分子。含有sHASEGP多肽的編碼序列或其部分的表達(dá)載體，例如可以通過將所述編碼部分亞克隆入3個(gè)PGEX載體中的每一個(gè)的EcoRI限制性位點(diǎn)而制備得到(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體(SmithandJohnson,Gene7:31-40(1988))。這使得產(chǎn)物可以以正確的閱讀框被表達(dá)。用于表達(dá)sHASEGP多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的示范性載體和系統(tǒng)包括公知的畢赤酵母(P/'cW")載體(例如可從Invitrogen,SanDiego,CA獲得)，特別是那些設(shè)計(jì)用于分泌被編碼的蛋白質(zhì)的載體和系統(tǒng)。蛋白質(zhì)也可以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被表達(dá)，諸如以包涵體的形式。一種示范性的載體描述于實(shí)施例中。用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的質(zhì)粒包括例如pET表達(dá)載體(參見美國專利4,952,496;可從Novagen,Madison,WI獲得；也參見Novagen出版的文獻(xiàn)，其描述了該系統(tǒng))。這樣的質(zhì)粒包括pETlla，其包含T71ac啟動(dòng)子、T7終止子、誘導(dǎo)型大腸桿菌lac操縱子和lac阻遏物基因；pET12A-C，其含有T7啟動(dòng)子、T7終止子和大腸桿菌OMPT分泌信號；禾口pET15B和pET19B(Novagen,Madison,Wi)，其含有便于用His柱純化的His-Tag前導(dǎo)序列和便于在柱純化之后進(jìn)行切割的凝血酶切割位點(diǎn)；T7-lac啟動(dòng)子區(qū)域和T7終止子。載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，諸如畢赤酵母細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌中，蛋白質(zhì)表達(dá)于其中。示范性的畢赤酵母菌株例如包括GS115。示范性的細(xì)菌宿主含有編碼T7RNA聚合酶的DNA的染色體拷貝，其可操作地連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如LACUV啟動(dòng)子(參見美國專利4,952,496)。這樣的宿主包括但不限于溶原性大腸桿菌菌株BL21(DE3)。sHASEGP結(jié)構(gòu)域、衍生物和類似物可以通過各種本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。例如，一旦表達(dá)HASEGP多肽或其結(jié)構(gòu)域、片段或衍生物的重組細(xì)胞被鑒定出之后，單獨(dú)的基因產(chǎn)物可以被分離和分析。這可以通過基于該蛋白的物理/或功能特性的分析來實(shí)現(xiàn)，所述分析包括但不限于對產(chǎn)物進(jìn)行放射性標(biāo)記，然后通過凝膠電泳、免疫測定、與標(biāo)記物標(biāo)記的產(chǎn)物進(jìn)行交聯(lián)和測定蛋白水解活性來進(jìn)行分析。sHASEGP多肽可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(或從天然來源或從表達(dá)復(fù)合物或蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞)分離和純化，包括但不限于柱層析(例如，離子交換、親和、凝膠排阻、反相高壓和快速蛋白質(zhì)液相)、差速離心、差異溶解度或用于蛋白質(zhì)純化的其它任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在一種實(shí)施方案中，sHASEGP可以由HZ24轉(zhuǎn)染和甲氨蝶呤擴(kuò)增的DG44細(xì)胞的化學(xué)成分確定的條件培養(yǎng)基中純化至同質(zhì)，這通過下述方法進(jìn)行1)切向流滲濾，2)利用陰離子交換層析進(jìn)行結(jié)合并洗脫，3)流經(jīng)苯基瓊脂糖層析，4)利用苯基硼酸鹽層析進(jìn)行結(jié)合并洗脫，和4)利用羥磷灰石層析進(jìn)行結(jié)合并洗脫?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的分析方法來評價(jià)功能特性。可選擇地，一旦鑒定出sHASEGP多肽或它的結(jié)構(gòu)域或衍生物，該蛋白的氨基酸序列可以從編碼它的基因的核苷酸序列推斷出來。結(jié)果，蛋白或它的結(jié)構(gòu)域或衍生物可以用本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法合成得到(例如參見Himkapilleretal，Nature310:105-111(1984))，再進(jìn)行體外的糖基化作用。可以在蛋白質(zhì)水平對sHASEGP多肽序列進(jìn)行操作。本文也考慮這樣的sHASEGP多肽蛋白、其結(jié)構(gòu)域、其衍生物或類似物或片段，其在翻譯期間或翻譯后進(jìn)行不同的修飾，例如通過糖基化作用、乙?；饔?、磷酸化作用、氨基化作用、聚乙二醇化作用、通過已知的保護(hù)/封阻基團(tuán)進(jìn)行的衍生化作用、蛋白質(zhì)水解切割、連接到抗體分子或其他細(xì)胞配體。許多化學(xué)修飾中的任何一種都可以用已知技術(shù)來實(shí)施，包括但不限于用溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8、NABH4進(jìn)行特異性的化學(xué)切割，乙?；饔?、甲酰基化作用、氧化作用、還原作用、新陳代謝合成，這是在衣霉素和其他這樣的試劑存在的情況下進(jìn)行的。此外，sHASEGP多肽的結(jié)構(gòu)域、類似物和衍生物可以化學(xué)合成。例如，對應(yīng)于sHASEGP多肽的某部分的肽——其包括想要的結(jié)構(gòu)域或者其在體外介導(dǎo)想要的活性——可以使用肽合成儀來合成。而且，如果有必要的話，非典型的氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可以被引入，以替代或加入到sHASEGP多肽序列?？傮w上說，非典型的氨基酸包括但不限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體、a-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、E-ABU、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、e-丙氨酸、氟代氨基酸、特別設(shè)計(jì)的氨基酸諸如e-甲基氨基酸、ca-甲基氨基酸、na-甲基氨基酸和氨基酸類似物。此外，氨基酸可以是d(右旋)或1(左旋)的。當(dāng)天然產(chǎn)物被懷疑是突變體或者是分離自新種時(shí)，分離自該天然來源的sHASEGP多肽的氨基酸序列，以及那些在體外表達(dá)的或者在體內(nèi)或體外由合成的表達(dá)載體表達(dá)的多肽的氨基酸序列，可以通過對DNA序列的分析來確定，或者可選擇地，可以通過對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行直接測序來確定。這樣的分析可以通過人工測序或通過使用自動(dòng)氨基酸測序儀來實(shí)施。修飾一本文考慮了sHASEGP多肽和結(jié)構(gòu)域的許多的修飾。編碼sHASEGP的核酸分子可以利用本領(lǐng)域已知的許多策略的任何策略來進(jìn)行修飾(SambrookETA/.(1990),MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork)。這些序列可以用限制性內(nèi)切核酸酶在合適的位點(diǎn)進(jìn)行切割，然后進(jìn)行進(jìn)一步的酶促修飾，如果有必要的話，再分離并進(jìn)行體外連接。在編碼sHASEGP的結(jié)構(gòu)域、衍生物或類似物的基因的生產(chǎn)中，應(yīng)該小心以確保在編碼期望活性的基因區(qū)域，該被修飾的基因保留原始的翻譯閱讀框，而不被翻譯終止信號阻斷。此外，編碼sHASEGP的核酸分子可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或者產(chǎn)生編碼區(qū)域中的變異，和/或形成新的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或破壞先前存在的位點(diǎn)，從而方便進(jìn)一步的體外修飾。而且，如本文中所描述地，考慮了具體一級序列變化的突變蛋白，例如Cys殘基的替代和糖基化位點(diǎn)的消除或添加；SEQIDNo.l的sHASEGP具有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。這樣的修飾可以由本領(lǐng)域已知的用于突變發(fā)生的任何技術(shù)來完成，這些技術(shù)包括但不限于化學(xué)誘變和體外定點(diǎn)誘變(Hutchinsonetal.，j.Biol.Chem.253:6551-6558(1978))，使用TABELinkers(Pha腿cia)。在一種實(shí)施方案中，例如，sHASEGP多肽或其結(jié)構(gòu)域被修飾以包括進(jìn)熒光標(biāo)記。在其它特定的實(shí)施方案中，sHASEGP多肽被修飾以具有異質(zhì)雙功能試劑，這樣的異質(zhì)雙功能試劑可以被用于交聯(lián)復(fù)合體中的成員。此外，sHASEGP的結(jié)構(gòu)域、類似物和衍生物可以用化學(xué)的方法合成。例如，對應(yīng)于sHASEGP多肽的某部分的肽——其包括想要的結(jié)構(gòu)域或者其在體外介導(dǎo)想要的活性——可以使用肽合成儀來合成。而且，如果有必要的話，非典型的氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物可以被引入，以替代或加入到sHASEGP序列。總體上說，非典型的氨基酸包括但不限于常見氨基酸的D-異構(gòu)體、a-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、E-ABU、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、P-丙氨酸、氟代氨基酸、特別設(shè)計(jì)的氨基酸諸如ti-甲基氨基酸、ca-甲基氨基酸、na-甲基氨基酸和氨基酸類似物。此外，氨基酸可以是d(右旋)或l(左旋)的。F.具有N-連接糖部分的功能活性糖基化SHASEGP的產(chǎn)生適當(dāng)?shù)豊-糖基化的人sHASEGP是產(chǎn)生催化性能穩(wěn)定的蛋白質(zhì)所必需的。sHASEGP的N-連接糖基化可以通過各種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。sHASEGP的糖基化作用可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)將編碼sHASEGP的核酸引入能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)腘-連接糖基化的真核細(xì)胞，或者，將sHASEGP多肽與能夠引入期望的N-連接糖部分的無細(xì)胞提取物或純化的酶相接觸。表達(dá)系統(tǒng)的選擇由真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)引入到異位表達(dá)的多肽中的糖基化作用的程度和類型會有所變化。例如，CHO細(xì)胞可高效率地將N-連接糖基化作用引入到活性sHASEGP多肽中。引入N-連接的糖基化作用以產(chǎn)生功能性sHASEGP產(chǎn)物的其他真核表達(dá)系統(tǒng)可以通過將人sHASEGP表達(dá)質(zhì)粒引入所述細(xì)胞中并測試中性活性而得以測試。合適的N-連接糖基化作用可以利用PNGASE釋放的寡糖的FACE分析來確定。本文中進(jìn)一步提供了具有催化活性的sHASEGP的糖基化情況。糖基化的確認(rèn)也可以通過用PNGASE-F處理來自所述細(xì)胞的sHASEGP來進(jìn)行，或通過在導(dǎo)入編碼sHASEGP的核酸之后將此細(xì)胞培養(yǎng)在衣霉素中來進(jìn)行。sHASEGP多肽在體外的N-糖基化作用。sHASEGP多肽可以通過下述方法進(jìn)行N-糖基化將sHASEGP多肽與無細(xì)胞提取物接觸，該無細(xì)胞提取物含有將N-連接的糖轉(zhuǎn)移到sHASEGP多肽的活性，無細(xì)胞提取物諸如犬微粒體膜，或者通過偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行N-糖基化，如通過商業(yè)渠道可獲得的(PromegaMadisonWI)。寡糖被認(rèn)為具有還原端和非還原端，無論在還原端的糖是否實(shí)際上是還原糖。根據(jù)公認(rèn)的命名法，本文在描述寡糖時(shí)將非還原端置于左邊，將還原端置于右邊。本文在描述所有的寡糖時(shí)，使用了非還原糖的名字或縮寫(例如Gal)，然后是糖苷鍵的構(gòu)型(a或(3)、環(huán)鍵(ringbond)、在該鍵中涉及的還原糖的環(huán)位置，然后是還原糖的名字或縮寫(例如GlcNAc)。兩個(gè)糖之間的連接可以表示為例如2，3、2.fwdarw.3或(2,3)。每個(gè)糖均為吡喃糖。如本文中所使用的，N-連接糖部分(N-linkedsugarmoiety)是指通過Asn殘基的酰胺氮附著到sHASEGP的寡糖。N-連接寡糖分為幾個(gè)主要的類型(甘露寡糖型、復(fù)合型、雜合型、硫酸化型)，它們都具有通過Asn殘基的酰胺氮連接的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核，所述Asn殘基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa不是Pro)。N-連接位點(diǎn)常?？捎稍跍y序期間"空白(blank)"循環(huán)的出現(xiàn)而間接指示出來?？梢栽谟蒔NGaseF釋放寡糖之后，進(jìn)行陽性鑒定，PNGaseF將糖基化Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。PNGaseF釋放之后，N-連接的寡糖可以用Bio-GelP-6層析進(jìn)行純化，對寡糖收集物進(jìn)行制備型高pH陰離子交換層析(HPAEC)(Townsendetal.,(1989)Anal.Biochem.182,1-8)。某些寡糖異構(gòu)體可以用HPAEC拆分。在HPAEC層析譜中海藻糖殘基將較早地移至洗脫位置，而其他唾液酸殘基將會增加保留時(shí)間。其寡糖結(jié)構(gòu)已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、a-l酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAseB、轉(zhuǎn)鐵蛋白)被同時(shí)進(jìn)行處理，這可方便寡糖峰的指認(rèn)。收集到的寡糖可以用成分分析和甲基化連接分析的組合方法進(jìn)行表征(Waegheetal.,(1983)CarbohydrRes.123，281-304.)，利用NMR光譜術(shù)來測定端基異構(gòu)構(gòu)型(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)。可選擇地，寡糖可以用熒光輔助碳水化合物電泳(FACE)進(jìn)行鑒定。Callewaertetal.(2001)Glycobiology11,275-281。GsHASEGP上的N-連接糖部分的檢測和表征確定蛋白是否事實(shí)上被糖基化是糖蛋白聚糖分析中的起始步驟。在十二烷基硫酸鈉存在的條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)這一方法己經(jīng)作為在蛋白質(zhì)測序之前的最終歩驟被選擇。糖基化的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中常常以彌散的條帶進(jìn)行遷移。用肽-N4-(N-乙酰-D-氨基葡萄糖基)天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)處理之后帶寬的顯著減小和遷移位置的變化被認(rèn)為表明發(fā)生了N-糖基化作用。如果其他類型的糖基化作用是主要的，其他方法必須被使用。凝集素印跡法提供了一種獨(dú)立于糖基化類型(N和O)的方法。凝集素，從各種植物組織得到的碳水化合物結(jié)合蛋白，對于在糖蛋白聚糖上發(fā)現(xiàn)的廣泛的確定的糖表位不但具有高的親和力而且具有窄的特異性(Cummings,R.D.(1994)MethodsinEnzymol.230,66-86.)。當(dāng)與生物素或地高辛結(jié)合時(shí)，利用與堿性磷酸酶連接的抗生物素蛋白或抗-地高辛抗體，可以容易地通過比色反應(yīng)在膜印跡上將它們鑒定出來(Haselbeck,etal.(1993)MethodsinMol.Biol.14,161-173.)，這類似于蛋白質(zhì)印跡中使用的二抗-堿性磷酸酶反應(yīng)。用一組具有明確限定的特異性的凝集素所進(jìn)行的篩選可以提供關(guān)于糖蛋白的碳水化合物補(bǔ)充物的大量信息。重要的是，顏色顯影放大(colordevelopmentamplification)是足夠高的，以致10-50ng的糖蛋白能容易地在SDS-PAGE的膜印跡上看見。盡管凝集素對它們的同系配體顯示出很高的親和力，但一些的確對結(jié)構(gòu)相關(guān)的表位表現(xiàn)出顯著的親和力。因此，重要的是，當(dāng)選擇一組凝集素時(shí)，應(yīng)該注意交叉反應(yīng)性的可能性，并使用最有可能將復(fù)合型、雜合型和高甘露糖型N-連接聚糖與O-連接結(jié)構(gòu)分別地區(qū)分開來的那些凝集素。單糖分析也可以被用來確定sHASEGP是否被糖基化，并且如同凝集素分析的情況，這提供了關(guān)于結(jié)構(gòu)特征的額外信息。定量單糖成分分析i)鑒定糖基化蛋白，ii)給出各種糖與蛋白質(zhì)的摩爾比，iii)在某些情況下提示寡糖類型的存在，iv)是設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)闡明策略(structuralelucidationstrategy)的第一步，禾tlv)為用于重組糖蛋白療法的產(chǎn)品一致性提供了測量手段。近年來，帶有脈沖電流檢測(pulsedamperometricdetection)的高pH陰離子交換層析(HPAEC-PAD)已被廣泛用于測定單糖成分(Townsend,etal.(1995)inCarbohydrateAnalysis:High-performanceliquidchromatographyandcapillaryelectrophoresis(Z.ElRassied.).pp.181-209.)。更最近地，基于熒光團(tuán)的標(biāo)記方法已被引入，并且許多可以以試劑盒的形式獲得。熒光方法的明顯優(yōu)點(diǎn)是靈敏性增加(50倍)。一個(gè)潛在的不利之處是，在水解產(chǎn)物中或者在外部標(biāo)準(zhǔn)混合物(externalstandardmixture)中，在偶聯(lián)反應(yīng)期間，.不同的單糖對熒光團(tuán)可能顯示出不同的選擇性。然而，靈敏性的增加和由可利用的糖蛋白的總量中的一小部分便能鑒定出存在哪些單糖的能力，以及應(yīng)用激光誘發(fā)熒光所帶來的潛在的更大的靈敏性使得該方法具有吸引力。小量的sHASEGP的單糖成分分析最好在電印跡——如果待分析的是更少量的樣品等份的話，最好是被點(diǎn)印跡——之后，再在PVDF(PSQ)膜上進(jìn)行(Weitzhandleretal,(1993)丄Biol.Chem.268,5121-5130.)。PVDF是碳水化合物分析的理想基質(zhì)，這是因?yàn)橐坏┩ㄟ^酸或酶促水解被釋放之后，單糖或寡糖都不再結(jié)合于膜。FACE分析是檢測sHASEGP的糖基化情況的有效手段。應(yīng)用了30%寡糖凝膠的FACEtmN-連接寡糖作圖(Prozyme)便是一種這樣的機(jī)制。通過用N-聚糖酶(a.k.aPNGase)進(jìn)行酶促消化而從100嗎的糖蛋白上切下的、經(jīng)熒光團(tuán)ANTS標(biāo)記并通過電泳分離而得到的寡糖可以用于檢測sHASEGP的糖基化情況。通過將樣品和該樣品的稀釋物以及寡糖標(biāo)準(zhǔn)梯度標(biāo)記物一同跑膠，可以確定寡糖條帶的相對位置，其中，以聚合度(DP)單位來表示遷移距離。H.用于鑒定調(diào)節(jié)sHASEGP活性的化合物的篩選方法本文中例舉并描述了若干類分析方法。應(yīng)該理解的是，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可以用于其他分析方法。然而，這里要說明的是，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域顯示出催化活性。同樣地，它們對于體外的篩選分析也是理想的。它們也可以用于結(jié)合分析。sHASEGP全長酶原、活性酶和透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域都被考慮應(yīng)用于本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何篩選分析中，包括本文中提供的那些分析方法。因此，下面的描述，如果是涉及透明質(zhì)酸酶分析，則旨在適用于包括sHASEGP在內(nèi)的任何透明質(zhì)酸酶的單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的應(yīng)用。其他分析例如結(jié)合分析也在本文中提供，特別是對于應(yīng)用sHASEGP，包括其任何變體例如其拼接變體。1.用于鑒定調(diào)節(jié)sHASEGP蛋白的透明質(zhì)酸酶活性的試劑的催化分析方法。本文提供了用于鑒定sHASEGP——特別是其單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或催化活性部分一一的催化活性的調(diào)節(jié)物的方法。該描述通過下述步驟實(shí)施將全長酶原或活化形式的sHASEGP，特別是其單鏈結(jié)構(gòu)域在受測物質(zhì)存在的情況下與sHASEGP的底物相接觸，檢測底物的蛋白水解，由此評估該sHASEGP的活性，并將該活性與對照相比較。例如，對照可以是通過下述步驟評價(jià)出的sHASEGP活性將包括全長酶原或活化形式在內(nèi)的sHASEGP，特別是其單鏈結(jié)構(gòu)域與該sHASEGP的底物相接觸，檢測底物的蛋白質(zhì)水解，由此評估出sHASEGP的活性。在存在和不存在所述的受測化合物時(shí)的結(jié)果被比較。活性的差異指示了受測物質(zhì)調(diào)節(jié)sHASEGP的活性。sHASEGP活化切割的激活劑也被考慮到；這樣的分析在后面被討論到。在一種實(shí)施方案中，多種受測物質(zhì)在上述的篩選方法中同時(shí)被篩選。在另一實(shí)施方案中，sHASEGP從耙細(xì)胞中分離出，然后作為工具用于鑒定對所述耙細(xì)胞具有潛在的特異性的試劑。在另一種實(shí)施方案中，受測物質(zhì)是治療性化合物，因此，在受測物質(zhì)存在和受測物質(zhì)不存在的情況下所測得的sHASEGP活性的差異表明耙細(xì)胞對治療性化合物有應(yīng)答。—種方法包括下述步驟(a)將sHASEGP多肽或其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域與一種或多種受測化合物在有助于配體和化合物相互作用的條件下相互接觸；和(b)在所述的一系列化合物中鑒定出特異性地結(jié)合于所述配體的一種或多種化合物。本文中提供的另一方法包括下述步驟a)將sHASEGP多肽或其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域與sHASEGP多肽的底物接觸，檢測底物的降解，由此評估該sHASEGP多肽的活性；b)在受測物質(zhì)存在的情況下，將該sHASEGP多肽與sHASEGP多肽的底物接觸，檢測底物的降解，由此評估sHASEGP多肽的活性；和c)比較在步驟a)和b)中所評估的sHASEGP多肽的活性，從而，由步驟a)中測得的活性與由步驟b)中測得的活性的差異表明該受測物質(zhì)調(diào)節(jié)該sHASEGP多肽的活性。在另一種實(shí)施方案中，多種受測物質(zhì)同時(shí)被篩選。在比較存在或不存在受測物質(zhì)時(shí)的sHASEGP多肽活性以評估該受測物質(zhì)是否是該sHASEGP多肽的調(diào)節(jié)物時(shí)，不一定必須平行地測定活性，盡管這樣的平行測量是常用的。在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量sHASEGP多肽的活性，并將所測得的活性與該sHASEGP多肽的活性歷史值相比較是可行的。例如，可以在受測物質(zhì)存在的情況下測量該sHASEGP多肽的活性，并與先前在沒有該受測物質(zhì)的情況下所測得的sHASEGP多肽的活性歷史值相比較，反之亦然。例如，這可以通過在與用于執(zhí)行分析的試劑盒一同提供的插頁或者小冊子上提供該sHASEGP多肽的活性值來實(shí)現(xiàn)。用于選擇特定sHASEGP的底物的方法在實(shí)施例中被描述，并例舉了特定的透明質(zhì)酸酶分析方法。提供了聯(lián)合物以及含有所述聯(lián)合物并任選地包括實(shí)施分析的說明書的試劑盒。所述聯(lián)合物包括sHASEGP多肽和待分析的sHASEGP多肽的底物，以及可任選的用于檢測所述底物的蛋白水解的試劑。所述底物，可以是生色或熒光分子，包括糖胺聚糖，可被特定的sHASEGP多肽水解，它可以通過測試該sHASEGP多肽切割該受測底物的能力而被經(jīng)驗(yàn)性地鑒定。鑒定出可被最有效地被切割的底物，即，以最低的蛋白濃度和/或最快的速度或在理想的條件下被切割的底物。本文還提供了含有上述聯(lián)合物的試劑盒。該試劑盒可任選地包括鑒定sHASEGP多肽活性的調(diào)節(jié)物的說明書。任何sHASEGP多肽都被考慮作為鑒定其活性的調(diào)節(jié)物的靶。2.結(jié)合分析。本文也提供了用于鑒定和分離試劑特別是結(jié)合sHASEGPs的化合物的方法。這些分析是被設(shè)計(jì)用來鑒定結(jié)合分離的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域(或含有sHASEGP多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的非sHASEGP多肽的其它蛋白質(zhì))的試劑，或結(jié)合包括衍生自全長酶原或衍生自延伸的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的活化形式在內(nèi)的活化形式的試劑。這樣被鑒定得到的化合物是用于鑒定用來治療涉及異常透明質(zhì)酸化合物的候選化合物或先導(dǎo)化合物。用于所述方法中的sHASEGP多肽包括本文中定義的任何sHASEGP多肽，包括sHASEGP單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其蛋白水解活性部分。多種方法在本文中被提供。這些方法可以在溶液中或在固相反應(yīng)中實(shí)施，其中，在固相反應(yīng)中，sHASEGP多肽或其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域通過連接子直接或間接地連接到固體支持物上。篩選分析被描述于實(shí)施例中，并且這些分析方法己經(jīng)被用來鑒定候選化合物。對于本文的目的，所有上述結(jié)合分析都是被提供用于sHASEGP。本文提供了鑒定試劑例如化合物的方法，所述試劑特異性地結(jié)合于sHASEGP單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域、全長活化的sHASEGP或其雙鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。該方法可以通過下述步驟來實(shí)施(a)在可使得sHASEGP和試劑之間發(fā)生結(jié)合的條件下，將sHASEGP與一種或多種受測試劑接觸；禾tl(b)在所述的一系列試劑中鑒定出特異性地結(jié)合sHASEGP的一種或多種試劑。例如，在實(shí)施這樣的方法時(shí)，將sHASEGP多肽與可能的結(jié)合伴侶或細(xì)胞提取物或細(xì)胞組分在允許潛在的結(jié)合伴侶與多肽相結(jié)合的條件下混合。在混合之后，將已與sHASEGP結(jié)合的肽、多肽、蛋白或其他分子從混合物中分離出來。結(jié)合到sHASEGP上的結(jié)合伴侶然后可以被移走并作進(jìn)一步的分析。為了鑒定和分離結(jié)合伴侶，整個(gè)蛋白質(zhì)例如SEQIDNo.1的整個(gè)公開的蛋白質(zhì)可以被使用。可選擇地，可以使用該蛋白質(zhì)的片段。許多方法都可以被用來獲得細(xì)胞提取物或體液，諸如血液、血清、尿、汗液、滑液、CSF和其他此類液體。例如，可以使用物理或化學(xué)破碎方法將細(xì)胞破碎。物理破碎方法的例子包括但不限于超聲波和機(jī)械剪切?；瘜W(xué)裂解方法的例子包括但不限于去污劑裂解和酶裂解。為了獲得用于本方法的提取物，技術(shù)人員可以方便地采用制備細(xì)胞提取物的方法?！┘?xì)胞的提取物被制備，在蛋白質(zhì)和結(jié)合伴侶能夠結(jié)合的條件下，將提取物與sHASEGP混合?？梢允褂酶鞣N條件，包括類似于人細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的條件或體液中的條件的條件，所述體液例如血液。特性，例如所使用的細(xì)胞提取物的同滲濃度pH、溫度和濃度可以被改變，以優(yōu)化蛋白質(zhì)與結(jié)合伴侶的結(jié)合。類似地，用于從體液中分離出感興趣的分子的方法是已知的。在合適的條件下混合之后，將結(jié)合的復(fù)合體從混合物中分離出來?？梢允褂酶鞣N技術(shù)來分離混合物。例如，對sHASEGP具有特異性的抗體可以被用來免疫沉淀結(jié)合伴侶復(fù)合體。可選擇地，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)分離技術(shù)諸如層析和密度/沉淀離心。將提取物中的非結(jié)合的細(xì)胞組分除去之后，可以使用常規(guī)方法，將結(jié)合的伴侶從復(fù)合體上解離下來。例如，可以通過改變混合物的鹽濃度或pH來完成解離。為了幫助將結(jié)合在一起的結(jié)合伴侶對從混合提取物中分離出來，可以將sHASEGP固定到固體支持物上。例如，該蛋白質(zhì)可以附著到硝化纖維基質(zhì)或丙烯酸珠子上。該蛋白質(zhì)或其片段與固體支持物的粘附有助于將肽/結(jié)合伴侶對與提取物中的其他組分分離開來。被鑒定出的結(jié)合伴侶可以是單個(gè)蛋白質(zhì)或由兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物?？蛇x擇地，編碼單鏈透明質(zhì)酸酶的核酸分子可以被用于酵母雙雜交系統(tǒng)。酵母雙雜交系統(tǒng)已被用于鑒定其他的蛋白伴侶對，并且可以容易地加以應(yīng)用，以利用本文中描述的核酸分子。其他的體外結(jié)合分析，特別是sHASEGP的體外結(jié)合測定，使用的是多肽的混合物，其至少包括這些蛋白質(zhì)中的一個(gè)的催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)候選結(jié)合目標(biāo)或底物。在合適的條件下溫育混合物之后，sHASEGP或其含有催化結(jié)構(gòu)域的多肽片段結(jié)合候選底物或與候選底物相互反應(yīng)的能力被評估。對于無細(xì)胞的結(jié)合分析，這些成分中的一種成分包括可檢測的標(biāo)記或與可檢測的標(biāo)記偶聯(lián)。所述標(biāo)記可以提供直接的檢測，諸如放射性、發(fā)光性、光密度或電子密度等，或間接的檢測，諸如表位標(biāo)簽、酶等。許多方法都可以被用來檢測標(biāo)記，取決于標(biāo)記的性質(zhì)以及其它的分析成分。例如，結(jié)合于固體基質(zhì)的標(biāo)記物可被檢測，或含有該標(biāo)記物的結(jié)合復(fù)合體的一部分，可以從該固體基質(zhì)上分離出來，然后所述標(biāo)記可以被檢測。3.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢測。作為膜錨定蛋白的sHASEGP，可以直接或間接地參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即，可以直接作為細(xì)胞表面受體參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或間接地通過激活蛋白質(zhì)例如能夠引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的促生長因子來參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，分泌的sHASEGP，諸如SEQIDN0.4中描述的sHASEGP的可溶性結(jié)構(gòu)域可以參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者直接地通過結(jié)合到細(xì)胞表面受體或與細(xì)胞表面受體相互作用而進(jìn)行，或間接地通過激活蛋白質(zhì)例如可以引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的促生長因子而進(jìn)行。用于評價(jià)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的，它們可以適用于sHASEGP多肽。提供了用于鑒定可影響或改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑的分析方法，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由sHASEGP——尤其是全長的sHASEGP或sHASEGP的足以將胞外結(jié)構(gòu)域或其功能部分錨定在細(xì)胞表面的部分一一直接或間接地——例如通過來激活促生長因子——介導(dǎo)。這樣的分析例如包括基于轉(zhuǎn)錄的分析，其中，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的調(diào)節(jié)是通過檢測對報(bào)告基因表達(dá)的影響而被評估的(參見美國專利5,436,128)。4.用于鑒定調(diào)節(jié)編碼sHASEGP的核酸的表達(dá)的試劑的方法。另一實(shí)施方案提供了用于鑒定調(diào)節(jié)sHASEGP編碼核酸的表達(dá)的試劑的方法。這樣的分析方法可以使用任何可利用的用于監(jiān)控編碼sHASEGP的核酸的表達(dá)水平的變化的手段?？梢允褂萌魏畏治龇椒▉肀O(jiān)測試劑調(diào)節(jié)編碼sHASEGP的核酸的表達(dá)的能力。例如，mRNA表達(dá)可以通過與核酸的雜交而被直接監(jiān)測。而且，所描述的酶分析方法可以被用來檢測可調(diào)節(jié)SHASEGP的表達(dá)的試劑。在合適的條件下和在合適的時(shí)間，將細(xì)胞系暴露于待被測試的試劑，并通過標(biāo)準(zhǔn)的程序分離總RNA或mRNA(參見，例如Sambrooketal(1989)MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,2ndEd.ColdSpringHarborLaboratoryPress)。用于檢測暴露于試劑的細(xì)胞和對照細(xì)胞之間在RNA表達(dá)水平上的差異的探針可以由核酸制備得到。通常地，但不是必需的，所設(shè)計(jì)的探針在高嚴(yán)格性的條件下只與目標(biāo)核酸雜交。在高嚴(yán)格性的條件下，只有高度互補(bǔ)的核酸雜交體形成。因此，分析條件的嚴(yán)格性決定了為了能夠形成雜交體而在兩核酸鏈之間應(yīng)該存在的互補(bǔ)的數(shù)量。應(yīng)該選擇可以將探針:耙標(biāo)雜交體和可能的探針:非耙標(biāo)雜交體之間的穩(wěn)定性的差異最大化的嚴(yán)格性。例如，sHASEGP的N末端和C末端片段可以表達(dá)在細(xì)菌中，并用來搜索與這些片段相結(jié)合的蛋白質(zhì)。融合蛋白，例如在sHASEGP的N或C末端區(qū)域融合有His標(biāo)記或GST的蛋白可以被制備，以用作底物。這些融合蛋白可以偶聯(lián)到例如谷胱甘肽-瓊脂糖珠子上，然后探查細(xì)胞裂解物或體液。在裂解之前，細(xì)胞或體液可以用候選試劑處理，所述候選試劑能夠調(diào)節(jié)sHASEGP或與其上的結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白。結(jié)合于所述融合蛋白的裂解物蛋白可以用SDS-PAGE來分辨、通過蛋白質(zhì)測序或質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行分離和鑒定，如本領(lǐng)域所知的?？贵w探針可以通過使用肽、多肽或蛋白質(zhì)，采用合適的免疫方案，對合適的哺乳動(dòng)物宿主進(jìn)行免疫而制備得到，如果所述的肽、多肽或蛋白質(zhì)足夠長(例如sHASEGP多肽的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40或更多的連續(xù)氨基酸)，或者如果需要增強(qiáng)免疫原性的話，可以將它們偶聯(lián)到合適的載體上。用于制備攜有載體——例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或其他載劑蛋白質(zhì)——的免疫原性偶聯(lián)物的方法是本領(lǐng)域已知的。在某些情況下，使用例如碳二亞胺試劑所進(jìn)行的直接偶聯(lián)是有效的；在其他例子中，連接試劑諸如那些由PierceChemicalCo.,Rockford,IL提供的試劑是被期望的，以提供對半抗原的可及性。半抗原肽可以用Cys殘基在氨基或羧基端處延伸，或者有半胱氨酸殘基散布其中，例如，這可以方便與載劑的連接。免疫原的施用通?？梢酝ㄟ^在一段合適的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行注射來完成，可以與合適的佐劑一同使用，如本領(lǐng)域常規(guī)理解的。在實(shí)施免疫方案期間，對抗體進(jìn)行滴定，以確定形成了足夠的抗體?？闺目贵w(anti-peptideantibodies)可以應(yīng)用合成的肽來產(chǎn)生，所述的合成的肽例如對應(yīng)于sHASEGP的羧基末端氨基酸。合成肽的長度可以小至1-3個(gè)氨基酸，通常至少4個(gè)氨基酸殘基或更長?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方法將肽偶聯(lián)到KLH，并將其免疫到動(dòng)物諸如兔或有蹄類動(dòng)物中。然后可以純化出多克隆抗體，例如使用含有共價(jià)結(jié)合的肽的Actigel珠子進(jìn)行純化。盡管使用這種方法產(chǎn)生的多克隆抗血清可以滿足某些應(yīng)用，例如藥物組合物，但通常是使用單克隆制劑。如通常所知道的，通過使用KoWer等人的標(biāo)準(zhǔn)方法(Nature256:495-7(1975)或進(jìn)行修改——所述修改可以實(shí)現(xiàn)淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞的無限增殖，可以制備出分泌期望的抗體的永久化細(xì)胞系。通過免疫測定，篩選出分泌期望的抗體的永久化細(xì)胞系，其中，抗原是肽半抗原、多肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)分泌期望抗體的合適的永久化細(xì)胞系被鑒定出之后，該細(xì)胞可以借助于腹水在體外培養(yǎng)或在體內(nèi)產(chǎn)生。特別感興趣的是識別sHASEGP的催化結(jié)構(gòu)域或活化切割位點(diǎn)(區(qū)域)的單克隆抗體。也可以產(chǎn)生抗體或片段。特異性地結(jié)合受體的期望區(qū)域的區(qū)域，也可以利用多個(gè)物種來源以嵌合體的形式產(chǎn)生。在上述方法中被分析的試劑可以是被隨機(jī)選擇的或者被理性選擇或設(shè)計(jì)的。試劑可以是例如肽、小分子和碳水化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易理解，對試劑的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是沒有限制的。如本領(lǐng)域所知道的，肽試劑可以使用標(biāo)準(zhǔn)的固相(或液相)肽合成方法來制備。此外，編碼這些肽的DNA可以使用商業(yè)上可獲得的寡核苷酸合成儀器合成，并使用標(biāo)準(zhǔn)的重組生產(chǎn)系統(tǒng)重組產(chǎn)生。如果欲包含非基因編碼的氨基酸，則使用固相肽合成的生產(chǎn)方法是必需的。I.治療方法由本文中的方法鑒定出的sHASEGPs被用于治療或預(yù)防sHASEGP底物在動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物包括人中的異常積聚。在一種實(shí)施方案中，該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的sHASEGP糖蛋白，從而使疾病或紊亂得以治療或預(yù)防。在另一實(shí)施方案中，sHASEGP抑制劑可以被用于處理過量的中性透明質(zhì)酸酶活性。被處理的哺乳動(dòng)物可以是人。本文中所提供的抑制劑是通過篩選分析鑒定出來的那些抑制劑。此外，考慮了抗體和反義核酸或雙鏈RNA(dsRNA)，諸如RNAi。1.反義治療(antisensetreatment):在特定的實(shí)施方案中，如上文所描述的，sHASEGP多肽功能可以被sHASEGP多肽反義核酸降低或抑制，從而治療或預(yù)防過度的軟骨素酶活性。提供了至少6個(gè)核苷酸，一般可多達(dá)大約150個(gè)核苷酸的核酸的治療或預(yù)防用途，這些核酸對于編碼sHASEGP多肽或其部分的基因或cDNA是反義的。本文中所使用的sHASEGP多肽"反義"核酸指這樣的核酸，其借助于一定程度的序列互補(bǔ)性，并且通常在高嚴(yán)格性的條件下，能夠與sHASEGP多肽RNA(—般是mRNA)的一部分序列相雜交的核酸。反義核酸可以與sHASEGP多肽mRNA的編碼和/或非編碼區(qū)域相互補(bǔ)。這樣的反義核酸具有治療劑的用途，其可以減弱或抑制sHASEGP多肽功能，可以用于治療或預(yù)防上述的紊亂。sHASEGP多肽反義核酸至少6個(gè)核苷酸，通常是寡核苷酸(范圍在6至約150個(gè)核苷酸內(nèi)，包括6至50個(gè)核苷酸)。反義分子可以與透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的所有或部分序列互補(bǔ)。例如，寡核苷酸至少IO個(gè)核苷酸、至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少20、40、80到至少100個(gè)核苷酸、或至少125個(gè)核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修飾形式，可以單鏈的或雙鏈的。寡核苷酸可以在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上有修飾。寡核苷酸可以包括其他附加的基團(tuán)，諸如肽或有助于轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜的試劑(參見，例如Letsingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6553-6556(1989);Lemaitreetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:648-652(1987);PCT出版物WO88/09810，公開于1988年12月15日)或有助于轉(zhuǎn)運(yùn)通過血腦屏障的試劑(參見例如PCT出版物WO89/10134，公開于1988年4月25R)、雜交引發(fā)切割試劑(hybridization-triggeredcleavageagents)(參見例如Kroletal"BioTechniques6:958-976(1988))或嵌入劑(參見例如Zon.Pharm.Res.5:539-549(1988))。sHASEGP多肽反義核酸通常是寡核苷酸，典型地是單鏈DNA或RNA或其類似物或其混合物。例如，該寡核苷酸包括與編碼人sHASEGP多肽的核酸的一部分序列反義的序列。寡核苷酸可以用本領(lǐng)域已知的取代物在它的結(jié)構(gòu)的任何位置進(jìn)行修飾。sHASEGP多肽反義寡核苷酸可以包括至少一個(gè)經(jīng)修飾的堿基部分，其可以選自下列但不限于下列5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、(3-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2_甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、(3-D-甘露糖基Q核苷、5-apos-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲巰-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲基酯、尿啼啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶、(ACP3)w和2,6-二氨基嘌呤。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一個(gè)修飾的糖部分，其可以選自下述但不限于下列阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和已糖。寡核苷酸可以包括至少一個(gè)修飾的磷酸骨架，其選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲乙縮醛(formacetal)或其類似物。寡核苷酸可以是a-異頭(anomeric)寡核苷酸。a-異頭寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特異性的雙鏈雜交體，其中，雙鏈相互平行(Gautiereta.，Nucl.AcidsRes,15:6625-6641(1987))。寡核苷酸可以聯(lián)接到另一分子，例如但不限于肽；雜交引發(fā)交聯(lián)試劑(hybridizationtriggeredcross-linkingagent)、轉(zhuǎn)運(yùn)試劑或雜交引發(fā)切割試劑(hybridization-triggeredcleavageagent)。寡核苷酸可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如使用自動(dòng)DNA合成儀(例如可以商購自Biosearch,AppliedBiosystems等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可以使用Steinetal.,Nucl.AcidsRes.16:3209(1988)的方法合成；甲基膦酸酯寡核苷酸可以通過使用可控有孔玻璃聚合物支持物(controlledporeglasspolymersupports)來制備(Sarinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:7448-7451(1988))等。在特定的實(shí)施方案中，sHASEGP多肽反義寡核苷酸包括具有催化活性的RNA或核酶(參見如PCT國際公布WO90/11364，公丌于1990年10月4R;Sarveretal.，Science247:1222-1225(1990))。在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸是2'-0-甲基核糖核苷酸(Inoueetal.,Nucl.AcidsRes.15:6131-6148(1987))，或嵌合RNA-DNA類似物(Inoueetal.,FEBSLett.215:327-330(1987))。可選擇地，寡核苷酸可以是雙鏈RNA(dsRNA)，諸如RNAi。在可選擇的實(shí)施方案中，sHASEGP多肽反義核酸通過外源序列的轉(zhuǎn)錄而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。例如，載體可以被導(dǎo)入體內(nèi)，這樣它被細(xì)胞吸收，在該細(xì)胞中，載體或其一部分被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生反義核酸(RNA)。這樣的載體將含有編碼sHASEGP多肽反義核酸的序列。這樣的載體可以保持為附加體的形式或整合入染色體，只要它能被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生期望的反義RNA。這樣的載體可以用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建得到。載體可以是質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的其他載體，它們可以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和表達(dá)。編碼sHASEGP多肽反義RNA的序列的表達(dá)可以借助于本領(lǐng)域已知的在包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中起作用的任何啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的。這樣的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域(BernoistandChambon,Nature290:304-310(1981));包含在勞斯肉瘤病毒的3'長末端重復(fù)序列中的啟動(dòng)子(Yamamotoetal.,Ce〃22:787-797(1980));皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagneretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981));金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinsteretal.，Nature296:39-42(1982))等。反義核酸包括這樣的序列，即，該序列與HASEGP多肽基因——包括人sHASEGP多肽基因——的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)。絕對的互補(bǔ)是不被要求的?？捎行У刂委熁蝾A(yù)防贅生性疾病的sHASEGP多肽反義核酸的量取決于疾病的性質(zhì)，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)經(jīng)驗(yàn)性地確定。如果可能，在用人進(jìn)行測試和進(jìn)行應(yīng)用之前，在體外測定在細(xì)胞中的反義細(xì)胞毒性(antisensecytotoxicity)然后再在有用的動(dòng)物模型系統(tǒng)中進(jìn)行測定是有利的。2.RNA干擾。RNA干擾(RNAi)(參見例如Chuangetal.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985)可以被用來抑制編碼sHASEGP的基因的表達(dá)。干擾RNA(RNAi)片段，特別是雙鏈(ds)RNAi可以被用來產(chǎn)生sHASEGP功能的喪失。在生物體中，包括哺乳動(dòng)物、線蟲(C.e/egara)、果蠅和植物以及人中，使用RNAi來使得基因沉默的方法是已知的(參見例如Fireetal.(1998)Nature391:806-811;Fire(1999)TrendsGenet.15:358-363;Sharp(2001)GenesDev.15:485-490;Hammondetal.(2001)NatureRev,Genet.2:110-119;Tuschl(2001)Chem.Biochem.2:239-245;Hamiltonetal.(1999)Science286:950-952;Hammondetal.(2000)Nature404:293-296;Zamoreetal.(2000)Cell101:25-33;Bernsteinetal.(2001)Nature409:363-366;Elbashiretal.(2001)GenesDev.15:188-200;Elbashiretal.(2001)Nature411:494-498;國際PCT申請WO01/29058;國際PCT申請WO99/32619)。表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)的構(gòu)建物被導(dǎo)入宿主，諸如動(dòng)物和植物，其中使用可保持為附加體或者可整合入基因組的可復(fù)制載體。通過選擇合適的序列，dsRNA的表達(dá)可以干擾編碼sHASEGP的內(nèi)源mRNA的積聚。RNAi也可以在體外被用來抑制表達(dá)。包括對sHASEGP具有選擇性的(即，對sHASEGP是獨(dú)特的)至少約21(或21)個(gè)核苷酸的區(qū)域，被用來制備RNAi。約21個(gè)核苷酸的較小片段可以直接(即，在體內(nèi)或在體外)轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中；更大的RNAidsRNA分子通常通過使用編碼它們的載體而被導(dǎo)入。dsRNA分子至少約21bp長或更長，例如50、100、150、200和更長。在體外和體內(nèi)，將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的方法、試劑和實(shí)驗(yàn)方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。3.基因療法。在示范性的實(shí)施方案中，借助于基因療法，施用包括編碼sHASEGP多肽或其功能結(jié)構(gòu)域或其衍生物的核苷酸序列的核酸，以促進(jìn)sHASEGP多肽功能?；虔煼ㄊ侵竿ㄟ^將核酸給予患者而進(jìn)行的治療。在該實(shí)施方案中，由核酸產(chǎn)生它的編碼蛋白，而該蛋白通過促進(jìn)sHASEGP多肽功能來實(shí)現(xiàn)治療效果。可以使用任何本領(lǐng)域可利用的用于基因治療的任何方法(參見Goldspieletal.，ClinicalPharmacy12:488-505(1993);WuandWu，Biotherapy3:87-95(1991);Tolstoshev，An.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science260:926-932(1993)和MorganandAnderson,An.Rev.Biochem.62:191-217(1993);TIBTECH115:155-215(1993))。例如，用于基因治療的一種治療組合物包括編碼sHASEGP多肽的序列，其是表達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體可以在合適的宿主中表達(dá)sHASEGP多肽或其結(jié)構(gòu)域、片段或嵌合蛋白。特別地，這樣的核酸具有與sHASEGP多肽編碼區(qū)域可操作地連接的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的或組成型的，并且，可任選地，可以是組織特異性的。在另一特定的實(shí)施方案中，使用這樣的核酸分子，在該核酸分子中，有助于在基因組的期望位點(diǎn)發(fā)生同源重組的區(qū)域位于sHASEGP多肽編碼序列和任何其他期望的序列的兩側(cè)，從而使得sHASEGP蛋白質(zhì)核酸可以染色體內(nèi)表達(dá)(KollerandSm池ies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935(1989);Zijlstraetal"Nature342:435-438(1989))。將核酸傳送到患者，可以是直接的，在這種情況下，病人被直接暴露于核酸或攜帶核酸的載體，或可以是間接的，在這種情況下，細(xì)胞首先用核酸進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化，然后移植到患者中。這兩種途徑都是已知的，分別稱為體內(nèi)或離體(先體外后體內(nèi))基因療法。在特定的實(shí)施方案中，核酸被直接體內(nèi)給藥，在體內(nèi)，它被表達(dá)從而產(chǎn)生被編碼的產(chǎn)物。這可以通過利用本領(lǐng)域已知的許多方法中的任何方法來實(shí)現(xiàn)，諸如通過將其構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體的一部分并將它給予患者，由此，它變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，這可以例如通過使用缺陷的或減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體來實(shí)現(xiàn)(參見美國專利4,980,286)，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊法(例如基因槍；Biolistic,Dupont)，或包覆以脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑，封裝在脂質(zhì)體、微顆?；蛭⒛z囊中，或通過將其連接到已知能進(jìn)入核內(nèi)的肽上并將它給予患者，或通過將其連接到將遭受受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體并將它給予患者(參見如WuandWu，J.Biol.Chem，262:4429-4432(1987))其可以被用來革巴向特異性表達(dá)受體的細(xì)胞類型)，等等。在另一實(shí)施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，在該復(fù)合物中，配體是破壞核內(nèi)體的促融合病毒肽，這使得核酸可以免遭溶酶體降解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過靶向特異性的受體，核酸可以在體內(nèi)被作為耙標(biāo)，被細(xì)胞特異性地吸收和表達(dá)(參見例如PCT公布號WO92/06180，日期為1992年4月16日(Wuetal.);WO92/22635，日期為1992年12月23日(Wilsonetal.);WO92/20316，日期為1992年11月26日(Findeisetal.);WO93/14188，日期為1993年7月22日(Clarkeetal.),WO93/20221，日期為1993年10月14日(Young))?？蛇x擇地，核酸可以被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并整合入宿主細(xì)胞DNA中以便于表達(dá)，這通過同源重組進(jìn)行(KollerandSmithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935(1989);Zijistraetal"Nature342:435-438(1989))。在特定的實(shí)施方案中，可以使用含有sHASEGP多肽核酸的病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Milleretal.,Meth.Enzymol.217:581-599(1993))。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被修飾以剔除對于病毒基因組的包裝和整合入宿主細(xì)胞DNA是非必要的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。用于基因療法的sHASEGP多肽核酸被克隆入載體，其幫助基因傳送到患者中。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更為詳細(xì)的描述可以參見Boesenetal.，Biothempy6:291-302(1994)，其描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdd基因傳送給造血干細(xì)胞，以便使干細(xì)胞對化學(xué)療法更具抗性。闡述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的應(yīng)用的其他參考文獻(xiàn)是Clowesetal.,J.Clin.Invest.93:644-651(1994);Kiemetal"Blood83:1467-1473(1994);SalmonsandGunzberg,HumanGeneTherapy4:129-141(1993);禾卩GrossmanandWilson,Curr.Opin.InGeneticsAndDevel.3:110-114(1993)。腺病毒是可以用于基因治療的另一種病毒載體。腺病毒是可以用來將基因傳送給呼吸上皮細(xì)胞的特別具有吸引力的載體。腺病毒天然地感染呼吸上皮細(xì)胞，在那里它們引起輕微的疾病?；谙俨《镜膫魉拖到y(tǒng)的其他耙標(biāo)是肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒具有能夠感染未分裂細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。KozarskyandWilson,CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3:499-503(1993)綜述了基于月泉病毒的基團(tuán)治療。Boutetal.，HumanGeneTherapy5:3-10(1994)證明了使用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到獼猴的呼吸上皮細(xì)胞。腺病毒在基因治療中的應(yīng)用的其他例子可以參見Rosenfeldetal.,Science252:431-434(1991);Rosenfeldetal.,Cell68:143-155(1992);和Mastrangelietal.,J.Clin.Invest.91:225-234(1993)。腺相關(guān)病毒(AAV)也已被提議用于基因療法(Walshetal.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993》。基因治療的其他途徑涉及，通過諸如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法，將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物的細(xì)胞中。通常，轉(zhuǎn)移的方法包括將選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然后對細(xì)胞進(jìn)行選擇，以分離出已經(jīng)吸收并正在表達(dá)被轉(zhuǎn)移的基因的那些細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞傳送給患者。在這種實(shí)施方案中，將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，然后再在體內(nèi)給予所得到的重組細(xì)胞。這種導(dǎo)入可以用本領(lǐng)域己知的任何方法進(jìn)行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體進(jìn)行感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞(microcell)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等。用于將外源基因?qū)爰?xì)胞的許多技術(shù)是本領(lǐng)域己知的(參見如LoefflerandBehr，Meth.Enzymol.217:599-618(1993);Cohenetal"Meth.Enzymol.217:618-644(1993);Cline,Pharmac.Ther.29:69-92(1985))，并且它們都可以被使用，只要作為接受者的細(xì)胞的必要的發(fā)育和生理功能不被破壞。該技術(shù)應(yīng)該能夠穩(wěn)定地將核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中，這樣，核酸被細(xì)胞表達(dá)并且通常能遺傳給子代細(xì)胞并被子代細(xì)胞表達(dá)。所獲得的重組細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法被傳送給患者。在一種實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞被注射，例如進(jìn)行皮下注射。在另一實(shí)施方案中，重組皮膚細(xì)胞可以用作皮移植片，移植到患者上。重組血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或祖先細(xì)胞)可以通過靜脈給予。欲使用的細(xì)胞的數(shù)量取決于所想要的效果、患者的狀態(tài)等，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定?？梢詫?dǎo)入核酸以便實(shí)施基因治療的細(xì)胞包括任何期望的可以利用的細(xì)胞類型，包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞諸如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如諸如從骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟和其他來源獲得的干細(xì)胞。例如，用于基因治療的細(xì)胞對于患者是自體的。在重組細(xì)胞被用于基因治療的實(shí)施方案中，sHASEGP多肽核酸被導(dǎo)入細(xì)胞中，這樣，它被細(xì)胞或它們的子代表達(dá)，然后重組細(xì)胞被體內(nèi)施用以獲得治療效果。在特定的實(shí)施方案中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞。依據(jù)該實(shí)施方案，可以體外分離和培養(yǎng)的任何千細(xì)胞和/或祖細(xì)胞都具有潛在應(yīng)用價(jià)值。這樣的干細(xì)胞包括但不限于造血干細(xì)胞(HSC)、上皮組織諸如皮和腸內(nèi)膜(lining)的干細(xì)胞、胚胎心肌細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞(PCT公開號WO94/08598，日期為1994年4月28日)和神經(jīng)干細(xì)胞(StempleandAnderson,Cell71:973-985(1992))。上皮干細(xì)胞(ESC)或角質(zhì)化細(xì)胞可以通過已知的程序從組織諸如皮膚和腸內(nèi)膜獲得(Rheinwald，Meth.CellBio.21A:229(1980))。在成層上皮組織諸如皮膚中，通過胚層一一最靠近基膜的層一一內(nèi)的干細(xì)胞的有絲分裂，發(fā)生更新作用(renewal)。腸內(nèi)膜內(nèi)的干細(xì)胞使得該組織可以快速的更新。從患者或供體的皮膚或腸內(nèi)膜獲得的ESC或角質(zhì)化細(xì)胞可以培養(yǎng)在組織培養(yǎng)基中(Rheinwald，Meth.CellBio.21A:229(1980);PittelkowandScott，Cano.ClinicProc.61:771(1986))。如果ESC由供體提供，也可以使用抑制宿主對移植物的反應(yīng)活性的方法(例如放射、給予藥物或抗體，以促進(jìn)溫和的免疫抑制)。至于造血干細(xì)胞(HSC)，能分離、增殖和體外培養(yǎng)HSC的任何技術(shù)都可以用于本實(shí)施方案中?？梢员挥脕韺?shí)現(xiàn)這些實(shí)施方案的技術(shù)包括(a)從骨髓細(xì)胞分離并建立HSC培養(yǎng)物，所述骨髓細(xì)胞分離自未來的宿主或者供體；或(b)應(yīng)用先前建立的長期HSC培養(yǎng)物，其可以是過敏原性的或異種的。在使用非自體的HSC時(shí)，通常也使用抑制未來宿主/患者的移植免疫反應(yīng)的方法。在特定的實(shí)施方案中，人骨髓細(xì)胞可以通過針吸法(needleaspiration)從后髂嵴獲得(參見例如Kodoetal.,J.Clin.Invest.73:1377-1384(1984))。例如，HSC可以制備成高度富集或基本上純的形式。所述的富集可以在長期培養(yǎng)之前、期間或之后完成，并且可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來進(jìn)行。骨髓細(xì)胞的長期培養(yǎng)物可以通過使用例如改良的Dexter細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(Dexteretal.,J.CellPhysiol.91:335(1977))或Witlock-Witte培養(yǎng)技術(shù)(WitlockandWitte，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:3608-3612(1982))來建立和維持。在特定的實(shí)施方案中，待被導(dǎo)入以進(jìn)行基因治療的核酸包括可操作地連接于編碼區(qū)域的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這樣，該核酸的表達(dá)通過控制合適的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在或不存在而得以控制。3.藥物前體(prodrugs)—提供了治療腫瘤的方法。該方法通過給予藥物前體而得以實(shí)施，該藥物前體被HASEGP在特定的位點(diǎn)切割從而釋放出活性藥物或能夠在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為活性藥物的前體(precursor)。一旦與表達(dá)sHASEGP活性的細(xì)胞接觸，所述藥物前體被轉(zhuǎn)化為活性藥物。藥物前體可以是綴合物(或稱為偶聯(lián)物)，其含有連接到目標(biāo)sHASEGP的底物上的活性試劑，諸如抗腫瘤藥物，例如細(xì)胞毒性試劑或其他治療試劑(TA)，這樣，該綴合物中的藥物或試劑是無活性的或者不能進(jìn)入細(xì)胞，但是在切割之后便被激活。例如，藥物前體可以含有硫酸軟骨素分子，通常相對短、小于約20個(gè)雙糖單位，其被目標(biāo)sHASEGP催化切割。細(xì)胞毒性試劑包括但不限于垸化劑、抗增殖劑和微管蛋白結(jié)合試劑。其他的試劑包括長春花類藥物(vincadrugs)、絲裂霉素、爭光霉素和紫杉醇。J.藥物組合物和給藥方式1.組合物的成分。本文提供了含有活性sHASEGP的藥物組合物。本文也提供了調(diào)節(jié)sHASEGP多肽活性的化合物與其它的用于治療透明質(zhì)酸酶紊亂的療法或化合物諸如抗體化合物的聯(lián)合。sHASEGP多肽和另外的試劑可以作為分離開的組合物進(jìn)行包裝，以便可以一起給藥或連續(xù)給藥或間斷給藥。可選擇地，它們可以提供為單一的組合物來施用，或提供為兩種組合物但給藥時(shí)作為單一的組合物。所述的這些聯(lián)合可以包裝為試劑盒。2.制劑和給藥途徑本文中提供的sHASEGP多肽和其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可以配制成藥物組合物，通常用于單劑量給藥。所述制劑中的多肽的濃度可以有效地傳送在給藥之后對于目的治療為有效的量。通常，組合物被配制成便于單次劑量給藥的形式。為了配制組合物，一定重量分?jǐn)?shù)的sHASEGP多肽、其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其混合物以有效的濃度溶解、懸浮、分散或者以其它方式混合于所選擇的媒介物(載體)中，這樣，被治療的癥狀可以被緩解或改善。適用于本文提供的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的給藥的藥物載體或媒介物包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的適用于特定的給藥模式的任何載體。此外，多肽可以作為組合物中唯一的藥物活性組分而配制于組合物中，或者，可以與其他活性組分組合。脂質(zhì)體懸浮液，包括以組織為靶的脂質(zhì)體，也可以用作藥物學(xué)上可接受的載體。這些都可以依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備。例如，脂質(zhì)體制劑可以按美國專利4,522,811中所述的制備?；钚詓HASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域被包含在藥物學(xué)上可接受的載體中，其數(shù)量足以在不對被治療的患者產(chǎn)生不利副作用的情況下產(chǎn)生治療上有用的效果。治療上有效的濃度可以通過在已知的體外和體內(nèi)系統(tǒng)中測試多肽而經(jīng)驗(yàn)性地確定，例如通過可以使用本文中提供的分析方法，或參見TalianiWa/.(1996)^wa/.5/oc/2em.240:60-67，F(xiàn)ilocamoWa/.(1997)Wra/ogy71:1417-1427,Sudo"a/,(1996)爿w"V/ra/32:9-18;Buffard"a/.(1995)Wro/ogv209:52-59;BianchiWa/.(1996)爿wa/.5z'oc/zem.237:239-244;Hamatake"a/.(1996)她rv/油gy39:249-258;Steinkiihlere,a/.(1998)飾c/ze附.37:8899-8905;D'Souza"a/.C1995)JGe".Wra/.76:1729-1736;Takeshitaetal.(1997)Anal.Biochem.247:242-246;也參見例如Shimizu"(1994)Kra/.68:8406-8408;Mizutani"a/.(1996)/.Fra/.70:7219-7223;Mizutani"a/.(1996)5/oc/z綴腸p—.紐Co訓(xùn)ww.227:822-826;Luetal.(19%)尸rac.Wa".JcadSd.(USA)93:1412-1417;Hahma/.(1996)Mro/ogy226:318-326;ItoWo/.(1996)乂Wra/.77:1043-1054;Mizutani"a/.(1995)加oc/e附.Co附/ww".212:906-911;Cho&fl/.(1997)/Fro/.Me仇65:201-207，然后由此推斷出用于人的劑量。通常，考慮治療上有效的劑量。被給予的量可以在每毫升血液體積0.001至1mg的級別，包括約0.005-0.05mg/ml血液體積和約0.01mg/ml血液體積。制備藥物的單位劑量形式(Pharmaceuticaldosageunitforms),其在每單位劑量形式中可提供約lmg至約lOOOmg的必需活性組分或必需組分的組合，包括約10至約500mg，包括約25-75mg的必需活性組分或必需組分的組合。精確的劑量可以經(jīng)驗(yàn)性地確定。在一些例子中，優(yōu)選高單位劑量的人sHASEGP。例如，對于sHASEGP的靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選的sHASEGP濃度為每毫升500-100,000單位。凍干的sHASEGP制劑對于保存大的單位劑量的sHASEGP也是理想的?？紤]將200,000單位的sHASEGP凍干小瓶裝制劑用于靜脈內(nèi)傳送。高濃度的劑量也被考慮用于傳送小體積的sHASEGP?？紤]將lO-lOOpl的5000單位/ml的sHASEGP注射入眼睛前房，以溶解之前在白內(nèi)障和有晶體眼人工晶體植入手術(shù)期間施用的粘彈性物質(zhì)。50-200U/ml劑量的小體積注射也被考慮用于玻璃體內(nèi)操作，例如治療糖尿病視網(wǎng)膜病的玻璃體出血或玻璃體視網(wǎng)膜脫落。稍大體積的注射(例如，在約l到幾ml,或者更多)被考慮用于稍大的和/或更容易引流(drained)的體內(nèi)空間。例如，如本文所述，l到幾ml或更多的眶周注射可注射到一個(gè)或多個(gè)眼周間隙，例如，通過向特農(nóng)下隙或鞏膜上隙注射，以促進(jìn)藥理學(xué)試劑向眼后部組織例如脈絡(luò)叢(choroidplexus)和/或視網(wǎng)膜的鞏膜遞送。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，一些體內(nèi)間隙能夠易于容納較大體積。例證性地，眼周的鞏膜上隙和特農(nóng)下隙能夠易于容納1到幾ml或甚至更大的體積(例如，高達(dá)或高于5到10ml，取決于例如具體組織的特性和遞送體積的速度)。另夕卜，如本文所描述和例證的，可以看出較大體積sHASEGP(可與一種或多種其它藥理學(xué)試劑或其它試劑聯(lián)合)的引入可用于進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)試劑向體內(nèi)期望的目標(biāo)位置的遞送。不限制于特定作用機(jī)理，相信此類較大體積注射可通過由增加的壓差所促進(jìn)的對流輸送過程，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)sHASEGP和存在于被治療組織中的其它試劑的滲透或散布。此外，不希望限制于特定作用機(jī)理，相信這種增加的壓差可在本發(fā)明中發(fā)生，其通過下列所述中的一種或多種作用而發(fā)生(i)升高的驅(qū)動(dòng)壓或升高的"壓位差(pressurehead)"(例如，由伴隨大量填充或略微溢出或超過間隙或注射位點(diǎn)產(chǎn)生的增加的液體靜壓力所引起)和(ii)降低的下游壓力或降低的"阻力(impedance)"(例如，由間質(zhì)基質(zhì)中通路的打開所引起，其是伴隨局部的透明質(zhì)酸酶活性和隨之發(fā)生的相對水合的透明質(zhì)素的降解而發(fā)生的)。用于本發(fā)明的這種應(yīng)用和其它應(yīng)用(如，促進(jìn)藥理學(xué)試劑及其它試劑的遞送)的優(yōu)選透明質(zhì)酸酶是sHASEGPs，特別是人sHASEGPs，在將試劑遞送到人體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)組織的情況下。但是，在透明質(zhì)酸酶應(yīng)用和用途中涉及的這些以及其它方法，也可應(yīng)用于使用非人sHASEGPs的情況，諸如哺乳動(dòng)物sHASEGPs，以及其它人類或哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶，優(yōu)選此類透明質(zhì)酸酶的可溶形式。活性成分可以一次給予，或者可以分為多次較小的劑量，間隔一段時(shí)間給藥?？梢岳斫獾氖?，精確的劑量和治療的持續(xù)時(shí)間取決于正在被治療的疾病，并且可以使用已知的測試方案經(jīng)驗(yàn)性地確定，或由體內(nèi)或體外的測試數(shù)據(jù)推出。應(yīng)該注意的是，濃度和劑量值也可以隨待減輕的癥狀的嚴(yán)重程度而有所變化。進(jìn)一步應(yīng)該理解的是，對于任何特定的對象，具體的劑量方案應(yīng)該隨著時(shí)間的推移，根據(jù)個(gè)體的需要以及實(shí)施和監(jiān)控該組合物的給藥的人員的專業(yè)判斷作出調(diào)整，應(yīng)該理解本文中所闡述的濃度范圍僅僅是示范性的，不是為了限制所要求保護(hù)的組合物和含有它們的聯(lián)合物的范圍或應(yīng)用。藥學(xué)上可接受的衍生物包括酸、鹽、酯、水合物、溶劑化形式和藥物前體形式。通常所選擇的衍生物的藥物動(dòng)力學(xué)特性優(yōu)于對應(yīng)的中性sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，為了形成藥物組合物，將有效濃度或數(shù)量的一種或多種在本文中提供的多肽或其藥學(xué)上可接受的衍生物與用于全身性給藥、外部給藥或局部給藥的合適的藥物載體或媒介物混合。sHASEGP多肽或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域以可有效地改善或治療正被考慮治療的紊亂的量被包括在其中。組合物中活性多肽的濃度取決于活性多肽的吸收、失活、排泄率、給藥方案、給藥量、具體劑型以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素。用于所述方法的治療劑可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何途徑來施用，例如但不限于局部給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、腦池內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥、眶周給藥、心室內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、氣管內(nèi)給藥以及其中的任何兩種或更多種給藥途徑的組合。也可嘗i式干私、狀月巿制齊l1(drypowderpulmonaryformulations)。最合適的給藥途徑將依據(jù)所打算的用途而變化，所述的用途例如用作傳送試劑(deliveryagent)以促進(jìn)流體的皮下傳送、用來降低接受粘彈性物質(zhì)的青光眼患者的眼內(nèi)壓力，或用作"擴(kuò)散劑"以增強(qiáng)化學(xué)治療劑的活性，還將依據(jù)感興趣的位置而變化，所述的位置例如具體的內(nèi)臟、腫瘤生長物、眼內(nèi)腔和表皮。給藥的方式包括但不限于外部給藥、局部給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、腦池內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥、眶周給藥、心室內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥以及其中的任何兩種或更多種給藥方式的組合。例如，對于各種癌癥的治療，例如鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、膀胱癌和腸胃癌的治療，局部給藥，包括給藥于腫瘤生長的位點(diǎn)(例如，鞘內(nèi)給藥、心室內(nèi)給藥或腦池內(nèi)給藥)，是有益的，其優(yōu)點(diǎn)在于，治療劑可以高的濃度被施用，而無并發(fā)癥的危險(xiǎn)，而這些并發(fā)癥會伴隨著治療劑的全身性給藥而發(fā)生。作為示范性的一類能與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)聯(lián)合的藥理學(xué)試劑(例如通過與一種或多種sHASEGP共同配制或與一種或多種sHASEGPs共同施用(其可在施用所述試劑之前、同時(shí)或之后施用)來聯(lián)合)，對于治療各種癌癥有效的或可能有效的許多試劑已在本領(lǐng)域中被描述，且新抗癌試劑定期被開發(fā)，其同樣可以與一種或多種sHASEGPs聯(lián)合(例如，通過共同配制，或在試劑給藥之前、同時(shí)和/或之后共同給藥)，以改進(jìn)試劑的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)或其它有益的性能。例證性地(不限于此)，許多抗癌或化療試劑現(xiàn)己被批準(zhǔn)可以與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)聯(lián)合用于治療各種癌癥，此聯(lián)合可通過共同配制或共同給藥(在抗癌劑給藥之前、同時(shí)或之后)。此類試劑包括，例如，阿地白介素(Aldesleukins)(例如，PROLEUKIN)、阿侖單抗(Alemtuzumabs)(例如，CAMPATH)、Alitretinoins(例如，ANRETIN)、別嘌呤醇(All叩urinols)(例如，ZYLOPRIM)、六甲蜜胺(Altretamines)(例如，HEXALEN)、氨磷汀(Amifostines)(例如，ETHYOLTM)、阿那曲唑(Anastrozoles)(例如，ARIMIDEXTM)、三氧化二砷(ArsenicTrioxides)(例如，TRISENOX)、天冬酰胺酶(Asparaginases)(例如，ELSPARtm)、BCGLive(例如，TICEBCG)、貝沙羅汀(Bexarotenes)(例如，TARGRETIN)、博來霉素(Beomycins)(例如，BLENOXANE)、靜脈注射白消安(Busulfanintravenous)(例如，BUSULFEX)、口服白消安(Busulfanorals)(例如，MYLERAN)、卡普睪酮(Calusterones)(例如，METHOSARB)、卡培他濱(Capecitabines)(例如，XELODATM)、卡鈾(Carboplatins)(例如，PARAPLATIN)、卡莫司汀(Carmustines)(例如，BCNU,BiCNU)、聚苯丙生為載體的卡莫司(CarmustineswithPolifeprosans)(例如，GLIADELWafer)、塞來昔(Celecoxibs)(例如，CELEBREX)、苯丁酸氮芥(Chlorambudls)(例如，LEUKERAN)、順鉑(Cisplatins)(例如，PLATINOLTM)、克拉屈濱(Cladribines)(例如，LEUSTATIN,2-CdATM)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamides)(例如，CYTOXAN,NEOSAR)、阿糖胞苷(Cytarabines)(例如，CYTOSAR-UTM)、阿糖胞苷脂質(zhì)體(Cytarabineliposomals)(例如，DepoCytTM)、達(dá)卡巴嗪(Dacarbazines)(例如，DTIC-Dome)、放線菌素D(Dactinomycins)(例如，COSMEGEN)、達(dá)依泊汀a(DarbepoetinAlfas)(例如，ARANESP)、道諾紅菌素脂質(zhì)體(Daunorubicinliposomals)(例如，DANUOXOME)、道諾紅菌素/道諾霉素(Daunorubicins/Daunomycins)(例如，CERUBIDINE)、地尼白介素-毒素連接物(DenileukinDiftitoxes)(例如，ONTAK)、右雷佐生(Dexrazoxanes)(例如，ZrNECARD)、多烯紫杉醇(Docetaxels)(例如，TAXOTERE)、亞德里亞霉素(Doxorubicins)(例如，ADRLAMYCIN,RUBEX)、亞德里亞霉素脂質(zhì)體(DoxorubicinIiposomals)(例如，DOXIL)、屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolonepropionates)(例如，DROMOSTANOLONEtm和MASTERONEtm注射剤)、Elliott'sBSolutions(例如，Elliott'sBSolution),表柔比星(Epirubicins)(例如，ELLENCE)、阿法依伯汀(Epoetinalfas)(例如，EPOGEN)、雌莫司汀(Es加mustines)(例如，EMCYT)、磷酸依托泊甙(Etoposidephosphates)(例如ETOPOPHOS)、依托泊武VP-16s(EtoposideVP-16s)(例如VEPESID)、依西美坦(Exemestanes)(例如AROMASIN)、非格司亭(Filgrastims)(例如NEUPOGEN)、5氟脫氧尿苷(Floxuridines)(例如FUDR)、氟達(dá)拉賓(Fludarabines)(例如FLUDARA)、含5-FUs的氟尿嘧啶(Fluorouracilsincl.5-FUs)(例如ADRUCIL)、氟維司群(Fulvestrants)(例如FASLODEXTM)、吉西他濱(Gemcitabines)(例如GEMZAR)、吉妥單抗/奧唑米星(Gemtuzumabs/Ozogamicins)(例如MYLOTARG)、醋酸戈舍瑞林(Goserelinacetates)(例如ZOLADEX)、羥基脲(Hydroxyureas)(例如HYDREA)、替伊莫單抗(Ibritumomabs/Tiuxetans)(例如ZEVALIN)、去甲氧正定霉素(Idarubicins)(例如IDAMYCIN)、異磷酰胺(Ifosfamides)(例如IFEX)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinibmesylates)(例如GLEEVEC)、干擾素a-2as(Interferonalfa-2as)(例如ROFERON-A)、干擾素a-2bs(Interferonalfa-2bs)(例如INTRONA)、伊立替康(Irinotecans)(例如CAMPTOSAR)、來曲唑(Letrozoes)(例如FEMARA)、甲酰四氫葉酸(Leucovorins)(例如WELLCOVORIN,LEUCOVORIN)、左旋咪唑(Levamisoles)(例如ERGAMISOLTM)、環(huán)己亞硝脲(Lomustines/CCNUs)(例女HCeeBUTM)、Meclorethamines/氮芥(Meclorethamines/Nitrogenmustards)(例如MUSTARGENTM)、醋酸甲地孕酮(Megestrolacetates)(例如MEGACE)、美法侖/L-PAM(Melphalans/L-PAMs)(例如ALKERAN)、含6-MPs的巰基嘌呤(Mercaptopurineincl.6-MPs)(例如PURINETHOL)、美司那(Mesnas)(例如MESNEX)、甲氨蝶呤(Methotrexates)、甲氧沙林(Methoxsalens)(例如UVADEX)、絲裂霉素Cs(MitomycinCs)(例如MUTAMYCIN,MITOZYTREX)、米托坦(Mitotanes)(例如LYSODREN)、米托蒽醌(Mitoxantrones)(例如NOVANTRONE)、苯丙酸南諾龍(NandrolonePhenpropionates)(例如DURABOLIN-50)、Nofetumomabs(例如VERLUMA)、白細(xì)胞介素-11(Oprelvekins)(例如NEUMEGA)、奧沙利鉑(Oxaliplatins)(例如ELOXATIN)、紫杉醇(Paclitaxels)(例如PAXENETM,TAXOLTM)、氨羥二磷酸二鈉(Pamidronates)(例如AREDIATM)、培加酶(Pegademases)(例如ADAGEN)、培門冬酶(Pegaspargases)(例如ONCASPAR)、培非格司亭(Pegfilgrastims)(例如NEULASTA)、噴司他丁(Pentostatins)(例如NIPENT)、哌泊溴烷(Pipobromans)(例如VERCYTE)、普卡霉素/光輝霉素(Plicamycin/Mithramycins)(例如MITHRACINTM)、B卜吩姆鈉(Porf(mersodiums)(例如PHOTOFRIN)、甲基節(jié)肼(Procarbazines)(例如MATULANE)、奎納克林(Quinacrines)(例如ATABRINE)、拉布立酶(Rasburicases)(例如ELITEK)、美羅華(Rituximabs)(例如RITUXAN)、沙格司亭(Sargramostims)(例如PROKINE)、鏈脲霉素(Streptozocins)(例如ZANOSAR)、滑石(Talcs)(例如SCLEROSOL)、它莫西芬(Tamoxifens)(例如NOLVADEX)、替莫唑胺(Temozolomides)(例如TEMODARtm)、替尼泊甙/VM-26s(Teniposides/VM-26s)(例如VUMON)、睪內(nèi)酯(Testolactones)(例如TESLAC)、含6-TG的硫代鳥苷(Thioguaninesincl.6-TG)、三胺硫磷(Thiotepas)(例如THIOPLEXtm)、托泊替康(Topotecans)(例如HYCAMTINtm)、托瑞米芬(Toremifenes)(例如FARESTON)、托西莫單抗(Tositumomabs)(例如BEXXAR)、曲妥珠單抗(Trastuzumabs)(例如HERCEPTIN)、維生素A酸/ATRA(Tretinoins/ATRA)(例如VESANOID)、尿嘧啶氮芥(UracilMustards)、戊柔比星(Valrubicins)(例如VALSTAR)、長春花堿(Vinblastines)(例如VELBAN)、長春新堿(Vincristines)(例如ONCOVIN)、長春瑞賓(Vinorelbines)(例如NAVELBINE)、唑來磷酸(Zoledronates)(例如ZOMETA)以及本文所描述的和本領(lǐng)域中的其它試劑。如同本文描述的其它種類的藥理學(xué)試劑一樣，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)可與各種藥理學(xué)試劑(例如，抗腫瘤藥，或者本文描述的和/或本領(lǐng)域已知的另一類試劑中的成員)的施用聯(lián)合使用(或共同配制)?？蛇x擇地，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)可與指定種類的多于一種藥理學(xué)試劑(例如，若干抗腫瘤試劑，或本文所述的和/或本領(lǐng)域已知的其它種類試劑中的若干成員)聯(lián)合施用(或共同配制)。在與指定種類的兩種或更多種試劑聯(lián)合的情況下，通常優(yōu)選這兩種或多種試劑通過兩種或更多種不同的作用機(jī)理來起效。sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)也可與下述試劑聯(lián)合施用(或共同配制)，即，第一指定類型的一種藥理學(xué)試劑(例如，抗腫瘤藥，或本文所述的和/或本領(lǐng)域已知的其它類型試劑中的一種的一個(gè)成員)，以及用于治療多種癥狀中的任何癥狀的一種或多種不同類型的藥理學(xué)試劑中的一種或多種額外的藥劑。盡管某些原理在這里以抗癌試劑為例被提出，但這些原理也可適用于，例如，抗感染藥和本文描述和列舉的其它類型試劑中的眾多成員，以及本領(lǐng)域已知的或新開發(fā)的其它試劑。在本文描述的任何聯(lián)合物和/或聯(lián)合制劑的情況下(包括至少一種sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)和至少一種其它試劑(例如藥理學(xué)試劑，例如，本文列舉的一類試劑中的成員))，也考慮這種聯(lián)合物和/或聯(lián)合制劑可進(jìn)一步包括一種或多種試劑(如，各種穩(wěn)定劑、賦形劑及其類似物)，其本身不發(fā)揮實(shí)質(zhì)上的藥效作用，但其促進(jìn)聯(lián)合物和/或聯(lián)合制劑的有效性(例如，通過穩(wěn)定一種或多種成分或整個(gè)制劑，通過幫助促進(jìn)或靶向一種或多種試劑的活性或者sHASEGP的活性，和/或通過降低毒性或者以其它方式改進(jìn)聯(lián)合物或聯(lián)合制劑的安全性能)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這些試劑和其它抗癌試劑(以及本文描述的其它類型試劑的成員)的新形式和配方被定期開發(fā)，其可同樣與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)聯(lián)合。另外，由于此類酶可用于改進(jìn)多種試劑的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)特性，并使試劑能夠通過不同的(和可能更有目標(biāo)的)途徑被遞送，例如，sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)可用于增強(qiáng)先前認(rèn)為具有不理想特性的多種試劑的PK禾卩/或PD特性。在合適的動(dòng)物模型中在同時(shí)存在和不存在sHASEGP的情況下，對試劑進(jìn)行測試，可以用來評估具體試劑的相對有效性和毒性。如本文所闡釋和例舉的，多種大分子試劑(如，抗體和其它蛋白質(zhì)，尤其是通過非IV腸胃外注射給藥的那些)顯示出相對差的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，并可通過與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共同配制或共同給藥而被顯著地增強(qiáng)。不限制于特定作用機(jī)理，一般地認(rèn)為顯示出相對低的疏水性的小分子試劑能更有效地散布，例如通過間質(zhì)流體中的對流輸送，這可以通過sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)被促進(jìn)。預(yù)測這種屬性的常用方法是，評估計(jì)算的和/或估計(jì)的辛醇:水分配系數(shù)(K。w)，多種化合物的這種分配系數(shù)已被報(bào)道。在那一方面，試劑顯示出〈3的logK。w，更優(yōu)選<2或<1，更加優(yōu)選<0，還優(yōu)選<(-1)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，許多試劑也可被共價(jià)地和/或非共價(jià)地修飾，以增加它們的親水性，和/或?qū)⒋祟愒噭┌谛∨莼虼蠓肿訌?fù)合物中以促進(jìn)它們的滲透和/或遞送。為了進(jìn)一步闡明的目的(但不限制于此)，示例性的可與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)聯(lián)合的抗癌藥劑或化療藥劑被包括在下列列表中(其它是本領(lǐng)域已知的)阿西維辛(Acivicins);阿柔比星(Aclarubicins);阿考達(dá)唑(Acodazoles);阿克羅寧(Acronines);阿多來新(Adozelesins);阿地白介素(Aldesleukins);Alitreninoins(9-順式維甲酸)；六甲蜜胺(Altretamines);Alvocidibs;安巴腙(Ambazones);二霉素(Ambomycins);阿美蒽酉昆(Ametantrones);氨魯米特(Aminoglutethimides);氨吖啶(Amsacrines);阿那曲唑(Anastrozoles);阿那昔酮(Anaxirones);安西他濱(Ancitabines);安曲霉素(Anthramycins);Apaziquones;精美司那(Argimesnas);天冬酰胺酶(Asparaginases);曲林菌素(Asperlins);阿曲氮芥(Atrimustines);阿扎胞苷(Azacitidines);阿扎替派(Azetepas);固氮酶素(Azotomycins);Banoxantrones;Batabulins;巴馬司他(Batknastats);貝另卩昔濱(Benaxibines);苯達(dá)莫司汀(Bendamustines);節(jié)替哌(Benzodepas);貝沙羅汀(Bexarotenes);比卡魯月安(Bicalutamides);比4也舍平(Bietaserpines);Biricodars;雙蒽生(Bisantrenes);雙蒽生(Bisantrenes);二甲磺酸雙奈法德(BisnafideDimesylates);比折來新(Bizelesins);博來霉素(Bleomycins);硼替佐米(Bortezomibs);布喹那(Brequinars);溴匹立明(Bropirimines);布度鈦(Budotitanes);白消安(Busulfans);放線菌素C(Cactinomycins);卡魯睪酮(Calusterones);卡紐替尼(Canertinibs);卡培他濱(Capecitabines);卡醋胺(Caracemides);卡貝替姆(Carbetimers);卡鉑(Carboplatins);卡波酉昆(Carboquones);卡莫氟(Carmofurs);卡莫司汀(Carmustines);卡瑞斯汀(Carubicins);卡折來新(Carzelesins);西地霉素(Cedefingols);西地霉素(Cemadotins);苯丁酸氮芥(Chlorambucils);塞奧羅奈(Cioteronels);西羅霉素(Cirolemycins);順鉑(Cisplatins);克拉屈賓(Cladribines);克蘭氟脲(Clanfenurs);克羅拉濱(Clofarabines);Crisnatols;環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamides);阿糖胞苷(Cytarabines);達(dá)卡巴嗪(Dacarbazines);放線菌素D(Dactinomycins);柔紅霉素(Daunorubicins);地西他濱(Decitabines);右尼古地平(Dexniguldipines);右奧馬鉬(Dexormaplatins);地扎胍寧(Dezaguanines);地吖醌(Diaziquones);Dibrospidiums;地諾孕素(Dienogests);Dinalins;Disermolides;多烯紫杉醇(Docetaxels);Dof叫uidars;氟鐵龍(Doxifluridines);阿霉素(Doxorubicins);屈洛昔芬(Droloxifenes);丙酸甲雄烷酮(DromostanolonePropionates);偶氮霉素(Duazomycins);依考莫司汀(Ecomustines);依達(dá)曲沙(Edatrexates);Edotecarins;依氟鳥氨酸(Eflomithines):依克立達(dá)(Elacridars);依利奈法德(Elinafides);依沙盧星(Elsamitrucins);乙嘧替氟(Emitefurs);恩洛鉑(Enl叩latins);恩普氨酯(Enpromates);Enzastaurins;依匹哌啶(Epipropidines);表阿霉素(Epirubicins);依他前列素(Eptaloprosts):厄布洛唑(Erbulozoles);依索比星(Esorubicins);雌莫司汀(Estramustines);依他硝唑(Etanidazoles);依托格魯(Etoglucids);依托泊甙(Etoposides);氯苯乙嘧胺(Etoprines);Exisulinds;法倔唑(Fadrozoles);法扎拉濱(Fazarabines);芬維A胺(Fenretinides);氟脲苷(Floxuridines);氟達(dá)拉濱(Fludarabines);氟尿嘧啶(Fluorouracils);氟甲睪酮(Fluoxymesterones);氟西他濱(Flurocitabines);磷喹酮(Fosquidones);福司曲星(Fostriecins);福司曲星(Fostriecins);福曲他明(Fotretamines);力口柔比星(Galambicins);力Q洛他濱(Galocitabines);吉西他濱(Gemcitabines);吉羅酚(Geroquinols);吉馬替康(Gimatecans);吉莫斯特(Gimeracils);格洛沙腙(Gloxazones);葡膦酰胺(Glufosfamides);羥基脲(Hydroxyureas);去甲氧基柔紅霉素(Idarubicins);異磷酰胺(Ifosfamides);伊莫福新(Ilmofosines);伊洛馬司他(Ilomastats);依美克(Imexons);英丙舒凡(Improsulfans);Indisulams;Inproquones;千擾素(Interferons);干擾素a(InterferonAlfas);干擾素P(InterferonBetas);干擾素Y(InterferonGammas);白細(xì)胞介素-2s(Interleukin-2s)及其它白細(xì)胞介素(包括重組的白介素)；茚托利辛(Intoplicines);碘芐胍[131-I](Iobenguanes[131-1]);異丙鉑(IpropIatins);依立替康(Irinotecans);伊索拉定(Irsogladines);伊沙匹隆(Ixabepilones);酮曲沙(Ketotrexates);L-阿拉諾新(L-Alanosines);蘭瑞肽(Lanreotides);拉巾白替尼(Lapatinibs);Ledoxantrones;來曲唑(Letrozoles);Leuprolides;亮丙瑞林(Leuprorelins)(Leuprorelides);來沙骨化醇(Lexacalcitols);利奧吡咯(Liarozoles);洛鉬(Lobaplatins);洛美曲索(Lometrexols);洛莫司汀(Lomustines);洛那法尼(Lonafarnibs);洛索蒽醌(Losoxantrones);勒托替康(Lurtotecans);馬磷酰胺(Mafosfamides);甘露舒凡(Mannosulfans);馬立馬司他(Marimastats);馬索羅酚(Masoprocols);美登素(Maytansines);氮芥(Mechlorethamines);甲i也孕酮(Megestrols);美侖孕酮(Melengestrols);美法侖(Melphalans);美諾立爾(Menogarils);美雄烷(Mepitiostanes);巰嘌呤(Mercaptopurines);美替辛德(Metesinds);甲氨蝶呤(Methotrexates);美托咪酉旨(Metomidates);氯苯氨啶(Metoprines);美妥替哌(Meturedepas);米巾白(Miboplatins);米潑昔芬(Miproxifenes);米索硝唑(Misonidazoles);米丁度月安(Mitindomides);米托克星(Mitocarcins);Mitocromins;米托拉酮(Mitoflaxones);米托潔林(Mitogillins);米托胍腙(Mitoguazones);米托馬星(Mitomalcins);絲裂霉素(Mitomycins):米托萘胺(Mitonafides);米托喹酮(Mitoquidones);米托司培(Mitospers);米托坦(Mitotanes);米托蒽醌(Mitoxantrones);米托唑胺(Mitozolomides);Mivobulins;咪唑立賓(Mizoribines);莫法羅汀(Mofarotenes);莫哌達(dá)醇(Mopidamols);Mubritinibs;霉鼢酸(MycophenolicAcids);奈達(dá)鉑(Nedaplatins);Nelzarabines;奈莫柔比星(Nemorubicins);二胺硝吖啶(Nitracrines);諾考達(dá)唑(Nocodazoles);諾拉霉素(Nogalamycins);諾拉曲特(Nolatrexeds);Nortopixantrones;奧曲月太(Octreotides);奧馬鉬(Ormaplatins);Ortataxels;奧替拉西(Oteracils);奧昔舒侖(Oxisurans);氧苯石申(Oxophenarsines);紫杉醇(Paclitaxels);氨羥二磷酸二鈉(Pamidronates);Patubilones;培門冬酶(Pegaspargases);Peldesines;培禾(J霉素(Peliomycins);Pelitrexols;培美曲塞(Pemetrexeds);奈莫司汀(Pentamustines);培洛霉素(Peplomycins);培磷酰胺(Perfosfamides);哌立福新(Perifosines);吡鉬(Picoplatins);吡萘非特(Pinafides);哌泊溴烷(Pipobromans);哌泊舒凡(Piposulfans);吡非尼酮(Pirfenidones);吡羅蒽酉昆(Piroxantrones);Pixantrones;Plevitrexeds;普卡毒素(Plicamycins);普、洛美坦(Plomestanes);普洛美坦(Plomestanes);Porfimers;泊非霉素(Porftromycins);潑尼莫司汀(Prednimustines);丙卡巴肼(Procarbazines);普羅帕脒(Propamidines);Prospidiums;嘌噴替派(Pumitepas);嘌羅霉素(Puromycins);批唑呋喃菌素(Pyrazoftirins);雷莫司汀(Ranimustines);利波腺苷(Riboprines);利曲舒凡(Ritrosulfans);羅谷亞胺(Rogletimides);羅喹美克(Roquinimexs);鏈黑霉素(Rufocromomycins);沙柔比星(Sabarubicins);沙芬戈(Safingols);沙鉑(Satraplatins);司鉬(Sebriplatins);司莫司汀(Semustines);辛曲秦(Simtrazenes);西佐喃(Sizofirans);索布佐生(Sobuzoxanes);索拉芬尼(Sorafenibs);Sparfosates;膦門冬酸(SparfosicAcids);司帕霉素(Sparsomycins):t累鍺(Spirogermaniums);螺莫司汀(Spiromustines);螺鉑(Spiroplatins);螺鉑(Spiroplatins);鯊胺(Squalamines);鏈黑霉素(Streptonigrins);鏈伐立星(Streptovarycins);鏈脲菌素(Streptozocins);磺磷酰胺(Sufosfamides);磺氯苯脲(Sulofenurs);Tacedinalines;他禾U霉素(Talisomycins);Tallimustines(他莫司汀)；Tariquidars;?；悄就?Tauromustines);Tecogalans;替力口氟(TegafUrs);替洛蒽酉昆(Teloxantrones);替莫泊芬(Temoporfms);替尼泊甙(Teniposides);替羅昔隆(Teroxirones);睪內(nèi)酪(Testolactones);Thiamiprines;硫代鳥嘌呤(Thioguanines);噻替派(Thiotepas);硫米嘌呤(Tiamiprines);噻唑呋啉(Tiazofiirins);噻氯咪索(Tilomisoles);替洛龍(Tilorones);Timcodars;噻莫西酸(Timonacics);替拉扎明(Tirapazamines);Topixantrones;托瑞米芬(Toremifenes);Trabectedins(海鞘素743(Ecteinascidin743));曲妥珠單抗(Trastuzumabs);曲托龍(Trestolones);曲西立濱(Triciribines);曲西立濱(Triciribines);曲洛司坦(Trilostanes);三甲曲沙(Trimetrexates);TriplatinTetranitrates;曲普瑞林(Triptorelins);曲磷胺(Trofosfamides);妥布氯唑(Tubulozoles);烏苯美司(Ubenimexs);烏拉莫司汀(UracilMustards);烏瑞替派(Ured印as);伐司撲達(dá)(Valspodars);伐普肽(Vapreotides);維替泊芬(Verteporfins):長春堿(Vinblastines);長春新堿(Vincristines);長春堿酰胺(Vindesines);長春匹定(Vinepidines);長春氟寧(Vinflunines);長春米特(Vinformides);長春甘酉旨(Vinglycinates);長春西醇(Vinleucinols);長春羅新(Virileurosines);長春瑞賓(Vinorelbines);長春羅定(Vinrosidines);長春曲醇(Vintriptols);長春利定(Vinzolidines);伏氯唑(Vorozoles);黃鏈霉素A(胍甲四環(huán)素)(XanthomycinA's(Guamecyclines));折尼鉬(Zeniplatins);亞節(jié)維[2-H](Zilascorbs[2-H]);凈司他汀(Zinostatins);佐柔比星(Zorubicins);Zos叫uidars;及其類似物。適合于本文提供的sHASEGP多肽或可其溶性人類透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的施用的制藥上的和整型美容用的載體或媒介物，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合于特定給藥模式的任何此類載體。另外，多肽可以作為組合物中唯一的藥物活性成分被配制，或者可與不削弱所需作用的其它活性成分聯(lián)合，或者與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠補(bǔ)充所需作用的材料聯(lián)合。例如，本文提供的sHASEGP多肽可用作遞送劑或"散布"劑，與另一種活性化合物聯(lián)合，所述另一種活性化合物如治療上有效的試劑，包括但不限于藥物或前藥，以促進(jìn)所述另一種活性成分的遞送或增強(qiáng)其活性。在具體實(shí)施方案中，sHASEGP多肽或其可溶性人類透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，可與麻醉劑如利多卡因(Lignocaine)、丁哌卡因(Bupivicaine)或兩者的混合物共同配制或共同給藥，可選擇地，還和激素試劑如腎上腺素共同配制或共同給藥，以減少或終止眼科手術(shù)過程中的血液攝取。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，sHASEGP多肽或其可溶性人類透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，可與藥理學(xué)試劑如抗炎劑共同配制或共同給藥，以增強(qiáng)藥理學(xué)試劑在體內(nèi)向哺乳動(dòng)物組織的遞送(例如，到眼的一部分)，其中，此試劑被期望用于治療特定癥狀。共同給藥被考慮為，將sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)與藥理學(xué)試劑一起給藥或在接近的時(shí)間內(nèi)給藥。通常優(yōu)選sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)在藥理學(xué)試劑前不久(例如，之前5到60分鐘)給予，或者，最方便地，與藥理學(xué)試劑一起給予。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，所需的共同給藥的接近程度主要取決于試劑在具體組織環(huán)境中的有效半衰期，和所治療的具體疾病，并可通過測定在適當(dāng)模型例如適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中以不同的時(shí)間施用藥劑的作用來優(yōu)化。在一些情況下，給予sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)的最佳計(jì)時(shí)將超過60分鐘。例證性地，且不希望被理論束縛，在一些腫瘤的情形中，例如，在化療劑可以最大程度地進(jìn)入腫瘤之前，在腫瘤中的透明質(zhì)素的降解充分地完成，從而減小腫瘤的間質(zhì)體積，接著是透明質(zhì)素再生階段，在此階段中，流體被汲回腫瘤中，導(dǎo)致漿體對化療劑的吸收增加。在后者情況下，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)的最佳給藥可能在藥理學(xué)試劑給藥前約1到20小時(shí)獲得。為了優(yōu)化與用于疾病情況和藥理學(xué)試劑的具體組合的藥理學(xué)試劑相關(guān)的提前給藥的時(shí)間，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用常規(guī)時(shí)間進(jìn)程的提前給藥，通常用一個(gè)小時(shí)或更短時(shí)間中的一個(gè)或幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)與大于一小時(shí)(但通常不超過一天)中的一個(gè)或幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較，以優(yōu)化給藥時(shí)間。SHASEGP多肽或其可溶性人類透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，也可與多種化療劑如毒素或腫瘤壞死因子共同配制或共同給予，以增強(qiáng)化療劑的活性和/或化療劑對靶腫瘤的可達(dá)性?；钚曰衔锉话ㄔ谳d體中，其量足以在被治療的個(gè)體中發(fā)揮治療有益作用且沒有嚴(yán)重毒性作用。有效濃度可通過使用體外和體內(nèi)系統(tǒng)——包括本文描述的動(dòng)物模型一一測試化合物而被經(jīng)驗(yàn)性地確定。在通過腸胃外給藥(例如，通過消化道以外的其它途徑，例如，通過皮下的、皮內(nèi)的、肌肉內(nèi)的或靜脈內(nèi)的途徑)遞送的藥理學(xué)試劑的情況下，sHASEGPs(或者其它糖胺聚糖酶)可容易地與多種此類藥理學(xué)試劑中的任何共同配制或共同給藥，以增強(qiáng)它們向體內(nèi)所需位點(diǎn)的遞送。例如，取決于藥理學(xué)試劑和給藥途徑的具體結(jié)合，可通過增加試劑擴(kuò)散通過遞送位點(diǎn)處的組織或鄰近組織(例如，在其注射后)的程度(和/或速度)來增強(qiáng)遞送，和/或通過增加試劑擴(kuò)散和/或通過經(jīng)過目標(biāo)組織的對流轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，在其從血流、淋巴、腦脊液或其它流動(dòng)體系釋放以后)被運(yùn)載的程度(和/或速度)來增強(qiáng)遞送。遞送被增強(qiáng)的程度可被容易地評估，例如，在動(dòng)物模型系統(tǒng)中評價(jià)，在其中，sHASEGP的添加導(dǎo)致在體內(nèi)的感興趣的組織中試劑的生物利用度有可測量到的增加。不希望被理論束縛，相信在非靜脈腸胃外(如，皮下的、皮內(nèi)的和肌肉注射劑)的情況下，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)在注射位點(diǎn)附近和在"下游"位點(diǎn)處例如在注射位點(diǎn)與遠(yuǎn)端脈管床之間的位置的存在，可增強(qiáng)試劑向遞送系統(tǒng)如脈管的擴(kuò)散和/或?qū)α鬓D(zhuǎn)運(yùn)。在這種情況下的增強(qiáng)的遞送，可伴隨有效穿過并脫離初始遞送位點(diǎn)的試劑的量增加(可能通過增加流體總體流量的體積和速度來完成)。在許多藥理學(xué)試劑——其在組織中會被降解、移除或以其它形式失活——的情況下，增加其通過組織的速度可實(shí)質(zhì)地增加通過組織的有效試劑的量，進(jìn)一步增加其生物利用度。對于隨后進(jìn)入血流或其它管道(conduit)的非靜脈給藥的腸胃外給藥試劑，以及直接遞送到脈管(conduitvessels)中的試劑(如，通過靜脈內(nèi)給藥，IV)，試劑擴(kuò)散穿過由管道供給的組織的能力也可通過組織中sHASEGP的存在而被增強(qiáng)。無論sHASEGP是存在于"遞送組織"，正如前者的情況，和域存在于"靶標(biāo)組織"，正如后者的情況，sHASEGP的存在都可因而增強(qiáng)藥理學(xué)試劑向體內(nèi)靶標(biāo)組織的遞送的有效程度和/或速度。在任一情況中，sHASEGP都可用于增加己與之共同配制或共同給藥的藥理學(xué)試劑的有效生物利用度。結(jié)果，sHASEGP可用于獲得升高的和/或更快速達(dá)到的試劑濃度，以提供例如更有效的和/或更快速的對給定劑量的反應(yīng)。可選擇地，例如，sHASEGP可用于在更低給藥試劑劑量下獲得特定的反應(yīng)。sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)在注射點(diǎn)處或其鄰近處增強(qiáng)總體流體流動(dòng)的能力，也可改進(jìn)伴隨的藥理學(xué)試劑遞送的其它方面。例如，總體流體流動(dòng)的增加可幫助使注射的流體體積更容易地從注射點(diǎn)出散開(降低可能出現(xiàn)的疼痛或注射的其它不良結(jié)果)。確實(shí)，很久前就已經(jīng)認(rèn)識到，非IV腸胃外注射所伴隨的這種不良感覺，是患者可能抵抗或回避非IV腸胃外給藥的主要原因(其強(qiáng)烈要求產(chǎn)品采用靜脈給藥，而它原本通過非IV途徑給藥可能更方便和/或更安全)。當(dāng)使用本發(fā)明的sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)來增強(qiáng)一種或多種藥理學(xué)試劑或其它試劑在體內(nèi)的遞送時(shí)(有時(shí)該應(yīng)用被稱為"散布")，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)本身可通過與藥理學(xué)試劑相同的途徑給藥(在這種情況下，它可與藥理學(xué)試劑共同配制或以其它方式一起共同給藥，或者可分別給藥，優(yōu)選如上文討論的在藥理學(xué)試劑之前給藥)?？蛇x擇地，或額外地，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)可通過不同的給藥途徑來給藥。例如，藥理學(xué)試劑可通過非IV腸胃外注射被局部地引入，sHASEGP可被靜脈內(nèi)引入。作為另一個(gè)示范性的且非限制性的例子，sHASEGP可通過非IV腸胃外注射(在期望被藥理學(xué)試劑靶向的組織中)被局部地引入，藥理學(xué)試劑本身可通過另一種途徑被引入，例如靜脈內(nèi)、非腸胃外(例如，口服)或其它途徑。因此，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，本發(fā)明的sHASEGPs可被用于增強(qiáng)多種藥理學(xué)試劑和其它試劑的遞送和生物利用度，包括通常通過腸胃外和非腸胃外途徑遞送的試劑。例如，sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)可與一般通過腸胃外遞送給予的各種藥理學(xué)試劑共同配制或共同給藥，例如，以增強(qiáng)它們的效力和/或改進(jìn)它們在治療疾病中的風(fēng)險(xiǎn)/益處特性。作為可通過腸胃外施用并可通過與本發(fā)明的sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共同配制和/或共同施用而增強(qiáng)其遞送和/或生物利用度的多種藥理學(xué)試劑的示例，下面的列表并非詳盡地(因而并非限制性地)而僅僅是提供了示范性的試劑阿達(dá)木單抗(Adalimumabs)(例如HUMIRA)、卩-半乳糖苷酶(例如FABRAZYME)、阿地白介素(例如PROLEUKINIL-2)、阿法賽特(Alefacepts)(例如AMEVIVETM)、氨節(jié)青霉素(例如UNASYNTM注射劑)、阿那白滯素(Anakinras)(例如KINERET)、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗(AntipoliomyeliticVaccines)(例如PEDIARIX)、抗胸腺細(xì)胞(Anti-Thymocytes)(例如THYMOGLOBULIN)、阿奇霉素(Azithromycins)(例如ZITHROMAXIV)、貝卡普勒明(Becaplermins)(例如REGRANEX)、卡泊芬凈(Caspofiingins)(例如CANCIDAS)、頭孢唑啉(Cefazolins)(例如ANCEF和CEFAZOLIN)、頭孢吡肟(Cefepimes)(例如MAXIPIME)、頭孢替坦(Cefotetans)(例如CEFOTAN)、頭孢他啶(Ceftazidimes)(例如FORTAZ)、頭孢曲松(Ceftriaxones)(例如ROCEFIN)、西妥昔單抗(Cetuximabs)(例如ERBITUX)、西司他汀(Cilastatins)(例如PRIMAXINIV)、克拉維酸(ClavulanicAcids)(例如與阿莫西林聯(lián)合，如AUGMENTIN)、克林霉素(Clindamycins)(例如CLEOCIN)、a-達(dá)貝泊汀(DarbepoetinAlfas)(例如ARANESP)、Deaclizumabs(例如ZENAPAX)、白喉類毒素(DiphtheriaToxoids)(—般聯(lián)合例如DAPTACEL、INFANRIXtm和PEDIARIXtm)、依法利珠單抗(Efalizumabs)(例如RAPTIVA)、腎上腺素(Epinephrines)(例如EPIPENtm)、a-促紅細(xì)胞生成素(ErythropoietinAlphas)(例如EPOGENtm和PROCRIT)、依那西普(Etanercepts)(例如ENBRELTM)、非格司亭(Filgmstims)(例如NEUPOGENTM)、氟康唑(Fluconazoles)(例如DIFLUCANtm注射劑)、促濾泡素(Follicle-StimulatingHormones)例如a-促濾泡素(FollitropinAlphas)(例如GONAL-Ftm)和P-促濾泡素(FollitropinBetas)(例如FOLLISTIM)、磷苯妥英(Fosphenytoins)(例如CEREBYX)、氟康唑(Fluconazoles)(例如DIFLUCAN)、軋雙胺(Gadodiamides)(例如OMNISCANTM)、釓噴酸(Gadopentetates)(例如MAGNEVIST)、加替沙星(Gatifloxacins)(例如TEQUIN)、格拉默(Glatiramers)(例如COPAXONE)、GM-CSFs(例如LEUKINE)、戈舍瑞林(Goserelins)(例如ZOLADEX)、格拉司瓊(Granisetrons)(例如KYTRIL)、流感嗜血桿菌B(HaemophilusInfluenzaB's)(例如COMVAXtm和HibTITER)、氟哌啶醇(Haloperidols)(例如HALDOLTM)、甲型肝炎疫苗(HepatitisAVaccines)(例如HAVRIX、TWINRIXtm和VAQTA)、乙型肝炎疫苗(HepatitisBVaccines)(例如重組COMVAX、ENGERIX-B、RECOMBIVAX-HB、TWINRIX,和非重組BAYHEP-B和NABFM-HB)、替伊莫單抗(IbritumomabTiuxetans)(例如ZEVALIN)、免疫球蛋白(Immunoglobulins)(包括免疫球蛋白的混合物，如GAMMAGARDTM和類似物，以及多種純化的免疫球蛋白中的任意一種)、流感病毒疫苗(InfluenzaVirusVaccines)(例如FLUMIST)、英利昔單抗(Infliximabs)(例如REMICADE)、胰島素(Insulins)(例如HUMALOG、HUMALOGMIX75/25、HUMULINTM產(chǎn)品(包括50/50、70/30、Regular、NPH、Ultra和Ultraente)和NOVOLINTM)、甘精胰島素(InsulinGlargines)(例如LANTUSTM)、a-2a干擾素(InterferonAlfa-2a's)(ROFERANTM-A)、a-2b干擾素(InterferonAlfa-2b's)(例如INTRON-A)、復(fù)合ct干擾素(InterferonAlfacon-1's)(例如INFERGEN)、a_n3干擾素(InterferonAlfa-n3s)(例如ALFERONN)、卩-干擾素(InterferonBetas)(例如BETASERONtm和BETAFERON)、p陽la干擾素(InterferonBeta-la's)(例如AVONEXTM禾tlREBIF)、y-干擾素(InterferonGammas)(例如ACTIMMUNE)、碘克沙醇(Iodixanols)(例如VISIPAQUE)、碘海醇(lohexols)(OMNIPAQUE)、碘帕醇(I叩amidols)、碘佛醇(Ioversols)(例如OPTIRAYTM)、酮咯酸(Ketorolacs)(例如TORADOL)、艾杜糖醛酸水解酶(Laronidases)(例如ALDURAZYME)、左氧氟沙星(Levofloxacins)(例如LEVAQUIN)、利多卡因(Lidocaines)、利奈唑酮(Linezolids)(例如ZYVOX)、勞拉西泮(Lorazepams)(例如ATIVAN)、麻疹疫苗(MeaslesVaccines)(例如ATTENUVAX)、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹病毒疫苗(Measles-Mumps-RubellaVirusVaccines)(例如M-M-R11)、甲羥孕酮(Medroxyprogesterones)(例如DEPO-PROVERA)、美洛培南(Meropenems)(例如MERREMIV)、甲基強(qiáng)的松龍(Methylprednisolones)(例如SOLU-MEDROL)、咪達(dá)唑侖(Midazolams)(例如VERSED)、嗎啡(Morphines)(例如ASTRAMORPH/PF)、奧曲肽(Octreotides)(例如SANDOSTATIN)、奧馬佐單抗(Omalizumabs)(例如XOLAIR)、昂丹司瓊(Ondansetrons)(例如ZOFRAN)、帕利珠單抗(Palivizumabs)(例如SYNAGIS)、泮托拉唑(Pantoprazoles)(例如PROTONIXtm)、培門冬酶(Pegaspargases)(例如ONCASPAR)、聚乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastims)(例如NEULASTA)、聚乙二醇化a-2a干擾素(Peg-InterferonAlfa-2a's)(例如PEGASYS)、聚乙二醇化a-2b干擾素(Peg-InterferonAlfa-2b's)(例如PEG-INTRON)、培維索孟(Pegvisomants)(例如SOMAVERT)、百日咳疫苗(Pertussisvaccines)、哌拉西林(Piperacillins)(例如ZOSYNTM)、肺炎球菌疫苗(PneumococcalVaccines)(例如PNEUMOVAX23)和肺炎球菌組合疫苗(PneumococcalConjugateVaccines)(例如PREVNARTM)、異丙嗪(Promethazines)(例如PHENERGAN)、瑞替普酶(Reteplases)(例如RETAVASE)、生長激素(Somatropins)(例如GENOTROPIN、HUMATROPE、NORDITROPIN、NUTROPIN、SAIZEN、SEROSTIM、ZORBTIVE)、舒巴坦(Sulbactams)、舒馬曲坦(Sumatriptans)(例如IMITREX)、他左巴坦(Tazobactams)、替奈普酶(Tenecteplases)(例如TNKASE)、精制破傷風(fēng)類毒素(TetanusPurifiedToxoids)、替卡西林(Ticarcillins)(例如TIMENTIN)、托西莫單抗(Tositumomabs)(例如BEXXARtm)、曲安奈德(TriamcinoloneAcetonides)、萬古霉素(Vancomycins)(例如VANCOCIN)、水痘疫苗(Varicellavaccines)(例如VARIVAXtm)和其它疫苗；及類似物。如本文所描述和列舉的，許多不同種類和給藥途徑的藥理學(xué)試劑，可通過與sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)共同施用或共同配制而受益，以改進(jìn)它們應(yīng)用中的一個(gè)或多個(gè)方面。此類改進(jìn)可包括，例如，下列中的一個(gè)或任意組合(i)改進(jìn)吸收的程度和/或速度，從而改進(jìn)試劑的生物利用度(例如，通過在非IV腸胃外給藥后使其更多地到達(dá)血流，和/或通過更快速的滲透，使其在這種局部給藥后更少地被降解)，其可通過例如加速非IV腸胃外給藥后的間質(zhì)流動(dòng)和潛在的對流轉(zhuǎn)運(yùn)來實(shí)現(xiàn)(例如，通過應(yīng)用伴隨注射體積的流體靜力，聯(lián)合透明質(zhì)素降解所導(dǎo)致的阻力降低)；(ii)提供更安全或更便捷的給藥途徑(例如，使非IV腸胃外給藥能夠代替IV，或使改進(jìn)的或更便捷的非IV腸胃外給藥例如皮內(nèi)或皮下給藥能夠代替肌肉給藥)；(iii)更好的給藥方案(例如，更低頻率的給藥，或更高頻率但更低劑量的非IV途徑，與更低頻率但更高劑量的IV相反)；(iv)減少副作用或者以其它方式降低毒性(例如，IV定量給藥產(chǎn)生的初始高濃度(高Cmax)所伴隨的效應(yīng)，或由非IV腸胃外給藥后的緩慢和/或不完全吸收所產(chǎn)生的高局部劑量導(dǎo)致的效應(yīng))；(v)另外地改進(jìn)藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)(例如通過使試劑更多地到達(dá)靶位(例如，通過遞送位點(diǎn)如注射位點(diǎn)處或附近存在的sHASEGP增加間質(zhì)流體流動(dòng)和對流轉(zhuǎn)運(yùn))，和/或通過增強(qiáng)靶位內(nèi)的滲透(例如，通過靶位內(nèi)存在的SHASEGP增加間質(zhì)流體流動(dòng)和對流轉(zhuǎn)運(yùn))，或者通過將試劑優(yōu)先遞送到耙位(例如，通過向耙位局部給藥，并聯(lián)合sHASEGP的局部或全身給藥，以促進(jìn)耙的透過，或者通過使用載體或大分子復(fù)合物將試劑優(yōu)先靶向到特定位點(diǎn)，并聯(lián)合sHASEGP的局部或全身給藥，以促進(jìn)靶位的透過)；原來通過口服遞送的試劑也可通過重新配制成腸胃外遞送而受益，例如，從而避免試劑在腸道內(nèi)的流失或隨后的降解或毒性，使得可以更有效地靶向于期望起效的位點(diǎn)，并因而可能具有更高效力和/或更低毒性，或者以其它方式提供更好的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)性質(zhì)。另外，sHASEGPs可用于改進(jìn)口服給藥的試劑的藥效學(xué)(例如，通過增強(qiáng)口服給藥試劑在其期望靶位中的透過(例如，通過增加間質(zhì)流體流動(dòng)和對流轉(zhuǎn)運(yùn)，其由sHASEGP全身給藥后和/或sHASEGP向耙位局部給藥后存在于耙位中的sHASEGP導(dǎo)致))。甚至在試劑如藥理學(xué)試劑的期望靶位是血流本身的情況下，此類試劑可通過與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共同施用和/或共同配制而被增強(qiáng)。例如，存在用作血液修飾劑(bloodmodifier)的許多試劑，它們可通過包括口服給藥和腸胃外給藥(如IV注射)的多種途徑中的一種途徑來給藥。通過或能夠通過口服給藥的許多試劑仍然顯示出相對有限的或緩慢的吸收和/或受不期望的降解作用的影響(且有些其它試劑一旦引入血流便是基本上安全和有效的，但由于那個(gè)原因而不被口服給藥)。此類試劑的腸胃外給藥(例如，通過肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或經(jīng)皮的途徑，并聯(lián)合sHASEGP的施用，施用位置優(yōu)選位于或鄰近腸胃外給藥位點(diǎn))因而可被采用，以將其引入血流中。另外，有許多緊急的醫(yī)學(xué)情況，其中將試劑快速的遞送到血流是很重要的，但口服給藥太慢，靜脈注射又不方便、不安全或不可用。這些緊急情況包括血液是靶的那些情況，以及血流僅僅是向另一靶組織遞送的途徑的那些情況。在這些情況下，與sHASEGP聯(lián)合給藥的能力(或應(yīng)用已制成的與sHASEGP的共同制劑)可允許試劑通過非IV腸胃外給藥快速遞送。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，有許多為非IV腸胃外給藥設(shè)計(jì)的配方和器材，其可以提供，例如，時(shí)控的或其它觸發(fā)釋放的試劑，以及可變受控的定量給藥等。大量此類藥理學(xué)試劑(其可與sHASEGP共同制出制劑或聯(lián)合使用)被有規(guī)律地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)踐，并且它們的應(yīng)用的各個(gè)方面被詳細(xì)描述(見，例如，Physicians'DeskReference,Thomson2003,2004,2005)，許多其它此類試劑是本領(lǐng)域中已知的。在后一方面，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，sHASEGPs可以與目前使用的試劑聯(lián)合使用(例如，如本文所述的，以改進(jìn)它們的適用性)，與目前并未使用的試劑聯(lián)合使用(例如，以改進(jìn)它們的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)，并因而使其變得有用)，或與新幵發(fā)的試劑聯(lián)合使用。因此，對于一般通過腸道外引入(例如，通過IV注射)的藥理學(xué)試劑(如，本文描述的抗癌試劑、血液修飾劑或其它種類試劑中的成員)，sHASEGP(或其它糖胺聚糖酶)可用于，例如，使此類試劑能夠通過其它可能更便捷和/或更安全的途徑如非IV腸胃外給藥的方式被施用(例如，通過肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或經(jīng)皮的途徑)。對于已經(jīng)可以通過非IV腸胃外途徑遞送的試劑，sHASEGPs可用于增強(qiáng)其吸收和遞送的程度和/或速度(例如，通過促進(jìn)它的散布及隨后進(jìn)入血流，其可能受到本文描述的對流輸運(yùn)的幫助)。此類效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)包括更大部分的試劑到達(dá)血流中，對試劑的局部暴露降低(在濃度和/或時(shí)間方面)(例如，在注射點(diǎn)處或附近，其經(jīng)常限制定量給藥或?qū)е戮植慷拘詥栴})，增加試劑能夠被遞送到血流中的速度，其它改進(jìn)的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效學(xué)性質(zhì)，以及便利的給藥。最后一方面，非IV腸胃外給藥可以使許多試劑在醫(yī)院外施用，否則將需要靜脈給藥通常所需的住院護(hù)理或其它醫(yī)學(xué)關(guān)照。血液修飾劑的示范性例子包括如下試劑，如抗血友病試劑和血液因子缺乏試劑(bloodfactordeficiencyagents)(包括，例如，抗血友病因子(例如，ADVATE、HEMOFIL、KOATE-DVI、KOGENATETM-FS、RECOMBINATE禾口REFACTO)、抗抑制劑促凝復(fù)合物(anti-inhibitorcoagulentcomplexes)(例如，F(xiàn)EIBATMVH)、抗凝血酶III(antithrombinIIIs)(例如，THROMBATEIII)、凝集因子VII(coagulationsFactorVIIs)(例如NOVOSEVEN)、凝集因子VIII(coagulationFactorVIIIs)(例如，ADVATE、KOGENATETM-FS和RECOMBINATE)、凝集因子IX(coagulationFactorIXs)(例如，BEBULIN、BENEFIX，PPROPLEXT)、血漿蛋白部分(plasmaproteinfractions)(例如PLASMANATE)、vonWillebrand因子))；抗血小板試齊!j(antiplateletagents)(包括，例如，阿昔單抗(abciximabs)(例如，REOPRO)、阿那格雷(anagrelides)(例如AGRYLIN)、西洛他唑(cilostazols)(例如PLETALTM)、氯吡格雷二硫酸鹽(cl叩idogrelbisulfates)(例如PLAVIXTM)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamoles)(例如AGGRENOXTM禾BPERSANTINE)、依前列醇(epoprostenols)(例如FLOLAN)、埃替非巴肽(eptifibatides)(例如INTEGRILIN)、替羅非班(tirofibans)(例如AGGRASTAT));集落刺激因子(colonystimulatingfactors,CSFs)(包括，例如，粒細(xì)胞CSFs(GranulocyteCSFs)(例如NEULASTA和NEUPOGEN)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GranulocyteMacrophageCSFs)(例如LEUKINE));紅細(xì)胞生成刺激物(erythropoiesisstimulators)(包括，例如，紅細(xì)胞生成素，如達(dá)依泊汀a(darbepoetinalfas)(例如ARANESPTM)和紅細(xì)胞生成素a(epoetinalfas)(例如EPOGENtm和PROCRIT))、止血?jiǎng)┖桶椎鞍?包括，例如，抑蛋白酶肽(aprotinins)(例如TRASYLOL)、抗血友病因子和血漿的聯(lián)合(例如ADVATE)、醋酸去氨加壓素(DesmopressinAcetates)(例如DDAVPtm)和白蛋白(例如BUMINATETM禾QPLASBUMINTM));免疫球蛋白(例如BAYGAMTM、CARIMUNE，F(xiàn)IV、FLEBOGAMMA、GAMIMUNETM、GAMMAGARDS/DTM、GAMUNEX、IVEEGAM、IVEEGAMENIGIV、MICRHOGAM、RHOGAM、PANGLOBULINtm和THYMOGLOBULIN,以及乙型肝炎免疫球蛋白(h印atitisBimmuneglobulins)(例如BAYHEPB、NABI-HB和NOVAPLUSNABI-HB);凝血酶抑制劑(thrombininhibitors)(包括，例如，直接凝血酶抑制劑(例如ARGATROBANTM)和來匹盧定(lepirudin)(例如REFLUDAN)，禾卩drotecoginalfas(例如XIGRIStm);抗凝血?jiǎng)?包括，例如，達(dá)肝素(dalteparins)、低分子肝素(enoxaperins)和其它肝素(例如FRAGMIN和LOVENOX)、華法令(warfarins)(例如COUMADINtm和jANTOVEN))，及類似物。進(jìn)一步舉例，通過腸胃外給藥并可與sHASEGPs(或其它糖胺聚糖酶)共同施用和/或共同配制的各種類型的試劑的例子，包括在下面的列舉中乙酰唑胺(Acetazolamides)、阿昔洛韋(Acyclovirs)、月旦影酸(Adipiodones)、Alatrofioxacins、阿地白介素(Aldesleukins)、阿侖單抗(Alemtuzumabs)、阿芬他尼(Alfentanils)、變態(tài)反應(yīng)原性提取物(Allergenicextracts)、別嘌醇(Allopurinols)、a1-蛋白酶抑制劑(Alphal-proteinaseinhibitors)、前歹Ui也爾(Alprostadils)、(5可米福汀(Amifostines)、P可米卡星(Amikacins)、氨基酸、氨基已酸(Aminocaproicacids)、氨茶堿(Aminophyllines)、阿密替林(Amitriptylines)、異戊巴比妥(Amobarbitals)、氨力農(nóng)(Amrinones)、阿那白滯素(Anakinras)、止痛劑(Analgesics)、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗(Anti-poliomyeliticvaccines)、抗狂犬病血清(Anti-rabicserums)、抗破傷風(fēng)免疫球蛋白(Anti-tetanusimmunoglobulins)、抗凝血酶III(AntithrombinIlls)、抗蛇毒血清(Antivenomserums)、阿加曲班(Argatrobans)、精氨酸(Arginines)、砷、抗壞血酸、天冬酰胺酶(Asparaginases)、阿替洛爾(Atenolols)、阿曲庫銨(Atracuriums)、阿托品(Atropines),金硫葡糖(Aurothioglucoses)、巰唑嘌呤(Azathioprines)、阿奇霉素(Azithromycins)、氨曲南(Aztreonams)、卡介苗(BacillusCalmette-Guerin(BCG)vaccines)、桿菌肽(Bacitracins)、巴氯酚(Baclofens)、巴利西單抗(Basiliximabs)、苯甲酸(Benzoicacids)、苯托品(Benztropines)、倍他米松(Betamethasones)、生物素(Biotins)、比伐盧定(Bivalirudins)、博來霉素(Bleomycins)、肉毒抗毒素(Botulismantitoxins)、溴節(jié)胺(Bretyliutns)、丁苯氧酸(Bumetanides)、布比卡因(Bupivacaines)、丁丙諾啡(Buprenorphines)、白消安(Busulfans)、布托啡諾(Butorphanols)、降鈣素(Calcitonins)、骨化三醇(Calcitriols)、鈣(Calciums)、巻曲霉素(Capreomycins)、卡前列素(Carboprosts)、卡莫司汀(Carmustines)、肉毒堿(Carnitines)、卡泊芬凈(Caspoftmgins)、頭孢孟多(Cefamandoles)、頭孢唑林(Cefazolins)、頭孢哌酮(Cefoperazones)、頭孢噻肟(Cefotaximes)、頭孢替坦(Cefotetans)、頭孢西丁(Cefoxitins)、頭孢他啶(Ceftazidimes)、頭孢唑后(Ceftizoximes)、頭孢呋辛(Ceftiroximes)、氯霉素(Chloramphenicols)、氯普魯卡因(Chloroprocaines)、氯喹(Chloroquines)、氯噻嗪(Chlorothiazides)、氯丙嗪(Chlorpromazines)、Chondroitinsulfiiricacids、絨促性素a(Choriogonadotropinalfas)、鉻(Chromiums)、西多福韋(Cidofovirs)、西咪替丁(Cimetidines)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacins)、順阿曲庫胺(Cisatracuriums)、順鉬(Cisplatins)、克拉立濱(Cladribines)、克拉維酸(ClavuIanic200680013224.X說明書第87/165頁acids)、克林霉素(Clindamycins)、可樂定(Clonidines)、可待因(Codeines)、秋水仙堿(Colchicines)、粘菌素(Colistins)、膠原(Collagens)、Corticorelinovinetriflutates、促皮質(zhì)素(Corticotrophins)、替可克肽(Cosyntropins)、氰鈷胺(Cyanocobalamins)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamides)、環(huán)孢菌素(Cyclosporines)、半胱氨酸(Cysteines)、阿糖胞苷(Cytarabines)、達(dá)卡巴嗪(Dacarbazines)、達(dá)克珠單抗(Dacliximabs)、放線菌素D(Dactinomycins)、達(dá)福普汀(Dalfopristins)、達(dá)肝素(Dalteparins)、達(dá)那肝素(Danaparoids)、丹曲林(Dantrolenes)、柔紅霉素(Daunorubicins)、去鐵胺(Deferoxamines)、地尼白介素2(Denileukindiftitoxs)、去氨加壓素(Desmopressins)、地塞米松(Dexamethasones)、右美托咪啶(Dexmedetomidines)、右泛醇(Dexpanthenols)、右雷佐生(Dexrazoxanes)、右旋糖苷(Dextrans)、泛影酸(Diatrizoicacids)、i也西泮(Diazepams)、二氮嗪(Diazoxides)、雙環(huán)胺(Dicyclomines)、Digibinds、地高辛(Digoxins)、雙氫麥角胺(Dihydroergotamines)、地爾硫(Diltiazems)、苯海拉明(Diphenhydramines)、白喉，百日咳及破傷風(fēng)混合疫苗(Diphteria,tetanusandpertussisvaccines)、白喉抗毒素(Diptheriaantitoxins)、雙卩密達(dá)莫(Dipyridamoles)、多巴酚丁胺(Dobutamines)、多巴胺(Dopamines)、杜什氯銨(Doxacuriums)、多沙普侖(Doxaprams)、度骨化醇(Doxercalciferols)、多西環(huán)素(Doxycyclines)、氟哌利多(Droperidols)、Drotrecoginalfas、二p5丙茶堿(Dyphyllines)、依i也酸(Edeticacids)、Edrophoniums、依那普利拉(Enalaprilats)、麻黃堿(Ephedrines)、依前列醇(Epoprostenols)、麥角鈣化甾醇(Ergocalciferols)、麥角新堿(Ergonovines)、厄他培南(Ertapenems)、紅霉素(Erythromycins)、艾司洛爾(Esmolols)、雌二醇(Estradiols)、雌激素(Estrogenics)、依他尼酸(Ethacrynicacids)、乙醇月安(Ethanolamines)、乙醇(Ethanols)、乙碘油(Ethiodizedoils)、依替膦酸(Etidronicacids)、依托咪酯(Etomidates)、依托泊武(Etoposides)、因子8(FactorVIIIs)、法莫替丁(Famotidines)、非諾多泮(Fenoldopams)、芬太尼(Fentanyls)、氟尿苷(Floxuridines)、氟達(dá)拉濱(Fludarabines)、氟馬西尼(Flumazenils)、熒光素(Fluoresceins)、氟尿嘧啶(Fluorouracils)、氟奮乃靜(Fluphenazines)、葉酸(Folicacids)、促卵泡成熟激素(Follicle-stimulatinghormones)、甲吡唑(Fomepizoles)、福米韋生(Fomivirsens)、磺達(dá)肝素(Fondaparinuxs)、膦甲酸(Foscarnets)、磷苯妥英(Fosphenytoins)、氟維司群(Fulvestrants)、呋塞米(Furosemides)、軋?zhí)卮?Gadoteridols)、軋弗塞胺(Gadoversetamides)、更昔洛韋(Ganciclovirs)、加替沙星(Gatifloxacins)、吉妥單抗(Gemtuzumabozogamicins)、慶大霉素(Gentamicins)、胰高血糖素(Glucagons)、葡萄糖(Glucoses)、甘氨酸(Glycines)、格隆溴胺(Glycopyrrolates)、戈那瑞林(Gonadorelins)、絨毛膜促性腺激素(Gonadotropinchorionics)、B型嗜血桿菌多糖(HaemophilusBpolysaccarides)、氟哌啶醇(Haloperidols)、氯寸七血紅素(Hemins)、流感嗜血桿菌疫苗(Hemophilusinfluenzavaccines)、肝炎疫苗(Hepatitisvaccines)、草藥(Herbals)、組胺(Histamines)、肼苯達(dá)嗪(Hydralazines)、氫化可的松(Hydrocortisones)、氫嗎啡酮(Hydromorphones)、羥鈷胺(Hydroxocobalamins)、羥嗪(Hydroxyzines)、莨菪堿(Hyoscyamines)、伊布利特(Ibutilides)、去甲氧基柔紅霉素(Idarubicins)、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamides)、伊米苷酶(Imiglucerases)、免疫球蛋白(Immunoglobulins)、靛蘭月因月旨紅(Indigocarmines)、卩引哚美辛(Indomethacins)、干擾素a-conl(Interferonalfa-conls)、千擾素a-2A(Interferonalfa-2As)、干擾素a-N3(Interferonalfa-N3s)、干擾素p-lA(Interferonbeta-lAs)、碘化物(Iodides)、碘普羅胺(Iopromides)、碘替酸(Iothalamicacids)、碘格利酸(Ioxaglicacids)、碘昔蘭(Ioxilans)、右糖肝鐵注射劑(Irondextraninjections)、異煙肼(Isoniazids)、異丙腎上腺素(Isoproterenols)、曰本月il炎疫苗(Japaneseencephalitisvaccines)、卡另卩霉素(Kanamycins)、氯胺酮(Ketamines)、酮咯酸(Ketorolacs)、拉貝洛爾(Labetalols)、來匹盧定(Lepirudins)、亞葉酸(Leucovorins)、亮丙瑞林(Leuprolides)、左布比卡因(Levobupivacaines)、左旋甲狀月泉素(Levothyroxines)、禾U多卡因(Lidocaines)、林可霉素(Lincomycins)、Linezolids、碘塞羅寧(Liothyronines)、勞拉西泮(Lorazepams)、促黃體、激素(Luteinisinghormones)、萊姆病疫苗(Lymediseasevaccines)、錳福地卩比(Mangafodipirs)、甘露醇(Mannitols)、麻疹病毒(Measlesvirus)、氮芥(Mechlorethamines)、美法侖(Melphalans)、腦膜炎球菌多糖菌苗(Meningococcalpolysaccharidevaccines)、哌替啶(Meperidines)、甲哌卡因(Mepivacaines)、美羅培南(Meropenems)、美司鈉(Mesnas)、美索魅嗪(Mesoridazines)、間羥胺(Metaraminols)、美沙酮(Methadones)、美索巴莫(Methocarbamols)、美索比妥(Methohexitals)、甲氨蝶呤(Methotrexates)、甲基多巴乙酯(Methyldopates)、甲基麥角新堿(Methylergonovines)、甲氧氯普胺(Metoclopramides)、美托洛爾(Metoprolols)、甲硝唑(Metronidazoles)、咪達(dá)唑侖(Midazolams)、二甲胺四環(huán)素(Minocyclines)、光神霉素(Mithramycins)、絲裂霉素(Mitomycins)、米托蒽酉昆(Mitoxantrones)、美維松(Mivacuriums)、魚脂酸(Morrhuicacids)、莫西沙星(Moxifloxacins)、腮腺炎病毒(Mumpsviruses)、莫羅莫那-CD3(Muromonab-CD3s)、霉酚酸酉旨(Mycophenolatemofetils)、萘夫西林(Nafcillins)、納布啡(Nalbuphines)、納美芬(Nalmefenes)、納洛酮(Naloxones)、南諾龍(Nandrolones)、新斯的明(Neostigmines)、煙酰胺(Niacinamides)、尼卡地平(Nicardipines)、石肖酸甘油(Nitroglycerins)、石肖普鹽(Nitroprussides)、去甲腎上腺素(Norepinephrines)、奧普瑞白介素(Oprelvekins)、奧芬那君(Orphenadrines)、苯唑西林(Oxacillins)、奧沙利鉑(Oxaliplatins)、Oxyniorphones、土霉素(Oxytetracyclines)、縮宮素(Oxytocins)、本可松(Pancuroniums)、泛醇(Panthenols)、泛酸(Pantothenicacids)、Papaverines、Pegaspargases、聚乙二醇干擾素a-2a(Peginterferonalfa2As)、青霉素G(PenicillinGs)、噴他瞇(Pentamidines)、噴他佐辛(Pentazocines)、戊巴比妥(Pentobarbitals)、噴司他丁(Pentostatins)、全氟丙烷(Perflutrens)、羥哌氯丙嗪(Perphenazines)、百日咳疫苗(Pertussisvaccines)、苯巴比妥(Phenobarbitals)、酚妥拉明(Phentolamines)、苯福林(Phenylephrines)、苯妥英(Phenytoins)、毒扁豆堿(Physostigmines)、維生素Kl(Phytonadiones)、月市炎球菌疫苗(Pneumococcalvaccines)、多粘菌素B(Polymyxinbs)、Porfimers、Pralidoximes、丙胺卡因(Prilocaines)、普魯卡因胺(Procainamides)、普魯卡因(Procaines)、丙氯拉嗪(Prochlo卬erazines)、黃體酮(Progesterones)、異丙嗪(Promethazines)、普萘洛爾(Propranolols)、卩比斯的明羥化物(Pyridostigminehydroxides)、維生素B6(Pyridoxines)、奎尼丁(Quinidines)、奎奴普丁(Quinupristins)、狂犬病免疫球蛋白(Rabiesimmunoglobulins),狂犬病疫苗(Rabiesvaccines)、雷尼替丁(Ranitidines)、拉布立酶(Rasburicases)、瑞芬太尼(Remifentanils)、核黃素(Riboflavins)、利福平(Rifampins)、羅哌卡因(Ropivacaines)、風(fēng)疹疫苗(Rubellavaccines)、(Samariums)、賞營滅(Scopolamines)、石西(Seleniums)、舍莫i誇豐木(Sermorelins)、辛卡利特(Sincalides)、人蛋氨生長素(Somatrems)、大觀霉素(Spectinomycins)、鏈激酶(Streptokinases)、鏈霉素(Streptomycins)、鏈脲霉素(Streptozocins)、琥珀酰膽堿(Succinylcholines)、舒芬太尼(Sufentanil)、舒巴坦(Sulbactams)、磺胺異唑(Sulfamethoxazoles)、舒馬普坦(Sumatriptans)、他克莫司(Tacrolimuss)、替尼泊苷(Teniposides)、特布他林(Terbutalines)、特立帕肽(Teriparatides)、睪酮(Testosterones)、破^(務(wù)風(fēng)抗毒素(Tetanusantitoxins)、丁卡因(Tetracaines)、十四烷硫酸鹽(Tetradecylsulfates)、茶堿(Theophyllines)、硫胺素(Thiamines),硫乙拉嗪(Thiethylperazines)、硫噴妥(Thiopentals)、促甲狀腺激素(Thyroidstimulatinghormones)、替卡西林(Ticarcillins)、亭扎肝素(Tinzaparins)、替羅非班(Tirofibans)、妥布霉素(Tobramycins)、妥拉唑林(Tolazolines)、甲苯磺丁脲(Tolbutamides)、托泊替康(Topotecans)、托拉塞米(Torsemides)、氨甲環(huán)酸(Tranexamicacids)、曲前列尼爾(Treprostinils)、曲安奈德(Triamcinoloneacetonides)、己曲安奈德CTriamcinolonehexacetonides)、曲安西龍(Triamcinolones)、三亞乙基硫代磷酸胺(噻替派)(Triethylenethiophosphoramides(Thiotepa))、三氟拉嗪(Trifluoperazines)、曲美芐胺(Trimethobenzamides)、甲氧芐啶(Trimethoprims)、三甲曲沙(Trimetrexates)、曲普瑞林(Triptorelins)、氨基丁三醇(Tromethamines)、結(jié)核菌素(Tuberculins)、傷寒菌苗(Typhoidvaccines)、尿促卵泡素(Urofollitropins)、尿激酶(Urokinases)、丙戊酸(Valproicacids)、戊柔比星(Valrubicins)、水痘-帶狀皰疹免疫球蛋白(VaricellaZosterimmunoglobulins)、力口壓素(Vasopressins)、Vecuroniums、維拉巾白米(Verapamils)、長春堿(Vinblastines)、長春新堿(Vincristines)、伏立康唑(Voriconazoles)、華法林(Warfarins)、黃熱病疫苗(Yellowfevervaccines)、齊多夫定(Zidovudines)、鋅(Zincs)、鹽酸齊拉西酮(Ziprasidonehydrochlorides),以及與上述相關(guān)的試劑或者與上述試劑同類的或相似種類的試劑。用于腸胃外給藥(包括通過肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、局部應(yīng)用和其它非口服途徑)的溶液或懸浮液，可以包括下述的任何成分無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他的合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇和對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉；掩蔽劑(cheatingagents),例如乙二銨四乙酸(EDTA);緩沖液，例如醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液和磷酸緩沖液；以及用于調(diào)整滲透壓的試劑，包括但不限于氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、右旋糖、丙三醇或硼酸。腸胃外給藥的制劑可以裝入由玻璃、塑料或其它合適材料制成的安瓿、一次性注射器或者單劑量或多次劑量的小瓶中。sHASEGP多肽或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可以以微粉化的形式或其他合適的形式被懸浮，或可以被衍生化以產(chǎn)生更加可溶性的活性產(chǎn)物或產(chǎn)生藥物前體。所得到的混合物的形式取決于許多因素，包括預(yù)期的給藥方式和多肽在所選擇的載體或媒介物中的溶解性。有效的濃度是足以改善目標(biāo)癥狀的濃度，并可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法經(jīng)驗(yàn)性地確定。為了配制組合物，一定重量分?jǐn)?shù)的多肽以可有效緩解或改善的所要治療的癥狀的濃度被溶解、懸浮、分散或者以其它方式混合于所選擇的媒介物中。在sHASEGP多肽或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域顯示出不足的溶解性的情形下，可以使用溶解多肽的方法。此類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，包括但不限于使用輔助溶劑諸如二甲亞砜(DMSO)、使用表面活性劑諸如TWEEN"^和PluronicTMF68;或者溶解在含水碳酸氫鈉中。多肽的衍生物，諸如多肽的藥物前體，也可以用于配制有效的藥物組合物。對于眼科適應(yīng)癥，將組合物配制在眼科可接受的載體中。對于本文中的眼科用途，考慮局部給藥，這可以通過外部給藥或通過注射來進(jìn)行。緩釋制劑也是理想的。通常，組合物配制成用于單劑量給藥的形式，這樣，單次劑量可以提供有效的數(shù)量。在將多肽與媒介物混合或?qū)⒍嚯募尤朊浇槲锖?，所得到的混合物可以是溶液、懸浮液、乳液或其他組合物，并可以配制成含水混合物、乳液、膠狀物、藥膏、乳劑、溶液、酏劑、洗液、懸浮液、酊劑、糊狀、泡沫、氣溶膠、灌洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶形式或任何其他的適于全身性給藥、外部給藥或局部給藥的制劑形式。所得的混合物的形式取決于許多因素，包括預(yù)期的給藥方式和化合物在所選擇的載體或媒介物中的溶解性。如果必要的話，制備成化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或其他衍生物。對于局部的內(nèi)部給藥，諸如肌肉內(nèi)給藥、腸胃外給藥或關(guān)節(jié)內(nèi)給藥，化合物優(yōu)選用含水介質(zhì)例如等滲緩沖鹽水配制成懸浮溶液，或者與適用于內(nèi)部給藥的生物相容性支持物或生物粘結(jié)劑組合起來。sHASEGP多肽或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域被包括于藥學(xué)上可接受的載體中，其數(shù)量足以在不對接受治療的患者產(chǎn)生不利副作用的情況下產(chǎn)生治療上有用的效果。應(yīng)該理解的是，副作用的數(shù)量和程度取決于化合物被給藥時(shí)的情況。例如，某些毒性的和不利的副作用在治療威脅生命的疾病時(shí)是可以接受的，而在治療具有較輕后果的紊亂時(shí)則是無法接受的。對治療用途而言有效的量當(dāng)然將取決于疾病的嚴(yán)重性和患者的體重和總體狀態(tài)以及給藥途徑。盡管在局部給藥之后治療劑的局部濃度在某些情況下可能高于全身性給藥后安全獲得的濃度，但治療劑的局部給藥通常需要比任何方式的全身性給藥的劑量都要小的劑量。因?yàn)楦鱾€(gè)患者的癥狀的嚴(yán)重程度各有不同，而且每種治療劑都具有其獨(dú)特的治療特性，所以實(shí)施人員應(yīng)該確定患者對治療的反應(yīng)，并相應(yīng)地改變劑量。在體外使用的劑量可以為藥學(xué)組合物的原位施用數(shù)量提供有用的指導(dǎo)，并且動(dòng)物模型在某些情況下可以被用來確定治療具體的紊亂時(shí)的有效劑量。然而，總的來說，對于局部給藥，可以考慮，治療劑的有效量為每kg體重約0.1皮克(pg)至約1ng的范圍內(nèi)。獲得有效劑量時(shí)的各種考慮因素對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并已被描述(參見如GoodmanAndGilman's:ThePharmacologicalBasesofTherapeutics,她ed.，PergamonPress,1990;Remington'sPharmaceuticalSciences,17thed.,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1990;禾口Mantyhetal.，Science,278:275-79,1997，其涉及鞘內(nèi)注射神經(jīng)元特異性配體-毒素，其中的每一篇文獻(xiàn)都通過引用方式整體并入本文)。本文中應(yīng)用的sHASEGP多肽或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的制劑包括那些適用于口服給藥、直腸給藥、外部給藥、吸入給藥、口腔含化給藥、舌下含化給藥、其它腸胃外給藥(例如皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、透皮給藥或靜脈給藥)或任何給藥途徑的制劑。在任何給定情況下的最合適的途徑取決于正在治療的癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重性，以及正在使用的特定活性化合物的性質(zhì)。制劑可以以單元?jiǎng)┝啃问浇o予人和動(dòng)物，諸如片劑、膠囊、藥丸、粉劑、顆粒、無菌腸胃外給藥溶液或懸浮液、口服給藥溶液或懸浮液和油-水乳劑，它們都含有合適數(shù)量的多肽和/或其他試劑或其藥學(xué)上可接受的衍生物。藥學(xué)上具有治療活性的多肽和/或其他試劑和其衍生物通常以單元?jiǎng)┝啃问交蚨鄤┝啃问脚渲撇⒔o藥。本文中所使用的單元?jiǎng)┝啃问绞侵高m用于人和動(dòng)物個(gè)體的物理上獨(dú)立的單元，它們被獨(dú)立包裝，如本領(lǐng)域已知的。藥物組合物可以以單元?jiǎng)┝啃问浇o予人和動(dòng)物，諸如片劑、膠囊、藥丸、粉末、顆粒、無菌腸胃外給藥溶液或懸浮液、口服給藥溶液或懸浮液和油-水乳劑，它們都含有合適數(shù)量的sHASEGP多肽和/或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域和可任選的另一試劑或其藥學(xué)上可接受的衍生物。藥學(xué)上具有治療活性的化合物和/或其衍生物通常以單元?jiǎng)┝啃问交蚨鄤┝啃问脚渲撇⒔o藥。本文中所使用的單元?jiǎng)┝啃问绞侵高m用于人和動(dòng)物個(gè)體的物理上獨(dú)立的單位，并獨(dú)立地包裝，如本領(lǐng)域已知的。每一單元?jiǎng)┝亢凶阋援a(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)先確定數(shù)量的治療上有活性的化合物，所述化合物與必需的藥物載體、媒介物或稀釋劑結(jié)合。單元?jiǎng)┝康男问降睦影ǖ幌抻诎碴?、注射器和各自包裝的片劑或膠囊。例如，含有穩(wěn)定溶液和1至5000單位的sHASEGP的小體積諸如5至50h1的制劑可以預(yù)先包裝于注射器中，例如可以在粘彈性試劑注射之后使用。單元?jiǎng)┝啃问娇梢砸云湫〔糠纸o藥或多倍地給藥。多劑量形式是一系列完全相同的單元?jiǎng)┝啃问剑浒b于單個(gè)容器中，可以以分離的單元?jiǎng)┝啃问奖皇┯?。多劑量的形式的例子包括小藥瓶、片劑瓶或膠囊瓶或品脫瓶或加侖瓶。因此，多劑量形式是在包裝中不隔離開來的單元?jiǎng)┝啃问降谋稊?shù)。除了活性組分例如sHASEGP多肽之外，組合物還可以含有稀釋劑，諸如乳糖、蔗糖、磷酸氫鈣或羧甲基纖維素；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣和滑石；和粘結(jié)劑，諸如淀粉、天然膠，例如阿拉伯膠、明膠、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、纖維素和其衍生物，聚維酮、交聚維酮和其他這樣的粘合劑，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。液體的藥學(xué)上可施用的組合物可以通過例如將上面定義的活性化合物和可任選的藥物佐劑溶解、分散或以其它方式混合在載體中，從而形成溶液或懸浮液來制備，所述的載體例如水、鹽水、含水右旋糖、丙三醇、乙二醇、乙醇和類似物。如果需要的話，待施用的藥物組合物也可以含有很小量的無毒輔助物質(zhì)諸如潤濕劑、乳化劑或增溶劑、pH緩沖劑和類似物，例如醋酸鹽、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺醋酸鈉、三乙醇胺油酸鹽和其他這樣的試劑。制備這樣的劑型的方法是已知的，或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的(參見如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,15thEdition,1975)。待施用的組合物或制劑含有一定數(shù)量的活性化合物，該數(shù)量足以改善接受治療的對象的癥狀。例如，本文提供的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定化制劑包括EDTA、NaCl和CaCl2中配制的150單位/ml的可溶性糖蛋白。此外，抗細(xì)菌或抗真菌試劑一一包括但不限于硫柳汞一一可以存在于制劑中。本文中提供的另一制劑是于EDTA、NaCl和CaCl2中的穩(wěn)定化溶液或凍干形式的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，其中含有有效活性數(shù)量的可溶性糖蛋白，例如150單位/ml，并加入了乳糖，例如13mg/ml。本文也提供了含有處于EDTA、NaCl和CaCl2中的穩(wěn)定化溶液或凍干形式的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的制劑，其中含有有效活性數(shù)量的可溶性糖蛋白，例如150單位/ml，并加入了乳糖，例如13mg/ml，和白蛋白、PluronicF68、TWEEN和域其他去污劑。本文中提供的另一制劑，或者是凍干的或者是作為穩(wěn)定溶液，含有有效數(shù)量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，例如1至300單位/ml，它們處于EDTA、NaCl和CaCl2中。可以制備含有0.005%至100%的活性組分并由非毒性載體來平衡的劑型或組合物。對于口服給藥，藥物組合物可以采取例如片劑或膠囊的形式，其用藥學(xué)上可接受的賦形劑，利用常規(guī)的方法制備，所述賦形劑例如粘結(jié)劑(例如預(yù)糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或羧甲淀粉鈉)；或潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。片劑可以用本領(lǐng)域己知的方法包被。sHASEGPs或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或藥學(xué)上可接受的衍生物可以用可保護(hù)該可衣。組合物可以包括其他藥學(xué)上具有效力的試劑，所述試劑是該常規(guī)領(lǐng)域已知在治療一種或多種疾病或醫(yī)學(xué)癥狀中具有價(jià)值的試劑，包括但不限于化學(xué)治療劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、抗毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、a-腎上腺素激動(dòng)劑、a阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、p腎上腺素能阻斷劑、f丐通道阻斷劑、心血管藥劑、避孕藥劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、高血糖藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑(psychicenergizeragent)、鎮(zhèn)定劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑(urinaryagent)、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇類抗炎藥劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物、藥物前體、有機(jī)分子和促睡眠劑(sleepinducer),這樣可以獲得理想的特性組合。應(yīng)該理解的是，這樣的聯(lián)合治療構(gòu)成了本文中提供的治療組合物和方法的又一方面。1.口服組合物口服藥物劑型是固體、膠狀和液體。固體劑型是片劑、膠囊、顆粒和整裝粉劑?？诜瑒┑念愋桶▔嚎s的、可咀嚼的錠劑和片劑，其可以是腸衣包被的、糖衣包被的或膜包被的。膠囊可以是硬的或軟的明膠膠囊，而顆粒和粉末可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組分聯(lián)合起來以非泡騰或泡騰的形式提供。含有sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的藥物組合物可以是液體形式，例如溶液、糖漿或懸浮液，或可以以在使用之前需要與水或其他合適的載體進(jìn)行重構(gòu)的藥物產(chǎn)品的方式提供。這樣的液體制品可以通過常規(guī)的手段用藥學(xué)上可接受的添加劑來制備，所述的添加劑例如懸浮劑(諸如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(諸如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水的介質(zhì)(諸如杏仁油、油酯或分級分離的植物油)；和防腐劑(諸如p-羥基苯甲酸甲酯或p-羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。在某些實(shí)施方案中，制劑是固體劑型形式，優(yōu)選膠囊或片劑。片劑、藥丸、膠囊、藥片和類似物可以含有下述的任何組分或者具有類似性質(zhì)的化合物粘結(jié)劑；稀釋劑；分解劑；潤滑劑；助滑劑；甜味劑；和調(diào)味劑。粘結(jié)劑的例子包括微晶纖維素、黃芪膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠、植物粘膠、明膠溶液、蔗糖和淀粉糊。潤滑劑包括滑石、淀粉、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、石松和硬脂酸。稀釋劑包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高嶺土、鹽、甘露醇和磷酸氫鈣。助滑劑包括但不限于膠狀二氧化硅。分解劑包括交聯(lián)羧甲纖維素鈉、羧甲淀粉鈉、海藻酸、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、膨潤土、甲基纖維素、瓊脂和羧甲基纖維素。著色劑包括例如任何被批準(zhǔn)的合法的可溶于水的FD和C染料、其混合物；和懸浮在水化氧化鋁上的不溶于水的FD和C染料。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人工甜味劑例如糖精和任何數(shù)量的噴干香料(spraydriedflavors)。調(diào)味劑包括從植物例如水果提取得到的天然香料，和可產(chǎn)生愉悅感覺的合成的化合物混合物例如但不限于薄荷油和水楊酸甲酯。潤濕劑包括丙二醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、二甘醇單月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylenelauralether)。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蠟、蟲漆、氨化蟲漆和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。膜包衣包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素納、聚乙二醇4000和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。如果希望口服給藥，sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可以以這樣的組合物形式提供，即，該組合物可以保護(hù)它免遭胃的酸性環(huán)境的破壞。例如，該組合物可以配制在腸衣中，該腸衣在胃中維持它的完整性，并在腸中釋放出活性化合物。組合物也可以與抗酸劑或其他這樣的組分聯(lián)合起來進(jìn)行配制。當(dāng)單元?jiǎng)┬褪悄z囊時(shí)，除了上面類型的物質(zhì)外，它還可以含有液體載體諸如脂肪油。此外，單元?jiǎng)┝啃问娇梢院懈鞣N其他的材料，其修飾該劑量單元的物理形式，例如糖和其他腸內(nèi)吸收試劑的包衣。化合物也可以作為酏劑、懸浮液、糖漿、干糊片(wafer)、噴灑劑、口香糖或類似物的組分而被施用。除了活性化合物外，糖漿還可以含有蔗糖作為甜味劑，還可以含有某些防腐劑、染料和著色料以及香料。sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域也可以與不會削弱期望的作用的其他活性材料混合，或與可以補(bǔ)充期望的作用的材料例如抗酸劑、H2封阻劑和利尿劑混合。活性組分是本文中描述的化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物?？梢园ǜ邼舛鹊幕钚越M分，最高可達(dá)重量的約98%。包括在片劑中的藥學(xué)上可接受的載體是粘結(jié)劑、潤滑劑、稀釋劑、分解劑、著色劑、調(diào)味劑和潤濕劑。腸包衣片劑，由于該腸衣的緣故，可以抵抗胃酸的作用，并在中性和堿性的腸中溶解或分解。糖包被的片劑是壓縮片劑，其包有不同層的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。膜包被的片劑是壓縮片劑，其已用聚合物或其他合適的包衣包被。多重壓縮片劑(multiplecompressedtablet)是利用先前提及的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)通過一個(gè)以上的壓縮循環(huán)制成的壓縮片劑。著色劑也可以用于上述劑型。調(diào)味劑和甜味劑被用于壓縮片劑、糖包被的、多重壓縮的和可咀嚼的片劑。調(diào)味劑和甜味劑在可咀嚼片劑和錠劑的制備中是特別有用的。液體口服劑型包括含水溶液、乳劑、懸浮液、溶液和/或由非泡騰顆粒重構(gòu)的懸浮液和由泡騰顆粒重構(gòu)的泡騰制劑。含水溶液包括例如酏劑和糖漿。乳劑是水包油的或油包水的。酏劑是清透的、增甜的水醇(hydroalcoholic)制劑。用于酏劑的藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑。糖漿是糖例如蔗糖的濃縮水溶液，并可以含有防腐劑。乳狀液是兩相體系，在其中，一種液體以小球體的形式分散于另一種液體中。用于乳劑的藥學(xué)上可接受的載體是非水液體、乳化劑和防腐劑。懸浮液使用藥學(xué)上可接受的懸浮試劑和防腐劑。用于可以被重新配成液體口服劑型的非泡騰顆粒的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)包括稀釋劑、甜味劑和潤濕劑。用于可以被重新配成液體口服劑型的泡騰顆粒的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)包括有機(jī)酸和二氧化碳源。著色劑和增味劑被用于上述的所有劑型中。溶劑包括甘油、山梨醇、乙醇和糖漿。防腐劑的例子包括甘油、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸鈉和乙醇。用于乳劑的非含水液體的例子包括礦物油和棉籽油。乳化劑的例子包括明膠、阿拉伯膠、黃荒膠、膨潤土和表面活性劑諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、果膠、黃芪膠、維格姆膠(Veegum)和阿拉伯膠。稀釋劑包括乳糖和蔗糖。甜味劑包括蔗糖、糖漿、甘油和人造甜味劑諸如糖精。潤濕劑包括丙二醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、二甘醇單月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。有機(jī)添加劑包括檸檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氫鈉和碳酸鈉。著色劑包括任何批準(zhǔn)合法的可溶于水的FD和C染料以及其混合物。調(diào)味劑包括從植物例如水果提取得到的天然風(fēng)味劑，以及任何可以產(chǎn)生貽人味覺的合成的化合物混合物。對于固體劑型，將處于例如碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液或懸浮液封裝于明膠膠囊中。這樣的溶液、制劑和其封裝描述于美國專利4,328,245;4,409,239和4,410,545中。對于液體劑型，處于例如聚乙二醇中的溶液可以用足夠數(shù)量的藥學(xué)上可接受的液體載體例如水稀釋，這可以在施用時(shí)被容易地測定?？蛇x擇地，液體或半固體制劑可以通過將sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(例如碳酸丙烯酯)和其他此類載體中，并將這些溶液或懸浮液封裝于硬的或軟的明膠膠囊殼中而制備得到。其他有用的制劑包括在美國專利Re28，819和4,358,603中描述的制劑。適用于口腔含化給藥(舌下含化給藥)的制劑包括例如錠劑，其含有處于有風(fēng)味的基質(zhì)(flavoredbase)中的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，所述的風(fēng)味基質(zhì)通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠；還例如喉片，其含有處于惰性基質(zhì)(inertbase)中的化合物，所述的惰性基質(zhì)例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠。在所有的實(shí)施方案中，片劑和膠囊制劑可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣進(jìn)行包被，以便改變或維持活性組分的溶解過程。因此，例如，它們可以用常規(guī)的腸道可消化包衣——例如水楊酸苯酯、蠟和醋酸鄰苯二甲酸纖維素來包被。2.注射劑、溶液和乳劑本文也考慮了sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的腸胃外給藥，通常以注射為特征，皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。注射劑可以以常規(guī)的形式制備，或者作為液體溶液或者作為懸浮液；也可以以適于在注射之前用液體溶解或懸浮的固體形式制備；或作為乳狀液。合適的賦形劑例如水、鹽水、右旋糖、丙三醇或乙醇。此外，如果需要的話，待施用的藥物組合物也可以含有很小數(shù)量的非毒性輔助物質(zhì)，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其他此類試劑諸如例如醋酸鈉、失水山梨醇單月桂酯、三乙醇胺油酸酯和環(huán)糊精。本文也考慮應(yīng)用緩慢釋放或持續(xù)釋放的體系，以便維持恒定水平的劑量(參見例如美國專利3,710,795)。sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域在此類腸胃外組合物中的百分比取決于其特定性質(zhì)以及化合物的活性和患者的需要。組合物的腸胃外給藥包括靜脈、皮下和肌肉內(nèi)給藥。用于腸胃外給藥的制劑包括用于注射的無菌溶液、無菌干狀可溶性產(chǎn)品，諸如凍干的粉末，其僅在使用之前才與溶劑或無菌溶液混合，包括用于皮下注射的片劑、用于注射的無菌懸浮液、僅在使用之前才與媒介物混合的無菌干狀不可溶性產(chǎn)品，和無菌乳劑。溶液可以是含水的或者不含水的。如果是靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水或磷酸緩沖鹽水(PBS)，以及含有增稠劑和增溶劑諸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。用于腸胃外制劑中的藥學(xué)上可接受的載體包括含水媒介、無水媒介、抗微生物劑、等滲試劑、緩沖液、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑和分散劑、乳化劑、螯合劑或掩蔽劑和其他藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。含水媒介的例子包括氯化鈉注射液、林格注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。無水腸胃外媒介包括植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、香油和花生油。其濃度可以達(dá)到抑制細(xì)菌或抑制真菌效果的抗微生物劑必須加入到包裝于多劑量容器中的腸胃外制劑中，其中包括苯酚或甲酚、水銀劑、苯甲醇、三氯丁醇、p-羥基苯甲酸甲酯和p-羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯銨和芐索氯銨。等滲試劑包括氯化鈉和右旋糖。緩沖液包括磷酸鹽和檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因。懸浮和分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯基吡咯烷酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80(TWEEN80)。金屬離子的螯合劑或掩蔽劑包括EDTA。藥物載體也包括用作可與水混溶的媒介的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于調(diào)節(jié)pH的氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。藥物活性化合物的濃度被調(diào)節(jié)，以便注射液提供可以產(chǎn)生理想藥理效果的有效用量。準(zhǔn)確的劑量取決于患者或動(dòng)物的年齡、體重和狀態(tài)，如本領(lǐng)域所知道的。單元?jiǎng)┝磕c胃外制劑被包裝于安瓿、小瓶或攜帶針的注射器中。所有用于腸胃外給藥的制劑必須是無菌的，如本領(lǐng)域所已知并實(shí)踐的。示范性地，含有活性化合物的無菌水溶液的動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)灌輸是一種有效的給藥方式。另一實(shí)施方案是含有為了產(chǎn)生理想的藥理效果所必需的活性材料的無菌含水或油質(zhì)溶液或懸浮液?？稍O(shè)計(jì)注射劑以用于局部給藥和全身性給藥。通常，治療上有效的劑量被配制，對于接受治療的組織，其含有濃度至少約0.P/。w/w至高達(dá)約90。/。w/w，或更多的活性化合物，優(yōu)選濃度大于1%w/w的活性化合物?；钚越M分，諸如sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可以一次給藥，或分為許多較小的劑量在間隔的時(shí)間里給藥。應(yīng)該理解的是，精確的劑量和治療的持續(xù)時(shí)間與正在被治療的組織有關(guān)，并且可以利用已知的測試方案經(jīng)驗(yàn)性地確定，或由體內(nèi)或體外測試數(shù)據(jù)推斷得到。應(yīng)該注意，濃度和劑量值也可以隨著接受治療的個(gè)體的年齡而變化。應(yīng)該進(jìn)一步理解的是，對于任何特定的對象，具體的給藥方案應(yīng)該依據(jù)個(gè)體的需要和正在執(zhí)行或監(jiān)督制劑給藥的人員的專業(yè)判斷而隨著時(shí)間的推移進(jìn)行調(diào)整，還應(yīng)該理解的是，本文中闡述的濃度范圍只是示范性的，并不是為了限制要求保護(hù)的制劑的范圍或?qū)嵤１疚闹刑峁┑幕衔锟梢员慌渲朴脕硗ㄟ^注射——例如通過彈丸注射或持續(xù)灌輸——進(jìn)行腸胃外給藥。用于注射的制劑可以以單元?jiǎng)┝啃问酱嬖谟诶绨碴持谢蚨鄤┝咳萜髦?，其中添加有防腐劑。組合物可以是處于油或含水載體中的懸浮液、溶液或乳狀液，可以含有配方試劑諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x擇地，活性組分可以是粉末形式，其在使用之前與合適的介質(zhì)，例如無菌無熱原的水或其他溶劑重新配制。例如，本文所提供的是穩(wěn)定化溶液或凍干形式的腸胃外制劑，其中含有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，例如為500至500,000單位?；衔锟梢砸晕⒎刍蚱渌线m的形式懸浮，或可以被衍生化以產(chǎn)生更可溶的活性產(chǎn)物或產(chǎn)生藥物前體。所得到的混合物的形式取決于許多因素，包括所打算的給藥方式以及化合物在所選擇的載體或媒介物中的溶解性。有效的濃度足以改善狀況的癥狀并可以經(jīng)驗(yàn)性地確定。3.凍干粉末本文也提供了含有sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的凍干粉末，其可以被再配制為溶液、乳狀液和其他混合物而給藥。這些制劑也可以被重構(gòu)和配制為固體或膠。無菌的凍干粉末可以通過將含有sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的固體部分溶解在合適的溶劑中或者將含有sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的溶液的小等份與合適的溶劑相混合而得以制備。所述溶劑可以含有改善該粉末或由該粉末所制備得到的重構(gòu)溶液的穩(wěn)定性的賦形劑或其他藥理學(xué)組分?？梢允褂玫馁x形劑包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合適的試劑。所述溶劑也可以含有緩沖液，諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或其他這樣的緩沖液，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，通常為約中性pH。隨后對溶液進(jìn)行無菌過濾，再在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行凍干，從而得到凍干的制劑。通常，將由無菌過濾獲得的溶液分配入小瓶中進(jìn)行凍干。每個(gè)小瓶可以含有單劑量的化合物，諸如10-lOOOmg或100-500mg，或者含有多倍劑量的化合物。簡言之，凍干粉末可以這樣來制備，將右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合適的試劑以約1-20%的量溶解于合適的緩沖液例如擰檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的這樣的緩沖液中并使pH約為中性。然后將所選擇的鹽例如sHASEGP的鈉鹽(每10-100gm的緩沖溶液約lgm，通常約lgm/30gms)在室溫之上的溫度例如約30-35'C加入到所得到的混合物中，并進(jìn)行攪拌直到它溶解。所獲得的混合物通過加入更多的緩沖液進(jìn)行稀釋，以將所獲得的鹽濃度降低約10-50%,通常約15-25%。所獲得的混合物進(jìn)行無菌過濾或處理，以去除微粒并確保其無菌，并分配入小瓶中用于凍干。凍干的粉末可以在合適的條件下例如在約4'C至室溫進(jìn)行保存。用注射用水重構(gòu)該凍干粉末，從而提供了用于腸胃外給藥的制劑。為了重構(gòu)，在每毫升的無菌水或其它適當(dāng)?shù)妮d體中，加入治療上有效量的含有sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的凍干粉末。精確的數(shù)量依賴于所選擇的化合物，并可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法經(jīng)驗(yàn)性地確定。4.外部給藥外部混合物按照所描述的進(jìn)行制備以用于局部和全身性給藥。外部給藥，其有時(shí)在本領(lǐng)域被稱為經(jīng)皮給藥，典型地包括設(shè)計(jì)用來跨皮膚、粘膜或機(jī)體其它表面吸收的應(yīng)用(例如直接運(yùn)用到皮膚上的應(yīng)用；舌下的(舌下的(sublingual))應(yīng)用；對面頰(面頰(buccal))應(yīng)用；對眼、鼻或耳的應(yīng)用；或?qū)Ψ蔚膽?yīng)用(吸入))。所得到的混合物可以是溶液、懸浮液、乳劑或類似物，可以配制成乳液、凝膠、藥膏、乳膠體、溶液、酏劑、洗液、懸浮液、酊劑、膏、泡沫、氣溶膠、灌洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、皮貼或適合于外部給藥的任何其它制劑。sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其藥學(xué)上可接受衍生物的組合物可以被配制成氣溶膠以用于外部應(yīng)用，例如通過吸入方法(參見例如美國專利4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述了用來輸送用于治療炎性疾病特別是哮喘的類固醇的氣溶膠)。這些用于呼吸道給藥的制劑可以是用于噴霧器的氣溶膠或溶液形式，或是作為用于吹入法的超細(xì)粉末，其單獨(dú)使用或與惰性載體諸如乳糖聯(lián)合使用。在這樣的情況下，典型地，制劑的顆粒具有小于50微米的直徑，例如小于IO微米。對于吸入給藥，本文使用的組合物可以以氣溶膠噴霧給藥的形式從加壓的包裝或噴霧器中輸送出來，其中使用合適的推進(jìn)劑，這些推進(jìn)劑包括但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙垸、二氧化碳和其它合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況中，通過提供閥可以確定劑量單位，以輸送定量數(shù)量。用于吸氣器或吹藥器的例如明膠的膠囊和藥筒(cartridge)可以被配制成含有所述化合物和合適的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。組合物可以被配制用于局部或外部應(yīng)用，例如以凝膠、乳液和洗液的形式外用于皮膚和粘膜諸如眼里，以及應(yīng)用于眼或用于腦池內(nèi)應(yīng)用或脊柱內(nèi)應(yīng)用。外部給藥也被考慮用于經(jīng)皮傳送，以及用于眼給藥或粘膜給藥，或用于吸入治療。也可以將活性化合物的鼻溶液單獨(dú)或與其它藥學(xué)上可接受的賦形劑一起施用。例如，適合于外部應(yīng)用于皮膚或眼的制劑通常配制為藥膏、乳液、洗液、膏、凝膠、噴霧劑、氣溶膠和油。可以使用的載體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇和其兩種或更多種物質(zhì)的組合。外用制劑可進(jìn)一步有利地含有重量比例為0.05%至15%的增稠劑，包括但不限于羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚亞烷基乙二醇、聚羥烷基、(甲基)丙烯酸酯或聚(甲基)丙烯酰胺。外用制劑常常通過滴注或作為藥膏應(yīng)用到結(jié)膜囊。也可以將其用于眼、面竇(facialsinuses)和外耳道的灌洗或潤滑。液體狀的外用制劑也可以存在于條帶(strip)、隱形眼鏡和類似物的形式的親水性的三維聚合物基質(zhì)中，從中可以釋放出活性組分。也可以將其注入眼前房、鞏膜上隙和其它地方。例如，本文提供了在粘彈性物質(zhì)注射之后于眼內(nèi)使用的制劑，其含有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定化溶液，例如含有1至5000單位的具有30至150,000單位/mg的比活性的可溶性糖蛋白，所述溶液的體積是小量的，例如5至50W。作為另一個(gè)實(shí)例，本文也提供了用于眼內(nèi)使用的制劑，以在通過諸如特農(nóng)下注射的給藥途徑注射入包圍鞏膜的鞏膜上隙后，增強(qiáng)一種或多種藥理劑到眼內(nèi)組織的輸送，該制劑包括有效量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定化溶液，例如在諸如0.5到10ml體積里含有50至5,000單位的具有30至150,000單位/mg的比活性的可溶性糖蛋白。這些溶液，特別是那些打算眼用的溶液，可以用合適的鹽配制成0.01%-10%等滲溶液，其pH約5-7。離子滲入療法的聯(lián)合應(yīng)用在外部給藥到易于被離子滲入療法所影響的組織和向易于被離子滲入療法所影響的組織的其它應(yīng)用情況中，可將一種或多種sHASEGPs的使用(可能地，與另外的藥理劑或其它藥劑聯(lián)合配制或聯(lián)合施用)與離子滲入療法技術(shù)相結(jié)合，以進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)組織的通透?？紤]到這些，離子滲入療法和sHASEGPs可以協(xié)同行使功能，因?yàn)殡x子滲入療法可促進(jìn)將sHASEGPs輸送到組織或身體內(nèi)的其它位置，而且這樣輸送的sHASEGPs可以進(jìn)一步促進(jìn)酶的通透，以及聯(lián)合配制的或聯(lián)合施用的或存在于組織中的其它分子，即，通過酶促打開通道，其幫助擴(kuò)散，并且?guī)椭龠M(jìn)大量流體的流動(dòng)，并且因而幫助溶質(zhì)如藥劑(pharmacologics)的對流輸送。其他的給藥途徑，例如外部應(yīng)用、經(jīng)皮膏貼以及直腸給藥也在本文考慮之中。例如，用于直腸給藥的藥物劑型是產(chǎn)生全身性效果的直腸栓劑、膠囊和片劑。本文中使用的直腸栓劑指用于插入到直腸中的固體，其在體溫下融解或軟化，釋放出一種或多種藥理學(xué)上或治療上的活性成分。在直腸栓劑中使用的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)是基質(zhì)(bases)或載體(vehicle)和試劑，以提高熔點(diǎn)。基質(zhì)的例子包括可可油(可可油(theobromaoil))、甘油-明膠、碳蠟(聚氧化亞乙基二醇)和脂肪酸的甘油單酯、甘油雙酯和甘油三酯的恰當(dāng)混合物?？梢允褂酶鞣N基質(zhì)的組合。提高栓劑熔點(diǎn)的試劑包括鯨蠟和蠟。直腸栓劑可以通過壓縮方法或通過鑄型來制備。直腸栓劑的典型重量為約2至3gm。用于直腸給藥的片劑和膠囊可以使用同樣的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)并且采用與制備口服給藥制劑相同的方法進(jìn)行制造。適用于經(jīng)皮給藥的制劑可以作為獨(dú)立的貼劑存在，其適于在延長的時(shí)間段內(nèi)與接受者的表皮保持緊密接觸。此種貼劑適當(dāng)?shù)睾谢钚曰衔铮瑢τ谠摶钚曰衔?，可相?dāng)于例如濃度為0.1至0.2M的可選緩沖的水溶液。適合于經(jīng)皮給藥的制劑也可以通過離子滲入療法輸送(參見例如PharmaceuticalResearch3(6):318(1986))，并且典型地采用活性化合物的可任選緩沖的水溶液的形式。藥物組合物也可以通過受控釋放方法和/或輸送裝置來施用(參見例如美國專利3,536,809;3,598,123;3,630,200;3,845,770;3,847,770;3,916,899;4,008,719;4,687,610;4,769,027;5,059,595;5,073,543;5,120,548;5，354，566;5,591,767;5,639,476;5,674，533和5，733，566)?；钚曰衔锘蛩帉W(xué)上可接受的衍生物可以用可保護(hù)化合物免于從身體迅速清除的載體來制備，例如定時(shí)釋放的制劑或包衣。在本文提供的組合物和方法的一個(gè)實(shí)施方式中，治療劑通過緩慢釋放輸送載體被局部施用，例如，將治療劑封裝于膠體分散系統(tǒng)中或聚合物穩(wěn)定化晶體中?？捎玫哪z體分散系統(tǒng)包括納米膠囊、微球體、珠子和脂基系統(tǒng)，包括水包油乳劑、微囊、混合微囊和脂質(zhì)體。例如，膠體分散系統(tǒng)可以是脂質(zhì)體或微球體。脂質(zhì)體是人造膜小泡，當(dāng)被注射或植入時(shí)可用作緩慢釋放輸送載體。脂類-聚合物偶聯(lián)物和脂質(zhì)體的一些實(shí)例公開于美國專利5,631,018中，在此引入其全部作為參考。緩慢釋放輸送載體的其它實(shí)例是生物可降解的水凝膠基質(zhì)樣國專利5,041,292)、樹枝狀聚合物偶聯(lián)物(美國專利5,714,166)和多小泡脂質(zhì)體(DepofoamTMDepotech，SanDiego,CA)(美國專利5,723,147和5,766,627)。適用于封裝治療劑以用于局部注射(例如注射入皮下組織)的一類微球體是聚(D,L)丙交酯微球體，其描述于D.Fletcher,Anesth.Analg.84:90-94,(1997)中。例如，含有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域——例如1至5000單位/ml——的緩慢釋放制劑可以用于各種用途或用于治療各種病癥，包括但不限于化妝制劑(cosmeticformulation)、整形制劑、治療脊髓損傷和其它神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、某些眼病、炎性或自身免疫病癥、癌癥和其它慢性疾病病癥，其中sHASEGP的延時(shí)輸送是有益的。期望的血液水平可以通過持續(xù)輸入活性試劑來維持，這通過血漿水平進(jìn)行確證。應(yīng)該注意的是，由于毒性或者骨髓、肝臟或腎功能紊亂的原因，主治醫(yī)生將知道如何以及何時(shí)停止、中斷或調(diào)整治療，以降低劑量。相反地，如果臨床反應(yīng)不足(排除毒性副作用)，主治醫(yī)生也知道如何以及何時(shí)將治療調(diào)到更高的水平。sHASEGP多肽和/或其抑制劑——單獨(dú)或與其它試劑例如治療有效劑的組合——的效用和/或毒性也可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行評價(jià)(參見例如O&Apos;Reilly,InvestigationalNewDrugs15:5-13(1997》。6.制品sHASEGP多肽或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或含有任何前述試劑的組合物可以被包裝為制品，其包含包裝材料、包裝材料內(nèi)本文中提供的化合物或其適當(dāng)?shù)难苌镆灰凰鼈兛梢杂行У刂委煴疚乃紤]的疾病或紊亂，以及標(biāo)明所述化合物或其適當(dāng)?shù)难苌锸怯糜谥委煴疚乃紤]的疾病或紊亂的標(biāo)簽。該標(biāo)簽可以任選地包括被證明可以治療的紊亂。本文提供的制品包含包裝材料。用于包裝藥物產(chǎn)品的包裝材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如美國專利5,323,907、5,052,558和5,033,352)。藥物包裝材料的實(shí)例包括但不限于硬質(zhì)泡沫塑料包裝、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶和適用于所選擇的制劑和擬給藥和治療方式的任何包裝材料。本文所提供的化合物和組合物的各種制劑被考慮，同樣被考慮的是針對任意的紊亂的各種治療，在所述的紊亂中，HCV感染涉及作為癥狀或病因的介導(dǎo)者或原因。本文也提供了含有組合物和/或其與給藥說明書的組合的試劑盒。試劑盒可以進(jìn)一步包括通常以無菌形式包裝的用于注射復(fù)合物的注射針頭或注射器，和/或包裝的酒精墊。說明書也可以任選地包含在其中，以指導(dǎo)臨床醫(yī)生或患者施用活性藥劑。例如，本文提供了如此試劑盒，其包含帶有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的小體積注射器，例如包含在5至5(^1體積中的1至5000單位的可溶性糖蛋白，可選地包含含有粘彈性物質(zhì)的第二注射器。本文也提供了這樣的試劑盒，其包含小體積注射器，其中含有有效量的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，例如1至500單位的可溶性糖蛋白，以及治療量的第二活性組分，例如藥物、小分子、蛋白或核酸。K.動(dòng)物模型本文提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和動(dòng)物，例如包括小鼠和大鼠的嚙齒類動(dòng)物、牛、雞、豬、山羊、綿羊、包括大猩猩和其它靈長類的猴類。特別地，提供了含有編碼sHASEGP多肽的異源核酸的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，或者在其中該多肽的表達(dá)已被改變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這種改變例如通過置換或修飾內(nèi)源基因的啟動(dòng)子區(qū)域或其它調(diào)控區(qū)域。此類動(dòng)物可以通過促進(jìn)內(nèi)源性核酸和外源性sHASEGP基因之間通過同源重組事件或其它重組事件而發(fā)生的重組來產(chǎn)生，其中，所述外源性sHASEGP基因可以被過量表達(dá)或不當(dāng)表達(dá)，例如通過在強(qiáng)啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過使用任何已知的輸送方法將核酸引入生殖系細(xì)胞或體細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞而產(chǎn)生，所述的輸送方法包括但不限于微注射、脂轉(zhuǎn)染和其它基因輸送方式。典型地，將核酸引入細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞(ES)中，然后將該ES細(xì)胞注射入胚泡，并將胚泡植入代孕母親，再生出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一般地，通過異源的sHASEGP編碼核酸和內(nèi)源性核酸之間的重組將異源核酸分子引入動(dòng)物染色體。異源核酸可以靶向特定的染色體。在一些實(shí)例中，可以產(chǎn)生基因敲除動(dòng)物。此類動(dòng)物可以首先通過促進(jìn)其染色體中的sHASEGP多肽基因和生物學(xué)上已失活(典型地，通過插入異源序列例如抗生素抗性基因來實(shí)現(xiàn))的外源性sHASEGP多肽基因之間的同源重組而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種同源重組通過用包含插入失活的sHASEGP多肽基因的載體轉(zhuǎn)化胚胎來源的干細(xì)胞(ES)來實(shí)施，這樣，發(fā)生同源重組，然后將ES細(xì)胞注射入胚泡，并將胚泡植入代孕母體，由此生出sHASEGP多肽基因己失活的嵌合動(dòng)物("基因敲除動(dòng)物")(參見Capecchi,Science244:1288-1292(1989))。可以培育該嵌合動(dòng)物，以產(chǎn)生純合的基因敲除動(dòng)物，然后可以使用所述基因敲除動(dòng)物來產(chǎn)生另外的基因敲除動(dòng)物?；蚯贸齽?dòng)物包括但不限于小鼠、倉鼠、綿羊、豬、牛和其它非人哺乳動(dòng)物。例如，產(chǎn)生基因敲除小鼠。所得到的動(dòng)物可以充當(dāng)特定疾病例如癌癥的模型，其顯示出sHASEGP多肽的不足表達(dá)。這樣的基因敲除動(dòng)物可以用作此類疾病的動(dòng)物模型，例如用來篩選或測試能夠治療或預(yù)防此類疾病或紊亂的分子。也可以產(chǎn)生其它類型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括過量表達(dá)sHASEGP多肽的那些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這樣的動(dòng)物包括"基因敲入"動(dòng)物，它們是其中正?；虮蛔凅w例如突變體、過量表達(dá)形式或其它形式所替代的動(dòng)物。例如，一個(gè)物種例如嚙齒類動(dòng)物的內(nèi)源性基因可被其它物種例如人的基因所替代。動(dòng)物也可以通過非同源重組進(jìn)入染色體中的其它位點(diǎn)而產(chǎn)生；包括發(fā)生過多種整合事件的動(dòng)物。在產(chǎn)生第一代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之后，可以對嵌合動(dòng)物進(jìn)行培育，以產(chǎn)生具有過量表達(dá)的或不當(dāng)表達(dá)的sHASEGP多肽的另外的動(dòng)物。這樣的動(dòng)物包括但不限于小鼠、倉鼠、綿羊、豬、牛和其它非人哺乳動(dòng)物。所得到的動(dòng)物可以充當(dāng)特定疾病例如癌癥的模型，其顯示出sHASEGP多肽的過量表達(dá)或不當(dāng)表達(dá)。這樣的動(dòng)物可以用作此類疾病的動(dòng)物模型，例如用來篩選或測試能夠治療或預(yù)防此類疾病或紊亂的分子。在具體的實(shí)施方式中，產(chǎn)生具有過量表達(dá)的或不當(dāng)表達(dá)的sHASEGP多肽的小鼠。下面包括的實(shí)施例僅是用于說明目的，而不是打算限制本發(fā)明的范圍。L.sHASEGP的治療用途在過去的40年里，來自屠宰場的天然發(fā)生的透明質(zhì)酸酶已經(jīng)成為臨床酶制劑的主要來源。牛和羊睪丸是這種材料的主要來源。然而，這種臨床酶制劑是非常粗糙的，基于已知的比活性為30-100,000單位/mg之間，可知被售的制劑的純度在0.5-5%范圍內(nèi)。因此，它們純度的缺乏以及它們的屠宰場來源，使得它們不但成為人的免疫源而且成為克-雅二氏癥(JacobCreutzfeld)和其它牛和羊病原體的潛在來源。已經(jīng)知道發(fā)生過對牛和羊透明質(zhì)酸酶制劑的過敏反應(yīng)。牛或細(xì)菌源的透明質(zhì)酸酶已經(jīng)被用于治療與過量透明質(zhì)酸相關(guān)的疾病，并且被用來增強(qiáng)生理液和/或治療劑的循環(huán)。例如，牛透明質(zhì)酸酶可以與用于眼科手術(shù)程序的球周、球后和特農(nóng)囊下(sub-Tenon'sblock)阻斷中的麻醉劑一起注入。而且，在缺乏透明質(zhì)酸酶時(shí)手術(shù)并發(fā)癥出現(xiàn)增加(BrownSMetal.JCataractRefractSurg.1999Sep;25(9):1245-9.)。牛透明質(zhì)酸酶也可以用作局部壞死的解毒劑，該局部壞死來自于致壞死物質(zhì)例如長春花植物堿的靜脈旁注射(Few，B丄(1987)Amer.丄Matern.ChildNurs.12,23-26)。牛睪丸透明質(zhì)酸酶也可用于治療神經(jīng)節(jié)囊腫(Pauletal.JHandSurg1997Apr;22(2):219-21)。透明質(zhì)酸酶也可以用來幫助流體在皮下灌注術(shù)中的皮下輸送(BergerEY，AmGeriatrSoc1984Mar;32(3):199-203)。透明質(zhì)酸酶也已被用于降低接受粘彈性物質(zhì)的青光眼患者和白內(nèi)障患者眼睛內(nèi)的眼內(nèi)壓(美國專利4,820,516，1989年4月11日出版)。?；蚣?xì)菌源的透明質(zhì)酸酶己被用作"分散劑(spreadingagent)",來增強(qiáng)化學(xué)治療劑的活性禾Q/或使得腫瘤能更容易接近化學(xué)治療劑(SchuIleretal.，1991,Proc.Amer.Assoc.CancerRes.32:173，abstractno.1034;Czejkaetal"1990，Pharmazie45:H.9)?；瘜W(xué)治療和透明質(zhì)酸酶的組合在各種癌癥的治療中是有效的，所述癌癥包括膀胱癌(Hornetal.,1985，J.Surg.Oncol.28:304-307)、鱗狀細(xì)胞癌(Kohnoetal.,94，J.CancerRes.Oncol.120:293-297)、乳腺癌(Beckenlehneretal"1992,J.CancerRes.Oncol.118:591-596)和胃腸癌(Scheithaueretal.,1988,AnticancerRes.8:391-396)。透明質(zhì)酸酶作為治療腦癌(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)的唯一治療劑是有效的(PCT公開申請?zhí)朩O88/02261，1988年4月7日公布)。透明質(zhì)酸酶的給藥也誘導(dǎo)胰腺、胃、結(jié)腸、卵巢和乳房的以前抗化學(xué)治療的腫瘤發(fā)生應(yīng)答(Baumgartneretal.,1988，Reg.CancerTreat.1:55-58;Zankeretal.,1986，Proc.Amer.Assoc.CancerRes.27:3卯)。不幸的是，污染物和此類透明質(zhì)酸酶的非人性質(zhì)會導(dǎo)致過敏反應(yīng)。除了其間接的抗腫瘤效應(yīng)外，牛來源的透明質(zhì)酸酶具有直接的抗癌發(fā)生的效應(yīng)。透明質(zhì)酸酶阻止移植入小鼠的腫瘤的生長(DeMaeyeretal.，1992，Int.J.Cancer51:657-660)，并且抑制在暴露于致癌物質(zhì)時(shí)的腫瘤形成(Pawlowskietal.,1979,Int.J.Cancer23:105-109;Habermanetal.，1981,Proceedingsofthe17thA畫alMeetingoftheAmericanSocietyofClinicalOncology,Washington,D.C.,22:105,abstractno.415)。考慮到牛來源的透明質(zhì)酸酶作為治療劑的價(jià)值，特別是在其與傳統(tǒng)的化療劑一起用于化學(xué)治療時(shí)，或者其本身作為化學(xué)治療的治療劑時(shí)，在本領(lǐng)域就存在著對基本上純的人源透明質(zhì)酸酶制劑的需求。也需要有效的、具成本效益的制備透明質(zhì)酸酶的方法，以提供商業(yè)上相當(dāng)數(shù)量的酶。本發(fā)明致力于這些問題。透明質(zhì)酸是胞外基質(zhì)的基本成分。透明質(zhì)酸發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織中，并且是眼玻璃體的主要成分。在結(jié)締組織中，與透明質(zhì)酸締合的水合水在組織之頁間創(chuàng)造出空間，從而產(chǎn)生有利于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖的環(huán)境。透明質(zhì)酸在與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的生物學(xué)現(xiàn)象中起到關(guān)鍵作用，所述生物學(xué)現(xiàn)象包括快速發(fā)育、再生、修復(fù)、胚胎發(fā)生、胚胎發(fā)育、傷口愈合、血管生成和腫瘤發(fā)生(Toole,1991,CellBiol.Extracell.Matrix,Hay(ed),PlenumPress,NewYork,1384-1386;Bertrandetal.,1992,Int.丄Cancer52:1-6;Knudsonetal.,1993,FASEBJ.7:1233-1241)。另外，透明質(zhì)酸水平與腫瘤侵入性相關(guān)(Ozelloetal.,1960，CancerRes.20:600-604;Takeuchietal.,1976,CancerRes.36:2133-2139;Kimataetal.,1983，CancerRes.43:1347-1354)。脊髓損傷之后，神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕由星形細(xì)胞產(chǎn)生，并且神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕含有硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)。CSPGs在抑制軸突生長中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Levine，1994;Powelletal.，1997)。例如，在胚胎發(fā)育期間，CSPGs壓迫軸突并抑制神經(jīng)細(xì)胞粘著。CSPGs也在邊界形成中發(fā)揮重要作用(Snowetal.，1990,1992;PowellandGeller,1999)。另外，在CNS損傷之后CSPG的表達(dá)增加(Mckeonetal.,1991;Daviesetal.，1997)。研究表明，CSPGs的抑制效應(yīng)主要是由硫酸軟骨素(CS)糖胺聚糖(GAG)糖鏈引起的(Snowetal.,1990;ColeandMcCable，1991;GeisertandBidanset,1993)。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌軟骨素酶的鞘內(nèi)給藥事實(shí)上促進(jìn)了軸突再生，這支持了這點(diǎn)。而且，電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)確定，再生的CST軸突建立了功能聯(lián)系(Bradbury，etal2002)。除了CSPGs的直接抑制效應(yīng)之外，CSPGs也可以與細(xì)胞粘附分子或神經(jīng)營養(yǎng)因子相互作用，以影響神經(jīng)突的生長(Robertsetal.,1988;RuoslahtiandYamaguchi,1991;Milevetal.,1994)。重組的哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶因此可以用于逆轉(zhuǎn)CSPG在神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕中的抑制作用并且促進(jìn)損傷之后的軸突再生。充分降解神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕中的CSPG所需的sHASEGP的數(shù)量將會變化。在一些情況下，需要通過鞘內(nèi)輸送反復(fù)地給予10-5000單位的sHASEGP以去除瘢痕內(nèi)的CSPG。在其它情況下，通過使用緩釋制劑持續(xù)釋放sHASEGP可能是優(yōu)選的?？蛇x地，施用編碼sHASEGP的基因治療載體可以有效地增強(qiáng)CSPG的清除。sHASEGPs也可以在稱為化學(xué)髓核溶解術(shù)的方法中被用來治療椎間盤脫出。軟骨素酶ABC和切割sHASEG相似底物的酶可誘導(dǎo)降低腰椎中的椎間盤內(nèi)壓力(Sasakietal.，2001，Ishikawaetal.，1999)。有三類椎間盤損傷。椎間盤膨出(protrudeddisk)是完整但是凸出(intactbutbulging)的一種類型。在椎間盤突出(extrudeddisk)中，纖維質(zhì)包裹物己經(jīng)撕裂，并且NP泄出，但其依然與椎間盤相聯(lián)。在椎間盤脫出(sequestereddisk)中，NP的片段從椎間盤脫落，并游離于脊椎管。化學(xué)髓核溶解術(shù)對于椎間盤膨出和椎間盤突出是有效的，但對于椎間盤脫出損傷沒有效果。在美國，化學(xué)髓核溶解術(shù)僅被批準(zhǔn)用于腰部(更低的)脊椎。在其它國家，它已經(jīng)被成功地用于治療頸(上部脊椎)突出。因此，當(dāng)優(yōu)選要降低椎間盤壓力時(shí)，化學(xué)髓核溶解術(shù)是椎間盤手術(shù)的保守性替代方案。糖蛋白上的碳水化合物鏈的精確組成和結(jié)構(gòu)可直接影響其血清壽命，這是因?yàn)楦闻K和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的細(xì)胞可與攜帶特定碳水化合物的循環(huán)糖蛋白相結(jié)合并使之內(nèi)在化。肝細(xì)胞在它們的表面上具有受體，這些受體識別末端(即，聚糖相對于多肽的最遠(yuǎn)端)具有Gal殘基的寡糖鏈，巨噬細(xì)胞包含識別末端Man或GlcNAc殘基的受體，肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有識別暴露的巖藻糖殘基的受體。然而，還沒有發(fā)現(xiàn)唾液酸特異性受體。盡管有些依賴于寡糖的空間排布，但按照一般規(guī)則來說，被肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的細(xì)胞表面受體識別的暴露糖殘基的數(shù)量越多，糖蛋白被清除出血清越快。然而，因?yàn)椴淮嬖谕僖核崽禺愋允荏w，所有具有用唾液酸末端化或"封端(capped)"的分支的寡糖不會加快與之連接的蛋白質(zhì)的清除。除了影響其被肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞中的糖特異性受體識別之外，糖蛋白上寡糖鏈的存在和性質(zhì)也能影響重要的生物化學(xué)特性。從糖蛋白上除去碳水化合物通常將降低其溶解性，并且其也可能通過將正確的多肽折疊形式去穩(wěn)定化和/或暴露蛋白酶敏感位點(diǎn)，而使得它更易遭受蛋白水解降解。由于相似的原因，蛋白質(zhì)中的糖基化狀況可影響免疫系統(tǒng)對其的識別。在深低溫保藏和其它體外受精技術(shù)例如細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)之前，sHASEGPs可以被用來除去包圍卵的卵丘細(xì)胞。可以將在緩沖鹽溶液中的10-200U/ml之間的透明質(zhì)酸酶加入到收集的卵母細(xì)胞中。通過吸取和用缺少透明質(zhì)酸酶的介質(zhì)進(jìn)行數(shù)次洗滌，將卵母細(xì)胞與釋放的卵丘細(xì)胞分離開來。然后可以對卵進(jìn)行處理，以用于深低溫保藏或IVF技術(shù)。sHASEGPs也可以用于更有效地將化學(xué)治療劑滲入實(shí)體腫瘤中。sHASEGPs可以與抗癌劑一起進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，或者對于彌散性癌癥或難以到達(dá)的腫瘤進(jìn)行靜脈內(nèi)注射?？拱﹦┛梢允腔瘜W(xué)治療劑、抗體、肽或基因治療載體、病毒或DNA。此外，sHASEGPs可以被用來將腫瘤細(xì)胞募集至循環(huán)庫(cyclingpool)，以對具有獲得多元藥物抗性的先前耐藥性(chemorefractory)腫瘤進(jìn)行增敏作用(StCroixetalCancerLett1998Sep11;131(1):5-44)。sHASEGPs也可以用于增強(qiáng)將生物制劑例如單克隆抗體、細(xì)胞因子和其它藥物輸送到積聚糖胺聚糖的腫瘤。許多腫瘤缺失了參與糖胺聚糖的分解代謝的基因，這樣局部積聚可阻止抗腫瘤試劑和免疫系統(tǒng)到達(dá)腫瘤塊。sHASEGP也可以用于增加對常規(guī)的化學(xué)治療有抗性的腫瘤的敏感性。在一個(gè)實(shí)施方式中，將sHASEGP施用給具有與LuCa-l缺陷相關(guān)的腫瘤的患者，施用量足以增加在腫瘤位點(diǎn)周圍的擴(kuò)散(例如，增加化學(xué)治療因子的循環(huán)；例如，促進(jìn)化學(xué)治療劑在腫瘤位點(diǎn)和腫瘤位點(diǎn)周圍的循環(huán)和/或聚集)、抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性(例如，通過HA降解)和/或降低腫瘤細(xì)胞凋亡閾值(即，將腫瘤細(xì)胞帶入失巢凋亡狀態(tài))，該狀態(tài)使得腫瘤細(xì)胞更易遭受化學(xué)治療劑或可促進(jìn)細(xì)胞死亡的其它試劑的作用，優(yōu)選地，所述試劑優(yōu)先地促進(jìn)失巢凋亡中的細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡。本文中使用的化學(xué)治療劑旨在包括所有分子，合成的(例如，順鉑)以及天然發(fā)生的(例如，腫瘤壞死因子IF))，它們幫助抑制腫瘤細(xì)胞生長，優(yōu)選地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，更優(yōu)選地優(yōu)先促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。特別感興趣的是，使用sHASEGP來治療轉(zhuǎn)移癌和非轉(zhuǎn)移癌，特別是轉(zhuǎn)移癌，其相對于非癌癥(正常)細(xì)胞，具有降至不能被檢測的透明質(zhì)酸酶活性。sHASEGP可以用作化學(xué)治療劑(單獨(dú)或與其它化學(xué)治療劑聯(lián)合)，用于治療多種癌癥的任意一種，特別是侵入性腫瘤。例如，sHASEGP可以被用來治療肺小細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌以及胸癌、卵巢癌、頭和頸癌，或與降低的透明質(zhì)酸酶水平相關(guān)的任何其它癌癥，或與缺陷LuCa-l(hpHAse)基因(例如，不能表達(dá)足夠水平的hpHAse的LuCa-l基因，或編碼不能提供足夠水平的透明質(zhì)酸酶活性的缺陷hpHAse的LuCa-l基因)相關(guān)的任何其它癌癥，或與降低的透明質(zhì)素分解代謝相關(guān)的其它缺陷。sHASEGP優(yōu)選用于治療與缺陷HA分解代謝相關(guān)的惡性細(xì)胞增生性疾病，它不需要細(xì)胞參與來進(jìn)行降解。適于給藥的具體劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)上面討論的因素容易地確定(參見例如Harrison'sPrinciplesoflnternalMedicine,1lthEd.，987)。另外，適用于人的劑量的估計(jì)可以從sHASEGP在體外確定的酶活性水平和/或在動(dòng)物研究中的有效劑量進(jìn)行外推。例如，70-300TRU的透明質(zhì)酸酶能有效地減少重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠(scidmouse)中的腫瘤負(fù)荷?？紤]到該信息，在平均70kg的人中相應(yīng)的劑量范圍為約250，000-1，200,000TRU透明質(zhì)酸酶。將sHASEGP施用給人類患者的數(shù)量通常在1TRU至5,000,000TRU的酶活性范圍內(nèi)，優(yōu)選在約1,000TRU至2,500,000TRU的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約100,000TRU至1,500,000TRU的范圍內(nèi)，正常情況下在約250,000TRU和1,200,000TRU之間，約725,000TRU的劑量代表了平均處方劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，將sHASEGP配制在包含濃度約150,000TRU/cc的sHASEGP的0.15M鹽溶液中。然后將制劑以15,000TRU/kg患者體重的量靜脈內(nèi)注射?？蛇x地，該酶制劑也可以皮下注射，以使得透明質(zhì)酸酶可以灌注至腫瘤位點(diǎn)的周圍。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將sHASEGP注射在腫瘤周圍，或者注射入腫瘤塊。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，sHASEGP被配制成脂質(zhì)體，通過靜脈內(nèi)注射進(jìn)行輸送，或者通過在與LuCa-l(hpHAse)基因的缺陷相關(guān)的癌細(xì)胞的位點(diǎn)或位點(diǎn)附近注射而進(jìn)行輸送。sHASEGP的靜脈內(nèi)注射導(dǎo)致在腫瘤位點(diǎn)中具有sHASEGP。而且，因?yàn)閟HASEGP上的末端唾液酸防止該酶被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)從循環(huán)中清除掉，所以超唾液酸化的sHASEGP對于腸胃外給藥是優(yōu)選的。超唾液酸化的sHASEGP與非唾液酸化的牛和羊透明質(zhì)酸酶的比較顯示，超唾液酸化的sHASEGP獲得基本上更加有利的藥物動(dòng)力學(xué)。基因治療的易化大部分基因輸送載體的體內(nèi)效力并不與在體外所觀察到的效力相對應(yīng)。糖胺聚糖能阻礙DNA和病毒載體轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散入許多細(xì)胞類型。這樣的胞外基質(zhì)材料的水平能大大地阻礙該過程。Dubenskyetal.，(ProcNatlAcadSciUSA1984Dec;81(23):7529-33)證明，當(dāng)透明質(zhì)酸酶與膠原酶聯(lián)合時(shí)，透明質(zhì)酸酶可有助于DNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。已經(jīng)證明，腺相關(guān)病毒也能勝任透明質(zhì)酸酶介導(dǎo)的基因治療(Favreetal,GeneTher2000Aug;7(16):1417-20)。我們在本文中已經(jīng)確定，用sHASEGP在胞外基質(zhì)中打開確定尺寸的通道。這些孔通常沒有增加直徑大于約200-500nm的物質(zhì)的擴(kuò)散。然而，更小的分子例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和DNA復(fù)合體可勝任sHASEGP介導(dǎo)的擴(kuò)散。sHASEGPs—般打開基本上足夠大以允許大多數(shù)治療劑和其它感興趣的藥理劑(包括大分子例如蛋白質(zhì)和核酸以及大分子復(fù)合體例如基因治療載體)進(jìn)入的通道，而且該通道一般沒有大至促進(jìn)細(xì)胞的易位和運(yùn)動(dòng)，該事實(shí)保證了sHASEGPs在例如治療、預(yù)防和/或診斷各種疾病方面具有特別有利的用處?？蛇x地，病毒也可以裝配有sHASEGP基因，以有助于例如它們在耙組織中復(fù)制和傳播。靶組織可以是癌癥組織，由此，病毒能夠在腫瘤內(nèi)選擇性復(fù)制。病毒也可以是非裂解病毒，其中，病毒在組織特異性啟動(dòng)子下選擇性復(fù)制。隨著病毒的復(fù)制，sHASEGP與病毒基因的共表達(dá)將促進(jìn)病毒在體內(nèi)的傳播?？蛇x地，感興趣的核酸和sHASEGP可以同時(shí)使用，或連續(xù)使用或錯(cuò)開時(shí)間使用。"同時(shí)"是指聯(lián)合給藥。在這種情況下，這兩種基本成分可以在給藥之前混合成組合物，或者可以同時(shí)施用給細(xì)胞或宿主生物。也可以對其連續(xù)給藥，也就是說一種接一種，不論本發(fā)明的聯(lián)合產(chǎn)品中的哪種成分先被施用。最后，可以使用這樣的給藥方式，即，錯(cuò)開時(shí)間施用，或者間斷施用，其停止又再重新開始，并且其間的間隔可以是規(guī)律的也可以是不規(guī)律的。被指出的是，兩種成分的給藥途徑和位點(diǎn)可以是不同的。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，sHASEGP在核酸之前被施用，而且這兩種成分的給藥途徑優(yōu)選是相似的。注射之間的時(shí)間間隔不是關(guān)鍵的，可以由技術(shù)人員來規(guī)定?？赏扑]10min至72h的時(shí)間間隔，有利地為30min至48h的時(shí)間間隔，優(yōu)選1至24h的時(shí)間間隔，非常優(yōu)選地，為l至6h的時(shí)間間隔。另外，本發(fā)明的聯(lián)合產(chǎn)品也可以與一種或多種擬改善核酸給藥的分子相聯(lián)合。所述分子可以是這樣的分子，其對核酸具有保護(hù)作用(防止其在細(xì)胞內(nèi)降解)，其提高了它在宿主細(xì)胞的滲透或表達(dá)(促融合肽、核定位信號等)，其能夠靶向特定的細(xì)胞類型(識別細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的配體或抗體，等)，或其延長治療效應(yīng)(免疫抑制試劑，等)。所述的聯(lián)合產(chǎn)品也可以與促進(jìn)轉(zhuǎn)染的試劑(蛋白質(zhì)等)聯(lián)合。本發(fā)明的聯(lián)合產(chǎn)品可以以局部或腸胃外給藥為目的或以消化途徑給藥為目的進(jìn)行制備。特別提到的途徑是胃內(nèi)、皮下、心臟內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、滑膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和氣管內(nèi)途徑，并且更特別地，是肌肉內(nèi)途徑。給藥可以通過本領(lǐng)域的任何技術(shù)(注射、口服途徑、氣溶膠、滴注等)實(shí)現(xiàn)，可以作為單一劑量或作為在特定的時(shí)間間隔之后重復(fù)一次或若千次的劑量。可以調(diào)整給藥途徑以適應(yīng)將被轉(zhuǎn)染的感興趣基因和將被治療的疾病。制劑可以包括藥學(xué)上可接受的載體(賦形劑、輔助劑等)。導(dǎo)致胞外基質(zhì)解體的物質(zhì)和感興趣的核酸優(yōu)選溶解于緩沖液中，該緩沖液適合用于藥物用途且可以是高滲性的、低滲性的或等滲性的?？梢钥紤]各種緩沖液?？梢蕴岢龅氖纠跃彌_液有生理鹽溶液(0.9%NaCl)、非生理鹽溶液(1.8%NaCl)、Hepes-Ringer溶液、乳酸鹽-Ringer溶液，基于Tris-HCl的緩沖液(10mMTris-HCl,pH7.5至8、lmMEDTA;10mMTris-HCl，pH7.5至8、lmMMgCl2)、磷酸緩沖液(Krebs磷酸鹽H20緩沖液)、糖(葡萄糖、蔗糖、海藻糖等)溶液或僅僅是水。皮下灌注術(shù)皮下灌注術(shù)，流體的皮下灌輸，是有用和易行的水合技術(shù)，其適合于輕微至中等程度失水的成年患者，尤其是老年患者。該方法被認(rèn)為是安全的，且不會造成任何嚴(yán)重的并發(fā)癥。最常見的副作用是可以通過局部按摩和全身性利尿劑而得以處理的輕微的皮下浮腫?？梢栽?4小時(shí)內(nèi)在兩個(gè)不同的位置給藥大約3L。常見的灌輸位置是胸腔、腹、股和上肢。優(yōu)選的溶液是生理鹽水，但可以使用其它溶液，例如半生理鹽水，鹽水葡萄糖或5%葡萄糖。如果需要的話，可以將氯化鉀加入到溶液袋中。此外，其它藥物可以通過類似的途徑輸送。可以加入人sHASEGP,以增強(qiáng)流體吸收和增加給藥的總速度。因?yàn)槿藄HASEGP不可能具有如同牛的酶所知道的那樣的免疫原性，所以人sHASEGP比屠宰場來源的酶更優(yōu)選用于反復(fù)的皮下灌注術(shù)。人sHASEGP可以在家里由家庭成員或護(hù)士施用；該技術(shù)應(yīng)該是每一個(gè)家庭醫(yī)生熟悉的。在能走動(dòng)的患者中，皮下灌注術(shù)的位點(diǎn)包括腹、上胸腔、乳房以上、肋間隙上和肩胛區(qū)。在臥床患者中，優(yōu)選的位點(diǎn)是股、腹部和上肢外側(cè)。l至4天后，應(yīng)該更換注射針頭和輸液管，盡管灌輸裝置曾經(jīng)被使用更長的時(shí)間而無并發(fā)癥出現(xiàn)?？梢?天3次，一次1或2小時(shí)，給藥500mL，在第一次的早上輸注之前于皮下位點(diǎn)施用150U的sHASEGP。治療性注射的易化許多經(jīng)皮注射(例如通過使用注射針頭或其它穿透皮膚并被用來將分子置于皮下層的器械)的分子緩慢地或以非常緩慢的效率進(jìn)入循環(huán)。幾個(gè)因素調(diào)控皮下注射(SC)或肌內(nèi)注射(IM)的分子的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)。通常，更大的分子以更緩慢的速度和更低的效率進(jìn)入循環(huán)，它們不是通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入循環(huán)的。通過計(jì)算SC與靜脈內(nèi)給藥時(shí)的曲線下面積的比率(AUCsc/AUC靜脈一確定皮下生物利用度。第二因素是基質(zhì)分子的電荷和親合性，它們在分子在皮下的螯合(sequestration)過程中可能發(fā)揮作用。如果這些材料在局部被降解，它們可能永遠(yuǎn)不能到達(dá)它們的期望靶標(biāo)，并因而對靶器官表現(xiàn)出降低的總的全身性生物利用度。大的蛋白通常是靜脈內(nèi)給藥，因此藥劑在血流中直接可被利用。然而，如果藥劑可以皮下給藥、肌內(nèi)給藥或皮內(nèi)(ID)給藥的話，將是有利的，因?yàn)檫@些給藥形式對于患者而言更容易操作。特別是，如果藥劑必需在一生中有規(guī)律地服用，以及治療幵始的很早，當(dāng)患者是兒童時(shí)已經(jīng)開始治療的情況下。然而，具有非常大的和不穩(wěn)定的分子例如170至300kDa的凝結(jié)因子VIII的藥劑，如果被皮下給藥、肌內(nèi)給藥或皮內(nèi)給藥，通常具有非常低的生物利用度，這是因?yàn)槲詹蛔愣医到鈬?yán)重。除了需要增加許多皮下給藥的生物制劑的生物利用度之外，更快速的藥物動(dòng)力學(xué)在急診的情況下也是至關(guān)重要的。對于許多患者，實(shí)現(xiàn)靜脈內(nèi)接通(reachintravenousaccess)所需要的時(shí)間阻止了當(dāng)原本被全身性地給藥時(shí)可快速起作用的藥物被利用。在一些情況下，在不能接通靜脈內(nèi)通路之后，再進(jìn)行皮下注射，這進(jìn)一步擔(dān)擱了到達(dá)靶器官的時(shí)間。因此，皮下給藥的藥物的更迅速的可利用性將是有利的，因?yàn)檫@樣是第一時(shí)間的治療而不會由于接通靜脈所需要的時(shí)間而冒險(xiǎn)?？梢云は乱约办o脈內(nèi)輸送的分子的實(shí)例包括腎上腺素、阿托品、納洛酮(narcan)、利多卡因和右旋糖。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)在于，能夠以ID、SC或IM的方式輸送相等體積或更大體積的溶液，而不存在與注射位點(diǎn)處溶液的壓力和體積相關(guān)的疼痛和發(fā)病。例證性地(而非限制)，大量的生物制劑以可通過與一種或多種sHASEGPs聯(lián)合(例如通過共同配制，或在所述生物制劑給藥之前、同時(shí)或之后的sHASEGP聯(lián)合給藥)而得到增強(qiáng)，其包括例如阿昔單抗(例如REOPRO)、Adalimumabs(例如HUMIRA)、(3-半乳糖苷酶(Agalsidasebetas)(例如FABRAZYME)、Aldesleukins(例如PROLEUKIN)、阿法賽特(Alefacepts)(例如AMEVIVE)、阿侖單抗(Alemtuzumabs)(例如CAMPATH)、Alteplases(例如ACTIVASE)、Alteplases(例如CATHFLOACTIVASE)、阿那白滯素(Anakinras)(例如KINERET)、阿西莫單抗(Arcitumomabs)(例如CEA-Scan)、天冬酰胺酶(例如ELSPAR)、巴利昔單抗(Basiliximabs)(例如SIMULECT)、貝卡普勒明(Becaplermins)(例如REGRANEX)、貝伐單抗(bevaeizumabs)(例如AVASTIN)、A型肉毒毒素(例如BOTOXTM)、B型肉毒毒素(例如MYOBLOC)、CapromabPendetides(例如PROSTASCINT)、西妥昔單抗(Cetuximabs)(例如ERBITUX)、達(dá)利珠單抗(Daclizumabs)(例如ZENAPAX)、a-達(dá)比波廷(Darbepoetinalfas)(例如ARANESP)、白喉毒素-IL-2融合蛋白(Denileukindiftitoxs)(例如ONTAK)、Dornasealfas(例如PULMOZYMETM)、Drotrecoginalfas(例如XIGRIS)、依法利珠(Efalizumabs)(例如RAPTIVATM)、a-依伯汀(Epoetinalfas)(例如EPOGENTM)、依那西普(Etanerc印ts)(例如ENBREL)、非格司亭(Filgrastims)(例如NEUPOGEN)、替依莫單抗(Ibritumomabs/Tiuxetans)(例如ZEVALIN)、ImciromabPentetates(例如MYOSCINT)、因福利美(Infliximabs)(例如REMICADE)、a-2a干擾素(例如ROFERON-A)、復(fù)合干擾素(Interferonalfacon-ls)(例如INFERGEN)、a-n3干擾素(Interferonalfa-n3s)(例如ALFERONN)、(3-la干擾素(Interferonbeta-las)(例如AVONEX,BETASERON)、p-la千擾素(Interferonbeta-las)(例如REB1F)、Y-Ib干擾素(Interfei'ongamma-lbs)(例如ACTIMMUNE)、拉羅尼酶(Laronidases)(例如ALDURAZYME)、99-锝標(biāo)記抗癌單抗(Nofetumomabs)(例如VERLUMA)、奧馬珠單抗(Omalizumabs)(例如XOLAIR)、Oprelvekins(例如NEUMEGA)、帕利珠單抗(Palivizumabs)(例如SYNAGIS)、聚乙二醇化非格司亭(Pegfilgrastims)(例如NEULASTA)、聚乙二醇化a-2a干擾素(Peg-interferonalfa-2as)(例如PEGASYS)、聚乙二醇化a-2b干擾素(Peginterferonalfa-2bs)(例如PEG-INTRON)、拉布立酶(Rasburicases)(例如ELITEK)、瑞替普酶(Reteplases)(例如RETAVASE)、利妥昔單抗(Rituximabs)(例如RITUXAN)、替奈普酶(Tenecteplases)(例如TNKaseTM)、托西莫單抗和碘I-131(TositumomabandIodineI-131s)(例如BEXXAR)、曲妥珠單抗(Trastuzumabs)(例如HERCEPTrN)、尿激酶(Urokinases)(例如ABBOKINASE)。玻璃體出血為了將在施行玻璃體切開術(shù)期間造成視網(wǎng)膜的進(jìn)一步脫離或撕裂的可能性最小化，在美國專利5,292，509(Hageman)中已經(jīng)提出，在除去玻璃體之前，將某些無蛋白酶的糖胺聚糖酶注射入玻璃體，從而造成玻璃體與視網(wǎng)膜的解離或"剝離(disinserted)"。玻璃體的這種剝離或解離的目的是使當(dāng)玻璃體被除去時(shí)視網(wǎng)膜被進(jìn)一步撕裂或脫離的可能性最小化?？梢杂脕韺?shí)現(xiàn)這種玻璃體剝離的特定的無蛋白酶的糖胺聚糖酶的實(shí)例據(jù)稱包括軟骨素酶ABC、軟骨素酶AC、軟骨素酶B、4-硫酸軟骨素酶、6-硫酸軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶和13-葡糖醛酸酶。盡管已經(jīng)知道透明質(zhì)酸酶可以用于各種眼科應(yīng)用，其包括在美國專利5,292,509(Hageman)中描述的玻璃體切除輔助應(yīng)用，但已公開的研究表明透明質(zhì)酸酶本身對于視網(wǎng)膜和/或眼的其它解剖學(xué)結(jié)構(gòu)是有毒性的。參見TheSafetyofIntravitrealHyaluronidase;Gottleib，J.L.;Antoszyk,A.N.,Hatchell，D.L.andSoloupis,P.,InvestOphthalmolVisSci31:11,2345-52(l卿)。而且'使用不純的屠宰場來源的透明質(zhì)酸酶制劑可能引起眼色素層炎或眼部炎癥。因此，由于其增加的效價(jià)、純度和非動(dòng)物的來源，人sHASEGP是優(yōu)選被使用的，而對于動(dòng)物來源來說，在反復(fù)的給藥之后，它會引起免疫原性反應(yīng)和抗體介導(dǎo)的中和作用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以將聚乙二醇化形式的sHASEGP注射入眼睛。此類聚乙二醇化的sHASEGP不會以非常快速的方式從玻璃體清除，而在玻璃體中更長的時(shí)間維持其活性?！┩该髻|(zhì)酸酶制劑的眼科毒性(ophthalmictoxicity)已經(jīng)被其他研究者所證實(shí)，這些研究者已經(jīng)提出此類透明質(zhì)酸酶制劑被用作毒性刺激物，在動(dòng)物毒性模型中在眼中造成實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的新血管形成(參見AnExperimentalModelofPreretinalNeovascularizationintheRabbit;Antoszyk，A.N.，Gottleib,J.L.,Casey,R.C.,Hatchell,D.L.andMachemer，R.,InvestOphthalmolVisSci32:1,46-51(1991))。使用沒有水銀基污染物和牛源或細(xì)菌源污染物的高度純化的sHASEGP對于眼內(nèi)方法是優(yōu)選的。而且，考慮到其無牛病原體的純度和降低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，重組的人sHASEGP相比屠宰場源制劑是優(yōu)選的。最優(yōu)選地，考慮聚乙二醇化的sHASEGP。因此，提供使用人sHASEGP的酶學(xué)方法來治療哺乳動(dòng)物眼的眼疾病。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的sHASEGP被聚乙二醇化，以延長其在玻璃體內(nèi)的居留吋間，并防止在局部被吸收。預(yù)防新血管形成和增加對視網(wǎng)膜具有毒性的材料從玻璃體清除的速度，通過施用一定量的透明質(zhì)酸酶來實(shí)現(xiàn)，所述量的透明質(zhì)酸酶有效地液化接受治療的眼睛的玻璃體液，而不對眼睛產(chǎn)生毒性損害。玻璃狀液的液化增加了玻璃體腔的液體交換的速度。該交換的增加去除了造成眼科損害和視網(wǎng)膜損害的那些物質(zhì)和條件。sHASEGP的整容美容用途已經(jīng)知道，透明質(zhì)酸酶具有將基礎(chǔ)物質(zhì)的粘多糖長鏈解聚化的作用，所述粘多糖長鏈可以保留住結(jié)合水，并且減慢——通過毛細(xì)壓縮——有機(jī)液體的擴(kuò)散，該擴(kuò)散消除代謝廢物。與脂細(xì)胞的脂肪超載相關(guān)的水和廢物的這種保留，構(gòu)成了典型的"豬皮(pigskin)"水腫或"桔皮(orangeped)"水腫。因此，該解聚作用將粘多糖的長鏈切割成較短的鏈，由此消除了結(jié)合水，消除了廢物，恢復(fù)了靜脈和淋巴循環(huán)，局部水腫也從而消失。因此，經(jīng)由皮下給藥的sHASEGP的應(yīng)用，優(yōu)選用于除去所謂的脂肪團(tuán)(cdhilite)的積聚過程中所涉及的糖胺聚糖，和促進(jìn)淋巴流動(dòng)。人sHASEGP優(yōu)選用于處理脂肪團(tuán)，這是因?yàn)槠淠軌蛉コ龅奶前肪厶牵鴽]有屠宰場源的蛋白的促炎成分，而且它是高純度的并且不太可能是免疫原性的。sHASEGP可以通過反復(fù)的皮下注射進(jìn)行給藥、以藥膏或乳液的形式透皮輸送給藥，或通過使用可注射的緩釋制劑進(jìn)行給藥，這樣可以促進(jìn)糖胺聚糖的持續(xù)降解，并防止它們的重新形成。器官移植透明質(zhì)素具有若干生物學(xué)效應(yīng)，它們部分地涉及其分子尺寸(West，D.C.，Kumar,S.Exp.Cell.Res.183,179-196,1989)。器官中的透明質(zhì)素的含量在該器官出現(xiàn)炎癥的不同癥狀下會有所增加。因此，在表征為炎癥性免疫損傷例如牙槽炎(Nettelbladt0etal，AmRevRespDis1989;139:759-762)和心急梗塞(Waldenstrometal,JClinInvest1991;88(5):1622-1628)的不同器官的組織中，已經(jīng)表明透明質(zhì)素的濃度是增加的。其它的實(shí)例是在腎(Ha'lIgrenetal,JExpMed1990a;171:2063-2076;Wellsetal,Transplantation1990;50:240-243)、小腸(Wallanderetal,TransplantInt1993;6:133-137)或心臟(Hallgrenetal,JClinInvest1990b;85:668-673)移植之后的同種異體移植排斥；或者病毒引起的心肌炎癥(Waldenstrdmetal，EurJClinInvest1993;23:277-282)。發(fā)生與器官移植相關(guān)的間質(zhì)水腫是移植手術(shù)領(lǐng)域中嚴(yán)重的問題。多達(dá)25%的移植會腫脹到導(dǎo)致功能暫時(shí)失去的程度。而且，在2-3%的情形中，腫脹導(dǎo)致了腎的破裂，因此導(dǎo)致大出血。sHASEGP可被用來降解器官移植中積聚的糖胺聚糖。這些糖胺聚糖的去除促進(jìn)了水從移植物中去除，并因此促進(jìn)器官行使功能。這樣，500-10,000單位/kg范圍內(nèi)的劑量可被施用，以減少組織間隙壓。糖胺聚糖在腦中的病理性積聚在大量腦脊髓病理狀態(tài)下，透明質(zhì)素水平被提高。在成年人中，腦脊髓透明質(zhì)素的水平在正常情況下小于200嗎/L(Laurentetal,ActaNeurolScand1996Sep;94(3):194-206)。在疾病例如腦膜炎、椎管狹窄、頭部損傷和腦梗塞中，這些水平可以提高到8，000嗎/L以上。因此，sHASEGP的給藥(例如通過將sHASEGP、聚乙二醇化的sHASEGP或超唾液酸化的sHASEGP鞘內(nèi)輸送或全身性注射)可以被用來降解其水平危險(xiǎn)地提高的底物。頭部創(chuàng)傷之后，腦中缺乏有效的淋巴也可導(dǎo)致危及生命的水腫。透明質(zhì)素積聚是HA合成酶介導(dǎo)的合成增加和降解減少的結(jié)果。盡管透明質(zhì)素的積聚最初可以提供有益的效果一一增加受傷組織中的水含量，以幫助白細(xì)胞外滲，但是持續(xù)的積聚可能是致命的。因此，將人sHASEGP施用給遭受頭部創(chuàng)傷的患者，可以去除組織透明質(zhì)素積聚和與它相結(jié)合的水。人sHASEGP可以通過分流管(shunt)進(jìn)行鞘內(nèi)給藥，或者可選地，sHASEGP、聚乙二醇化的sHASEGP或超唾液酸化的sHASEGP(優(yōu)選其人類形式)可以被靜脈內(nèi)給藥，以到達(dá)腦組織。在中風(fēng)中發(fā)生腦缺血和腦再灌注后，透明質(zhì)素含量通常增加，這很大程度上是由于HA合成酶的表達(dá)增加和分解代謝減少。離子泵失效并且血漿泄漏入間隙中，導(dǎo)致流體滯留，如果滯留的流體不能被淋巴系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)厍宄?，將?dǎo)致組織壞死。一些團(tuán)體企圖通過阻斷血管滲透，來防止缺血再灌注之后的間隙流體積聚。然而，一旦流體已經(jīng)外滲，阻止血管滲透性則可能阻止了水腫的消解，并使病癥惡化。如上面提到的，人sHASEGP可鞘內(nèi)給藥(例如通過分流管)，或者sHASEGP、聚乙二醇化的sHASEGP或超唾液酸化的sHASEGP(優(yōu)選人sHASEGP)可以被靜脈內(nèi)給藥，以到達(dá)腦組織。人sHASEGP也可以用于治療與腦瘤相關(guān)的水腫，特別是與多形成膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)的水腫。與腦瘤相關(guān)的水腫由透明質(zhì)素在腫瘤附近的非癌癥部分的腦中積聚所產(chǎn)生。將透明質(zhì)酸酶投藥于透明質(zhì)素積聚的位置(例如通過靜脈注射或通過分流管)，通過降解這些位置過量的透明質(zhì)素可以緩解與此種惡性相關(guān)的水腫。因此，透明質(zhì)酸酶能成功地治療腦瘤，不但減少了腫瘤塊，抑制腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移，而且也可用于緩解與該惡性相關(guān)的水腫。可以用與施用牛睪丸透明質(zhì)酸酶治療水腫相類似的方式(參見例如SaEarpArq.Braz.Med.44:217-20)，將人sHASEGP給藥以治療水腫。不被限于具體的應(yīng)用或作用機(jī)制，sHASEGP可通過下述的一項(xiàng)或多項(xiàng)潛在地緩解缺血或出血中風(fēng)和/或其它的CNS損傷病癥(i)通過減少顱內(nèi)壓而增加受損組織的氧合作用；(ii)促進(jìn)凝塊溶解和毒性代謝重吸收；(iii)抑制白血球外滲入梗塞或出血區(qū)域(例如通過除去為CD44受體的透明質(zhì)素)；(iv)促進(jìn)受損組織的神經(jīng)再生；或(V)提高腦血管發(fā)生。心血管疾病中的糖胺聚糖積聚的處理己經(jīng)顯示，在動(dòng)物模型中，在實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞之后施用透明質(zhì)酸酶可以減少梗塞大小(Maclean，et.aScience1976Oct8;194(4261):199-200)。被提出的牛透明質(zhì)酸酶減少動(dòng)物的梗塞大小的機(jī)制是通過缺血再灌注之后發(fā)生的透明質(zhì)酸積聚的減少。梗塞大小的減小被認(rèn)為是由淋巴排泄Gymphdrainage)增加和組織氧合作用增加和心肌水含量減少引起的。盡管可以在動(dòng)物模型中梗塞大小的減小可以獲得，但是該好處并沒有在更大的針對人的臨床研究中得以實(shí)現(xiàn)。牛睪丸透明質(zhì)酸酶在動(dòng)物和人中具有非常短的血清半衰期，大約3分鐘(Wolf,et.al.,JPharmacolExpTher1982Aug;222(2):331-7)。該短暫的半衰期是由于末端甘露糖殘基容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清道夫受體識別的緣故。盡管小的動(dòng)物由于其較小的血管床的原因可能從透明質(zhì)酸酶受益，但也需要具有更長的半衰期的酶。由于不存在識別唾液酸化作用的清道夫受體，所以超唾液酸化的sHASEGP具有更好的藥物動(dòng)力學(xué)特性。在100-200，000單位/kg范圍內(nèi)的劑量的超唾液酸化sHASEGP可以被用于幫助分解缺血再灌注后過量的透明質(zhì)素，并減少梗塞大小。超唾液酸化sHASEGP也可以被用來限制動(dòng)脈硬化的冠脈斑塊(coronaryplaques)。此種斑塊積聚糖胺聚糖并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞粘附。Kolodgieetal,ArteriosclerThrombVaseBiol.2002Oct1;22(10):1642-8。超唾液酸化sHASEGP的給藥可以被用來減少斑塊形成?？紤]以100-100,000U/kg的劑量反復(fù)地將透明質(zhì)酸酶投藥，利用具有低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)和增加的半衰期的人重組蛋白的需求將導(dǎo)致斑塊明顯減少。外周組織壞死的治療組織壞死發(fā)生在因靜脈機(jī)能不全而引起的許多疾病中。缺少足夠的氧合是組織再生的主要障礙之一。已經(jīng)證明，動(dòng)脈內(nèi)透明質(zhì)酸酶治療顯著地改善患有外周動(dòng)脈阻塞性疾病的患者的臨床現(xiàn)象(EWeret.al，Lancet(1980)648-649)。sHASEGP可以以10-200,000單位的劑量動(dòng)脈內(nèi)注射，一周3-5次。麻醉劑和其它藥理劑向哺乳動(dòng)物組織的輸送的增強(qiáng)屠宰場來源的透明質(zhì)酸酶通常在眼手術(shù)之前的局部麻醉中被用來進(jìn)行球周阻斷(peribulbarblock)。該酶的存在避免了對其它阻斷的需求并加速了運(yùn)動(dòng)不能(眼睛運(yùn)動(dòng)的喪失)的發(fā)作。球周和特農(nóng)下阻斷是透明質(zhì)酸酶在眼科手術(shù)中最常見的應(yīng)用。自從WydaseTM停產(chǎn)以來，復(fù)視和下垂增加的報(bào)告就已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)與球周阻斷有關(guān)(BrownetalJCataractRefractSurg1999;25:1245-9)。由于惠氏公司(Wyeth，s)停產(chǎn)Wydase,牛睪丸來源的透明質(zhì)酸酶材料現(xiàn)在由復(fù)合藥劑供應(yīng)。然而，對于使用臨時(shí)的復(fù)合無菌產(chǎn)品，存在著若干顧慮。http:〃www.ashp.org/shortage/hyaluronidase.cfmcfid=11944667&CFToken=9426953-re併ref。復(fù)合制劑并不是FDA批準(zhǔn)的產(chǎn)品。同樣地，F(xiàn)DA也沒有對該制造方法的質(zhì)量和一致性進(jìn)行控制。10-500單位的sHASEGP可以直接與5ml的2。/。利多卡因(Xylocaine)、5ml的0.5。/。布比卡因(Marcaine)以及可任選的1:200,000的腎上腺素相混合。sHASEGP可被用來增加運(yùn)動(dòng)不能的發(fā)作并除去對其它的阻斷的需要。sHASEGP對于眼瞼整容和臉部提整(facelift)中的整容手術(shù)時(shí)的運(yùn)動(dòng)不能也是理想的。sHASEGP也可以在此種手術(shù)程序之后被使用，以擴(kuò)散抗炎癥劑和減少組織腫脹。sHASEGP也可以與緩沖溶液例如碳酸氫鹽相混合，以預(yù)防在注射程序中的不適。sHASEGP也可以與用于裂傷的麻醉劑相混合，以減少注射所需要的材料的總體積并減少因組織腫脹引起的疼痛。使用sHASEGP促進(jìn)藥理劑和其它藥劑的分散如本文所述，本發(fā)明的組合物和方法可被用來促進(jìn)或加強(qiáng)將麻醉劑和其它藥理劑(例如，本文涉及的多種類別的藥學(xué)上有效的藥劑的成員)輸送到任何種類的哺乳動(dòng)物的活體中。就此方面而言，sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可被用來幫助擴(kuò)散，并且因此促進(jìn)小分子藥理劑以及較大分子藥理劑的輸送，所述小分子藥理劑例如示例的麻醉劑、抗感染劑和消炎藥，所述較大分子藥理劑例如蛋白質(zhì)(包括例如酶、單克隆抗體和類似物)、核酸(包括脫氧核糖核酸(例如基因和反義分子)和核糖核酸(包括RNA千擾分子(RNAi)和類似物))和可包括這些成分的組合的大分子組合物(包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類和脂基分子及類似物的組合)。作為舉例說明而不是作為限制，當(dāng)間隙區(qū)在之前或同時(shí)暴露于本文描述和說明的sHASEGP，直徑范圍在從小于大約10nm到大約500nm，特別是從大約20到200nm的分子和大分子復(fù)合體，很可能在通過間隙區(qū)的輸送中表現(xiàn)出顯著的提高。不被限定于作用機(jī)制的特定理論，相信本發(fā)明的sHASEGP主要通過水解包圍哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞外基質(zhì)內(nèi)的糖胺聚糖以生成孔型通路或通道來行使其功能，所述通路或通道有助于暴露的胞外基質(zhì)內(nèi)的分子的擴(kuò)散或其它運(yùn)動(dòng)；并且進(jìn)一步，這樣部分的胞外基質(zhì)的滲透化作用對那些沒有大到被胞外基質(zhì)內(nèi)其它大分子成分——例如膠原蛋白的拱形網(wǎng)絡(luò)——阻礙的分子的擴(kuò)散或"散布"具有最大的效果。在特定組織環(huán)境中給定的sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可得到的散布效果(spreadingeffect)的程度，可通過評估測試sHASEGP或其結(jié)構(gòu)域?qū)y試組織中不同大小的可檢測測試分子(例如熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記的珠子)的擴(kuò)散的影響容易地進(jìn)行確定，如本文闡述，該評估是在使用sHASEGP或其結(jié)構(gòu)域在一定的時(shí)間和濃度下進(jìn)行或不進(jìn)行預(yù)處理或同時(shí)處理的情況下進(jìn)行的。作為舉例說明，在將重組rHuPH20皮下注射入鼠的側(cè)部皮膚的情況下，熒光標(biāo)記珠子的擴(kuò)散測試(如本文示例的)表明，對于直徑小于大約500nm的珠子，對擴(kuò)散的影響是最大的。進(jìn)一步相信更大的大分子(以500nm或更大的珠子為例)在擴(kuò)散中不但被它們較大的尺寸所阻礙，而且被與胞外基質(zhì)中相對更加開放的其它網(wǎng)絡(luò)的潛在相互作用所阻礙，所述網(wǎng)絡(luò)例如由間質(zhì)膠原蛋白條帶形成的網(wǎng)絡(luò)。另外，與所述的動(dòng)物源透明質(zhì)酸酶不同，本發(fā)明當(dāng)前優(yōu)選的sHASEGP不包含促進(jìn)外滲的試劑或污染劑——例如膠原蛋白酶(其可開放更大的通道)——或者可激發(fā)免疫反應(yīng)的其它污染物。在需要更大的孔或通道的具體的應(yīng)用中，sHASEGP或其可溶性人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域可以優(yōu)選地與其它基質(zhì)降解酶一一例如有助于更大尺寸的大分子復(fù)合體或細(xì)胞的進(jìn)一步散布的膠原蛋白酶一一的相對純的形式聯(lián)合。對于大多數(shù)應(yīng)用，使用可促進(jìn)小于約500nm大小的大分子，更優(yōu)選的小于約200nm大小的大分子的通透性的試劑是非常有利的，理由是所述試劑基本上不促進(jìn)經(jīng)過處理的組織內(nèi)的細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，但是其可以促進(jìn)較小的復(fù)合物和試劑通過。如本文描述和說明的，sHASEGP可被用來增強(qiáng)將多種其它藥理劑和/或其它藥劑輸送到人體內(nèi)的組織(包括例如眼后部的典型的很難觸及的組織)。不希望被理論束縛，相信sHASEGP可通過潛在增強(qiáng)藥劑在組織內(nèi)的擴(kuò)散或滲透，和/或通過增加組織間隙的總體流體流動(dòng)進(jìn)而增強(qiáng)的對流運(yùn)輸，增強(qiáng)許多此類藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)和/或藥效動(dòng)力學(xué)特性。以舉例說明為目的(而不是限制)，可以與本發(fā)明的sHASEGP相聯(lián)合(例如通過與一種或多種sHASEGP共同配制而聯(lián)合，或者通過與一種或多種sHASEGP共同給藥(其可在施用藥劑之前、同時(shí)或之后給藥)而聯(lián)合)的用于治療影響眼睛的各種疾病的藥理劑的實(shí)例包括，例如血管發(fā)生抑制劑(例如制管張素、乙酸阿奈可他(anecortaveacetate)(例如RETAANETM)、內(nèi)皮抑制素、血小板反應(yīng)蛋白(例如血小板反應(yīng)蛋白-l和血小板反應(yīng)蛋白-2)、抗血管生成抗體和其它抗血管生成劑或血管靶向劑(VTA)(例如抗VEGF抗體例如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTINTM)、羧基酰胺三唑(CAI)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、OLTIPRAZ(5-[2-吡嗪基]-4-甲基-l，2-3-硫酮)、SU-5416、TNP-470、沙利度胺(thalidomide))和類似物)；抗白內(nèi)障和抗糖尿病視網(wǎng)膜病物質(zhì)(例如醛糖還原酶抑制劑(ARI)諸如托瑞司他(tolrestat)(例如ALREDASE)和唑泊司他(zopolrestat)(例如ALOND)、賴諾普利(lisinopril)、依拉普利(enalapril)、statil和硫醇交聯(lián)物質(zhì)以及類似物)；抗炎劑(包括如本文描述的和本領(lǐng)域的甾體抗炎劑和非甾體抗炎劑)；抗感染劑(包括下面描述的化合物，以及許多其眼科制品(opthalmicpreparation),例如BLEPHAMIDETM、CILOXANTM、POLYTRIM、QUIXIN、TOBRADEXTM、VIGAMOX、ZYMAR);卩-腎上腺素能阻斷劑(例如倍他洛爾(betaxolol)(BETOPTICSTM)、噻嗎洛爾(timolol)(例如BETIMOLtm和TIMOPTIC)和其組合(例如噻嗎洛爾和碳酸酐酶抑制劑諸如杜塞酰胺(dorzolainide)(例如COSOPT);碳酸酐酶抑制劑(例如乙酰唑胺、布林佐胺(brinzolamide)(例如AZOPTTM)、雙氯酚酰胺、杜塞酰胺(dorzolamide)(例如TRUSOPTTM和與其它藥劑的組合，例如COSOP丁tm)、醋甲唑胺和類似物)；擴(kuò)瞳藥(例如硫酸阿托品、環(huán)噴托酯、后馬托品、東莨菪堿、托吡卡胺、尤卡托品和羥基安菲他命以及類似物)；光動(dòng)力學(xué)療法藥劑(例如維替泊芬(verteporfin)(例如VISUDYNE);前列腺素類似物(例如比馬前列素(bimatoprost)(例如LUMIGANTM)、拉坦前列素(Latanoprost)(例如XALATAN)和曲伏前列腺素(travoprost)(例如TRAVATAN);擬交感神經(jīng)劑(例如溴莫尼定(bimatoprost)(例如ALPHAGANTMP);以及其組合(例如p-腎上腺素能阻斷劑和碳酸酐酶抑制劑的組合，如在COSOPT中)；和大量其它類的藥劑，例如如下面或本文其它地方描述的和/或本領(lǐng)域已知的或新開發(fā)的抗感染劑和各種其它生理調(diào)節(jié)劑?？膳c本發(fā)明sHASEGP聯(lián)合的大量其它藥理劑(例如通過與一種或多種sHASEGP聯(lián)合配制而聯(lián)合，或者通過與一種或多種sHASEGP聯(lián)合給藥(其可在施用藥劑之前、同時(shí)或之后給藥)而聯(lián)合)，可被用來治療影響眼或影響機(jī)體的其它多種組織的各種疾病。以舉例說明為目的(而不是限制)，這類藥劑包括，例如麻醉劑；抗代謝藥、抗瘤劑和其它抗癌藥；抗病毒藥；抗感染劑，其包括抗菌藥和其它抗生素、抗真菌劑和其它抗感染劑；免疫調(diào)節(jié)劑；甾體抗炎劑和非甾體抗炎劑；卩-阻斷劑；擬交感神經(jīng)劑；Ducosanoid、前列腺素和前列腺素類似物；縮瞳藥、類乙酰膽堿功能藥和抗膽堿酯酶；抗過敏劑和解充血藥；激素劑；生長因子；其它合成和生物學(xué)來源藥劑(biologicallyderivedagent);及它們的組合。具有這類特性的藥劑——其可在新型藥理學(xué)制劑的配方中和/或現(xiàn)有藥理學(xué)試劑的重新配方中與sHASEGP相結(jié)合——的一些說明性實(shí)例，包括上面和下面描述的多類藥劑(以及被常規(guī)用作診斷、預(yù)防或治療各種疾病的其它已知的和新穎的藥劑)麻醉劑，特別是非吸入局部麻醉劑(例如氨布卡因(ambucaines);阿莫卡因(amoxecaines);阿米f各卡因(amylocaines);P可托卡因(aptocaines);阿替卡因(articaines);奧布卡因(benoxinates);苯甲醇；苯佐卡因(benzocaines);貝托卡因(betoxycaines);珍尼和P酉旨(biphenamines);丁吖卡因(bucricaines);布美卡因(bumecaines);布比卡因(bupivacaines);布他卡因(butacaines);氨苯丁菌旨(butambens);布坦卡因(butanilicaines);卡比嘩卡因(carbizocaines);氯普魯卡因(chloroprocaine);氯丁卡因(clibucaines);氯達(dá)卡因(clodacaines);可卡因(cocaines);地昔卡因(dexivacaines);二月安卡因(diamocaines);地布卡因(dibucaines);達(dá)克羅寧(dyclonines);依魯卡因(elucaines);依替卡因(etidocaines);尤普羅辛(euprocins);苯氧卡因(fexicaines);福莫卡因(fomocaines);heptacaines;海克卡因(hexylcaines);羥普魯卡因(hydroxyprocaines);羥丁卡因(hydroxytetracaines);氨苯異丁酯(isobutambens);凱托卡因(ketocaines);亮氨卡因(leucinocaines);禾!j多卡因(lidocaines);甲哌卡因(mepivacaines);美普卡因(meprylcaines);octocaines(奧他卡因)；奧索卡因(orthocaines);奧昔卡因(oxethacaines);奧布卡因(oxybuprocaines);非那卡因(phenacaines);哌諾卡因(pinolcaines);哌羅卡因(piperocaines);匹多卡因(piridocaines);聚多卡醇(polidocanols):普莫卡因(pramocaines);丙胺卡因(prilocaines);普魯卡因(procaines);丙泮卡因(propanocaines);丙哌卡因(propipocaines);丙氧卡因(propoxycaines);丙美卡因(proxymetacaines);B比咯卡因(pyrrocaines);夸4也卡因(quatacaines);奎尼卡因(quinisocaines);禾U索卡因(risocaines);羅多卡因(rodocaines);羅哌卡因(ropivacaines);7K楊醇；suicaines;丁卡因(tetracaines);曲噴卡因(trapencaines);三甲卡因(trimecaines))和類似物；以及各種其它非吸入麻醉劑(例如阿法沙龍(alfaxalones);阿莫拉酮(amolanones);乙苯"惡啶(etoxadrols);芬太尼(fentanyls);氯胺酮(ketamines);左P惡屈爾(levoxadrols);美西妥拉(methiturals);美索比妥(methohexitals);咪達(dá)唑侖(midazolams);米那索龍(minaxolones);丙泮尼i也(propanidids);丙泊酉旨(propoxates);丙嗎卡因(pramoxines);丙泊酚(propofols);瑞芬太尼(remifentanyls);舒芬太尼(sufentanyls);替來他明(tiktamines);佐拉敏(zolamine)和類似物)；抗代謝藥(例如葉酸類似物(諸如二甲葉酸(denopterins)、乙基去氮氨蝶呤(依達(dá)曲沙，edatrexates)、甲氨蝶呤(methotrexates)、卩比曲克辛(piritrexims)、蝶酰三谷氨酸(蝶羅呤，pteropterins)、雷替曲塞(Tomudex)、三甲氧蝶呤(三甲曲沙，trimetrexates))、嘌呤類似物(諸如克拉立濱(cladribines)、氟達(dá)拉濱(fludarabines)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurines)、硫唑嘌呤胺(thiamiprines)、thiaguanines)和嘧啶類似物(諸如環(huán)胞啶(安西他濱，ancitabines)、阿扎胞苷(azacitidines)、6-氮尿苷(6-azauridines)、卡莫氟(carmofurs)、阿糖胞苷(cytarabines)、去氧氟尿苷(doxifluridines)、乙嘧替氟(emitefors)、山崳酰阿糖胞苷(依諾他濱，enocitabines)、氟尿苷(floxuridines)、氟尿嘧啶(fluorouracils)、雙氟脫氧胞苷(吉西他濱，gemcitabines)、替加氟(tegafors))和類似物；抗瘤劑(例如阿克拉霉素(aclacinomycins)、放線菌素(actinomycins)、阿霉素(adriamycins)、安西他濱(ancitabines)、氨曲霉素(anthramycins)、阿扎胞苷(azacitidines)、氮絲氨酸(azaserines)、6-氮尿苷(6-azauridines)、比生群(雙蒽生，bisantrenes)、博來霉素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycins)、卡莫氟(carmofurs)、卡莫司汀(carmustines)、卡柔比星(carubicins)、嗜癌素(carzinophiins)、色霉素(chromomycins)、川頁鉬(cisplatins)、克拉立濱(cladribines)、阿糖胞苷(cytarabines)、放線菌素D(dactinomycins)、柔紅霉素(daunorubicins)、二甲葉酸(denopterins)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸(6-diazo-5陽oxo-L-norleucines)、去氧氟尿苷(doxifluridines)、多柔比星(doxorubicins)、依達(dá)曲沙(edatrexates)、乙嘧替氟(emiteftirs)、依諾他濱(enocitabines)、fepirubicins、氟達(dá)拉濱(fludarabines)、氟尿嘧啶(fluorouracils)、吉西他濱(gemcitabines)、伊達(dá)比星(idarubicins)、loxuridines、美諾立爾(menogarils)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurines)、甲氨蝶呤(methotrexates)、光輝霉素(mithramycins)、絲裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacids)、諾拉霉素(nogalamycins)、橄欖霉素(olivomycines)、培洛霉素(peplomycins)、吡柔比星(pirarubicins)、吡曲克辛(piritrexims)、普卡霉素(plicamycins)、泊非霉素(porfiromycins)、蝶羅呤(pteropterins)、嘌羅霉素(puromycins)、維生素A酸(retinoicacids)、鏈黑霉素(streptonigrins)、鏈脲菌素(streptozocins)、呋喃脲嘧啶(tagaflirs)、他莫昔芬(tamoxifens)、硫唑嘌呤胺(thiamiprines)、硫鳥嘌吟(thioguanines)、曲安西龍(triamcinolones)、三甲曲沙(trimetrexates)、殺結(jié)核菌素(tubercidins)、長春堿(vinblastines)、長春新堿(vincristines)、凈司他丁(zinostatins)、佐柔比星(zorubicin)和類似物)(也參見本文描述的其它示例性抗癌藥)；抗病毒藥(例如阿巴卡韋(abacavirs)(例如ZIAGEN)、阿昔洛韋(acyclovirs)(例如ZOVIRAX)、金剛烷胺和金剛乙胺(amantadines禾Qrimantadines)(例如SYMMETREL)、氨普那韋(amprenavirs)(例如AGENERASE)、西多福韋(cidofovirs)(例如VISTIDE)、地拉韋啶(delavirdines)(例如RESCRIPTOR)、雙脫氧胞甙(didanosines)(例如VIDEX)、依法韋侖(efavirenz)(例如SUSTIVA)、泛昔洛韋(famciclovirs)(例如FAMVIR)、福米韋生(fomivirsens)(例如VITRAVENE)、膦甲酸(foscarnets)(例如FOSCAVIRTM)、更昔洛韋(ganciclovirs)(例如CYTOVENEtm)和纈更昔洛韋(valganciclovirs)(例如VALCYTE)、碘苷(idoxuridines)(例如HERPLEXTM)、茚地那韋(indinavirs)(例如CRJXIVAN)、干擾素(interferons)(例如ALFERONN、INTRONA、PEGASYS、PEG-INTRONTM、ROFERON-A以及干擾素和其它抗病毒藥例如ROBETRON和PEGASYS/COPEGUS)、拉米夫定(kmivudines)(例如3TC丁m禾BEPIVIRJm)以及拉米夫定和齊多夫定(zidovudines)的組合(例如COMBIVIRTM)、單克隆抗體例如帕利珠單抗(Palivizumabs)(諸如SYNAGIS)、奈非那韋(nelfmavirs)(例如VIRACEPT)、奈韋拉平(nevirapines)(例如VIRAMUNE)、奧塞米韋(oseltamivirs)(TAMIFLU)、噴昔洛韋(penciclovirs)(例如DENAVIR)、普來可3P利(pleconarils)、利巴偉林(ribavirins)(例如COPEGUStm和REBETOL)、金剛乙胺(rimantadines)(例如FLUMADINE)、利托那韋(ritonavirs)(NORVIRTM)、沙奎那韋(saquinavirs)(例如INVERASE)、司他夫定(stavudines)(d4T，例如ZERIT)、伐昔洛韋(valacyclovirs)(例如VALTREX)、阿糖腺苷(vidarabines)(例如VIRA-A)、扎西他濱(zalcitabines)(例如HWID)、扎那米韋(zanamivirs)(RELENZATM)、齊多夫定(zidovudines)(例如AZT，RETROVIR)以及類似物)；抗菌藥和其它抗生素包括，例如氨基苷類抗生素(Aminoglycosides);酰胺醇(Amphenicols);袢霉素(Ansamycins);碳頭孢烯(Carbacephems);碳青霉烯(Carbapenems);頭孢菌素或頭孢烯(Cephalosporins或Cephems);頭霉素(Cephamycins);棒垸(克拉維垸，Clavams);環(huán)式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮內(nèi)酯類(Ketolides);林可胺類藥物(Lincosamides);大環(huán)內(nèi)酯類(Maerolides);單環(huán)內(nèi)酰胺(Monobactams);硝基呋喃(Nitroftirans);氧頭孢烯(Oxacephems);^惡唑烷酮(Oxazolidinones);青霉烯(Penems)、硫霉素(thienamycins)和混雜的P-內(nèi)酰胺；青霉素(Penicillins);多肽抗生素；喹諾酮；氨磺酰；砜；四環(huán)素(Tetmcyclines);以及下面提供了其示例性成員的其它抗生素(和在本領(lǐng)域已知或新開發(fā)的其它抗生素)氨基苷類抗生素(Aminoglycosides)(例如阿米卡星(amikacins)、阿拉伯霉素(apramycins)、阿貝卡星(arbekacins)、班貝霉素(bambermycins)、丁月安菌素(butirosins)、地貝卡星(dibekacins)、雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycins)、福提霉素(fortimicins)、慶大霉素(gentamicins)、異巾白米星(isepamicins)、卡那霉素(kanamycins)、小諾米星(micronomicins)、新霉素(neomycins)、~1—^烯酸茅萬霉素(neomycinundecylenates)、奈替米星(netilmicins)、巴龍霉素(paromomycins)、卞亥糖霉素(ribostamycins)、西索米星(sisomicins)、大觀霉素(spectinomycins)、鏈霉素(streptomycins)、妥布霉素(tobramycins)、丙大觀霉素(trospectomycins)以及類似抗生素)；酰胺醇(amphenicol)(例如疊氮氯霉素(azidamfenicols)、氯霉素(chloramphenicols)、氟苯尼考(florfenicols)、甲砜霉素(thiamphenicols)和類似物)；安沙霉素類(ansamycins)(例如利福米特(rifamides)、利福平(rifampins)或利福平(rifampicins)(諸如RIFADIN、RIFADINIVtm以及包括利福平的組合，例如利福平/異煙肼(例如RIFAMATETM)和利福平/異煙肼/吡嗪酰胺(例如RIFATER)、利福霉素(rifamycins)、利福噴汀(rifapentines)、利福昔明(rifaximins)(例如XIFAXAM)以及類似物)；碳頭孢烯類(carbacephems)(例如氯碳頭孢(loracarbefs)、3-氯-l-碳頭孢烯、3-硫代碳頭孢烯、美國公開的專利申請第20050004095號描述的碳頭孢烯以及類似物)；碳青霉烯類(carbapenems)(例如比阿培南(biapenems)、亞胺培南(imipenems)、美羅培南(meropenems)、帕尼培南(panipenems)以及類似物)；頭孢菌素(Cephalosporins)或頭孢烷(cephams)(例如頭孢克洛(cefaclors)(例如CECLORtm)、頭孢羥氨節(jié)(cefadroxils)、頭孢孟多(cefamandoles)、頭孢曲秦(cefatrizines)、頭孢西酮(cefazedones)、頭孢唑林(cefazolins)(例如ANCEF)、頭孢卡平酉旨(cefeapenepivoxils)、頭孢利定(cefelidins)、頭孢地尼(cefdinirs)、頭孢托侖(cefditorens)、頭孢吡月虧(cefepimes)(例如MAXIPME)、頭孢他美(cefetamets)、頭孢克月虧(cefi'ximes)、頭孢甲月虧(cefmenoximes)、頭孢美唑(cefmetazoles)、頭孢地秦(cefodizimes)、頭孢尼西(cefonicids)、頭孢哌酮(cefoperazones)、頭孢雷特(ceforanides)、頭孢噻月虧(cefotaximes)、頭孢替安(cefotiams)、頭孢替坦(cefotetans)、頭孢西丁(cefoxitim)、頭孢唑蘭(cefozoprans)、頭孢咪唑(cefpimizoles)、頭孢匹胺(ce^piramides)、頭孢匹羅(cefpiromes)、頭孢泊月虧酉旨(cefpodoximeproxetils)、頭f包丙烯(cefprozils)、頭孢沙定(cefroxadines)、頭孢磺啶(cefsulodins)、頭孢他啶(ceftazidimes)(例如FORTAZ)、頭孢特侖(cefterams)、頭孢替唑(ceftezoles)、頭孢布烯(ceftibutens)、頭孢唑肟(ceftizoximes)、頭孢曲松(ceftriaxones)(例如ROCEPHIN)、頭孢呋辛(cefuroximes)(例如ZINACEF)、頭孢唑南(cefhzonams)、頭孢賽曲(cephacetriles)、頭孢氨芐(cephalexim)、頭孢來星(cephaloglycins)、頭孢噻啶(cephaloridines)、頭孢菌素、頭孢噻酚(cephalothins)、頭孢匹林(cephapirins)、頭孢拉定(cephradines)、pivcefalexins以及類似物)；頭霉素(Cephamycins)(例如頭孢拉宗(cefbuperazones)、頭孢美唑(cefinetazoles)、頭孢米諾(cefininoxes)、頭孢替坦(cefotetans)、頭孢西丁(cefoxitins)(例如MEFOXIN)以及類似物)；棒烷(克拉維烷，Clavams)(例如棒酸(克拉維酸，clavulinicacid)或棒酸酉旨(克拉維酸酯，clavulanates)、2-和3-苯基棒烷以及包括這些藥劑的組合，例如阿莫西林/棒酸酯(amoxicillin/clavulanates)(例如AUGMENTIN)和替卡西林/棒酸酯(ticarcillin/clavulanates)(例如TIMENTIN)以及類似物)；環(huán)式脂酰肽(cycliclipopeptides)(例如達(dá)托霉(daptomycins)(例如CUBICIN);二氨基嘧啶，例如2,4-二氨基嘧啶(諸如溴莫普林(brodimoprims)、四氧普林(tetroxoprims)、甲氧節(jié)淀(trimethoprims)以及類似物)；酮內(nèi)酯類(Ketolides)(例如替利霉素(telithromycins)(諸如KETEKTM)和橋式二環(huán)酮內(nèi)酯類(例如EnantaEP-013420和6-11副環(huán)(bycyclic)酮內(nèi)酯類，如在美國公開專利申請20040157787中所述)以及類似物)；林可胺類藥物(Lincosamides)(例如克林霉素(clindamycins)、林可霉素(lincomycins)以及類似物)；大環(huán)內(nèi)酯類(Macrolides)(例如阿奇霉素(azithromycins)(諸如ZITHROMAXTM)、卡波霉素(carbomycins)、克拉霉素(clarithromycins)、地紅霉素(dirithromycins)、紅霉素(erythromycins)、醋硬月旨紅霉素(erythromycinacistrates)、依托紅霉素(erythromycinestolates)、葡庚糖酸紅霉素(erythromycinglucoheptonates)、乳糖酸紅霉素(erythromycinlactobionates)、司丙紅霉素(erythromycinpropionates)、硬月旨酸紅霉素(erythromycinstearates)、交沙霉素(josamycins)、柱晶白霉素(leucomycins)、麥迪霉素(midecamycins)、美歐卡霉素(miokamycins)、竹桃霉素(oleandomycins)、普禾U霉素(primycins)、羅他霉素(rokitamycins)、羅沙米星(玫瑰霉素，rosaramicins)、羅紅霉素(roxithromycins)、螺旋霉素(spiramycins)、醋竹桃霉素(troleandomycins)和類似物)；單環(huán)內(nèi)酰胺(Monobactams)(例如氨曲南(aztreonams)(諸如AZACTAMTM)、卡戸莫南(carumonams)、替吉莫南(tigemonams)禾卩類4以物)；硝基呋喃(例如呋喃他酮(foraltadones)、呋唑氯銨(fiirazoliumchlorides)、硝呋拉定(niforadenes)、硝呋太爾(ni化ratels)、硝呋復(fù)林(niftirfolines)、硝呋吡醇(niforpirinols)、硝呋拉嗪(niforprazines)、石肖呋妥因醇(nifurtoinols)、呋喃妥因(nitroftirantoins)和類似物)；氧頭孢烯類(Oxacephems)(例如氟氧頭孢(flomoxefs)、拉氧頭孢(latamoxefs)或者拉氧頭孢(moxalactams)(諸如MOXAMTM)和類似物)；p惡唑烷酮(Oxazolidinones)(例如利奈唑胺(linezolids)(諸如ZYVOX)、羥哌p惡酮(eperezolids)和類似物)；青霉烯(Penems)、硫霉素(thienamycins)和混雜的P-內(nèi)酰胺(miscellaneousbeta-lactams)(例如厄他培南(ertapenems)(諸如INVANZTM)、亞胺培南(imipenems)(諸如具有西司他丁(Cilastatin)，如在PRIMAXINtm中)、美羅培南(meropenems)(諸如MERREMTM)和類似物)；青霉素(例如甲亞胺青霉素(amdinocimns)、氮芐脒青霉素雙酯(amdinocillinpivoxils)、阿莫西林(amoxicillins)、氨芐西林(ampicillins)(包括它們的組合(諸如含有subactams,如在UNASYNtm中))、阿帕西林(apalcillins)、阿撲西林(aspoxicillins)、阿度西林(azidocillins)、阿洛西林(azlocillins)、巴氨西林(bacampicillins)、節(jié)基青霉素酸(benzylpenicilinicacids)、節(jié)基青霉素鈉(benzylpenicillinsodiums)、羧節(jié)西林(carbenicillins)、卡茚西林(carindacillins)、氯甲西林(clometocillins)、氯唑西林(cloxacillins)、coamoxiclavs、環(huán)己西林(cyclacillins)、雙氯西林(dicloxacillins)、依匹西林(epicilUns)、芬貝西林(fenbenicillins)、氟氯西林(floxacillins)、海他西林(hetacillins)、侖氮西林(lenampicillins)、美坦西林(metampicillins)、甲氧西林鈉(methicillinsodiums)、美洛西林(mezlocillins)、萘夫西林(nafcillins)、苯唑西林(oxacillins)、培那西林(penamecillins)、氫石典酸噴沙西林(penethamatehydriodides)、苯明青霉素G(penicillinGbenethamines)、節(jié)星青霉素G(penicillinGbenzathines)(諸如BICILLINL-A)、青霉素G二苯甲胺鹽(penicillinGbenzhydrylamines)、青霉素G牽丐(penicillinGcalciums)、哈胺青霉素G(penicillinGhydrabamines)、青霉素G鉀(penicillinGpotassiums)、普魯卡因青霉素G(penicillinGprocaines)、青霉素N(penicillinN)、青霉素O(penicillinO)、青霉素V(penicillinV)、芐星青霉素V(penicillinVbenzathines)、哈胺青霉素V(penicillinVhydrabamines)、青哌環(huán)素(penimepicyclines)、非奈西林鉀(phenethicillinpotassiums)、哌拉西林(pipemcillins)(包括它們的組合(例如含有P-內(nèi)酰胺酶抑制劑例如tazobactam,如在ZOSYNtm中))、匹氨西林(pivampicillins)、丙匹西林(propicillins)、喹那西林(quinacillins)、磺節(jié)西林(sulbenicillins)、舒他西林(sultamicillins)、酞氨西林(talampicillins)、他唑西林(tazocillins)、替莫西林(temocillins)、替卡西林(ticarcillins)(諸如含有克拉維酸酯(clavulanates)，如在TIMENTINTM中)和類似物)；多肽抗生素(例如安福霉素(amphomycins)、桿菌肽(bacitracins)、巻曲霉素(capreomycins)、粘菌素(colistimethates)(諸如COLI-MYCINM)、粘桿菌素(colistins)、持久殺菌素(enduracidins)、恩維霉素(enviomycins)、夫沙芬凈(fusafungines)、短桿菌月太(gramicidins)、米卡霉素(mikamycins)、多粘菌素(polymyxins)、普那霉素(pristinamycins)(以及普那霉素衍生物例如奎奴普丁(quinupristins)和達(dá)福普汀(dalfopristins)(諸如SYNERCID))、利托菌素(ristocetins)、替考拉寧(teicoplanins)、硫鏈絲菌肽(thiostreptons)、結(jié)核放線菌素(tuberactinomycins)、短桿菌酪肽(tyrocidines)、短桿菌素(tyrothricins)、萬古霉素(vancomycins)、紫霉素(viomycins)、維吉霉素(virginiamycins)、桿菌肽鋅(zincbacitracins)和類似物)；喹諾酮(包括氟喹諾酮(fluoroquinolones)和類似物)(例如甲磺酸阿拉曲伐沙星(alatrofloxacinmesylates)、西諾沙星(cinoxacins)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacins)(諸如CIPRO)、克林沙星(clinafloxacins)、二氟沙星(difloxacins)、依諾沙星(enoxacins)、氟羅沙星(fleroxacins)、氟甲喹(flumequines)、加替沙星(gatifloxacins)(例如TEQUIN)、格帕沙星(grepafloxacins)、左氧氟沙星(levofloxacins)(諸如LEVAQUIN)、洛美沙星(lomefloxacins)、米洛沙星(miloxacins)、馬波沙星(moxyfloxacins)(諸如AVELOX)、那氟沙星(nadifloxacins)、萘啶酸(nalidixicacids)、諾氟沙星(norfloxacins)、氧氟沙星(ofloxacins)、"惡喹酸(oxolinicacids)、帕珠沙星(pazufloxacins)、培氟沙星(pefloxacins)、吡哌酸(pipemidicacids)、吡咯酸(piromidicacids)、羅索沙星(rosoxacins)、戸氟沙星(rufloxacins)、司帕沙星(sparfloxacins)、替馬沙星(temafloxacins)、托氟沙星(tosufloxacins)、甲磺酸曲伐沙星(trovafloxacinmesylates)和類似物)；氨磺酰(Sulfonamides)(例如磺胺乙酰甲氧吡嗪(acetylsulfamethoxypyrazines)、節(jié)磺胺(benzylsulfamides)、氯胺B(chloramine-B)、氯月安T(chloramine-T)、二氯胺T(dichloramineT)、甲?；前樊惗奏奏?formylsulfisomidines)、卩陽葡糖基礎(chǔ)月安(beta-glucosylsulfanilamides)、擴(kuò)月安米隆(mafenides)、4'-甲基胺磺?；?磺苯胺(4'-(methylsulfamoyl)sulfanilanilides)、諾丙磺胺(noprylsulfamides)、酞磺醋胺(phthalylsulfacetamides)、酞磺胺噻唑(phthalylsulfathiazoles)、柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidines)、琥珀磺胺噻哇(succinylsulfathiazoles)、苯甲酰磺胺(sulfabenzamides)、磺胺醋酰(sulfacetamides)、磺胺氯噠嗪(sulfachlorpyridazines)、磺胺柯定(sulfachrysoidines)、磺胺西汀(sulfacytines)、磺胺嘧啶(sulfadiazines),磺胺戊烯(sulfadicramides)、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxines)、磺月安多辛(sulfadoxines)、磺月安乙二唑(sulfaethidoles)、石黃月安胍(sulfaguanidines)、磺胺胍諾(sulfaguanols)、磺胺林(sulfalenes)、磺胺洛西酸(sulfaloxicacids)、磺胺甲嘧啶(sulfamerazines)、甲氧嘧啶(sulfameters)、磺胺甲嘧啶(sulfamethazines),磺胺甲二唑(sulfamethizoles)、磺月安托卩密啶(sulfamethomidines)、磺胺異P惡唑(sulfamethoxazoles)、磺胺甲氧嗪(sulfamethoxypyridazines)、磺胺美曲(sulfametroles)、磺胺米柯定(sulfamidoclirysoidines)、磺胺"惡唑(sulfamoxoIes)、磺胺(sulfanilamides)、4-磺胺水楊酸(4-sulfanilamidosalicylicacids)、磺胺酰磺胺(sulfanilylsulfanilamides)、磺胺脲(sulfanilylureas)、n-磺胺酰-3,4-二甲苯甲酰胺(n-sulfanilyl-3，4-xylamides)、磺胺硝苯(sulfanitrans)、磺胺培林(sulfaperines)、磺胺苯吡唑(sulfaphenazoles)、磺胺普羅林(sulfaproxylines)、磺胺吡唑(sulfapyrazines)、磺胺吡啶(sulfapyridines)、磺胺異噻唑(sulfasomizoles)、磺胺均三嗪(sulfasymazines)、磺胺噻唑(sulfathiazoles)、磺胺硫脲(sulfathioureas)、磺胺托拉米(sulfatolamides)、磺胺二甲異嘧啶(sulfisomidines)、磺胺曲沙唑(sulfisoxazoles)和類似物)；砜(例如醋氨苯砜(acedapsones)、醋地砜(acediasulfones)、磺胺苯砜鈉(acetosulfonesodiums)、氨苯砜(dapsones)、i也百里砜(diathymosulfones)、葡月安苯砜鈉(glucosulfonesodiums)、苯丙砜(solasulfones)、舒巴坦(sublactams)、琥珀氨苯砜(succisulfones)、對氨基苯磺酸(sulfaniicacids)、對磺胺酰基節(jié)胺(p-sulfanilylbenzylamines)、阿地砜鈉(sulfoxonesodiums)、噻唑砜(thiazolsulfones)和類似物)；四環(huán)素(例如阿哌環(huán)素(apicyclines)、氯四環(huán)素、氯莫環(huán)素(clomocyclines)、地美環(huán)素(demeclocyclines)、多西環(huán)素(doxycyclines)、胍甲環(huán)素(guamecyclines)、賴甲環(huán)素(lymecyclines)、甲氯環(huán)素(meclocyclines)、美他環(huán)素(methacyclines)、米諾環(huán)素(minocyclines)、氧四環(huán)素、青哌環(huán)素(penimepicyclines)、匹哌環(huán)素(pipacyclines)、羅利環(huán)素(rolitetracyclines)、山環(huán)素(sancyclines)、四環(huán)素(tetracycline)),和其它(例如環(huán)絲氨酸(cycloserines)、莫匹羅星(mupirocins)、薯球蛋白(tuberins)和類似物)以及其它抗生素(例如氯福克酚(clofoctols)、梭鏈孢酸(fusidicacids)、?？宋鞫?hexedines)、六胺(methenamines)(包括例如烏洛托品(methenamine)、脫水亞甲基擰檬酸六胺(methenamineanhydromethylene-citrates)、馬尿酸烏洛托品(methenaminehippurates)、杏仁酸烏洛托品(methenaminemandelates)、磺基水楊酸環(huán)六亞甲基四胺(methenaminesubsalicylates)、呋喃妥因(nitroflirantoins)(例如FURADANTINTM)、石肖P5瞎琳(nitroxolines)、禾U替培南(ritipenems)、牛礎(chǔ)羅定(taurolidines)、xibomols禾口類似物)；抗真菌劑，包括多烯例如兩性霉屬B(amphotericinBs)(如ABELCETtm和AMBISOME)、克念菌素(candicidins)、制皮菌素(dermostatins)、菲律賓菌素(filipins)、抗真菌色素(fungichromins)、抗、滴蟲霉素(hachimycins)、哈霉素(hamycins)、魯斯霉素(lucensomycins)、甲三菌素(mepartricins)、游霉素(natamycins)(如納他霉素(Natacyn))、制霉菌素(nystatins)、變曲霉素(pecilocins)、標(biāo)霉素(perimycins)和其它(如重氮絲氨酸(azaserines)、灰黃霉素(griseofulvins)、寡霉素(oligomycins)、H^—烯酸新霉素、批咯菌素(pyrrolnitrins)、千蠕孢菌素(siccanins)、殺結(jié)核菌素(tubercidins)、綠毛綠素(viridins));以及合成的抗真菌劑例如烯丙胺(allylamines)(如布替萘芬(butenafines)、萘替芬(naftifines)、特比萘芬(terbinafmes));咪唑(如聯(lián)苯節(jié)唑(bifonazoles)、布康唑(butoconazoles)、氯登妥因(chlordantoins)、氯米達(dá)唑(chlormidazoles)、氯康唑(cloconazoles)、克霉唑(clotrimazoles)、益康唑(econazoles)、恩康唑(enilconazoles)、芬替康唑(fenticonazoles)、氟曲馬唑(flutrimazoles)、異康唑(isoconazoes)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazoles)、拉諾康唑(lanoconazoles)、咪康唑(miconazoles)、奧莫康唑(omoconazoles)、硝酸奧昔康唑(oxiconazolenitrates)、舍他康唑(sertaconazoles)、硫t康哇(sulconazoles)、噻康唑(tioconazoles)、伏立康唑(voriconazoles)(如VFEND));硫代氨基甲酸酯(如托西拉酯(tolciclates)、托林達(dá)酯(tolindates)、托萘酯(tolnaftates));三唑(諸如氟康唑(luconazoles)(如DIFLUCAN)、伊曲康唑(traconazoles)(如SPORANOX)、沙康唑(saperconazoles)、特康唑(terconazoles));和其它合成物(如吖啶瑣辛(acrisorcins)、阿莫羅芬(amorolfines)、珍尼柳酯(biphenamines)、溴柳氯苯胺(bromosalicylchloranilides)、丁氯柳胺(buclosamides)、丙酸鈣、氯苯甘醚(chloiphenesins)、ciclopiroxes、cloxyquins、艾索帕爾(coparaffinates)、二鹽酸i也馬哇(diamthazoledihydrochlorides)、依沙酰胺(exalamides)、氟胞嘧啶(flucytosines)、哈利他唑(halethazoles)、海克替啶(hexetidines)、月旨酰肽例如棘白菌素(echinocandin)(如在卡泊芬凈(caspofongin)CANCIDAS中)、氯氟卡班(loflucarbans)、硝呋太爾(nifiaratels)、碘化鉀、丙酸、2-巰基吡啶氧化物(pyrithiones)、水楊苯胺(salicylanilides)、丙酸鈉、舒苯汀(sulbentines)、替諾尼唑(tenonitrozoles)、三醋精、芐硫噻二嗪乙酸(ujothions)、^"^一碳烯酸(undecylenicacids)、丙酸鋅)和類似物；殺阿米巴藥(Amebicides)和抗原生動(dòng)物藥(anti-protozoals)(包括例如阿托伐酉昆(atovaquone)、鹽酸氛嗜(chloroquinehydrochloride)、憐酸氣喧(chloroquinephosphate)、甲石肖唑(metronidazole)、鹽酸甲石肖唑(metronidazolehydrochloride)、依西酸噴他脒(pentamidineisethionate)和類似物)；驅(qū)蟲藥(Anti-helmenthics)和抗寄生蟲藥(anti-parasitics)(包括例如甲苯達(dá)唑(mebendazole)、雙羥萘酸噻嘧啶(pyrantelpamoate)、噻苯噠唑(thiabendazole)和類似物)；抗培藥(Anti-malarials)(包括例如鹽酸氯喹(chloroquinehydrochloride)、磷酸氯喹(chloroquinephosphate)、多西環(huán)素(doxycycline)、硫酸羥氯喹(hydroxychloroquinesulfate)、鹽酸甲氟喹(mefloquinehydrochloride)、磷酸伯氨喹(primaquinephosphate)、乙胺嘧P定(pyrimethamine)、含有磺胺多辛的乙胺嘧啶(pyrimethaminewithsulfadoxines);抗肺結(jié)核藥(Anti-tuberculotics)和抗麻風(fēng)藥(anti-leprotics)(包括例如氨苯吩嗪(clofazimine)、環(huán)絲氨酸、氨苯砜(dapsone)、鹽酸乙胺丁醇(ethambutolhydrochloride)、異煙肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福布汀(rifabutin)、利福平(rifampin)、利福噴汀(rifapentine)、硫酸鏈霉素(streptomycinsulfate)和類似物，以及它們的組合例如利福平/異煙肼(如RIFAMATETM)和利福平/異煙肼/吡嗪酰胺(如RIFATER)。以進(jìn)一步舉例說明為目的(而非限制)，可與本發(fā)明的sHASEGP相聯(lián)合(如通過與一種或多種sHASEGP共同配制或通過與一種或多種sHASEGP共同給藥(可以將sHASEGP在所述藥劑給藥以前、同時(shí)或之后施用))的免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括，例如下列類型藥劑中的成員'免疫抑制劑(包括例如咪唑硫嘌呤(azathioprine)、巴利昔單抗(basiliximab)、環(huán)孢菌素(cyclosporine)、達(dá)利珠單抗(daclizumab)、淋巴細(xì)胞免疫球蛋白、莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、鹽酸霉酚酸酯(mycophenolatemofetilhydrochloride)、西羅莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)和類似物)；疫苗和類毒素(包括例如BCG疫苗、霍亂疫苗、白喉和破傷風(fēng)類毒素(吸附的(absorbed))、吸附的白喉和破傷風(fēng)類毒素和無細(xì)胞的百日咳疫苗、白喉和破傷風(fēng)類毒素和全細(xì)胞的百日咳疫苗、乙型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗(Haemophiliusbconjugatevaccines)、甲肝疫苗(失活的)、乙肝疫苗(重組的)、流行性感冒病毒疫苗(基于純化的表面抗原)、流行性感冒病毒疫苗(基于亞病毒或純化的亞病毒)、流行性感冒病毒疫苗(基于全病毒)、日本腦炎病毒疫苗(失活的)、萊姆病(Lymedisease)疫苗(重組OspA)、麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹病毒疫苗(活體的)、麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹病毒疫苗(活體減活的)、麻疹病毒疫苗(活體減活的)、腦膜炎球菌多糖(meningococcalpolysaccharide)疫苗、腮腺炎病毒疫苗(活體的)、瘟疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多價(jià)的)、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(失活的)、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(活體的、口服的、三價(jià)的)、狂犬病疫苗(吸附的)、狂犬病疫苗(人二倍體細(xì)胞)、風(fēng)疹和腮腺炎病毒疫苗(活體的)、風(fēng)疹病毒疫苗(活體的、減活的)、破傷風(fēng)類毒素(吸附的)、破傷風(fēng)類毒素(流體)、傷寒疫苗(口服的)、傷寒疫苗(不經(jīng)腸的)、VI型傷寒多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黃熱病疫苗和類似疫苗和類似物)；抗毒素和抗蛇毒血清(antivenins)(包括例如黑寡婦和其它蜘蛛的抗蛇毒血清、響尾蛇抗蛇毒血清(多價(jià)的)、白喉抗毒素(馬的)、黃金珊瑚蛇抗蛇毒血清(Micrurusfulviusantivenin)禾口類似物)；免疫血清(包括例如細(xì)胞巨病毒免疫球蛋白(靜脈內(nèi)的)、乙型肝炎免疫球蛋白(人的)、肌肉內(nèi)的免疫球蛋白、靜脈內(nèi)的免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白(人的)、靜脈內(nèi)的呼吸道合胞病毒免疫球蛋白(respiratorysyncytialvirusimmunegobulinintravenous)(人的)、免疫球蛋白(人的)、破傷風(fēng)免疫球蛋白(人的)、水痘-疹子免疫球蛋白和類似物)；其它的免疫調(diào)節(jié)劑(包括例如阿地白介素(aldesleukin)、依泊汀a(epoetinalfa)、非格司亭(Filgrastims)、用于注射的乙酸格拉替雷(glatirameracetate)、復(fù)合干擾素(Interferonalfacon-l)、a-2a干擾素(interferonalfa-2a)(重組的)、a-2b干擾素(interferonalfa-2b)(重組的)、a-n3干擾素(interferonalfa-n3)、(3-la干擾素(interferonbeta-la)、(3-lb干擾素(interferonbeta-lb)(重組的)、y-lb干擾素(interferongamma-lb)、鹽酸左旋咪唑(levamisolehydrochloride)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、沙格司亭(sargramostim)禾卩類似物)?？膳c本發(fā)明的sHASEGP聯(lián)合的其它藥劑(如通過與一種或多種sHASEGP共同配制或通過與一種或多種sHASEGP共同給藥(可以將sHASEGP在所述藥劑給藥以前、同時(shí)或之后施用))包括，例如下面列出的類固醇抗炎齊U(例如阿氯米松(alclomethasones)、阿爾孕酮(algestones)、倍氯米松(beclomethasones)、倍他米松(betamethasones)、布地奈德(budesonides)、氯倍他索(clobetasols)、氯倍他松(clobetasones)、氯可托龍(clocortolones)、氯潑尼醇(cloprednols)、皮質(zhì)酮(corticosterones)、可的松和氫化可的松(cortisones禾口hydrocortisones)(如乙酸氫化可的松(hydrocortisoneacetate))、可的伐嘩(cortivazols)、地夫可特(deflazacorts)、地奈德(desonides)、去羥米松(desoximetasones)、地塞米松(dexamethasones)(如磷酸地塞米松21(dexamethasone21-phosphate))、difluorosones、二氟可龍(diflucortolones)、二氟潑尼酯(difluprednates)、甘草次酸(enoxolones)、氟扎可特(fluazacorts)、氟氯奈德(flucloronides)、雙氟美松(flumethasones)、氟尼縮松(flunisolides)、氟輕松(fluocinolones)、醋酸氟輕松(fluocinonides)、氟可丁(fluocortins)、氟可龍(fluocortolones)、氟米龍(fluorometholones)、氟培龍(fluperolones)、氟潑尼定(fluprednidenes)、氟潑尼龍(fluprednisolones)、氟氫縮松(flumndrenolides)、氟替卡松(fluticasones)、福莫可他(formocortals)、哈西奈德(halcinonides)、卣倍他索(halobetasols)、卣米松(halometasones)、卣潑尼松(halopredones)、氫可他酉旨(hydrocortamates)、氫化可的松(hydrocortisones)、氯替潑i若(loteprednoletabonate)、馬、潑尼酮(mazipredones)、甲P5松(medrysones)、甲、潑尼松(meprednisones)、甲潑尼龍(methylprednisolones)、糠酸莫米松(mometasonefuroate)、巾白拉米松(paramethasones)、潑尼卡酉旨(prednicarbates)、潑尼松龍(prednisolones)(如潑尼松龍25-二乙氨基-乙酸酯(prednisolone25-diethylamino-acetate)、潑尼松龍石粦酸鈉(prednisolonesodiumphosphate))、強(qiáng)的松(prednisones)、潑尼松龍戊酸酉旨(prednivals)、潑尼立定(prednylidenes)、利美索龍(rimexolones)、替可的松(tixocortols)、去炎松(氟羥脫氫皮醇，triamcinolones)(如曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、苯曲安奈德(triamcinolonebenetonide)禾口己曲安奈德(triamcinolonehexacetonide))禾卩類1以物)；非類固醇抗炎劑(例如色甘酸鹽(或酯)(cromoglicates)、雙氯芬酸(diclofenacs)、氟比洛芬(flurbiprofens)、消炎痛(indomethacins)、布洛芬(ibuprofens)、酮咯酸(ketorolacs)(如酮咯酸氨基丁三醇(ketorolactromethamine))、洛度沙胺(lodoxamides)、奈多羅米(nedocromils)、卩比羅昔康(piroxicams)、水楊酸鹽(salicylates)和類似物)；p阻斷劑(例如倍他洛爾(betaxolols)(如鹽酸倍他洛爾(betaxololhydrochloride))、卡替洛爾(carteolols)、艾司洛爾(esmolols)、左布諾洛爾(levobunolols)、metipranalols、噻嗎洛爾(timolol)(如半水合噻嗎洛爾(timololhemihydrate)和各種形式的馬來酸噻嗎洛爾(timololmaleate))和類似物)；擬交感神經(jīng)齊U(例如腎上腺素(adrenaline)、溴莫尼定(brimonidines)、地匹福林(dipivefrins)、腎上腺素(epinephrines)和類似物)；Ducosanoids、前列腺素和前列腺素類似物(例如比馬前列素(bimatoprosts)、拉坦前列素(Latanoprost)、曲伏前列腺素(travoprost)、烏諾前列酮(unoprostones)和類似物)，以及抗前列腺素(antiprostaglandin)和前列素前體；縮瞳藥(Miotics)、類乙酰膽堿功能藥(cholinergics)和抗膽堿酯酶(anti-cholinesterases)(例如氯化乙酰膽堿、卡巴可、地美溴銨(demecariumbromides)、二異丙基氟磷酸鹽(或酉旨)(diisopropylfluorophosphates)、毒扁豆堿(eserines)、毒扁豆堿(physostigmines)、毛果云香堿(pilocarpines)、石典《七二乙氧磷酸硫月旦堿(phospholineiodines)、水楊酸鹽和類似物)；抗過敏齊U(例如安他唑啉鈉(sodiumantazolines)、西替利嗪(cetirizines)、氯苯吡月安(chloipheniramines)、色甘酸鹽(或酯)(cromoglycates)、色甘酸鈉(cromolynsodium)(Crolom)、富馬酸依美斯汀(emedastinedifumarate)、酮替芬(ketotifins)(如富馬酸酮替芬(ketotifenfumarate))、左卡巴斯汀(levocabastines)、噻吡二胺(methapyrilines)、奈多羅米鈉(nedocromilsodium)、奧洛他定(olopatadines)、吡拉明(pyrilamines)、非尼臘明(prophenpyridamines)禾卩類寸以物)；解充血藥(Decongestants)(例如苯腎上腺素(phenylephrines)、萘甲唑啉(naphazolines)、四氫唑啉(tetrahydrozolines)和類似物)；激素劑(例如雌激素、雌二醇、孕激素(progestationals)、孕酮、胰島素、降鈣素、甲狀旁腺素和甲狀旁腺肽以及血管生壓素下丘腦釋放因子(vasopressinhypothalamusreleasingfactor)禾口類4以物)；生長因子(例如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子P、促生長素和遷連蛋白以及類似物)；鎮(zhèn)痛藥(例如醋氨沙洛(acetaminophen);阿芬太尼(alfentanil);氨基苯甲酸酯(aminobenzoate);氨基苯甲酸鹽(aminobenzoate);阿尼多昔(anidoxime);阿尼利定(anileridine);氨節(jié)哌替啶(anileridine);阿尼洛泮(anilopam);阿尼羅酸(anirolac);安替比林(antipyrine);阿斯匹林(aspirin);本"惡洛芬(benoxaprofen);芐達(dá)明(benzydamine);鹽酸比西發(fā)定(bicifadinehydrochloride);布芬太尼(brifentanil);、溴朵林(bromadoline);溴芬酸(bromfenac);丁丙諾啡(buprenorphine);布他西丁(butacetn);布替西雷(butixirate);布托菲諾(butorphanol);丁啡喃(butorphanol);卡馬西平(carbamazepine);卡巴匹林鈣(carbaspirincalcium);卡必芬(carbiphene);卡芬太尼(carfentanil);琥珀酸環(huán)丙法多(ciprefadolsuccinate);希拉馬多(ciramadol);希拉馬多(ciramadol);氯尼塞利(clonixeri)；氯尼辛(clonixin);可待因(codeine);磷酸可待因(codeinephosphate);硫酸可待因(codeinesulfate);conorphone;環(huán)佐辛(cyclazocine);右奧沙屈(dexoxadrol);右培美酸(dexpemedolac);地佐辛(dezocine);二氟尼柳(diflunisal);二氫可待因(dihydrocodeine);二甲法登(dimefadane);安乃近(dipyrone);多匹可明(doxpicomine);氨甲茚酮(drinidene);依那朵林(enadoline);依匹唑(epirizole);酒石酸麥角胺(ergotaminetartrate);乙托沙素(ethoxazene);依托芬那酯(etofenamate);子香酚(eugenol);菲諾洛芬(fenoprofen);苯氧丙酸鈣(fenoprofencalcium);枸櫞酸芬太尼(fentanylcitrate);夫洛非寧(floctafenine);氟苯柳(flufenisal);氟尼辛(flunixin);氟尼辛葡胺(flunixinmeglumine);氟吡丁(flupirtine);氟丙喹宗(fluproquazone);氟朵林(fluradoline);氟比洛芬(flurbiprofen);氫嗎啡酮(hydromorphone);異丁芬酸(ibufenac);n引n朵各芬(indoprofen);酮佐辛(ketazocine);酮啡諾(ketorfanol);酮咯酸(ketorolac);來替米特(letimide);左旋醋美沙朵(levomethadylacetate);鹽酸左方定酉昔美沙、朵(levomethadylacetatehydrochloride);左南曲朵(levonantradol);左啡諾(levorphanol);洛非咪唑(lofemizole);草酸洛芬太尼(lofentaniloxalate);洛西那多(lorcinadol);氯諾昔康(lornoxicam);水楊酸鎂(magnesiumsalicylate);甲芬男卩酸(mefenamicacid);美大麻坦(menabitan);麥啶(meperidine);美普他酚(meptazinol);美沙酮(methadone);醋美沙朵(methadylacetate);甲氧夫啉(methopholine);甲氧異丁嗪(methotrimeprazine);乙酸美克法胺(metkephamidacetate);米姆本(mimbane);米芬太尼(mirfentanil);嗎林另卩宗(molinazone);硫酸嗎啡(morphinesulfate);莫沙佐辛(moxazocine);大麻坦(nabitan);納布啡(nalbuphine);納美酮(nalmexone);納莫雷特(namoxyrate);南曲多(nantradol);萘普生(naproxen);甲氧萘丙酸(naproxen);萘普索(naproxol);奈?！钒?nefopam);奈西利定(nexeridine);諾美沙多(noracymethadol);奧芬太尼(ocfentanil);奧他酰胺(octazamide);奧伐尼(olvanil);奧昔托隆(oxetorone);羥考酮(oxycodone);14-羥基二氫可待因酮(oxycodone);對苯二酸氧可酮(oxycodoneterephthalate);羥嗎啡酮(oxymorphone);培美酸(pemedolac);戊嗎酮(pentamorphone);噴他佐辛(pentazocine);噴他佐辛(pentazocine);非那吡啶(phenazopyridine);苯吡氨醇(phenyramidol);哌西那多(picenadol);皮那朵林(pinadoline);吡非尼酮(pirfenidone);吡羅昔康乙醇胺(piroxicamsolamine);普拉朵林(pravadoline);普地利定(prodilidine);普羅法多(profadol);丙卩比胺(propiram);達(dá)而豐(propoxyphene);萘磺酸達(dá)而豐(propoxyphenenapsilate);普羅沙挫(proxazole);普羅啡烷(proxorphan);吡咯利芬(pyrroliphene);瑞芬太尼(remifentanil);柳膽來司(salcolex);馬來酸沙乙酰月安(salethamidemaleate);水楊酰月安(salicylamide);7_K楊酸葡胺(salicylatemeglumine);雙水楊酯(salsalate);水楊酸鹽(或酯)(salicylate);螺朵林(spiradoline);舒芬太尼(sufentanil);舒芬太尼(sufentanil);sucapsaicin;"f也美辛(talmetacin);{也尼氟酯(talniflumate);他洛柳酯(talosalate);他扎朵林(tazadolene);特丁非隆(tebufelone);四氫甲剛胺(tetrydamine);替呋酸(tiforac);替利定(tilidine);硫平酸(tiopinac);托那佐辛(tonazocine);曲馬多(tramadol);曲芬太尼(trefentanil);三乙醇胺(trolamine);維拉朵林(veradoline);維立洛泮(verilopam);伏拉佐辛(volazocine);佐爾啡諾(xorphanol);甲苯噻嗪(xylazine);zenazocinemesilate;佐美酸(zomepirac);和類似物)；其它大分子藥理劑例如其它蛋白質(zhì)、核酸和類似物；以及大分子復(fù)合體例如各種藥物輸送載體、蛋白輸送載體和/或基因輸送載體(包括合成制備的載體例如脂質(zhì)體和類似物，以及生物學(xué)發(fā)生的載體例如病毒載體和類似物)；和如本領(lǐng)域已知的，用于各種狀況的另外的藥劑(和各種藥劑的關(guān)于用法、劑量、禁忌征候等其它信息，所述多種制劑包括本文確認(rèn)的那些藥劑)，包括如在下列參考文獻(xiàn)中確定的那些另外的藥劑，以及在下列專利參考中確定的那些另外的藥劑，所述參考文獻(xiàn)例如Physicians'DeskReference(PDR)(Thomson2003，2004,2005》theAmericanCollegeofPhysiciansCompleteHomeMedicalGuide(DKPublishing2003);所述專利參考包括如美國公開的申請20040224023、20040224012和20050002865(該藥劑列表在此引入作為參考)。藥劑的組合(例如選自上述藥劑組中的一組或多組和/或選自本文描述的或本領(lǐng)域已知的其它組或類別的藥理劑和其它藥劑的兩種或更多種藥劑)。sHASEGPs對于減低眼內(nèi)壓和其它眼科征候的應(yīng)用術(shù)后白內(nèi)障患者中發(fā)生的一個(gè)普遍副效應(yīng)是早期的——有時(shí)候會延長的一一顯著的眼內(nèi)壓增加。此種狀況有時(shí)候是嚴(yán)重的，特別在具有青光眼視神經(jīng)盤變化的患者中。盡管當(dāng)在手術(shù)期間將粘彈性試劑例如透明質(zhì)酸注射入眼睛中時(shí)，壓力增加往往會更加嚴(yán)重，但即使不使用此種試劑，術(shù)后眼內(nèi)壓也會升高。而且，即使在手術(shù)過程中不使用其它附加的藥物，此種壓力增加也會發(fā)生。在一些情況下，讓粘彈性試劑留在眼睛里是有益處的，這常常使得有必要給予患者大劑量的碳酸酐酶抑制劑。這些抑制劑通過減少房水的形成而降低眼內(nèi)壓，房水是正常情況下在眼睛中由睫狀體分泌的流體。目前用于減緩眼睛內(nèi)術(shù)后壓力增加的方法包括各種類型的滴眼液，諸如卩-腎上腺能阻斷劑、擬交感神經(jīng)藥、縮瞳藥、all選擇性試劑、碳酸酐酶抑制劑和前列腺素試劑。去除粘彈性試劑例如透明質(zhì)酸的優(yōu)選方法是在前節(jié)或后節(jié)手術(shù)程序的期間或之后緊接著注射sHASEGP，盡管本領(lǐng)域已知的其它給藥方法也是可能的。如果透明質(zhì)酸和sHASEGP在前節(jié)眼手術(shù)程序期間通過注射投藥于眼睛前房，以使得透明質(zhì)酸在手術(shù)程序開始期間能夠充當(dāng)間隔物，則是優(yōu)選的。在角膜移植的一些情況中，可以在適當(dāng)位置縫合角膜移植物之前，將透明質(zhì)酸和sHASEGP組合置于眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的表面。該組合也可以用于后節(jié)手術(shù)中，例如視網(wǎng)膜或玻璃體手術(shù)中。在一些情況下，在手術(shù)結(jié)束時(shí)，將粘彈性試劑例如Heal0nTM、ViscoatTM或其它可占據(jù)空間的物質(zhì)留在眼的前房可能是明智的。對于在眼內(nèi)內(nèi)含物趨向于向前運(yùn)動(dòng)并壓迫角膜后表面時(shí)的正壓力升高，這是尤其適用的。如果這發(fā)生在在適當(dāng)位置具有人工眼內(nèi)晶體的眼中，則角膜內(nèi)皮上的壓力可能顯著傷害細(xì)胞并隨后引起角膜腫脹，并且發(fā)生渾濁化現(xiàn)象，其與視力減低相關(guān)。通常，如果在手術(shù)程序結(jié)束時(shí)患者的眼內(nèi)壓顯著升高，則有必要給予這樣的患者大劑量的碳酸酐酶抑制劑，以及外用滴眼液諸如卩-阻斷劑和aII促效藥，以便減少水形成和/或增加水外流。這些試劑都具有顯著的副作用，并且在一些情況下，對于具有各種醫(yī)學(xué)癥狀例如呼吸問題、心臟病或高血壓的患者，它們的使用則屬于治療不當(dāng)。然而，在這些情況下使用sHASEGP將省去給予這些患者大劑量的此類藥物的必要。而且，在小梁網(wǎng)中具有相當(dāng)數(shù)量的透明質(zhì)酸。sHASEGP將分解這些透明質(zhì)酸，并因此促進(jìn)水通過小梁網(wǎng)流出?；颊叩难蹆?nèi)壓將因此減小。sHASEGP與其他前房試劑例如甲基纖維素(OcucoatTM，例如商購自StorzInstrumentCo.)-在白內(nèi)障手術(shù)中用作間隔劑和/或保護(hù)試劑—的組合也將有效地防止壓力的顯著升高，這是因?yàn)樗鼘⒂行У卮蜷_小梁網(wǎng)，通過降解小梁網(wǎng)中存在的大量的透明質(zhì)酸來排除更多的房水。從小梁網(wǎng)去除糖胺聚糖，對于患有隅角開放性青光眼的個(gè)體的眼內(nèi)壓的降低也是有用的。人sHASEGP可以通過結(jié)膜下注射或直接注射在眼前房中而被給藥。因?yàn)閟HASEGP起酶作用，所以甚至相對有限量的sHASEGP可有效地行使粘彈劑解毒劑的功能或者對通過應(yīng)用糖胺聚糖酶而得到幫助或改善的情形起作用。如用于其它用途時(shí)，對于最佳應(yīng)用的sHASEGP提供的透明質(zhì)酸酶活性單位部分取決于治療的具體情形一一特別是需要的糖胺聚糖降解的量，但是其可以使用適當(dāng)?shù)哪Ｐ捅蝗菀自u估，然后根據(jù)具體的用途對其適當(dāng)?shù)膬?yōu)化。作為舉例說明，被用作解毒劑的sHASEGP單位將受到例如下列因素的影響具體使用的步驟和粘彈劑使用量，以及是否使用其它的步驟例如沖洗和吸出將任何使用的粘彈劑去除。當(dāng)在沖洗和吸出之后使用sHASEGP時(shí)，通常可使用的數(shù)量提供的范圍是10到12,000單位，典型地100到5,000單位，更典型地500到2,000單位，盡管這將再一次取決于具體的應(yīng)用。當(dāng)sHASEGP被用于避免對沖洗和吸出的需要時(shí)，將使用更大的數(shù)量，以便有效消化更大量的使用的粘彈劑，通常可使用的數(shù)量提供的范圍是50到20,000單位，典型地400到10,000單位，更典型地1,500到5,000單位，盡管這將再一次取決于具體的應(yīng)用。在sHASEGP被用來降低青光眼相關(guān)聯(lián)的眼內(nèi)壓的情況中，sHASEGP的應(yīng)用也可被用作主要治療以降低青光眼相關(guān)聯(lián)的IOP，并且因而潛在地避免對于某些手術(shù)過程的需要，所述手術(shù)過程例如青光眼濾過、青光眼引流植入物(植入管分流(tubeshunt))、激光小梁成形術(shù)、睫狀體光凝固或虹膜切開術(shù)。因此本發(fā)明的sHASEGP可被引入，例如通過注射入眼前房，以提供最小侵入性的手段，以便降低青光眼相關(guān)聯(lián)的眼內(nèi)壓。不希望被理論限制，相信在此類情形中施用sHASEGP，可增強(qiáng)經(jīng)過小梁網(wǎng)的流體外流，并因此通過降低眼前房內(nèi)的流體靜壓和/或血壓滲透壓以降低IOP。在sHASEGP被用于溶解玻璃體聚集物或"漂物(floater)"——其通常是肉眼可見的不透明的玻璃體纖維聚集物——的情況中，將sHASEGP施用到玻璃體可被用來促進(jìn)分解。類似的，如本文描述的sHASEGP可被應(yīng)用于玻璃體以促進(jìn)玻璃體出血(即，血溢出進(jìn)入玻璃體)的消退，玻璃體出血可連同下述病癥一起發(fā)生，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinalveinocclusion)、后玻璃體脫落、視網(wǎng)膜撕裂、眼外傷和類似病癥。玻璃體出血一一其典型地緩慢消退_—的存在，可推延、復(fù)雜化或阻礙要求視網(wǎng)膜通過玻璃體可視化的某些程序，這些程序?qū)τ谠\斷和/或治療手術(shù)是需要的，例如激光光凝固和通常對于例如增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的病癥為主要治療的類似治療手術(shù)。促進(jìn)這類玻璃體出血消退的sHASEGP的使用因此能被用來幫助視網(wǎng)膜病癥的診斷和/或避免對更極端的手術(shù)例如玻璃體切割術(shù)的需要。在sHASEGP被用來在治療病癥例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變中促進(jìn)玻璃體-視網(wǎng)膜分離的情況中，將sHASEGP施用入玻璃體可用來促進(jìn)玻璃體與視網(wǎng)膜分離或分開。在本文中，sHASEGP不但可以促進(jìn)所述分離，還可以使這種分離以降低視網(wǎng)膜變形(retinaldistortion)或視網(wǎng)膜撕裂的方式進(jìn)行。本發(fā)明的sHASEGP也可以用來治療角膜混濁。就該方面而言，許多扭曲或變形可能影響角膜的正常組織的結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致在通過角膜的光通路中的中斷并且伴隨著視力的損傷。因此，大量的狀況和原因?qū)е陆悄づで?，其可以表現(xiàn)為傷疤、混濁或濁影。在施用sHASEGP以改善或者治療這些角膜病癥時(shí)，sHASEGP(在藥理學(xué)可接受的溶劑中，其包含一種或多種另外的藥理劑)可通過數(shù)種給藥途徑中的任意一種被引入角膜，這部分取決于角膜損傷的程度和位置。作為舉例說明，sHASEGP可被引入到眼的外表面上(使用例如滴液或其它外用途徑)，sHASEGP可封裝在載體例如脂質(zhì)體和類似載體中，所述載體可被用來幫助跨角膜上皮的細(xì)胞輸送，這通過注射或微注射到角膜上或角膜本身里面，或者通過其它方法應(yīng)用到角膜。對于促進(jìn)輸送，除了生物化學(xué)或機(jī)械學(xué)輔助方法，用于促進(jìn)滲透的其它方法例如離子電滲療法，也可被使用。本發(fā)明的sHASEGP也可被用來例如，增強(qiáng)在光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)中使用的藥劑的滲透性。PDT是針對脈絡(luò)膜新生血管膜(choroidalneovascularmembrane)(CNVM)的治療，所述脈絡(luò)膜新生血管膜通常是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的"濕(wet)"形式的視網(wǎng)膜下的滲漏性血管結(jié)構(gòu)。在PDT中，光敏染料例如VISUDYNE(維替泊芬(verteporfin))典型地被靜脈內(nèi)(IV)給藥，并且被允許灌注CNVM以及機(jī)體的剩余部分。然后，眼科醫(yī)生通常用特定波長(例如689nrn)的紅色激光治療CNVM，激光治療持續(xù)大約卯秒。非熱激光(non-thermallaserlight)活化染料(例如VISUDYNE)產(chǎn)生氧的活性形式，其凝結(jié)和降低了異常血管的生長，其又抑制了流體從CNVM滲漏。本發(fā)明的sHASEGP可被用于，例如促進(jìn)染料(例如VISUDYNE)直接向眼睛的更加局域化的給藥；和/或促進(jìn)通常與手術(shù)例如PDT—起施用到眼的其它藥劑的輸送。神經(jīng)節(jié)囊腫神經(jīng)節(jié)囊腫(也稱為腕囊腫、Bible囊腫或背腱鞘囊腫)是手的最常見的軟組織塊。它是充滿流體的囊，其可以在皮膚下被感覺到。它通常附著于手或腕中的腱鞘(可潤滑腱的襯里結(jié)構(gòu))，或與下面的關(guān)節(jié)連接；然而，有一些并不會明顯地連接于任何結(jié)構(gòu)。這些神經(jīng)節(jié)囊腫也可以出現(xiàn)在足中。當(dāng)腱的襯里結(jié)構(gòu)或關(guān)節(jié)上面的韌帶中出現(xiàn)撕裂和由于韌帶缺陷而造成襯里突出并導(dǎo)致在皮膚下形成腫塊時(shí)，它常常發(fā)生。因?yàn)槌３０殡S有炎癥，發(fā)炎的組織產(chǎn)生果醬樣的流體，充滿突出的囊。它們可以如巖石般堅(jiān)硬，這是由于在該囊內(nèi)含有壓力高的粘液樣流體，它們常常被誤認(rèn)為是骨突出。sHASEGP可以被用于改善神經(jīng)節(jié)囊腫。損傷區(qū)內(nèi)注射入5-1000單位的sHASEGP，然后進(jìn)行細(xì)針抽吸，可以去除囊腫，而不需要手術(shù)?？扇芜x地，皮質(zhì)類固醇也可以與sHASEGP—起注射。對于某些患者，則還需要其他注射。粘液性水腫皮膚的糖胺聚糖(GAG)浸潤是甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺功能減退癥、脛前粘液性水腫、苔蘚性粘液水腫和硬化病的一個(gè)特征。在所有的病況中和在正常的皮膚里透明質(zhì)酸都是主要的GAG。GAG的皮膚分布具有最小的組織多樣性。獲得性皮膚粘蛋白癥(acquiredcutaneousmucinoses)顯示出類似的皮膚GAG分布和生化組成。成纖維細(xì)胞活性的形態(tài)學(xué)差異表明，硬化病和苔蘚性粘液水腫的粘蛋白癥代表的是一個(gè)局部進(jìn)程，而甲狀腺疾病的GAG浸潤則可能具有全身性起源。這些紊亂可以通過sHASEGP的局部給藥和全身性給藥而得以改善。對于慢性治療，可以考慮使用聚乙二醇化的sHASEGP。sHASEGP的肺部應(yīng)用來自正常個(gè)體的支氣管肺泡灌洗液(BAL)的透明質(zhì)酸水平通常在15ng/ml以下。然而，在呼吸窘迫的狀況下，BAL水平大大上升(BjermerBrMedJ(ClinResEd)1987Oct3;295(6602):803-6)。例如，在ARDS中，透明質(zhì)酸可以上升到500ng/ml，然而在農(nóng)民肺中，BAL水平可以超過1000ng/ml(HallgrenetalAmRevRespirDis.1989Mar;139(3):682-7)，(La腦netalChest.1992Jan;101(1):109-14)。在肺中增加的透明質(zhì)酸可以阻止氧擴(kuò)散和氣體交換并且活化嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞應(yīng)答。牛透明質(zhì)酸酶制劑并不是治療此種病況的優(yōu)選之物，原因有許多。首先，已經(jīng)知道屠宰物睪丸來源的透明質(zhì)酸酶制劑受到絲氨酸蛋白酶例如頂體蛋白酶的污染。第二，牛的酶的外源性質(zhì)增加了過敏反應(yīng)的可能性，其能導(dǎo)致患者死亡。因此，高純度的重組人sHASEGP制劑可以通過肺或靜脈內(nèi)傳送的方法而被傳送。也可以將人sHASEGP施予患有與升高的糖胺聚糖有關(guān)的其他肺部并發(fā)癥的患者，或者，給予人sHASEGP以增強(qiáng)其他共同傳送的分子至肺部的傳送。本發(fā)明現(xiàn)在將通過參考下面的非限制性實(shí)施例來進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。實(shí)施例1基于微量滴定的透明質(zhì)酸酶測定下面的實(shí)施例提供了測量sHASEGP透明質(zhì)酸酶活性的快速分析方法。該分析方法可以是關(guān)于TRU、IU或NFU，其中使用W.H.O.標(biāo)準(zhǔn)的透明質(zhì)酸酶制劑。生物素化的透明質(zhì)素微量滴定測定使用生物素-酰肼(Pierce)、SulfoNHS(Pierce)和1-乙基二甲氨基丙基-碳二亞胺(Sigma)，使透明質(zhì)素的葡糖醛酸殘基上游離的羧基在一步反應(yīng)中被生物素化。該生物素化的HA底物在第二個(gè)反應(yīng)中，被共價(jià)偶聯(lián)到96孔微滴定板上。酶反應(yīng)完成時(shí)，殘留的底物用抗生物素蛋白-過氧化物酶反應(yīng)進(jìn)行檢測，其可以用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板讀數(shù)器讀出。因?yàn)榈孜锸潜还矁r(jià)結(jié)合于微滴定板，所以矯作結(jié)果(artifact)例如生物素化底物的pH依賴性的置換沒有發(fā)生。靈敏度使得能夠?qū)碜耘囵B(yǎng)細(xì)胞和生物樣品的透明質(zhì)酸酶活性進(jìn)行快速測定，分析之間的偏差小于10%。a.實(shí)驗(yàn)方案生物素化的HA底物的制備在偶聯(lián)到生物素之前，將lOOmg的HA(SigmaChemicals)溶解于0.1MMES,pH5.0中，至最終濃度為lmg/ml，在4'C溶解至少24小時(shí)。將Sulfo-NHS(Pierce;RockfordIL)加入到該CS04MES溶液中，至最終濃度為0.184mg/ml。將生物素酰肼(Pierce)溶解于DMSO,作為lOOmM的貯存液，再加入到CS04溶液，至最終濃度為lmM。將l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)的貯存液制備為溶于蒸餾水中的100mM貯存液，再加入到HA生物素溶液，至最終濃度為30mM。將該溶液在4'C攪拌過夜。未連接的生物素和EDAC通過用水透析而去除，其中3次更換1000x體積的水。將透析過的、生物素化的HA(bHA)進(jìn)行等分，可在-2(TC保存達(dá)數(shù)月。用含有濃度為0.2mg/ml的bHA的水將Sulfo-NHS稀釋至0.184mg/ml,并吸放到96孔COVALINK-NH板(NUNC;PlacervilleNJ)，每孔50fil。將EDAC用水稀釋至0.123mg/ml，并吸放到含有bHA溶液的COVALINK-NH板，結(jié)果，bHA的最終濃度為10嗎/孔，EDAC的最終濃度為6.15嗎/孔。將板在4'C溫育過夜，或23'C溫育2小時(shí)，這給出了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。將bCS04共價(jià)固定在微量滴定板上之后，通過振蕩去除偶聯(lián)溶液(couplingsolution),并將板在含有2MNaCl禾Q50mMMgS04的PBS(緩沖液A)中洗滌3次。該板可以保存在4'C達(dá)1周。帶有固定化的bHA的COVALINK-NH板可以用100|11/孔的測定緩沖液平衡，測定緩沖液是0.1M甲酸，pH3.7、0.1MNaCl、1%TRITONX-100去污劑、5mM葡糖二酸單內(nèi)酯，用于溶酶體透明質(zhì)酸酶；或者是10mMHepes，PH7.4，具有l(wèi)mMCaC12和lmg/ml人血清蛋白(ICN)，用于中性活性酶。用于"相對濁度降低單位"(rTRUs)的酶活性的校準(zhǔn)的一組標(biāo)準(zhǔn)通過下述步驟產(chǎn)生用中性酶緩沖液將牛睪丸透明質(zhì)酸酶(SigmaTypeVI-S)稀釋為1.0至lxl(T6rTRU/孔并測定100^1/孔，一式三份。用溶酶體測定緩沖液將酸性活性透明質(zhì)酸酶的樣品稀釋為1:10至1:130,000，按100^1/孔的量移取，一式三份。對于大部分的組織提取物和人血漿分析，37'C溫育30分鐘是足夠的。陽性和陰性對照孔(分別沒有酶或沒有ABC(參見下面))也被包括，一式三份。通過加入200pl/孔的6M鹽酸胍來終止反應(yīng)，然后以300pl/孔的量用PBS、2MNaCl、50mMMgSO4、0.05%TWEEN20去污齊ij(緩沖液B)洗滌3次?？股锼氐鞍?生物素復(fù)合物(ABC)試劑盒(VectorLabs;BurlingameCA)可以在10ml的含有0.1%TWEEN20去污劑的PBS中制備，其在溫育期間在室溫下預(yù)先溫育30分鐘。加入ABC溶液(10(^il/孔)，并在室溫溫育30分鐘。將板用緩沖液B洗滌5次，然后以100pl/孔的量加入o-苯二胺(OPD)底物，該底物溶液通過將l片10mg的OPD片劑溶解于10ml的0.1M檸檬酸-磷酸緩沖液，pH5.3，并加入7.5pl的30%H202來制成。將板在黑暗中溫育10-15分鐘，然后使用492nm濾器，在ELISA平板讀數(shù)儀(TitertekMultiskanPLUS;ICN)上讀數(shù)，通過使用Biometallics(PrincetonNJ)的DeltaSoftII平板讀數(shù)軟件的計(jì)算機(jī)來進(jìn)行監(jiān)控。應(yīng)用了牛睪丸透明質(zhì)酸酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以利用通過商業(yè)渠道購得的透明質(zhì)酸酶制劑的四參量曲線擬合而產(chǎn)生，未知樣品通過它們在492nm的吸收值，借助于內(nèi)插法而被估算出。為了分析透明質(zhì)酸酶的pH依賴性，純化的重組sHASEGP和牛睪丸透明質(zhì)酸酶被應(yīng)用。酶活性對pH的依賴性可以通過將純化的sHASEGP或部分純化的牛睪丸透明質(zhì)酸酶用下述緩沖液稀釋至0.1rTRU來進(jìn)行測量50mM甲酸鹽，pH3-4.5;50mM醋酸鹽，pH5-6;50mMMES，pH6-7;或50mMHEPES，pH7-8。將樣品在37'C測定30分鐘，活性用最大活性的百分比來表示。緩沖液中不使用NaCl，這是因?yàn)镹aCl能改變睪丸透明質(zhì)酸酶制劑的pH最適宜值(Gold,Biochem.J.205:69-74,1982;Gacesaetal.Biochem.Soc.Trans.7:1287-1289,1979);生理鹽濃度(0.15M)使得表觀pH最適宜值降低，這一影響在睪丸酶的純化制劑中比在原始的粗樣品中更為顯著。b.結(jié)果透明質(zhì)素在使用了生物素-酰肼和EDAC的一步反應(yīng)中被生物素化。EDAC是將HA上的游離羧基基團(tuán)與生物素酰肼進(jìn)行偶聯(lián)，將EDAC進(jìn)行限制，則HA上只有一小部分的總葡糖酸酸殘基被標(biāo)記。將EDAC(3xl0—5M)加入到HA(2.8xl(T3M)，按這一數(shù)量，則產(chǎn)生最大值每93個(gè)HA二糖單位偶聯(lián)1分子的生物素酰肼。制備牛睪丸透明質(zhì)酸酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)的四參量曲線擬合，所述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)在pH3.7進(jìn)行測量，并稀釋為l.O至lxl(r6TRU〃L。四參量曲線擬合由方程來建立y=((A陽D)/(l+(濃度/C)AB))+D)，其中，Iogity=ln(y'/l-y')，y'=(y-D)/(A-D)，B=-b/lnl0，C=EXP(a/B)。四個(gè)參量(A、B、C、D)用軟件程序來計(jì)算，該軟件程序利用了2+2線性回歸運(yùn)算法則(Rodbardetal.,Clin.Chem.22:350，1976)。該曲線擬合具體表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的S形特征。樣品測定時(shí)的最佳準(zhǔn)確性通常在0.001至0.01TRU/孔溫育30分鐘時(shí)獲得。在60分鐘的溫育期間，可檢測到1/1000的TRU。對于更小范圍的值，也可以利用標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)曲線來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。盡管本發(fā)明已經(jīng)依據(jù)特定的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)該理解的是，要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)該限于這些特定的實(shí)施方案。實(shí)施例2sHASEGPcDNA的克隆編碼人sHASEGP的核酸可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過許多方法來獲得，包括但不限于人工基因合成、RT-PCR和cDNA文庫雜交(例如參見GmachletalFEBS336(3)1993,Kimmeletal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90199310071-10075)?？蛇x擇地，編碼人sHASEGP的克隆可以從IMAGE或人基因序列的其他供應(yīng)商那里獲得(InvitrogenCloneIDIOH10647)。全長人PH20cDNA經(jīng)計(jì)算長為2009個(gè)核苷酸，含有1530個(gè)核苷酸的開放閱讀框。5'UTR非同尋常的大，其可能代表著滯留的內(nèi)含子(retainedin加n)，而且它可能由于5'UTR中的9個(gè)非編碼起始密碼子的緣故，通過阻止核糖體結(jié)合到正確的起始甲硫氨酸密碼子而抑制翻譯。該蛋白(Genbank登記號為NP—003108)經(jīng)預(yù)測包含有509個(gè)氨基酸，SEQIDNo.l，計(jì)算出的分子量為58kDa。為了克隆的測序，PCR擴(kuò)增條帶被切下，并用膠提取回收試劑盒(Qiagen)洗出，再克隆入合適的經(jīng)限制性消化而具有粘末端的載體。雙鏈DNA的所有測序反應(yīng)依據(jù)制造商的說明進(jìn)行，其中使用Taq染料脫氧終止循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems)，在ABIPrism自動(dòng)測序儀(AppliedBiosystems)上進(jìn)行測序。使用引物SEQIDN014和SEQIDN047進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增人睪丸cDNA文庫(Clontech,PaloAltoCA)，獲得了人PH-20開放閱讀框。PCR產(chǎn)物用Mzel和5amHI消化，并克隆到載體IRESpuro2(Clontech)的A7zel和SamHI位點(diǎn)。實(shí)施例4由人PH20cDNA分離出SHASEGP為了構(gòu)建分泌形式的sHASEGP，缺少疏水性C末端的截短變體被構(gòu)建。使用GPI切割預(yù)測程序，GPI錨切割位點(diǎn)被定位于該全長的GPI錨定的蛋白中的氨基酸位置N483附近。由7個(gè)嵌套3'引物組成的引物組被用來構(gòu)建7個(gè)截短的缺失變體，所述變體從位置Y482處開始缺少預(yù)測的GPI錨，并由此逐步剔除一個(gè)又一個(gè)的氨基酸。這些引物被設(shè)計(jì)成具有相容的Nhel(5')和BamHl(3')位點(diǎn)，以便將所述的截短變體克隆進(jìn)載體Irespuro2，其中或者在3'引物中使用終止密碼子未標(biāo)記，或者其作為C末端用His標(biāo)記的蛋白質(zhì)以方便純化和檢測。例如，反向引物SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10被用來產(chǎn)生剔除突變子，以位置Y482、F481和I480為末端，無6-His標(biāo)記。其他變體引物用同樣的堿基設(shè)計(jì)產(chǎn)生，其中進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椧园ê团懦囟ǖ陌被?。為了產(chǎn)生His-標(biāo)記的變體，用于非標(biāo)記的變體的同一組引物被類似地使用，不同的是在各自的反向引物中缺少終止密碼子，而正向引物是相同的(對于His標(biāo)記的構(gòu)建物，是指具有SEQIDNo19、20、21、22、23、24和25的引物，它們是沒有終止密碼子的反向引物，對應(yīng)于它們各自的構(gòu)建物的非標(biāo)記的反向引物)。重疊的引物被用來構(gòu)建6個(gè)氨基酸的間隔子，然后跟著在Irespuro2載體中的BamHl和Notl位點(diǎn)內(nèi)的六聚組氨酸，這樣，His-標(biāo)記的突變體通過在含有所述his標(biāo)記的Irespuro2載體中的Nhel和BamHl位點(diǎn)內(nèi)將PCR擴(kuò)增并經(jīng)過限制性消化的產(chǎn)物連接起來而產(chǎn)生。為了確認(rèn)人sHASEGP是否可以在它的羧基末端進(jìn)行修飾而產(chǎn)生分泌型中性活性酶，在GPI錨附著位點(diǎn)至預(yù)測的"催化結(jié)構(gòu)域"范圍進(jìn)行一系列的截短，被預(yù)測的"催化結(jié)構(gòu)域"是依據(jù)與蜂毒酶的同源性獲得的。在IRESPuro2中的編碼人sHASEGP全長GPI錨定克隆的DNA被用作模板以產(chǎn)生各種截?cái)嗟娜笔ё凅w。軟件建模程序給出了全長多肽的若干預(yù)測的切割位點(diǎn)。這樣的預(yù)測出的位點(diǎn)之一在氨基酸位置N483(SEQIDNo.l)。PCR引物被設(shè)計(jì)用來從N483起連續(xù)地截短蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生6個(gè)缺失突變體，以Y482(缺少N)開始，至E477(缺少P)結(jié)束。a.實(shí)驗(yàn)方案產(chǎn)生缺少N483的截短變體在pIRESPuro2的Nhel和BanHl之間的全長GPI錨定sHASEGP克隆被用作模板。該模板用含有Nhel位點(diǎn)的5'引物——其從天然信號肽的起始甲硫氨酸Ml開始(SEQIDNo.14)，和含有BamHl位點(diǎn)的3'引物——其在Y482處結(jié)束(SEQIDNo.8)進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物在l。/。瓊脂糖凝膠上跑膠，以分離并確認(rèn)準(zhǔn)確大小的擴(kuò)增帶，將膠純化，用NheI和BamHI限制性消化，再克隆入載體pIRESPuro2(Clontech)的Nhel和BamHI位點(diǎn)之間，產(chǎn)生用于表達(dá)該SHASEGP截短突變體的表達(dá)載體，該截短突變體在氨基酸位置Y482處結(jié)束，缺少GPI錨，具有所描述的氨基酸序列(SEQIDNo.5，對應(yīng)于所獲得的sHASEGP多肽的序列，直至Y482)和核苷酸序列(SEQIDNo.48:為SEQIDNo.5多肽的編碼核苷酸)。其它的分別缺少Y482、F481、1480、Q479和P478的截短突變體被產(chǎn)生。使用同樣的策略，唯一的差異是對于各個(gè)突變體使用合適的3'引物。各3'引物描述如下用于缺少Y482的sHASEGP突變體的3'引物一SEQIDNo.9用于缺少F481的突變體的3'引物一SEQIDNo.10用于缺少I480的突變體的3'引物—SEQIDNo.ll用于缺少Q(mào)479的突變體的3'引物一SEQIDNo.12用于缺少P478的突變體的3'引物一SEQIDNo.13產(chǎn)生進(jìn)一步的缺失突變體以確定sHASEGP的最小化的活性結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步的剔除作用是從上述的sHASEGP截短至最內(nèi)部的、序列至E477的中性pH活性截短突變體的3'末端，以10至20個(gè)氨基酸的氨基酸塊為單位來進(jìn)行的。Nhel正向引物SEQIDNo.14與適當(dāng)定位的3'引物被用來PCR擴(kuò)增sHASEGP剔除變體，其中從羧基末端剔除掉了所期望的長度。例如，用描述于SEQIDNo.14和SEQIDNo.26的引物分別作為5'和3'引物進(jìn)行PCR，當(dāng)被IresPuro2載體中的表達(dá)構(gòu)建物表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生了SEQIDNo.49中的多肽。類似地，用SEQIDNo27、28、29、30、31和32中描述的反向3'引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)生分別以成熟sHASEGP的氨基酸位置A447、S430、G413、S394、A372和S347為末端的剔除突變體。在每一種情況下，PCR產(chǎn)物用Nhel和BamHI消化，消化得到的產(chǎn)物克隆入plresPuro2載體的Nhel和BamHI位點(diǎn)之間。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入在CD-CHO無血清培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)中的CHO細(xì)胞，每一組的最終表達(dá)構(gòu)建物的一些獨(dú)立克隆被測試其分泌型中性活性sHASEGP活性，樣品在指定的時(shí)間點(diǎn)被取出以用于測定。依照制造商推薦的實(shí)驗(yàn)方案，從過夜培養(yǎng)物制備得到的小量制備DNA用Genejuice(Novagen，CA)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。用上面描述的微量滴定分析方法測量透明質(zhì)酸酶活性。sHASEGP截短突變體的透明質(zhì)酸酶活性被測量，從而鑒定出具有分泌型中性活性透明質(zhì)酸酶活性的最小化活性結(jié)構(gòu)域。<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>4810.7404820.3294830.,5090.044結(jié)果顯示，上述的所有6個(gè)氨基酸剔除突變體——其以Y482至E477中的指示出的氨基酸為末端，均比GPI錨定sHASEGP,給出更高的分泌的活性。結(jié)果還顯示，剔除范圍超過A467的剔除消除了所有的分泌型活性。A467克隆的分泌型中性活性降至P478或N483克隆中所發(fā)現(xiàn)的活性的大約10%。因此推斷，比起先前由蜂毒酶假定的情況，需要人sHASEGP羧基末端結(jié)構(gòu)域的更多部分來產(chǎn)生中性活性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，羧基末端結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸是中性活性所必需的。N483處的GPI切割位點(diǎn)之前的約IO個(gè)氨基酸的非常窄的范圍界定了最小活性結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例5信號肽的修飾對SHASEGP分泌活性的影響人sHASEGP具有異常長的預(yù)測出的天然前導(dǎo)肽。此外，在該前導(dǎo)肽中的兩個(gè)鄰近的半胱氨酸殘基的存在可能導(dǎo)致在高水平表達(dá)期間多肽多聚體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的聚集，并因此阻止了sHASEGP的高水平表達(dá)。因此，一系列更具效率的促分泌前導(dǎo)肽被測試，以檢測它們增強(qiáng)sHASEGP靶向分泌的能力。a.實(shí)驗(yàn)方案通過重疊引物退火并用引物進(jìn)行PCR延伸，構(gòu)建出Kappa前導(dǎo)肽，所述的引物對應(yīng)于SEQIDNo37、38、39和40中的序列。所獲得的PCR擴(kuò)增的kappa序歹IJ，用側(cè)翼引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述側(cè)翼引物在5'端含有Nhel位點(diǎn)(如SEQIDNo.41中描述)，在3'端含有EcoRl位點(diǎn)(如在SEQIDNo.42中描述)。這使得能在Litmus39(NEB)載體的Nhel和EcoRI位點(diǎn)之間克隆Kappa前導(dǎo)肽(該多肽序列在SEQIDNo.43中描述)。sHASEGP具有內(nèi)部EcoRI位點(diǎn)因此，Nhel位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)之間的該kappa構(gòu)建物，進(jìn)一步用5'Spel引物(如SEQIDNo.44中描述)和3'Mlul引物(如SEQIDNo.45中描述)擴(kuò)增。以P478為末端的無GPI錨的sHASEGP用Nhel和Bamffl從plresPuro2中切割出來，并克隆入Litmus39(NEB)載體的Nhel和Bamffl位點(diǎn)內(nèi)。由此獲得的含有sHASEGP的Litmus載體用Spel和Mlul限制酶消化，用Spel和Mlul引物將擴(kuò)增的kappa前導(dǎo)肽構(gòu)建物克隆入該載體中。在該含有Kappa和sHASEGP序列的Litmus39載體上進(jìn)行定點(diǎn)突變，以使sHASEGP的成熟多肽與Kappa前導(dǎo)序列能夠融合在同一閱讀框架中。對應(yīng)于SEQIDNo.34和35的引物對被用來產(chǎn)生以天然Asp為末端氨基酸的kappa前導(dǎo)序列，該Asp被融合到sHASEGP的F38(sHASEGP的序列至P478)(如SEQIDNo.46中描述的融合蛋白質(zhì)的多肽序列)。其他引物對組合例如SEQIDNo.33和SEQIDNo.35，被用來產(chǎn)生以Asp(D)為末端的Kappa前導(dǎo)序列，其融合到SHASEGP的L36;SEQIDNo.33和SEQIDNo.36被用來產(chǎn)生以Gly(G)(在所述的末端Asp(D)前面)為末端的Kappa前導(dǎo)序列，其融合到SHASEGP的L36;SEQIDNo.34和SEQIDNo.36被用來產(chǎn)生以Gly(G)(在所述的末端Asp(D)的前面)為末端的Kappa，其融合到SHASEGP的F38。通過定點(diǎn)誘變獲得的Kappa-sHASEGP融合蛋白用凝膠純化，用酶Dpnl消化，以消化任何延續(xù)下來的親代DNA，然后用Nhel和BamHI消化，并克隆入已用Nhel/BamHI消化的HisIresPuro2骨架，該骨架在pIRESPuro2載體的BamHl和Notl位點(diǎn)之間克隆有his標(biāo)記(6個(gè)氨基酸的間隔子，隨后跟著6個(gè)組氨酸)。因此，連接完成之后，我們獲得了plresPuro2中的Nhel-kappa-SHASEGP-BamHI-His構(gòu)建物。獲得4組這樣的構(gòu)建物，其對應(yīng)于在Kappa前導(dǎo)序列的末端的G或D和在成熟sHASEGP的起始端的L36或F38的組合。來自每一類構(gòu)建物的一些獨(dú)立克隆被轉(zhuǎn)染入CD-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)中的CHO細(xì)胞，以測試與天然的分泌前導(dǎo)序列相比，kappa分泌前導(dǎo)序列的存在是否會促進(jìn)分泌蛋白質(zhì)的水平增加。從過夜培養(yǎng)物制備獲得的小量制備DNA用Genejuice(Novagen，CA)轉(zhuǎn)染試劑，依據(jù)制造商推薦的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在指定的時(shí)間點(diǎn)收取樣品以用于微量滴定分析測試。透明質(zhì)酸酶活性按照上面描述的微量滴定分析方法來測量。小鼠IgGKappa鏈前導(dǎo)肽sHASEGP融合構(gòu)建物被測試，以測試出更高水平的分泌型中性活性sHASEGP活性。b.結(jié)果人sHASEGP基因構(gòu)建物U/ML/24小時(shí)，PH7.4IgGKappa前導(dǎo)肽sHASEGP氨基酸38-478HIS63.0257天然前導(dǎo)肽sHASEGP氨基酸1-478HIS60.4857酶分析的結(jié)果表明，當(dāng)與缺少IgGKappa前導(dǎo)序列的克隆P478、Y482或N483相比時(shí)，相對于天然的分泌前導(dǎo)序列，IgGKappa前導(dǎo)序列能夠?qū)HASEGP的分泌增強(qiáng)約7至8倍。具有變化的前導(dǎo)序列融合位點(diǎn)的其它kappa前導(dǎo)序列構(gòu)建物也產(chǎn)生了增加水平的分泌型中性活性透明質(zhì)酸酶活性，其中所述的前導(dǎo)序列融合位點(diǎn)是從該Kappa前導(dǎo)序列的Asp或Gly至sHASEGP的L36或F38。這些實(shí)施例旨在擴(kuò)展而不是限制本發(fā)明的范圍，其他有效的促分泌前導(dǎo)序列可以采用同樣的技術(shù)而被利用。實(shí)施例6人sHASEGP表達(dá)載體的產(chǎn)生通過克隆入雙順反子表達(dá)序列盒HZ24(SEQIDNO47)，產(chǎn)生不帶表位標(biāo)記的sHASEGP。表達(dá)sHASEGP的HZ24質(zhì)粒載體包括pCI載體骨架(Promega)、編碼人PH20透明質(zhì)酸酶的氨基酸1-482的DNA序列、來自ECMV病毒(Clontech)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。pCI載體骨架也包括編碼13-內(nèi)酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、fl復(fù)制起點(diǎn)、巨細(xì)胞病毒即刻早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)(CMV)、嵌合內(nèi)含子和SV40晚期多聚腺苷酸化信號(SV40)。編碼sHASEGP構(gòu)建物的DNA在天然信號前導(dǎo)序列的甲硫氨酸處含有Kozak共有序列，在酪氨酸482處含有終止密碼子。得到的構(gòu)建物pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ-24)導(dǎo)致由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的單一mRNA，它編碼PH20的氨基酸1-482和二氫葉酸還原酶的氨基酸1-187，它們由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)分隔開。利用5'引物和反向引物，將人PH20開放閱讀框從IrivitrogenORF克隆(IOH10647,Invitrogen，CarlsbadCA)中擴(kuò)增出來，其中所述的5'引物在PH20的甲硫氨酸之前引入了Nhel位點(diǎn)和Kozack共用序列，所述的反向引物在酪氨酸482之后引入了終止密碼子并引入了BamHl限制性位點(diǎn)。用Nhel和BamHI消化PH20PCR片段后，將所得到的PCR產(chǎn)物連接入質(zhì)粒pIRESpuro2(Clontech,PaloAlto,CA)。實(shí)施例7sHASEGP表達(dá)細(xì)胞系的產(chǎn)生將培養(yǎng)于補(bǔ)充有4mM谷氨酰胺和18mlPlurionicF68/L(Gibco)的用于DHFR(-)細(xì)胞的GIBCO改良型CD-CHO培養(yǎng)基中的未轉(zhuǎn)染DG44CHO細(xì)胞，在0.5xl()S細(xì)胞/ml時(shí)接種到搖瓶中以準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染。細(xì)胞于37'C培養(yǎng)在5%C02的濕潤培養(yǎng)器中，并進(jìn)行120rpm的振蕩。在轉(zhuǎn)染之前，測試指數(shù)生長的未轉(zhuǎn)染DG44CHO細(xì)胞的存活率。將未轉(zhuǎn)染的DG44CHO細(xì)胞培養(yǎng)物的60,000,000個(gè)存活細(xì)胞進(jìn)行沉淀，并重新懸浮于0.7mL的2x轉(zhuǎn)染緩沖液(2xHeBS=40mMHepes,pH7.0、274mMNaCl、10mMKC1，1.4mMNa2HP04、12mM右旋糖)中，濃度為20,000,000個(gè)細(xì)胞。向每一等份的重懸浮細(xì)胞，加入0.09mL的線性HZ24質(zhì)粒(250ug)，在室溫下將細(xì)胞/DNA溶液轉(zhuǎn)移入0.4cm間隙BTX(Gentronics)電穿孔小盒。在沒有與細(xì)胞混合的質(zhì)粒DNA的情況下進(jìn)行陰性對照電穿孔。細(xì)胞/質(zhì)?；旌衔锉浑姶┛讜r(shí)，電容器的放電條件為330V和960nF或者350V和960pF。電穿孔之后，將細(xì)胞從小盒中移出，并轉(zhuǎn)移到5mL的改良CD-CHO培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基是用于DHFR(-)細(xì)胞，補(bǔ)充有4mM谷氨酰胺和18mlPlurionicF68/L(Gibco)，讓培養(yǎng)物在6孔組織培養(yǎng)板的孔中生長兩天而不進(jìn)行選擇，培養(yǎng)板是置于37°C的5%C02濕潤培養(yǎng)箱中。電穿孔2天之后，從各個(gè)孔中移出0.5mL的組織培養(yǎng)基，并測試透明質(zhì)酸酶活性的存在。在轉(zhuǎn)染后的40小時(shí)，HZ24轉(zhuǎn)染的DG44CHO細(xì)胞的初始透明質(zhì)酸酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table>〖0725]來自轉(zhuǎn)染2(350V)的細(xì)胞從組織培養(yǎng)孔中收集，計(jì)數(shù)，并稀釋至每毫升10,000至20,000個(gè)存活細(xì)胞。將O.lmL的細(xì)胞懸浮液等份試樣轉(zhuǎn)移到5個(gè)96孔圓底組織培養(yǎng)板的各個(gè)孔中。將O.lmL的CD-CHO培養(yǎng)基(GIBCO)加入到含有細(xì)胞的孔中(最終體積0.2mL),所述CD-CHO培養(yǎng)基含有4mMGlutamax-l并且沒有次黃嘌呤和胸苷補(bǔ)充物。由在無甲氨蝶呤的條件下培養(yǎng)的5個(gè)板中鑒定得到的10個(gè)克隆板/孔ID相對透明質(zhì)酸酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table>6個(gè)HZ24克隆被培養(yǎng)放大，并作為單細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到搖瓶。使用二維無限稀釋策略(two-dimensionalinfinitedilutionstrategy),將克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10接種到96孔圓底組織培養(yǎng)板。將稀釋的克隆培養(yǎng)在500個(gè)未轉(zhuǎn)染DG44CHO細(xì)胞/孔的背景中，以便為最初幾天的培養(yǎng)提供必要的生長因子。每一亞克隆制備10個(gè)板?？寺?D3產(chǎn)生24個(gè)可見的亞克隆。這24個(gè)亞克隆中8個(gè)亞克隆的上清液中測量到了明顯的透明質(zhì)酸酶活性(>50單位/mL),這8個(gè)亞克隆在存在50nM甲氨蝶呤的條件下放大培養(yǎng)于T-25組織培養(yǎng)瓶中。克隆3D350nM在存在500nM甲氨蝶呤的條件下被進(jìn)一步放大，在搖瓶中獲得了活性超過1,000單位/ml的克隆(克隆3D35M)。實(shí)施例8sHASEGP的產(chǎn)生將一小管的3D35M解凍，并由T型搖瓶通過1L轉(zhuǎn)瓶來進(jìn)行放大，它們培養(yǎng)在補(bǔ)充有100nM甲氨蝶呤和Glutamax(Invitrogen)的CHOCDM(Invitrogen,CarslbadCA)中。細(xì)胞由轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)移到5L生物反應(yīng)器(Braun)，接種密度為4.0xlOE5個(gè)存活細(xì)胞/ml。參數(shù)為溫度設(shè)置值37°C、pH7.2(起始設(shè)置值)、溶解氧設(shè)置值25%和空氣覆蓋(airoverlay)為0-100cc/min。在168小時(shí)時(shí)，加入250ml的供給弁1培養(yǎng)基(CDCHO+50g/L葡萄糖)。在216小時(shí)時(shí)，加入250ml的供給#2培養(yǎng)基(CDCHO+50g/L葡萄糖+10mM丁酸鈉)，在264小時(shí)時(shí)，加入250ml的供給#2培養(yǎng)基。該過程產(chǎn)生的最終生產(chǎn)率為1600單位/ml，最大細(xì)胞密度為6百萬細(xì)胞/ml。發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)的最后階段加入丁酸鈉顯著地增加了sHASEGP的產(chǎn)量。3D3-5M生長&sHASEGP產(chǎn)量，5L生物反應(yīng)器<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table>實(shí)施例9sHASEGP的純化通過深度過濾和切向流透析到10mMHepespH7.0中，將來自3D3克隆的條件培養(yǎng)基澄清化。然后通過Q瓊脂糖(Pharmacia)離子交換、苯基瓊脂糖(Pharmacia)疏水相互作用層析、苯基硼酸鹽(Prometics)和羥磷灰石層析(Biorad,Richmond,CA)的連續(xù)層析，純化可溶性HASEGP。SHASEGP被結(jié)合到瓊脂糖，用含有400mMNaCI的同樣的緩沖液洗脫。將洗脫物用2M硫酸銨稀釋至最終濃度為500mMASO4，并通過苯基瓊脂糖(lowsub)柱，然后在同樣的條件下結(jié)合到苯基硼酸樹脂。用pH9.0、無AS04的50mMN-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)洗滌之后，sHASEGP用HepespH6.9從該苯基瓊脂糖樹脂上洗脫下來。將洗脫物加載到陶瓷羥磷灰石樹脂上，pH6.9，在5mMP04lmMCaCl2中，再用含有0.1mMCaCl2的80mMPO4pH7.4洗脫。借助于使用USP參考標(biāo)準(zhǔn)的微濁度分析(microturbidityassay),確定所獲得的純化的sHASEGP具有超過65,000USP單位/mg蛋白的比活性。純化的sHASEGP在24至26分鐘以單峰的形式，用在0.1%TFA/H2O和0.P/。TFA/90。/o乙腈/10%1120之間的梯度從Pharmacia5RPC苯乙烯二乙烯基苯柱上洗脫出來，經(jīng)SDS電泳的辨認(rèn)，為單一的61kDa的較寬條帶，而用PNGASE-F處理之后，其減為51kDa的較銳利的條帶。N-末端氨基酸測序揭示，前導(dǎo)肽已被有效地去除。生物化學(xué)方法純化的sHASEGP的N-末端氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table>實(shí)施例10DG44CHO來源的sHASEGP糖基化作用的分析關(guān)于來自不同物種的sHASEGP是否需要糖基化作用以實(shí)現(xiàn)它們的催化活性，存在相互矛盾的數(shù)據(jù)。例如，據(jù)報(bào)道，具有酶促催化活性的蜜蜂蜂毒透明質(zhì)酸酶可以在缺少糖基化機(jī)制的細(xì)胞諸如大腸桿菌中合成。而且，用PNGase處理純化的牛睪丸透明質(zhì)酸酶不會使酶活性失活(Yamagataeta11997)。其他研究報(bào)道，去糖基化作用之后，活性喪失，而且二硫鍵是額外地需要的。所有之前的測試都是使用粗制的或部分純化的制劑來進(jìn)行，然而，還沒有弄清楚，活性的喪失是由于去糖基化的酶被暴露于粗制劑中污染的蛋白酶，還是由于糖基化作用和催化活性之間的直接功能關(guān)系。a.實(shí)驗(yàn)方案為了確定在無蛋白質(zhì)的條件下使用CHO表達(dá)系統(tǒng)，功能性的N-連接糖基化作用是否能被導(dǎo)入人sHASEGP，編碼人sHASEGP-HIS6的cDNA被表達(dá)于CHO細(xì)胞中，這是通過使用IRESpuro雙順反子表達(dá)盒在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。將細(xì)胞在CHOCDM(Invitrogen/Gibco)中培養(yǎng)72小時(shí)，然后濃縮，用30kDa截留膜(cutoffmembranes)在PelliconTFF單元(Millipore)上進(jìn)行切向流透析。將濃縮物與iomMHepesPH7.450mMNaCl進(jìn)行交換。然后將透析后所得物加載在DEAE流線形瓊脂糖樹脂上，并在PharmaciaFPLC樹脂上，用梯度為0-1MNaCl的NaCl洗脫。人sHASEGP用10-30%NaCl洗脫下來。柱分離級分中的sHASEGP的水平證明，大部分的酶在10-30%NaCl的梯度中被回收。來自10-30%NaCl梯度的酶然后進(jìn)一步通過親合層析在帶有Ni的IMAC樹脂上純化。用50mM醋酸鹽PH5.0、lOmMImidizole洗滌之后，人sHASEGP從IMAC樹脂上洗脫得到。濃縮該蛋白，并用lOmMHepesPH7.4透析。在基于EUSA的生物素化底物的微量滴定分析中，測得高度純化的酶在lmM鈣和lmg/mlHSA存在的條件下，具有97,000單位/mg蛋白的比活性。為了檢測蛋白質(zhì)相對分子量的變化，純化的人sHASEGP用PNGASE或神經(jīng)氨酸酶處理過夜，然后進(jìn)行凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移，用連接有抗His6單克隆抗體的HRP(Qiagen)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，并進(jìn)行ECL檢測。b.結(jié)果蛋白質(zhì)印跡分析證明，在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的人sHASEGP對PNGASE的處理敏感。人sHASEGP的相對分子量顯示，蛋白質(zhì)是高度糖基化的。一旦用PNGASE進(jìn)行徹底的過夜消化之后，人sHASEGP降為單一物質(zhì)，這證明未消化的條帶的一些異質(zhì)性可能是由N-連接糖殘基造成的。PNGaseF的部分消化顯示出一系列的中間產(chǎn)物，其從未處理的蛋白發(fā)生變化，經(jīng)過更長時(shí)間的處理，則發(fā)生進(jìn)一步的變化。盡管條帶在7%凝膠上稍顯彌散，但至少可以看見6個(gè)不同的中間同工異構(gòu)型。用神經(jīng)氨酸酶對sHASEGP進(jìn)行的處理揭示，CHO細(xì)胞事實(shí)上能夠合成唾液酸化的人sHASEGP。用神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行處理，并在7%凝膠上對sHASEGP進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析后發(fā)現(xiàn)，與未處理的sHASEGP相比，CHO來源的人重組sHASEGP在遷移中顯示出約l-3kDa的變化。因此，這是第一次報(bào)道了基本上唾液酸化的人sHASEGP的產(chǎn)生。這對于人sHASEGP的穩(wěn)定性和血清半衰期的增加都是非常有價(jià)值的，因?yàn)樵S多物種的天然精液sHASEGP缺少唾液酸化，不能與唾液酸特異性凝集素進(jìn)行反應(yīng)。sHASEGP的FACE分析利用FACE分析對活性sHASEGP寡糖進(jìn)行分析，使得能夠快速確定具有催化活性的sHASEGP的特征。實(shí)驗(yàn)方案使用FACETMN-連接寡糖作圖方法(N-LinkedOligosaccharideProfiling)(Prazyme)，對來自3D35M克隆的純化的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行評價(jià)。寡糖用N-聚糖酶(a.k.aPNGase)通過酶促消化從128.7嗎的糖蛋白上切割下來，用熒光團(tuán)ANTS標(biāo)記，并用電泳進(jìn)行分離。通過將樣品以及該樣品的稀釋物和寡糖標(biāo)準(zhǔn)梯度物一同跑膠，確定出寡糖條件的相對位置，其中，所述寡糖標(biāo)準(zhǔn)梯度物以聚合度(DP)單位來表示遷移距離。結(jié)果透明質(zhì)酸酶樣品的N-譜圖由IO個(gè)條帶組成，其中的6個(gè)(其與寡糖標(biāo)準(zhǔn)條帶G5-G12—同遷移)的強(qiáng)度大于9%。而且，與G9標(biāo)準(zhǔn)物一同遷移的條帶的強(qiáng)度最強(qiáng)，為35%-46%。sHASEGP寡糖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table>311.610.0410.0410.48.3735.467.329.776.149.085.5712.493.842.3103.260.5實(shí)施例11酶活性對SHASEGPN-連接糖基化作用的依賴性a.實(shí)驗(yàn)方案將純化的HIS6sHASEGP的樣品與緩沖液在37'C混合過夜，該緩沖液含有神經(jīng)氨酸酶和PNGASE,并含有或不含有50mM辛基葡糖苷。通過凝膠遷移(gelshift),由蛋白質(zhì)印跡分析證明，寡糖被去除。b.結(jié)果樣品U紙無Rx22.01神經(jīng)氨酸酶0/N50mM辛基葡糖苷23.57PNGaseFw/50mM辛基葡糖苷0.0PNGaseF，無50mM辛基葡糖苷o/n10.74實(shí)施例12SHASEGP對硫酸化的和非硫酸化的糖胺聚糖的活性除了使用HA的微量滴定分析之外，sHASEGP對其他糖胺聚糖或蛋白聚糖的底物特異性，可以用純化的底物利用凝膠遷移分析來測試，以確定sHASEGP對其他糖胺聚糖的活性。許多透明質(zhì)酸酶分析是基于對新的還原性N-乙酰氨基基團(tuán)的產(chǎn)生(BonnerandCantey，Clin,Chim.Acta13:746-752，1966)或粘性的損失(DeSaleguietal.,Arch.Biochem.Bioplays.121:548-554,1967)或濁度(DorfmanandOtt,丄Biol.Chem.172:367,1948)的測定來進(jìn)行的。采用純化的底物時(shí)，所有這些方法都足以測定內(nèi)切葡萄糖胺活性的存在或不存在。a.實(shí)驗(yàn)方案凝膠遷移分析(GELSHIFTASSAY)——將純化的底物與重組sHASEGP混合，以測試內(nèi)切葡糖苷酶活性，該活性將使底物在凝膠中的遷移增加。硫酸軟骨素A，Aggrecan和D來自Calbiochem。透明質(zhì)素(人臍帶)、硫酸軟骨素C、硫酸皮膚素和硫酸肝素從Calbiochem獲得。人臍帶透明質(zhì)素從ICN獲得。將每一受測底物稀釋至0.1mg/ml。將純化的sHASEGP或來自表達(dá)sHASEGP的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的1(Hd樣品與9(Hd的受測底物在期望的緩沖液中混合，在37X:溫育3小時(shí)。溫育之后，用樣品緩沖液(TrisEDTAPH8.0、溴酚藍(lán)和甘油)中和樣品，然后在15%聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將膠在含有0.5%阿爾新藍(lán)的3%冰乙酸中染色過夜，然后在7%冰乙酸中脫色，檢測糖胺聚糖。通過比較在酶存在和不存在的情況下底物的遷移，來確定降解情況。b.結(jié)果將含有100單位的HASEGPHIS6的10lal溶液與帶有50[ig/ml人血清白蛋白的卯pllOmMHepes緩沖液在37'C溫育2小時(shí)，其中含有IO昭的各種糖胺聚糖和蛋白聚糖。電泳分析及隨后的阿爾新藍(lán)染色顯示，硫酸軟骨素A、C和D、Aggrecan和透明質(zhì)素中的每一種都顯示出增加的遷移變化，而硫酸肝素和硫酸軟骨素B沒有顯示出增加的遷移。未消化的糖胺聚糖的遷移在凝膠的中部表現(xiàn)為成片的模糊帶(smear)，而消化的產(chǎn)物顯示出，大部分的阿爾新藍(lán)染色跑在染料的前端，少量的物質(zhì)是以遞增的梯度在遷移。實(shí)施例13金屬離子對sHASEGP活化的影響除了需要糖基化作用以獲得最佳酶活性之外，發(fā)現(xiàn)人sHASEGP還用陽離子激活以獲得最佳的酶活性。在純化的過程中，在連續(xù)的層析步驟之后，發(fā)現(xiàn)sHASEGP具有低的比活性。當(dāng)通過DEAE以及隨后繼續(xù)的Ni-IMAC純化被純化至同質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)HIS6標(biāo)記的sHASEGP具有非常低的比活性。因?yàn)镮MAC樹脂能螯合金屬離子，所以將各種金屬加回到sHASEGP，以測定相對酶活性。a.實(shí)驗(yàn)方案純化的sHASEGP在用O.lmM鎳(Ni)、鈷(Co)、鋅(Zn)、鈣(Ca)和鎂(Mg)在室溫下溫育2小時(shí)后，用微量滴定分析來測定透明質(zhì)酸酶活性，從而對純化的sHASEGP進(jìn)行測試。b.結(jié)果金屬鹽添加物中性活性U/ml無添加物11,909100uMNi6細(xì)6100uMCo8.972訓(xùn)uMZn3.7476100uMCa101.9892用O.lmM鈣或O.lmM鎂溫育sHASEGP之后，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶活性顯著增加。用其他金屬溫育之后，未見此種激活作用?；贏280的測量，向sHASEGP加入鈣使酶的比活性增加至約97,000單位/mg蛋白。然后測試鈣和鎂金屬的劑量響應(yīng)曲線，以確定酶的最佳金屬離子濃度。mM二價(jià)金屬[Ca++][Mg++]<table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table>發(fā)現(xiàn)sHASEGP的激活作用發(fā)生在微摩爾范圍內(nèi)。對鈣和鎂來說，大于lOmM的濃度都是抑制性的。為了排除針對底物而不是酶的非特異性激活作用，將含有氯化鈣的lOmMHepes緩沖液與固定化的生物素化的底物在微量滴定板上溫育，然后洗滌。當(dāng)將酶加入到已洗滌過的用鈣預(yù)溫育的板上時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)激活作用。該激活作用還在用磷脂酶C釋放的天然sHASEGP上進(jìn)行了測試，其結(jié)果顯示出類似的鈣激活作用，這排除了羧基末端HIS6表位標(biāo)記可能帶來的假結(jié)果。實(shí)施例14白蛋白對sHASEGP活性的影響發(fā)現(xiàn)為了獲得最佳活性，除了^外，對重組rHUPH20和其他屠宰物睪丸來源的透明質(zhì)酸酶制劑的稀釋還需要白蛋白。a.實(shí)驗(yàn)方案將人血清白蛋白(ICN)稀釋入含有鈣的lOmMHepes緩沖液中，以測定白蛋白蛋白對酶活性的影響。使用lmMCaCl2和lmg/ml人血清白蛋白，對sHASEGP和商業(yè)制劑進(jìn)行酶分析。b.結(jié)果在存在白蛋白的條件下的高度稀釋，發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸酶活性的激活。至于該激活作用是否是阻止了變性的結(jié)果，或者白蛋白是否影響了底物的可利用性，尚不清楚。因此，人sHASEGP的優(yōu)選試劑可以包括白蛋白和由鈣或鎂組成的金屬±卜JTTL。實(shí)施例15純化的sHASEGP在體內(nèi)的散布活性(spreadingactivity)a.實(shí)驗(yàn)方案將在lOmMHepesPH7.4、150mMNaCl0.1%Pluronic(普流尼克)中的純化的sHASEGP用含0.15MNaCl的無熱原的水稀釋至濃度為0.5U/ul。用鹽水進(jìn)行一系列的稀釋，最后的體積均為2(HiL，得到每一次注射量為總共O.Ol、0.05、0.1單位的產(chǎn)物。加入20pL的臺盼藍(lán)溶液至最終體積為40pL，皮下注射入balbNu/Nu小鼠每一側(cè)的側(cè)面皮膚，這些小鼠之前己通過腹膜內(nèi)注射被麻醉，例如給予氯胺酮/甲苯噻嗪。用微測徑器，從1=0至1=45分鐘，在2維方向上測量染料面積。面積用mm2表示。作為對照，缺少中性活性但為分泌型的重組人HYAL1被包括入該實(shí)驗(yàn)。b.結(jié)果測試項(xiàng)目面積@45分鐘A.鹽水對照51.5mmB.sHASEGP0.01U76.8譲2C.sHASEGP0.05U98.22mm2D.sHASEGP0.10U180.4mm2E.HYAL1100U67.48mm^實(shí)施例16sHASEGP擴(kuò)散活性的動(dòng)力學(xué)a.實(shí)驗(yàn)方案將重組純化的sHASEGPHis6分為2個(gè)等份試樣。一份等份試樣在帶有加熱蓋的熱循環(huán)儀中加熱至95'C共15分鐘，另一等份試樣保持在室溫中。在微量滴定酶分析中確認(rèn)酶活性的熱失活。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，熱失活的和天然的材料被測試。將4單位純化的sHASEGP或等量熱失活物質(zhì)與臺盼蘭染料一同皮下注射。在長至15分鐘之內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量面積。b.結(jié)果4個(gè)單位4個(gè)單位，熱失活的t注射后分鐘t注射后分鐘t0=52.38t0=50.58t3=116.51t3=65.48t65=181.93t6.5=63.87ti。=216.96t10=65.80t16=279.99t16=74.3實(shí)施例17sHASEGP分解的皮膚屏障的恢復(fù)a.實(shí)驗(yàn)方案為了確定在皮下給藥后被sHASEGP打開的孔的再建時(shí)間，在tK)時(shí)，將2單位的純化的sHASEGP或鹽水對照經(jīng)皮下注射入動(dòng)物的兩個(gè)相對的側(cè)面位點(diǎn)，然后在30分鐘、60分鐘和24小時(shí)時(shí)，在同樣的位點(diǎn)注射臺盼藍(lán)。在注射后第15分鐘記錄染料擴(kuò)散的面積，并與對照比較。b.結(jié)果2單位鹽水對照t注射sHASEGP后小時(shí)t注射sHASEGP后小時(shí)t。.5h=183t0.5h=54tihr=167tih尸50t22hr=61t22h產(chǎn)48該結(jié)果顯示，皮膚屏障在給予2單位酶之后的24小時(shí)內(nèi)重新形成。實(shí)施例18sHASEGP開啟的通道大小的測定已經(jīng)顯示，人sHASEGP在間質(zhì)中打開了足以允許小分子例如臺盼藍(lán)染料擴(kuò)散通過的通道。然而，不知道在sHASEGP存在的情況下可以擴(kuò)散的顆粒的尺寸上限是多少。a.實(shí)驗(yàn)方案各種不同大小的熒光分子被用來測定由人sHASEGP打開的通道的大小。以40pl的體積，在皮下注射入平均分子量為4,400和2,000,000Da的熒光葡聚糖(FlouresceinatedDextrans,Sigma)以及具有20納米至500納米范圍內(nèi)的確定直徑的熒光素標(biāo)記珠子(MolecularProbes),然后在同樣的位置注射sHASEGP或鹽水對照。在注射后15分鐘，在二維方向上測量染料前線包括的面積。b.結(jié)果擴(kuò)散試劑擴(kuò)散測試顆粒大小15分鐘時(shí)的面積標(biāo)準(zhǔn)偏差sHASEGP4400Da84.225.7對照4400Da38.05.8sHASEGP2x10E6Da141.24.5對照2xlOE6Da51.78,1sHASEGP20nm直徑92.320.6對照20nm直徑51.63.0sHASEGP腦nm直徑61.05.7對照100nm直徑40.07.0sHASEGP200nm直徑35.51.6對照200nm直徑27.98.2sHASEGP500nm直徑44.813.6對照500nm直徑41.29.8結(jié)果顯示，給予sHASEGP之后，從約1kDa(臺盼藍(lán))至直徑50nm(乳膠珠)的分子都顯示出擴(kuò)散增加。牛血清白蛋白(66kDa)顯示出與臺盼藍(lán)相似的擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)，而50nm乳膠珠則需要更多的時(shí)間來擴(kuò)散。500nm珠直到480分鐘時(shí)也沒有顯示出擴(kuò)散。實(shí)施例19與人SHASEGP皮下共注射之后生物素化抗體的血清藥物動(dòng)力學(xué)特性a.實(shí)驗(yàn)方案雌性Balb/c小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉。然后小鼠用與20^1鹽水或20nL含有4單位活性的sHASEGP相混合的20pL0.5mg/ml的生物素化小鼠IgG進(jìn)行皮下注射。b.結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table>結(jié)果證明，sHASEGP增加了大分子在循環(huán)中的血清分布動(dòng)力學(xué)。在2小時(shí)時(shí)，對照組中沒有檢測到生物素化的IgG，而在sHASEGP組中，在2小時(shí)時(shí)，明顯地檢測到360ng/ml的濃度。實(shí)施例20在靜脈內(nèi)注射人sHASEGP之后，皮下注射的分子的擴(kuò)散活性a.實(shí)驗(yàn)方案對于每一劑量的各種受測物質(zhì)和載劑對照，四個(gè)染料注射位點(diǎn)被利用。染料注射在靜脈注射的45分鐘后進(jìn)行。每種劑量的受測物質(zhì)或?qū)φ瘴镔|(zhì)被靜脈注射入2只動(dòng)物。對于每一劑量或載體對照，在酶給藥45分鐘之后進(jìn)行染料注射，在2.5、5、IO和15分鐘計(jì)算測定染料前沿面積。b.結(jié)果結(jié)果顯示，在靜脈內(nèi)給藥后，高度純化的sHASEGP是可全身性地獲得的，直至遠(yuǎn)端組織。全身性地給予的sHASEGP的散布活性是劑量依賴性的，10單位的注射不能與載劑對照辨別開來。<table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>實(shí)施例21—聚乙二醇化的例證性應(yīng)用，為了產(chǎn)生顯示出改良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的修飾的sHASEGPs作為通過聚乙二醇化作用來產(chǎn)生具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)——例如增加的血清半衰期~"的修飾形式sHASEGPs的例證性的實(shí)例，如上所述，我們將直鏈或支鏈的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)部分連接到示例性sHASEGP，重組人類PH20(rHuPH20)。許多不同功能活化基團(tuán)可被用于將PEG部分連接到sHASEGP，例如，rHuPH20(包括，舉例來說，醛、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺及其它)。許多不同聚乙二醇化試劑可從各種來源，包括NektarTherapeutics(www.nektar.com)以及許多其4也白勺4共應(yīng)商(www.pharma.dow.com、www.nof.co.jp、www.sunbio.com、www.celares.com)商業(yè)上得到。為了舉例說明，按照本文所述，rHuPH20已經(jīng)使用許多例證性的PEG試劑被有效地聚乙二醇化，產(chǎn)生許多不同的聚乙二醇化的rHuPH20酶。類似的方法也已經(jīng)被應(yīng)用于其它透明質(zhì)酸酶，包括例證性的動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶(使用羊睪丸透明質(zhì)酸酶制劑，其從ISTAPharmaceuticals可得到，為VitraseTM)、例證性的細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸酶(使用細(xì)菌透明質(zhì)酸酶制劑，其從Sigma可得到，為HyaluronateLyase)和例證性的細(xì)菌來源的具有透明質(zhì)酸酶活性的軟骨素酶(使用細(xì)菌的軟骨素酶ABC制劑，其從AssociatesofCapeCod,Inc./SeikagakuCorporation可得到，為軟骨素酶ABC)。除了改變功能基團(tuán)之外，各種不同長度和結(jié)構(gòu)的PEG可得到，其可通過使用特定的功能基團(tuán)而被整合。為了舉例說明，長度為5至60KDa范圍(例如，5、10、20、30、40和60KDa)的PEG已經(jīng)被結(jié)合到rHuPH20上。另外各種具有不同長度和結(jié)構(gòu)的不同PEG可以容易地從來源中得到，所述來源包括Nektar、theDowChemicalCorporation(Dowpharma.)、NOFCorporation、Sunbio、Celares和l其它來源。與PEG試劑和將蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法相關(guān)的很多參考文獻(xiàn)在本領(lǐng)域是已知的，包括本文所引用的許多綜述和論文(參見，例如Roberts,MJetal.AdvancedDrugDeliveryReview2002,54:459-476;HarrisJMandZalipsky,S(eds)of"Poly(ethyleneglycol),ChemistryandBiologicalApplications"ACSSymposiumSeries680(1997);Mehvar,Retal.J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3(1):125-136(2000);Harris,JM,NatureReviews2:215etseq.(2003);Tsubery，H.,JBiol.Chem279(37):38118-24(2004));并且在描述聚乙二醇化作用和各種試劑和方法的許多參考文獻(xiàn)中被進(jìn)一歩描述(參見，例如Monfardini,Cetal，BioconjugateChem.6:62-69(1995);VeroneseFMetal.,J.BioactiveCompatiblePolymers12:197-207(1997));以及各種美國和其他出版的專利和申請，包括US5,672,662;US5,932,462;US6,495,659和US6,737,505;以及美國專利4，002，531;4,179,337;5,122,614;5,183,550;5.324,844;5,446，090;5,612,460;5,643，575;5,766,581;5，795，569;5,808,096:5，卯0,461;5,919,455;5,985,263;5,990.237;6.113,906;6,214,966;6,258,351;6.340.742;6.413,507;6,420.339;6,437,025;6,448,369:6,461,802:6.828,401;6.858,736;美國專利申諾公丌20010021763;20010044526:20010046481;20020052430;20020072573:20020156047:20030114647;200301435%;20030158333;20030220447:20040013637;2005000360;20050114037;20050171328和20050209416;和歐洲公開EP01064951和EP0822199;PCT公開WO00176640;WO0002017;WO0249673;WO9428024和WO0187925(其中的每一種出版物在此引用以作參考)。實(shí)施例21-A:例證性的聚乙二醇化形式的人類重組透明質(zhì)酸酶作為例證性sGASEGP的聚乙二醇化的示例性說明，PEG醛、琥珀酰亞胺和碳酸鹽每個(gè)都已經(jīng)被應(yīng)用于將PEG部分連接到rHuPH20。在這三種化學(xué)術(shù)中，琥珀酰亞胺基PEG在rHuPH20這種情況下一般是最方便使用的。例如，rHuPH20已經(jīng)被結(jié)合到示例性的琥珀酰亞胺基單體PEG(monoPEG，mPEG)試劑，該試劑包括mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酯(SuccinimidylPropionates,mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(SuccinimidylButanoates，mPEG-SBA)禾口(為了連接"支鏈"PEG)mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺。這些聚乙二醇化的琥珀酰亞胺酯含有位于PEG基團(tuán)和活化交聯(lián)劑之間的不同長度的碳骨架，和單個(gè)或帶支鏈的PEG基團(tuán)。這些區(qū)別可以被使用，例如，以提供不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和在結(jié)合過程中潛在地限制PEG連接到rHuPH20的可利用的位點(diǎn)。含有直鏈或支鏈PEG的琥珀酰亞胺PEG(如上)已經(jīng)被結(jié)合到rHuPH20。采用本領(lǐng)域所述的組分和技術(shù)，琥珀酰亞胺PEG已經(jīng)被用于可再生性地產(chǎn)生rHuPH20，其包括每個(gè)sHASEGP含有大約三到六個(gè)PEG分子的分子組合。這種聚乙二醇化的rHuPH20組合物很容易被純化，從而產(chǎn)生這樣的組合物，其具有大約25000Unit/mg蛋白透明質(zhì)酸酶活性的比活性，且基本不含非聚乙二醇化的rHuPH20(少于5%的非聚乙二醇化形式)。正如本領(lǐng)域已知的以及例如在包括上面引用的那些在內(nèi)的聚乙二醇化參考文獻(xiàn)中描述的，各種試劑和技術(shù)也可被利用，以實(shí)現(xiàn)與多分散性PEG產(chǎn)物不同的單分散PEG產(chǎn)物(參見，例如在上面詳述的說明書中引用的與位點(diǎn)特異性單聚乙二醇化和定點(diǎn)聚乙二醇化相關(guān)的綜述和參考文獻(xiàn))。與未修飾形式的sHASEGP相比，在將聚乙二醇化的sHASEGP給藥之后，在動(dòng)物模型中已經(jīng)觀察到藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)方面的改進(jìn)。舉例來說，在給小鼠靜脈注射1000單位的未修飾rHuPH20或1000單位的結(jié)合有分子量大約為40kDa的PEG的rHuPH20(rHuPH20-PEG40)之后，觀察到用rHuPH20-PEG40處理的小鼠的血清內(nèi)的中性活性透明質(zhì)酸酶活性(PH20)的血清半衰期比用未修飾的rHuPH20處理的小鼠中的血清半衰期明顯地長(16-20倍)。此外，在大鼠中風(fēng)模型中rHuPH20-PEG40的有效性己經(jīng)與非聚乙二醇化的rHuPH20進(jìn)行比較。來自這些研究的最初的結(jié)果表明，在誘導(dǎo)中風(fēng)之后七天的大鼠存活方面，rHuPH20-PEG40(高于75-85%存活，相對于對照的低于50%)具有更大的有效性。利用可從Nektar得到的各種PEG試劑，我們使用mPEG-SBA(30kD)、mPEG-SMB(30kD)和基于mPEG2-NHS(40kD)、mPEG2-NHS(60kD)的支鏈形式，已經(jīng)制備出示例形式的人類重組透明質(zhì)酸酶(特別地，基于ifluPH20的優(yōu)選的酶)。這些試劑和許多其他試劑可以各種分子量獲得(參見，例如2005-06的Nektar產(chǎn)品目錄，其可在線得至ll:http:〃www.nektarxom或http:〃www.nektar.com/pdf/nektar—catalog.pdf，這些目錄和參考文獻(xiàn)在此引用以作參考)。許多其它的PEG試劑和方法可從其他供應(yīng)商得到和/或在本領(lǐng)域有所描述。作為舉例說明，使用NHS化學(xué)術(shù)，以及碳酸酯和醛，聚乙二醇化形式的rHuPH20己經(jīng)被產(chǎn)生，其中使用可從Nektar得到的以下各種試劑支鏈的mPEG2-NHS-40K(Nektar#2z3y0t01)、支鏈的mPEG-NHS-10K(Nektar#2z3xOLol-10)、支鏈的mPEG-NHS-20K(Nektar#2z3xOLol-20)、支鏈的mPEG-NHS-40K(Nektar#2z3xOLo1-40)、支鏈白勺mPEG2-NHS-60K(Nektar#2z3y0v01)、mPEG-SBA-5K(Nektar弁2m450h01)、mPEG-SBA-20K(Nektar#2M450p01)、mPEG-SBA-30K(Nektar#2M450r01)、mPEG-SMB-20K(Nektar#2m4k0p01)、mPEG-SMB-30K(Nektar弁2m4k0r01)、mPEG-丁醛陽30K(Nektar#072M0R01)、mPEG-SPA-20K(Nektar#2ra4mOp01)、mPEG-SPA-30K(Nektar弁2m4mOKH)，禾口PEG-NHS-5K-生物素(Nektar#0H4M0H02)。使用來自Dowphamm——陶氏化學(xué)集團(tuán)的一個(gè)分公司——的PEG試劑，我們也制得了聚乙二醇形式的透明質(zhì)酸酶(例如rHuPH20);包括用Dowpharma的對硝基苯基碳酸酯PEG(30kDa)和丙醛PEG(30kDa)聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶?；旧习凑障率龅厥褂煤蜏y試Nektar和Dowpharma試劑及其獲得產(chǎn)品，產(chǎn)生很多種聚乙二醇化透明質(zhì)酸酶組合物。采用類似技術(shù)，其它試劑和其它透明質(zhì)酸酶也可以類似地發(fā)生反應(yīng)。為了產(chǎn)生聚乙二醇形式的rHuPH20，在針對每種PEG試劑或化學(xué)術(shù)推薦的pH和其它條件下(一般地，醛反應(yīng)是在pH大約4.5下進(jìn)行，NHS反應(yīng)是在中性pH下進(jìn)行，碳酸鹽反應(yīng)是在pH大約9.5下進(jìn)行)，將純化的酶(濃度在大約1到14mg/ml之間)與摩爾過量的各種PEG試劑(--般大約10:1的摩爾過量的PEG:酶)混合。反應(yīng)組分在4攝氏度下混和大約16小時(shí)而進(jìn)行反應(yīng)。SDS-PAGE被用于初步檢測反應(yīng)產(chǎn)物。一般地，未修飾的rHuPH20被觀察到作為大約63kDa分子量的單一條帶進(jìn)行遷移。各種聚乙二醇形式的rHuPH20—般包括在大約150-200kDa范圍(典型地大約180kDa)的條帶以及大于200kDa的幾個(gè)條帶。然后我們進(jìn)行了修飾的酶產(chǎn)物的凝膠過濾，接著測試分級分離的蛋白質(zhì)的酶活性。簡單地說，按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將PEG修飾的透明質(zhì)酸酶與其各自的天然未修飾形式分離是通過使用Superose6柱(GE/Pharmacia)的凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)進(jìn)行的。用磷酸鹽緩沖鹽水作為分離的流動(dòng)相，流速為0.2ml/分鐘。該柱采用GE/Pharmacia的凝膠過濾標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)(GelFiltrationCalibrationStandards)進(jìn)行校準(zhǔn)。含有分離的透明質(zhì)素降解酶的級分，通過改進(jìn)的類國藥典濁度分析實(shí)驗(yàn)以微量滴定的形式來測試其相對透明質(zhì)酸酶活性。通過Superose6凝膠過濾柱分級分離的rHuPH20透明質(zhì)酸酶活性的峰保留體積(時(shí)問)，從未修飾的透明質(zhì)酸嗨的大約16ml(大約60到80KD的表觀分子量)移至Peg-修飾的透明質(zhì)酸酶的大約10ml(大于100,000KD到大約670，000KD的表觀分子量)。當(dāng)摩爾過量的聚乙二醇與酶反應(yīng)時(shí)，Peg修飾可明顯且完全地將所有可測酶活性移至更高分子量的修飾形式。然后我們采用酶譜法(Zymography)(利用底物凝膠電泳進(jìn)行的糖胺聚糖降解活性分析)測定各種天然和修飾的酶的酶活性。簡單地說，含有透明質(zhì)素的SDS-PAGE酶譜凝膠被鋪設(shè)，并且基本上按照以前由MiuraRO,etal.Analysisofglycosaminoglycan-degradingenzymesbysubstrategelelectrophoresis(zymography).AnalBiochem.1995Marl;225(2):333-40描述的方法進(jìn)行分析。根據(jù)表觀分子量為大約60kDa的單個(gè)條帶，天然rHuPH20透明質(zhì)酸酶表明了在酶譜凝膠中的透明質(zhì)素降解活性。rHuPH20透明質(zhì)酸酶的Peg修飾導(dǎo)致了酶譜凝膠中透明質(zhì)素降解活性的遷移，其具有在大約180kDa的酶活性信號，并且具有大于200kDa分子量的酶活性的至少2個(gè)額外條帶。這些結(jié)果和本文描述的其它結(jié)果表明，使用各種PEG試劑的任何一種，糖胺聚糖酶可以有效地通過聚乙二醇化作用而被修飾(其可被用于改變它們的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性和/或其它特性)，并且得到的酶可以保留基本的酶活性，使其可以應(yīng)用于各種不同應(yīng)用的任何一種一一尤其體內(nèi)或其它的應(yīng)用，其中修飾酶以延長其半衰期可能是有用的。實(shí)施例21-B:例證性的聚乙二醇形式的非人類透明質(zhì)酸酶盡管人類重組透明質(zhì)酸酶，在該酶被用于與人類細(xì)胞相關(guān)的方面是特別優(yōu)選的，并且當(dāng)其應(yīng)用到人體或人體內(nèi)時(shí)更是特別優(yōu)選的，但本文所闡明的技術(shù)也可被用于產(chǎn)生藥物代謝動(dòng)力學(xué)改進(jìn)形式的其它透明質(zhì)酸酶，其可在某些背景或環(huán)境下具有合適的應(yīng)用。因此，通過將本文所闡明的和本領(lǐng)域所述的方法應(yīng)用到其它透明質(zhì)酸酶，我們已經(jīng)生產(chǎn)出許多修飾的酶，其被聚乙二醇化(其可以如上所述地用于改善它們的藥物代謝動(dòng)力學(xué))而且還保留了基本的酶活性。為了舉例說明，本文所述和闡明的方法已經(jīng)被應(yīng)用于一系列不同的示范性的"非人類"透明質(zhì)酸酶，包括例證性的動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶、例證性的細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸酶和例證性的細(xì)菌來源的具有透明質(zhì)酸酶活性的軟骨素酶。如本文所述，聚乙二醇形式的這些非人類透明質(zhì)酸酶被用于有效地提供延長的半衰期(例如在靜脈給藥或其它體內(nèi)給藥之后)。作為非人類動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶的例證性的實(shí)例，我們已經(jīng)產(chǎn)生了聚乙二醇化形式的羊睪丸透明質(zhì)酸酶(可從ISTAPharmaceuticals得到，為Vitrase)。購買于ISTAPharmaceuticals的Vitrase(注射用透明質(zhì)酸酶，凍干的，OvineNDC67425-001-01，6200USP單位/瓶)是來自眼科專家的禮物。Vitrase溶液通過將凍干的Vitrase用USP0.9%氯化鈉注射液(Baxter)進(jìn)行重構(gòu)來制備。作為非人類細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸酶的例證性的實(shí)例，我們已經(jīng)產(chǎn)生了聚乙二醇化形式的細(xì)菌透明質(zhì)酸酶，其可作為透明質(zhì)酸裂解酶(HyaluronateLyase)從Sigma得到。來自Streptomyceshyalurolyticus或其它種類的透明質(zhì)酸裂解酶(CASNumber9001-54-1,ECNumber4.2.2.1)(674單位/瓶)購買于Sigma。透明質(zhì)酸裂解酶用無菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行重構(gòu)。參見，例如Ohya，T.,andKaneko,Y.Biochini.Biophys.Acta198,607,(1970)。作為非人類的具有透明質(zhì)酸酶活性的軟骨素酶的例證性的實(shí)例，我們已經(jīng)產(chǎn)生了聚乙二醇化形式的細(xì)菌軟骨素酶ABC(可為從AssociatesofCapeCod,Inc.SeikagakuCorporation得到的軟骨素酶ABC)。來自普通變形菌(Proteusvulgaris)的軟骨素酶ABC(軟骨素ABC裂解酶，軟骨素ABC消除酶，ECNumber:4.2.2.4，CASNumber:9024-13-9，cat.#100330或10033)購自AssociatesofCapeCodInc.。軟骨素酶ABC溶液是在0.1%BSA溶液中制備。參考文獻(xiàn)包括(1)Yamagata，T.，etal.，J.Biol.Chem.,243，1523(1968);(2)Saito,H.，etal.,J.Biol.Chem.，243,1536(1968);(3)Suzuki,S.,etal"J.Biol.Chem.,243，1543(1968);禾口(4)Oike，Y.,etal.，J.Biol.Chem..257,9751(1982)。作為例證性的PEG試劑，我們使用了mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(可為從Nektar得到的mPEG-SBA(30kD))。雖然mPeg-SBA-30K(甲氧基聚(乙二醇)丁酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯，平均分子量30,000，Cat#2M450R01)被用于此實(shí)施例，也可使用其它任何分子量的甲氧基聚(乙二醇)的N-羥基琥珀酰亞胺酯或者任何分子量的聚(乙二醇)的N-羥基琥珀酰亞胺酯，或任何大小的peg-醛，或任何大小的peg-碳酸酯，或其它NektarPEG試劑，或其它聚乙二醇化試劑。參考，例如Zalipsky,SandCLee,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications,"J.M.Harris,ed.，Plenum,NY，1992,cf.chapter21。為了生產(chǎn)示例性的聚乙二醇化形式的動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶，一小瓶羊睪丸透明質(zhì)酸酶(Vitrase)用0.62ml0.9%的鹽水進(jìn)行重構(gòu)(10單位/微升)，并且將0.3ml重構(gòu)的酶溶液轉(zhuǎn)移到無菌管中。將示例性的PEG試劑，mPeg-SBA-30K(9.9mg)加入到含有Vitrase溶液的管中，該管被混合直到看上去所有mPeg進(jìn)入溶液，然后該混合物在混合下于4攝氏度反應(yīng)大約16小吋。為了生產(chǎn)示例性的聚乙二醇化形式的細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸酶，一安瓿的Sigma透明質(zhì)酸裂解酶用0.7ml無菌過濾的磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行重構(gòu)(~1單位/微升)，并將0.3ml重構(gòu)的酶溶液轉(zhuǎn)移到無菌管中。將示例性的PEG試劑，mPeg-SBA-30K(9.8mg)加入到含有透明質(zhì)酸裂解酶溶液的管中，該管被混合直到看上去所有mPeg進(jìn)入溶液，然后該混合物在混合下于4攝氏度反應(yīng)大約16小時(shí)。為了生產(chǎn)示例性的聚乙二醇化形式的細(xì)菌來源的具有透明質(zhì)酸酶活性的軟骨素酶，一小瓶軟骨素酶ABC(10單位)用0.2ml的0.9%鹽水進(jìn)行重構(gòu)，并將示例性的PEG試齊IJ，mPeg-SBA-30K(12.4mg)加入到含有軟骨素酶ABC溶液的小瓶中，混合直到看上去所有mPeg進(jìn)入溶液，然后該混合物在混合下于4攝氏度反應(yīng)大約11小時(shí)。最初的分析包括應(yīng)用SDS-PAGE檢測修飾的酶，并與未修飾的對照進(jìn)行比較。簡單地說，在通過3%到8。/。的NuPageTris/Acetate凝膠(Invitrogen)分離后，用考馬斯蘭(CoomassieBlue)或銀染色觀察^部的蛋白質(zhì)。染色的條帶的分子量可通過6在同-凝膠上跑膠的已知分子鏡的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)比較,確定。Vitrase的結(jié)果如下(A)Vitrase(未修飾)，為大約如下分子量的5個(gè)條帶(kDa):90、80、63、50和40;(B)PEG-Vitrase，為大約如下分子量的7個(gè)條帶(kDa):150、180和大于200的五個(gè)條帶。軟骨素酶ABC的結(jié)果如下(A)軟骨素酶ABC(未修飾)，為大約如下分子量的6個(gè)條帶(kDa):100、80、50、38、33和30;(B)PEG-軟骨素酶ABC，為大約如下分子量的8個(gè)或更多的條帶(kDa):150-200的一到兩個(gè)條帶和大于200的六個(gè)或更多的條帶。透明質(zhì)酸裂解酶的結(jié)果如下(A)透明質(zhì)酸裂解酶(未修飾)，為大約如下分子量的一個(gè)條帶(kDa):35;(B)PEG-透明質(zhì)酸裂解酶，為大約如下分子量的四個(gè)或更多的條帶(kDa):大于200。正如被證實(shí)的，活化的聚乙二醇(例如mPeg-SBA-30K(甲氧基(聚乙二醇)丁酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯，平均分子量30,000))，可應(yīng)用于羊透明質(zhì)酸酶(例如Vitrase)、細(xì)菌軟骨素酶ABC(例如，來自普通線形菌)或細(xì)菌透明質(zhì)酸裂解酶(例如，來自Streptomyceshyalurolyticus)，以使酶制劑發(fā)生化學(xué)變化，產(chǎn)生平均分子量增加的新分子，這將與聚乙二醇形式的這些酶的產(chǎn)生聯(lián)系起來。對這些產(chǎn)物的進(jìn)一步表征提供了額外的證據(jù)，這些酶不僅僅能被有效地聚乙二醇化，而且得到的酶產(chǎn)物能在透明質(zhì)素降解中顯示出基本的酶活性_—這證明聚乙二醇化可應(yīng)用于這些各種類型的酶(其可被用于改變它們的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性而同時(shí)保留了基本的酶活性)。然后我們進(jìn)行了修飾的酶產(chǎn)物的凝膠過濾，接著測試分級分離的蛋白質(zhì)的酶活性。簡單地說，按照本領(lǐng)域己知的技術(shù)，將PEG修飾的透明質(zhì)酸酶與其各自的天然未修飾形式分離是通過使用Superose6柱(GE/Pharaiacia)的凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)進(jìn)行的。用磷酸鹽緩沖鹽水作為分離的流動(dòng)相，流速為0.2ml/分鐘。該柱采用GE/Pharmacia的凝膠過濾標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)(GelFiltrationCalibrationStandards)進(jìn)行校準(zhǔn)。含有分離的透明質(zhì)素降解酶的級分，通過改進(jìn)的美國藥典濁度分析實(shí)驗(yàn)以微量滴定的形式來測試其相對透明質(zhì)酸酶活性。對于每種特定酶，用于分析每種要檢測的透明質(zhì)素降解酶的活性的pH和緩沖液如文獻(xiàn)所述。通過Superose6凝膠過濾柱分級分離的羊透明質(zhì)酸酶活性(例如，Vitrase)的峰保留體積(時(shí)間)，從天然的羊透明質(zhì)酸酶的15.5ml(大約60到80KD的表觀分子量)移至Peg-修飾的羊透明質(zhì)酸酶的9.5ml(大于100，000KD到大約670,000KD的表觀分子量)。當(dāng)過量摩爾的聚乙二醇與羊酶反應(yīng)時(shí)，Peg修飾可明顯且完全地將所有可測酶活性移至更高分子量的修飾形式。注入后天然細(xì)菌透明質(zhì)酸裂解酶活性的峰保留體積(吋間)為大約16ml(大約50到70KD的表觀分子量)。凝膠過濾分級分離的Peg-修飾的透明質(zhì)酸裂解酶在任何級分都沒表現(xiàn)出酶活性。沒有可測到的酶活性，包括其中天然透明質(zhì)酸裂解酶活tf:在正常情況下「'J檢測到的部分，這表明peg修飾對S功能產(chǎn)牛負(fù)作用。Peg-修飾的軟骨素酶ABC表明注入后在大約11ml和13ml的酶活性峰(大約在200和600KD之間的表觀分子量)以及注入后還有在大約16ml的峰(大約50到70KD的表觀分子量)。注入后天然軟骨素酶ABC具有只在大約16ml的酶活性。該數(shù)據(jù)表明該軟骨素酶ABC被peg修飾過，保持比天然分子量分子高的酶活性。凝膠過濾法(gelfiltration)可用于評價(jià)透明質(zhì)素降解酶的Peg-修飾的程度；分級分離制劑的酶活性的分析可用于評價(jià)Peg修飾對透明質(zhì)素降解酶的酶活性的影響，這與總活性和顯示酶活性的組分的分子量有關(guān)。然后我們采用酶譜法(Zymogmphy)(利用底物凝膠電泳進(jìn)行的糖胺聚糖降解活性分析)測定各種天然和修飾酶的酶活性。簡言之，含有透明質(zhì)素的SDS-PAGE酶譜凝膠被鋪設(shè)，并基本上按照以前在MiuraRO,etal.Analysisofglyc.osaminoglycan-degradingenzymesbysubstrategelelectrophoresis(zymography).AnalBiochem.1995Marl;225(2):333-40中描述的方法進(jìn)行分析。天然羊透明質(zhì)酸酶表明在酶譜凝膠中的透明質(zhì)素降解活性，鑒定出在大約60KD和90KD的兩個(gè)主要活性條帶，它們在這些分子量之間具有一些拖尾的酶活性。沒有表現(xiàn)出大于100KD的酶活性。羊透明質(zhì)酸酶的Peg修飾表現(xiàn)為酶譜凝膠中的透明質(zhì)素降解活性的移動(dòng)，其具有在大約150KD的酶活性信號，和具有大于200KD分子量的酶活性的至少2個(gè)額外條帶。天然軟骨素酶ABC在酶譜凝膠中顯示出單個(gè)透明質(zhì)素降解活性條帶，表明分子量大約在80到90KD。軟骨素酶ABC的peg修飾表現(xiàn)為酶譜凝膠中的透明質(zhì)素降解活性的移動(dòng)，其具有大約在180KD的酶活性信號，和具有大于200KD分子量的活性的至少一個(gè)額外條帶。因此，酶譜分析證實(shí)，示例性的動(dòng)物來源的透明質(zhì)酸酶(Vitrase)和示例性的具有透明質(zhì)酸酶活性的細(xì)菌來源的軟骨素酶(軟骨素酶ABC)可以通過聚乙二醇化(其可用于改變它們的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，正如上面針對重組人類透明質(zhì)酸酶的描述)而被修飾，而且得到的修飾酶仍能顯示出基本的酶活性。考慮到前面的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，其它透明質(zhì)酸酶(本文所述的人類和其他重組形式的酶，以及其它非人類動(dòng)物的或細(xì)菌的，原核的或其它的透明質(zhì)酸酶，以及軟骨素酶)同樣可用本領(lǐng)域已知或最新發(fā)現(xiàn)的各種PEG試劑的任何一種來修飾，以產(chǎn)生具有改變了的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和/或其它特性的修飾酶，其使得它們能用在特定的應(yīng)用中。實(shí)施例22—例證性地使用sHASEGP以促進(jìn)小分子藥理試劑在體內(nèi)的擴(kuò)散作為使用本發(fā)明的sHASEGP組合物來促進(jìn)藥理試劑散布或擴(kuò)散進(jìn)入哺乳動(dòng)物的器官和組織以及在其內(nèi)部的散布或擴(kuò)散的例證性的實(shí)施例，我們對使用rHUPH20促進(jìn)地塞米松(dexamethasone)("dex"，用作示例性的藥理小分子的抗炎劑)滲透到哺乳動(dòng)物眼組織中進(jìn)行了評價(jià)。對于像麻醉劑這樣的試劑注射到哺乳動(dòng)物的眼睛，實(shí)現(xiàn)麻醉阻斷所通常使用的途徑包括眼球周圍的、眼球后部的和特農(nóng)囊下的注射。對于該例證性的實(shí)施例，我們比較了在有或沒有sHASEGP伴隨給藥的情況下的dex特農(nóng)下注射，然后檢測眼后部組織中dex的濃度，特別是脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜，其是重要的藥物靶但是有效地接觸藥理試劑經(jīng)常是困難的。使用新西蘭紅雄兔(大約2.1到3.2kg)并采用鹽酸克他命(21mg/kg)和鹽酸甲苯噻嗪(5.25mg/kg)肌肉注射使其處于基礎(chǔ)麻醉狀態(tài)。表面給藥的0.5%的丙美卡因(proparacaine)用于麻醉眼睛表面。瞳孔用ln/。的托吡卡胺(tropicamide)和2.5%的去氧腎上腺素(phenylephrine)進(jìn)行擴(kuò)大。用囊膜剪(Vannasscissor)將每只兔的右眼結(jié)膜剪開之后，將Medez三端口麻醉套管(EagleLaboratories,RanchoCucamonga,CA)的一端插入鞏膜外隙，1.5ml單獨(dú)的dex(AmericanPharmaceuticalPartners,n=18)或含有sHASEGP(3000單位的rHUPH20，n=l8)的dex被注射到眼的后極附近。棉簽(co加n-tippedapplicator)放置在結(jié)膜入口處以防流體流出。注射后1、2、3或6小時(shí)，兔依上述進(jìn)行麻醉，通過心內(nèi)注射戊巴比妥(120mg/kg)將其致死。安樂死之后，取出lml血樣，將兩只眼睛從每個(gè)動(dòng)物中剜出。剜出之后立刻用結(jié)核菌素注射器通過前房穿刺術(shù)從每個(gè)眼睛中收集2ml的房水樣品。從剜出的眼睛中去除前段之后，吸出1ml玻璃質(zhì)樣品并將其放到標(biāo)記的Eppendorf管。眼睛的剩余部分被切開，并用6mm環(huán)鉆(FineScienceTools,FosterCity,CA)將視神經(jīng)下組織樣品打孔，藥物在鞏膜外側(cè)被注射其中。從打孔的組織中用鈍的刀片將視網(wǎng)膜刮下，并將其放入標(biāo)記管中，對于脈絡(luò)膜也是如此。用質(zhì)譜評價(jià)組織內(nèi)的dex水平，其可檢測下限在5ng/ml的級別。對于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜樣品，含有50mMTris堿、1n]MMgCl2,pH9.0的緩沖液被加入到該組織，所以最終濃度為20mg/ml。該組織用超聲勻漿器(BioLogics，Inc.,型號150V/T)碎解5-15秒。組織勻漿、玻璃體液、含水液體和血漿的樣品都采用如下方法分析。含有作為內(nèi)標(biāo)(internalstandard,I.S.)的地塞米松和強(qiáng)的松龍(prednisolone)的樣品,用甲基叔丁醚通過渦流混合五分鐘進(jìn)行萃取。有機(jī)相和水相通過在l，300g離心5分鐘而分離，將水相在-70'C冷凍十五分鐘，并將有機(jī)相倒入新管，在40'C氮?dú)饬髦羞M(jìn)行蒸發(fā)。殘留物用水:乙睛(50:50v/V)重構(gòu)。處理后的樣品采用高效液相色譜使用保持在45°C的PhenomenexSyneryPolarRP柱進(jìn)行分析。流動(dòng)相用加熱的氮?dú)庠赯-噴霧源/界面處被霧化，離子化的化合物用串聯(lián)四極質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。得到了地塞米松和強(qiáng)的松龍的峰高并用MassLynxTM軟件，Micromass,Beverly,MA進(jìn)行積分。校準(zhǔn)曲線是通過將標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰高比在MassLynxTM中擬合成冪方程得到的。然后該校準(zhǔn)曲線方程通過使用樣品的峰高比可用于內(nèi)插獲得樣品中地塞米松的濃度。質(zhì)譜結(jié)果表明，單獨(dú)用dex處理的兔的脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和玻璃體的地塞米松水平在第一時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰濃度(即注射后1小時(shí))；而接受同時(shí)給藥的sHASEGP的兔的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的dex濃度更高而且持續(xù)增加直到第二時(shí)間點(diǎn)(即注射后2小時(shí))。在已經(jīng)用sHASEGP處理的組織中的脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜和玻璃體峰濃度分別是大約10倍、5倍和8倍高，而且曲線下的面積(areasunderthecurve,AUC)也大了至少50%。這些結(jié)果表明，sHASEGP的給藥可用于實(shí)質(zhì)上提高如dex的藥理試劑的遞送，甚至到達(dá)體內(nèi)相對難以到達(dá)的組織，例如哺乳動(dòng)物眼睛的后段。另外，因?yàn)橄鄬竦撵柲訕?gòu)成在特農(nóng)下注射間隙與靶向的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜層之間的組織屏障，遞送到后面層的高水平藥理試劑表明，sHASEGP可用于有效地促進(jìn)體內(nèi)藥理試劑穿過組織層的遞送。在促進(jìn)跨鞏膜遞送方面，sHASEGP因此能應(yīng)用在最低侵入性的方法中，以促進(jìn)用于治療影響眼睛后部的狀況的試劑的傳遞，這在許多眼疾病的情形中是特別令人感興趣的。例如，這對于治療脈絡(luò)膜新血管生成(例如通過給予類固醇)、黃斑變性和影響這些組織的其它疾病——它們典型地是通過玻璃體內(nèi)注射來治療，可以提供更少侵入性的遞送途徑。目前還有很多種試劑被用于這些狀況，例如但不限于，地塞米松、氟羥強(qiáng)的松龍、MacugenTM和VEGF拮抗劑。除了sHASEGP的酶活性有利于遞送途徑例如通過特農(nóng)下注射的遞送中的擴(kuò)散，也認(rèn)為，導(dǎo)入一定流體容量的sHASEGP,所述流體容量能有效填充或擴(kuò)張其所注射的組織間隙，產(chǎn)生了正的液體靜壓，這有助于進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)流體和其所包含的試劑傳遞到周圍組織中(例如，通過對流傳輸)。實(shí)施例23—例證性地使用sHASEGP降低腫瘤間質(zhì)流體壓力，因此提高腫瘤對抗腫瘤藥理試劑的易感性如本文所述和所闡明，sHASEGP可用于產(chǎn)生間質(zhì)通道，其能增加流體流動(dòng)并且促進(jìn)藥理和其它試劑向體內(nèi)期望的組織位點(diǎn)的遞送。對于許多已知的和定期開發(fā)的藥理試劑，尤其抗腫瘤劑、抗代謝藥、抗血管生成劑和各種細(xì)胞毒素劑和細(xì)胞生長抑制劑，腫瘤代表了特別重要的靶標(biāo)。與將這些藥理試劑靶向到體內(nèi)腫瘤位點(diǎn)有關(guān)的挑戰(zhàn)由于如下事實(shí)而加劇許多腫瘤呈現(xiàn)了升高的間質(zhì)壓力，這傾向于阻止被給藥的藥理劑的灌注，尤其是向腫瘤物質(zhì)的深處位點(diǎn)。認(rèn)為，sHASEGP能減低這種阻力，因此有利于各種已知和最新開發(fā)的藥理試劑中的任何一種向腫瘤的遞送，從而通過給定劑量的藥劑使得它們更加敏感且更容易治療。關(guān)于這些方面，本發(fā)明的sHASEGP己經(jīng)顯示出能促進(jìn)間質(zhì)通道的形成而且加強(qiáng)上述各種大小的標(biāo)志物的擴(kuò)散。此外，我們已經(jīng)觀察到sHASEGP可用于將間質(zhì)組織的水力傳導(dǎo)性增加10倍以上。正如腫瘤細(xì)胞情形下這些原理的確認(rèn)，示例性的sHASEGP(rHuPH20,50單位)應(yīng)用于體外的腫瘤細(xì)胞，使得基本上除去細(xì)胞外周基質(zhì)，其被認(rèn)為是升高的腫瘤間質(zhì)流體壓力的一個(gè)主要的貢獻(xiàn)因素。另外，在異種移植人類腫瘤模型中rHuPH20的體內(nèi)給藥，在給藥一小時(shí)內(nèi)引起了腫瘤問質(zhì)流體壓力的顯著降低。如上面本發(fā)明詳述中所描述，本發(fā)明的sHASEGP可與許多已知或新開發(fā)的抗癌試劑的任何一種聯(lián)合使用，用于治療各種癌癥。實(shí)施例24—例證性地使用sHASEGP以增強(qiáng)通過非靜脈內(nèi)腸胃外注射傳送的大分子的藥物動(dòng)力學(xué)如上所討論，sHASEGP可用于調(diào)節(jié)已知或新開發(fā)的藥理試劑和其它試劑的藥物動(dòng)力學(xué)，例如通過促進(jìn)它們的吸收和/或身體的分布。這種改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)又可用來改善特定試劑的藥效學(xué)(例如，通過減少注射部位附近殘余試劑的數(shù)量來降低局部毒性，和/或通過增加遞送到(和/或穿過)期望靶的試劑的數(shù)量來增加療效)。另外，因?yàn)閟HASEGP可用于有效驅(qū)動(dòng)局部給藥的藥理試劑的擴(kuò)散(例如，穿過注射位點(diǎn)和進(jìn)入血流中)，用sHASEGP本質(zhì)上改善吸收的藥動(dòng)學(xué)和用降低量的施加藥物來獲得類似的藥效學(xué)也是可能的。作為使用sHASEGP來增強(qiáng)大分子藥物的藥動(dòng)學(xué)的一個(gè)例證性的實(shí)例，所述藥物通常通過非靜脈內(nèi)腸胃外注射給藥，我們將重組人類PH20(rHuPH20)與聚乙二醇化形式的干擾素a-2b(從Schering-Plough可得的PEG-INTRON)聯(lián)合。PEG-INTRON是大約31KD的大分子，其典型地通過皮下注射給藥以治療丙型肝炎病毒(HCV)(通常與小分子藥物三氮唑核苷(ribavirin)聯(lián)合)。像許多皮下給藥的大分子一樣，PEG-INTRON吸收相對緩慢而且相當(dāng)一部分試劑從沒進(jìn)入血流，其生物利用度在50-60%的級別。另外，相當(dāng)一部分病人(典型地多于一半)表現(xiàn)出各種注射部位反應(yīng)，推定是由于滯留的局部濃度的藥理試劑引起的或由此而惡化的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這樣的藥物動(dòng)力學(xué)的后果是翻數(shù)倍的；不但包括注射位點(diǎn)附近所捕獲的試劑的"浪費(fèi)"，而且有局部代謝化合物反應(yīng)。我們通過各種給藥途徑進(jìn)行碘-125標(biāo)記的PEG-INTRON的給藥，有或沒有rHuPH20的伴隨給藥，以檢測rHuPH20對PEG-INTRON藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。為了測定rHuPH20的絕對生物利用度，我們也測定了靜脈給藥的PEG-INTRON的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。簡單地說，十八只Sprague-Dawley大鼠(每只重約225-250克)被分成二組，每組六只。第--組靜脈給予(通過尾靜脈汴射，IOO微升體積，1.5微克/kg)測試品(即，1-125標(biāo)記的PEG-WTRON)。1-125標(biāo)記的干擾素的比活性為55uCi/微克。在給藥前和給藥后0.5、1、2、4、8、24、48、72、96和120小時(shí)收集血樣(100微升)，并將其處理以用于通過Y計(jì)數(shù)定量標(biāo)記的藥物(表示為每克血漿每分鐘數(shù)(CPM))。第二組六只動(dòng)物通過皮內(nèi)注射入頸后刮毛備好的地方給予等劑量和體積的測試品，并且血樣如第一組那樣進(jìn)行處理。第三組六只動(dòng)物如前一組通過皮內(nèi)注射給予總體積100微升混合有rHuPH20(100I.U.)的等劑量的測試品，然后如第一和第二組那樣處理血樣。該研究結(jié)果顯示在下面的表24-l中。表24-1sHASEGP對干擾素藥物動(dòng)力學(xué)特性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table>如表24-1所示，當(dāng)PEG-INTRON的皮內(nèi)給藥結(jié)合sHASEGP的給藥時(shí)，示例性的藥理劑PEG-INTRON的生物利用度(用AUC進(jìn)行估測)得到顯著改善。事實(shí)上，聯(lián)合以sHASEGP的皮內(nèi)服藥所達(dá)到的絕對生物利用度與直接的靜脈內(nèi)給藥在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無法區(qū)別，對于直接的靜脈內(nèi)給藥，所有的材料直接遞送到血流里。因此，與通過非靜脈腸胃外給藥引入的藥理試劑聯(lián)合使用的sHASEGP,可以提供與直接向血流的給藥相比擬的遞送水平。盡管皮內(nèi)給藥后的Tmax必定更長(因?yàn)樗巹┬枰恍r(shí)間到達(dá)血流)，在ID(皮內(nèi))給藥sHASEGP之后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)血流中試劑的濃度基本上達(dá)到IV(靜脈內(nèi))給藥所達(dá)到的濃度，而且之后顯然超過它們。實(shí)施例25—例證性地使用sHASEGP以促進(jìn)通常由靜脈內(nèi)注射遞送的大分子的皮內(nèi)遞送如上面所討論，sHASEGP可用于通過不同給藥途徑促進(jìn)已知或新開發(fā)的藥理試劑和其它試劑的遞送，其可以提供更大的便利性、安全性、降低的成本和/或其它益處。作為這樣的再配制(reformulation)的例證性的實(shí)例，我們使用sHASEGP來促進(jìn)通常由靜脈注射給藥的大分子藥物的皮內(nèi)遞送。對于此特定的實(shí)施例，我們將重組人PH20(rHuPH20)與嵌合的人-鼠抗TNFa-單克隆抗體(Infliximab,可從Centocor得到的REMICADE)聯(lián)合。REMICADE是大約150kD的大分子，其典型地由靜脈內(nèi)注射給藥，用于治療關(guān)節(jié)炎或克氏病(Crohn'sdisease)。因此，REMICADE的給藥一般需要涉及靜脈內(nèi)接入以及伴隨的專業(yè)護(hù)理和風(fēng)險(xiǎn)，而且每次給藥需要約兩小時(shí)的時(shí)間。REMICADE(20mg/ml)用1251標(biāo)記至比活性為10)aCi/mg。十八只大鼠被分成三組，每組六只，(i)通過靜脈內(nèi)給藥，(ii)通過皮內(nèi)給藥，或(iii)通過聯(lián)合100單位sHASEGP(來自100,000U/ml的儲存液)的皮內(nèi)給藥，給予總體積為100nl的放射性冷REMICADE(總共10mg/kg)混合物；然后在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)血液和組織通過Y計(jì)數(shù)進(jìn)行處理，基本上遵照前面實(shí)施例所述。結(jié)果概括在表中表25-1sHASEGP對REMICADE的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table>如表25-l所示，當(dāng)皮內(nèi)給藥聯(lián)合以一定劑量的sHASEGP時(shí)，示例性藥理劑REMICADE的生物利用度(用AUC進(jìn)行估價(jià))得到顯著改善。正如PEG-INTRON的增強(qiáng)的遞送所觀察到的，聯(lián)合以sHASEGP的皮內(nèi)服藥所達(dá)到的REMICADE生物利用度的整體水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與靜脈內(nèi)給藥的生物利用度相似，靜脈內(nèi)給藥時(shí)，所有的材料直接遞送到血流里。盡管皮內(nèi)給藥后REMICADETmax相對于靜脈給藥一定更長，在ID(皮內(nèi))給藥sHASEGP之后二十四小時(shí)內(nèi)血流中試劑的濃度超過IV(靜脈內(nèi))給藥所觀察到的濃度，而且之后接近或超過IV濃度。與不含sHASEGP的ID給藥相比，使用sHASEGP時(shí)所觀察到的Tmax的到達(dá)要快兩倍(24小時(shí)對48小時(shí))；Cmax和生物利用度(AUC)兩者都實(shí)質(zhì)上增加(分別為大約65%和95%)。性使用sHASEGP以促進(jìn)通常由非靜脈腸胃外注射遞送的更大大分子復(fù)合物的皮內(nèi)遞送作為使用sHASEGP來增強(qiáng)通常由非靜脈內(nèi)腸胃外注射給藥的大分子藥物的藥物動(dòng)力學(xué)的例證性的實(shí)施例，我們將重組人PH20(rHuPH20)與重組人因子VIII(RECOMBINATE,可從Baxter得到)聯(lián)合。因子V1D是包含多個(gè)多肽的大的糖蛋白復(fù)合物，具有大約為280kD的結(jié)合分子。因子VI典型地只通過靜脈注射給藥以治療血友病。像皮下給藥的許多大分子一樣，因子VP及收相對緩慢，而且相當(dāng)一部分試劑從來沒使其進(jìn)入血流，其生物利用度在0.5-1%的級別。十八只大鼠被分成S組，毎組六只，(i)通過靜脈內(nèi)給藥，(ii)通過皮內(nèi)給藥，或(iii)通過聯(lián)介sHASEGP的皮內(nèi)給藥，給予125-1標(biāo)記的因子W1;然后在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)處理血液和組織，基本上遵照前面實(shí)施例所述測量M克血衆(zhòng)每分鐘數(shù)(countsperminute，CPM)。表26-1rHuPH20對因子W1的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響時(shí)間(小時(shí))CPM因子vin(50謹(jǐn)g)皮內(nèi)SDCPM因子VID(50IU/kg)+sHASEGP100U皮內(nèi)SDCPM因子\1('50腿g)靜脈內(nèi)0,529,74812，00246,3765,503670,743143，7679,41570,24914,614379,558249,50714,59272,73614,985247,397356,08717,62176,63114,454200,602455,49412,72184,0668,646177,84655,27714,18179,7359,363165,914650,19513,97072,1766,848121,198852，29013,70766,41910,495114,5791248,33610,76558,81711,76075,9122423,1734,70024,5964,42629,610AUC1,014,5211,303,0782,554,607Cmax56,08784,066-Tmax44-絕對生物利用度39.7%51%100%如表26-l所示，相對于單獨(dú)的因子VB1，因子VID與rHuPH20的共同給藥顯著增加了全身性生物利用度(P<0.01)。利用TCA沉淀對于消除進(jìn)入血流中完全降解的1-125標(biāo)記的因子VID蛋白質(zhì)的分布來說是必須的。實(shí)施例27—例證性地使用sHASEGP來改善中風(fēng)后的存活和/或行為結(jié)果在第一組研究中，sHASEGP在中風(fēng)大鼠模型中進(jìn)行評估。簡單地說，通過中大腦動(dòng)脈阻塞手術(shù)致使Sprague-Dawley大鼠中風(fēng)，接著在不同時(shí)間進(jìn)行對照溶液(鹽水)或測試溶液(含sHASEGP的鹽水)的靜脈給藥。讓動(dòng)物康復(fù)，并且在一定時(shí)問期問接著評價(jià)對照與測試組的存活比。另外，存活者在一系列時(shí)問點(diǎn)采用與中風(fēng)典型地相關(guān)的行為征狀的多種分析進(jìn)行評價(jià)。只有在最初的資格預(yù)選的前肢屈伸測試中表現(xiàn)正常的大鼠被包括在該研究中，而且隨后隨機(jī)指定為對照或測試組的動(dòng)物。無菌外科手術(shù)由ZivicLaboratories基本上如下進(jìn)行。大鼠在提供有2.5%氟烷(halothaiie)的室內(nèi)被麻醉。制造腹部中線切口，并且分離出肌肉組織，暴露出右外頸動(dòng)脈，然后將其隔離并兩次結(jié)扎。然后將未系但束緊的5/0聚酰胺結(jié)扎線放在外頸動(dòng)脈殘余部分(stump)周圍。在殘余部分的內(nèi)腔切個(gè)小洞，并將18-20mm長的4/0微絲(microfilament)縫合材料插入內(nèi)腔而且深入到內(nèi)部的頸動(dòng)脈里。當(dāng)完全深入時(shí)，線栓(monofilament)的內(nèi)端應(yīng)當(dāng)阻止向中大腦動(dòng)脈的流動(dòng)。然后束緊的聚酰胺結(jié)扎線被系好以固定住線栓。牽拉被移除，皮膚切口用傷口鉗關(guān)閉。靜脈注射程序基本上如下進(jìn)行。大鼠在提供有2.5%氟烷(halothane)的室內(nèi)被麻醉。制造腹部皮膚切口，露出頸靜脈。無菌的lml—次性注射器裝上30規(guī)格的針并裝上注射材料。用鎖骨作支撐，將注射器插入頸靜脈(使用注射器上微小的負(fù)壓將血液吸進(jìn)注射器，由此確認(rèn)靜脈注射的合適位置)，然后注射材料緩慢注射到頸靜脈中。注射后，將針慢慢抽出(而且任何出血用無菌棉簽進(jìn)行控制)，然后皮膚用傷口鉗關(guān)閉。誘發(fā)中風(fēng)后各組(每組大約40只動(dòng)物)中動(dòng)物的存活被監(jiān)控，然后將每天的存活者數(shù)量對中風(fēng)后的天數(shù)進(jìn)行作圖，得到Kaplan-Meier中風(fēng)曲線。到中風(fēng)后第三天時(shí)各組間的實(shí)質(zhì)性區(qū)別變得明顯。致使中風(fēng)后一周時(shí)，超過一半的對照動(dòng)物已經(jīng)死亡，而將近四分之三的sHASEGP治療的動(dòng)物仍存活，這是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差別(p=0.03)。除了測量中風(fēng)后的存活比率，存活者也采用被設(shè)計(jì)用來評估中風(fēng)相關(guān)的某些行為問題的發(fā)生率的其它分析進(jìn)行測試(在中風(fēng)后第l、2、3和4周)。被評價(jià)的行為狀況包括前肢屈曲、軀干扭曲、后肢、步態(tài)擾亂和墻走，其被用于生成PNEGS行為得分(較高的得分反映中風(fēng)相關(guān)的行為問題的增加)。誘發(fā)中風(fēng)后第二周，sHASEGP治療的動(dòng)物表現(xiàn)出顯著更好的行為得分(p=0.02)，治療組與對照之間的相對差異在隨后的幾周變得甚至更大(對于第三周和第四周分別為p=0.007和p=0.003)。盡管參考上面的實(shí)施例本發(fā)明已經(jīng)被描述，要理解的是，修改和變動(dòng)都包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅僅受權(quán)利要求限制。權(quán)利要求1.基本上純化的糖蛋白，其包含具有中性活性的可溶性透明質(zhì)酸酶多肽和至少一個(gè)N-連接糖部分，其中所述N-連接糖部分共價(jià)連接于所述多肽的天冬酰胺殘基上。2.權(quán)利要求l所述的多肽，其中，所述多肽選自(a)包含由如此序列編碼的氨基酸序列的多肽，所述序列具有與SEQIDNO.l中所示的氨基酸序列至少約74%氨基酸序列同一性(b)包含由SEQIDNO.6中所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽；(c)包含由如此核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽，所述核苷酸序列在高嚴(yán)格性條件下沿著它全長的至少85%，與SEQIDNO.6中所示的核苷酸序列雜交；或(d)由如此核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列是包含SEQIDNO.50中所示的序列的核苷酸序列剪接變體。3.權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述的糖部分被共價(jià)連接到天冬酰胺殘基上，所述天冬酰胺殘基選自SEQIDNO.l中所列的氨基酸82、166、235、254、368、393或柳。4.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分是通過PNGase敏感性鍵被共價(jià)連接到所述的多肽上。5.權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述的糖部分是高甘露糖型。6.權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述的糖部分是復(fù)合型。7.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分是雜合型。8.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的糖部分進(jìn)一步包括至少一個(gè)以唾液酸為末端的糖部分。9.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽基本上由人透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分組成。10.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽的透明質(zhì)酸酶部分包括sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分。11.權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽被聚合物修飾。12.權(quán)利要求ll所述的多肽，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。13.多肽，其基本上由人透明質(zhì)酸酶蛋白的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分組成。14.權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述透明質(zhì)酸酶是超唾液酸化的。15.權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0.3的氨基酸1-450所示的氨基酸序列。16.權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0.3的氨基酸1-438所示的氨基酸序列。17.權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括SEQIDN0.3的氨基酸1-459所示的氨基酸序列。18.權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述多肽被聚合物修飾。19.權(quán)利要求18所述的多肽，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。20.權(quán)利要求I所述的多肽，其中所述sHASEGP是人多肽。21.權(quán)利要求l所述的多肽，其中所述多肽是SEQIDN0.4所示的可溶性多肽。22.權(quán)利要求1所述的多肽，其中能夠?qū)⑺龆嚯囊龑?dǎo)出所述細(xì)胞的信號序列被可操作地連接到所述sHASEGP多肽。23.分離的可溶性人透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)，其中所述sHASEGP的效價(jià)大于40,000USP單位/mg蛋白。24.權(quán)利要求23所述的sHASEGP，其中所述透明質(zhì)酸酶是唾液酸化的。25.權(quán)利要求23所述的sHASEGP，其中所述蛋白被聚合物修飾。26.權(quán)利要求25所述的sHASEGP，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。27.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述的多肽。28.核酸分子，其包括選自下列的序列(a)SEQIDN0.6中所述的序列；(b)在高嚴(yán)格性條件下，沿全長的至少約70%，與SEQIDN0.6中所述的核苷酸序列雜交的序列；(c)編碼SEQIDNo.1、3、4、5和50中所述的多肽的核苷酸序列；(d)為(a)、(b)或(c)的剪接變體的序列；(e)編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的序列，其包括與SEQIDNo.6或50中所述的序列具有至少約60%序列同一性的核苷酸序列；和(f)包括(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的簡并密碼子的序列。29.載體，其具有SEQIDNO:51所述的序列。30.載體，其包含權(quán)利要求27所述的核酸分子。31.分離的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求30所述的載體。32.權(quán)利要求31所述的細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。33.抗體，其結(jié)合于權(quán)利要求1所述的sHASEGP，其中所述的抗體對牛、羊或細(xì)菌透明質(zhì)酸酶無反應(yīng)活性。34.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中編碼權(quán)利要求1的多肽的內(nèi)源性基因已通過該動(dòng)物或其祖先的同源重組或者插入誘變而被破壞。35.用于產(chǎn)生含有sHASEGP的可溶性多肽的方法，包括將被可操作地連接于啟動(dòng)子的、SEQIDN0.6中所述的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，所述細(xì)胞可將N-連接的糖部分整合到sHASEGP中；在被編碼的多肽被所述細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；和回收所述被表達(dá)的多肽。36.用于產(chǎn)生含有sHASEGP的可溶性多肽的方法，其包括將被可操作地連接于合適啟動(dòng)子的、編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，所述細(xì)胞能夠?qū)-連接的糖部分整合到sHASEGP中；在所述被編碼的多肽被所述細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；和回收所述表達(dá)的多肽。37.用于產(chǎn)生含有sHASEGP的可溶性多肽的方法，其包括在被編碼的多肽被細(xì)胞表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求31所述的細(xì)胞；和回收所述表達(dá)的多肽。38.離體基因治療的方法，包括在體外，將可操作地連接于合適啟動(dòng)子的、編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，所述細(xì)胞能夠?qū)-連接糖部分整合到sHASEGP中；從而產(chǎn)生含有所述核酸的遺傳修飾的細(xì)胞；和將含有所述核酸的細(xì)胞施用到所述對象，從而編碼所述sHASEGP的所述核酸被轉(zhuǎn)移到所述對象。39.制備用于體外受精的哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的方法，所述的方法包括將卵母細(xì)胞與一定數(shù)量的權(quán)利要求1的sHASEGP接觸，所述數(shù)量足以去除卵丘基質(zhì)。40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述卵丘被有效地去除，而不需使用窄孔移液管對所述卵母細(xì)胞進(jìn)行操作。41.用于產(chǎn)生sHASEGP多肽的方法，包括將權(quán)利要求1所述多肽與糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，所述糖基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑺鯪-連接糖部分引入多肽，從而產(chǎn)生sHASEGP。42.組合物，包含基本上純的sHASEGP糖蛋白多肽和合適的藥物載體。43.組合物，包含權(quán)利要求1所述多肽和合適的藥物載體。44.用于治療具有過量的sHASEGP底物的對象的方法，包括施用一定數(shù)量的權(quán)利要求1的sHASEGP多肽，所述數(shù)量足以去除所述的sHASEGP底物。45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的過量的底物由瘢痕組織產(chǎn)生。46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的瘢痕組織是由脊髓損傷引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕。47.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的瘢痕組織是瘢痕瘤瘢痕。48.用于增加直徑小于約0.5微米的治療物質(zhì)或其它分子或大分子復(fù)合物(每一種都為藥劑)在對象中的擴(kuò)散的方法，包括施用給對象sHASEGP多肽和藥劑，所述sHASEGP多肽的量足以打開或形成直徑小于約0.5微米的通道，從而增加所述藥劑的擴(kuò)散。49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的sHASEGP多肽以0.1至1500單位之間的劑量被注射。50.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的sHASEGP多肽在注射之前與所述治療物質(zhì)或其它藥劑混合。51.試劑盒，包含(a)在可接受的載體中的、劑量在0.1至1500單位/ml之間的sHASEGP多肽；(b)在可接受的載體中的至少一種治療物質(zhì)或其它分子或大分子復(fù)合物(每一種都為藥劑)；和(c)任選地，遞送治療物質(zhì)和其它藥劑的說明書。52.權(quán)利要求51所述的試劑盒，其中所述sHASEGP多肽和所述治療物質(zhì)或其它藥劑以混合物的形式提供。53.治療心血管紊亂的方法，包括以足以去除過量糖胺聚糖的量，施用給對象權(quán)利要求1的sHASEGP多肽。54.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的心血管紊亂選自心肌梗塞、充血性心力衰竭或動(dòng)脈硬化。55.治療腫瘤的方法，包括以足以去除過量糖胺聚糖的用量，施用給對象權(quán)利要求1的sHASEGP多肽。56.將分子輸送到含有過量糖胺聚糖的組織的方法，包括將權(quán)利要求1的sHASEGP多肽施用給組織，所施用的量足以充分降解糖胺聚糖，以打開直徑小于約500nm的通道；和將分子施用給包含所述降解的糖胺聚糖的組織。57.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述多肽用聚合物修飾。58.權(quán)利要求57所述的方法，其中所述聚合物是PEG或葡聚糖。59.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述sHASEGP多肽在施用所述分子之前、同時(shí)或之后被施用。60.藥物組合物，包含權(quán)利要求1的基本上純化的可溶性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)多肽和藥物載體。61.藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述的基本上純化的sHASEGP多肽。62.權(quán)利要求60所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含藥物活性劑或藥理劑。63.權(quán)利要求62所述的藥物組合物，其中所述藥物活性劑或藥理劑選自化療劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、抗毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗疙疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、a-腎上腺素能激動(dòng)劑、ot阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、(3腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥劑、避孕藥劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、高血糖藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑、鎮(zhèn)定劑、促睡眠劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇抗炎藥劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物或有機(jī)分子。64.組合物，包括，無菌小瓶和權(quán)利要求60所述的藥物組合物，其中所述組合物被包含于所述小瓶中。65.試劑盒，包括權(quán)利要求64所述的組合物和下列中的至少一種(a)包裝材料；或(b)使用所述試劑盒來應(yīng)用所述藥物組合物的說明書。66.組合物，包括，含有權(quán)利要求60所述的藥物組合物的無菌注射器。67.組合物，包括，含有權(quán)利要求62所述的藥物組合物的無菌注射器。68.權(quán)利要求67所述的組合物，進(jìn)一步包括含有藥物學(xué)上有效的試劑的第二注射器。69.權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述藥物學(xué)上有效的試劑或藥理劑選自化療劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、抗毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、ct-腎上腺素能激動(dòng)劑、a阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、p腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥劑、避孕藥劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、高血糖藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑、鎮(zhèn)定劑、促睡眠劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇抗炎藥劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物或有機(jī)分子。70.權(quán)利要求68所述的組合物，其中所述第二注射器包括粘彈劑。71.試劑盒，包括權(quán)利要求67所述的組合物和下列中的一種或多種(a)包裝材料；和(b)使用所述試劑盒來應(yīng)用所述藥物組合物的說明書。72.用于治療糖胺聚糖的病理性積聚的方法，包括以足以改善或降低積聚的糖胺聚糖的量，施用重組sHASEGP，其中所述的sHASEGP無牛、羊或細(xì)菌酶。73.權(quán)利要求72所述的方法，其中所述積聚選自心血管積聚、腦積聚、箝頓包莖、粘液性水腫、苔蘚性粘液水腫和淋巴水腫。74.促進(jìn)壞死組織的血管再生的方法，包括以足以在所述的壞死組織中誘導(dǎo)新血管生長的量，施用重組sHASEGP。75.從玻璃體液中去除糖胺聚糖的方法，包括；施用sHASEGP。76.用于產(chǎn)生基本上純化的中性活性的可溶性透明質(zhì)酸酶多肽和至少一個(gè)N-連接糖部分的方法，其中所述N-連接糖部分被共價(jià)連接到所述多肽的天冬酰胺殘基上，包括在適合于產(chǎn)生所述多肽的條件下，在存在O.l-lmM丁酸鈉的條件下，在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞。77.用于純化sHASEGP的方法，所述的方法包括在低離子強(qiáng)度下將含有sHASEGP的培養(yǎng)基與陰離子交換樹脂在中性pH下接觸，用約40QmM的鹽洗脫所述的sHASEGP;將所述的sHASEGP在約0.5M硫酸銨存在的條件下與疏水相互作用層析樹脂接觸；將硫酸銨中的所述sHASEGP與苯基硼酸樹脂接觸；在低鹽、中性pH下洗脫所述的sHASEGP;將所述的sHASEGP與羥磷灰石樹脂接觸，用約100mM磷酸鈉洗脫所述的sHASEGP，從而產(chǎn)生sHASEGP，其中所述的sHASEGP基本上被純化。78.誘導(dǎo)玻璃體液液化以治療哺乳動(dòng)物眼障礙的方法，包括將所述玻璃體液與一定量的權(quán)利要求1的蛋白接觸，所述蛋白的量足以有效液化所述的玻璃體液，從而治療所述障礙。79.降低在對象的眼內(nèi)的眼內(nèi)壓的方法,包括將人sHASEGP施用給需要其的對象，所述人sHASEGP的特征為基本上無牛、羊或細(xì)菌酶；大于約40,000USP單位/mg蛋白；禾口由此降低所述對象的眼內(nèi)壓。80.促進(jìn)將sHASEGP或其它糖胺聚糖酶(GAG酶)輸送到哺乳動(dòng)物的第一組織的方法，包括將一定體積的包含所述GAG酶的液體引入所述第一組織，并且使所述體積的液體和所述GAG酶的催化活性去促進(jìn)所述GAG酶進(jìn)入所述組織。81.權(quán)利要求80所述的方法，其中所述體積的液體在引入所述體積的液體的位置或靠近引入所述體積的液體的位置足以引起所述第一組織的局部膨脹。82.權(quán)利要求80所述的方法，進(jìn)一步包括將一種或多種另外的藥理劑或其它藥劑(A-X)導(dǎo)入所述第一組織。83.權(quán)利要求82所述的方法，其中A-X選自可檢測到的分子或其它診斷試劑、麻醉劑或其它組織改性劑、藥理劑或制藥學(xué)上有效的試劑，以及整形試劑或其它美容化妝試劑。84.權(quán)利要求82所述的方法，其中A-X是藥理劑或制藥學(xué)上有效的試劑。85.權(quán)利要求82所述的方法，其中A-X選自化療劑或抗癌劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、抗毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、a-腎上腺素能激動(dòng)劑、(x阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、P腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥劑、避孕藥劑、整形或美容化妝劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、高血糖藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑、鎮(zhèn)定劑、促睡眠劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇抗炎藥劑或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。86.權(quán)利要求82所述的方法，其中A-X選自阿達(dá)木單抗(例如HUMIRATM)、卩—半乳糖苷酶(例如FABRAZYM￡)、阿地白介素(例如PROL.EUKINIL-2)、阿法賽特(例如AMEVIVE)、氨芐青霉素(例如UNASYNTM注射齊lJ)、阿那白滯素(例如KINERET)、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗(例如PEDIARIX)、抗胸腺細(xì)胞(例如THYMOGLOBULIN)、阿奇霉素(例如ZITHROMAXIV)、貝卡普勒明(例如REGRANEXtm)、卡泊芬凈(例如CANCIDAS)、頭孢唑啉(例如ANCEFtm和CEFAZOLINtm)、頭孢吡肟(例如MAXIPIME)、頭孢替坦(例如CEFOTAN)、頭孢他啶(例如FORTAZ)、頭孢曲松(例如ROCEFIN)、西妥昔單抗(例如ERBITUX)、西司他丁(例如PRIMAXINIV)、克拉維酸(例如，與阿莫西林聯(lián)合，諸如AUGMENTIN)、克林霉素(例如CLEOCIN)、a-達(dá)貝泊汀(例如ARANESP)、Deaclizumabs(例如ZENAPAX)、白喉類毒素(一般為藥物聯(lián)合，例如DAPTACEL、INFANRIX丁m禾卩PEDIARIX)、依法利珠單抗(例如RAPTIVA)、腎上腺素(例如EPIPEN)、a-促紅細(xì)胞生成素(例如EPOGENtm和PROCRIT)、依那西普(例如ENBREL)、非格司亭(例如NEUPOGEN)、氟康唑(例如DIFLUCANTM注射劑)、促濾泡素例如a-促濾泡素(例如GONAL-Ftm)和P-促濾泡素(例如FOLLISTIM)、磷苯妥英(例如CEREBYX)、氟康唑(例如DIFLUCAN),軋雙胺(例如OMNISCAN)、軋噴酸(例如MAGNEVIST)、加替沙星(例如TEQUIN)、格拉默(例如COPAXONE)、GM-CSF's(例如LEUKINE)、戈舍瑞林(例如ZOLADEX)、格拉司瓊(例如KYTRIL)、流感嗜血桿菌B，s(例如COMVAXtm和HibTITER)、氟哌啶醇(例如HALDOL)、甲型肝炎疫苗(例如HAVRIXTM、TWINRIXtm和VAQTA)、乙型肝炎疫苗(例如重組體COMVAXtm、ENGERIX-B、RECOMBIVAX-HB、TWINRIX,和非重組體BAYHEP-B和NABIM-HB)、替伊莫單抗(例如ZEVALIN)、免疫球蛋白(包括免疫球蛋白的混合物，如GAMMAGARDTM和類似物，以及各種純化的免疫球蛋白中的任意種)、流感病毒疫苗(例如FLUMIST)、英利昔單抗(例如REMICADE)、胰島素(例如HUMALOG、HUMALOGMIX75/25、HU薦LINTM產(chǎn)品(包括50/50、70/30、Regular、NPH、Ultra禾QUltralente)，和NOVOLIN)、甘精胰島素(例如LANTUS)、干擾素a-2a(ROFERAN-A)、干擾素a-2b(例如INTRON-ATM)、復(fù)合a干擾素(例如INFERGENtm)、干猶素a-n3(例如ALFERONNtm)、干猶素卩(例如BETASERONtm和BETAFERONtm)、干枕素p-la(例如AVONEXtm和REBIF)、干擾素y(例如ACTIMMUNE)、碘克沙醇(例如VISIPAQUETM)、碘海醇(OMNIPAQUETM)、碘帕醇、碘佛醇(例如OPTIRAY)、酮咯酸(例如TORADOL)、艾杜糖醛酸水解酶(例如ALDURAZYME)、左氧氟沙星(例如LEVAQUIN)、利多卡因、利奈唑酮(例如ZYVOX)、勞拉西泮(例如ATIVAN)、麻疹疫苗(例如ATTENUVAX)、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹病毒疫苗(例如M-M-R11)、甲羥孕酮(例如DEPO-PROVERA)、美洛培南(例如MERREMIV)、甲基強(qiáng)的松龍(例如SOLU-MEDROL)、咪達(dá)唑侖(例如VERSED)、嗎啡(例如ASTRAMORPH/PF)、奧曲肽(例如SANDOSTATIN)、奧馬佐單抗(例如XOLAIRtm)、昂丹司瓊(例如ZOFRAN)、帕利珠單抗(例如SYNAGIS)、泮托拉唑(例如PROTONIX)、培門冬酶(例如ONCASPAR)、聚乙二醇化非格司亭(例如NEULASTAtm)、聚乙二醇化干擾素a-2a(例如PEGASYS)、聚乙二醇化干擾素a-2b(例如PEG-INTRON)、培維索孟(例如SOMAVERT)、百日咳疫苗、哌拉西林(例如ZOSYN)、肺炎球菌疫苗(例如PNEUMOVAX23)和肺炎球菌組合疫苗(例如PREVNARTM)、異丙嗪(例如PHENERGAN)、瑞替普酶(例如RETAVASE)、生長激素(例如GENOTROPIN、HUMATROPE、NORDITROPIN、NUTROPINTM、SAIZEN、SEROSTIM、ZORBTIVE)、舒巴坦、舒馬曲坦(例如IMITREXtm)、他左巴坦、替奈普酶(例如TNKASEtm)、精制破傷風(fēng)類毒素、替卡西林(例如TIMENTIN)、托西莫單抗(例如BEXXAR)、曲安奈德、萬古霉素(例如VANCOCIN)、水痘疫苗(例如VARIVAXtm)和其它疫苗。87.權(quán)利要求82所述的方法，其中A-X是選自下列的抗生素藥劑或藥劑的組合氨基苷類抗生素；酰胺醇；袢霉素；碳頭孢烯；碳青霉烯；頭孢菌素或頭孢烯；頭霉素；克拉維烷；環(huán)式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮內(nèi)酯類；林可胺類藥物；大環(huán)內(nèi)酯類；單環(huán)內(nèi)酰胺；硝基呋喃；氧頭孢烯；"惡唑烷酮；青霉烯、硫霉素和P-內(nèi)酰胺類；青霉素；多肽抗生素；喹諾酮；氨磺酰；砜；四環(huán)素；和其它抗生素(例如氯?？朔印⑺箧滄咚?、海克西定、六胺、呋喃妥因、硝羥喹啉、利替培南、?；橇_定、Xibomols)。88.權(quán)利要求80所述的方法，其中所述GAG酶是sHASEGP。89.權(quán)利要求88所述的方法，其中所述sHASEGP是人sHASEGP。90.權(quán)利要求89所述的方法，其中所述人sHASEGP是PH20sHASEGP。91.權(quán)利要求90所述的方法，其中所述sHASEGP是SEQIDN0.4所示的可溶性多肽。92.權(quán)利要求88所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的或超唾液酸化白勺sHASEGP。93.權(quán)利要求91所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的人PH20sHASEGP。94.增加哺乳動(dòng)物的靶組織的滲透性的方法，包括將sHASEGP引入所述組織。95.權(quán)利要求94所述的方法，其中通過將所述sHASEGP注射入所述組織或附近組織，將所述sHASEGP弓I入所述組織。96.權(quán)利要求94所述的方法，其中通過預(yù)先將所述sHASEGP引入供應(yīng)所述組織的血流，將所述sHASEGP弓I入所述組織。97.權(quán)利要求96所述的方法，其中所述的預(yù)先引入血流是通過靜脈內(nèi)注射或輸注所述sHASEGP來介導(dǎo)。98.權(quán)利要求96所述的方法，其中所述的預(yù)先引入血流是通過將所述sHASEGP非靜脈內(nèi)腸胃外給藥來介導(dǎo)。99.權(quán)利要求94所述的方法，進(jìn)一步包括將A-X引入所述組織。100.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X通過注射入所述組織或附近組織被引入所述組織。101.權(quán)利要求99所述的方法，其中通過預(yù)先將PH20引入供應(yīng)所述組織的血流，將A-X引入所述組織。102.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的預(yù)先引入血流是通過靜脈內(nèi)注射或輸注所述分子或大分子復(fù)合物來介導(dǎo)。103.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的預(yù)先引入血流是通過將所述分子或大分子復(fù)合物非靜脈內(nèi)腸胃外給藥來介導(dǎo)。104.權(quán)利要求99所述的方法，其中所述將A-X引入所述組織的步驟在所述將所述sHASEGP引入所述組織的步驟之后的3小時(shí)內(nèi)開始。105.權(quán)利要求99所述的方法，其中所述將A-X引入所述組織的步驟在所述將所述sHASEGP引入所述第一組織的步驟之后的12小時(shí)內(nèi)開始。106.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X是選自小分子、蛋白質(zhì)和核酸的分子。107.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X是大分子復(fù)合物，其包含選自小分子、蛋白質(zhì)、核酸、脂類和兩親性分子的分子的組合。108.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X選自可檢測到的分子或其它診斷試劑、麻醉劑或其它組織改性劑、藥理劑或制藥學(xué)上有效的試劑，以及整形試劑或其它美容化妝試劑。109.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X是藥理劑或制藥學(xué)上有效的試劑。110.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X選自化療劑或抗癌劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、抗毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、a-腎上腺素能激動(dòng)劑、a阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、(3腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥劑、避孕藥劑、整形或美容化妝劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、高血糖藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑、鎮(zhèn)定劑、促睡眠劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇抗炎藥劑或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。111.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X是選自下列的抗癌劑或抗癌劑的組合阿克拉霉素、放線菌素、阿霉素、安西他濱、氨曲霉素、阿扎胞苷、氮絲氨酸、6-氮尿苷、雙蒽生、博來霉素、放線菌素C、卡莫氟、卡莫司汀、卡柔比星、嗜癌素、色霉素、順鉑、克拉立濱、阿糖胞苷、放線菌素D、柔紅霉素、二甲葉酸、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、去氧氟尿苷、多柔比星、依達(dá)曲沙、乙嘧替氟、依諾他濱、Fepirubicins、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、伊達(dá)比星、Loxuridines、美諾立爾、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、光輝霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、吡柔比星、吡曲克辛、普卡霉素、泊非霉素、蝶羅呤、嘌羅霉素、維生素A酸、鏈黑霉素、鏈脲菌素、呋喃脲噴啶、他莫昔芬、硫唑嘌呤胺、硫鳥嘌呤、曲安西龍、三甲曲沙、殺結(jié)核菌素、長春堿、長春新堿、凈司他丁和佐柔比星。112.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X是具有抗癌活性或化學(xué)治療活性的抗體或其它蛋白質(zhì)。113.權(quán)利要求99所述的方法，其中A-X是選自下列的抗生素藥劑或藥劑的組合:氨基苷類抗生素；酰胺醇；拌霉素；碳頭孢烯；碳青霉烯；頭孢菌素或頭孢烯；頭霉素；克拉維垸；環(huán)式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮內(nèi)酯類；林可胺類藥物；大環(huán)內(nèi)酯類；單環(huán)內(nèi)酰胺；硝基呋喃；氧頭孢烯；P惡晚烷酮；青霉烯、硫霉素和曰-內(nèi)酰胺類；青霉素；多肽抗生素；喹諾酮；氨磺酰；砜；四環(huán)素；和其它抗生素(例如氯?？朔?、梭鏈孢酸、海克西定、六胺、呋喃妥因、硝羥喹啉、利替培南、?；橇_定、Xibomols)。114.權(quán)利要求94所述的方法，其中所述sHASEGP是人sHASEGP。115.權(quán)利要求114所述的方法，其中所述人sHASEGP是PH20sHASEGP。116.權(quán)利要求115所述的方法，其中所述sHASEGP是SEQIDN0.4所示的可溶性多肽。117.權(quán)利要求94所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的或超唾液酸化的sHASEGP。118.權(quán)利要求116所述的方法，其中所述sHASEGP是聚乙二醇化的人PH20sHASEGP。119.緩解哺乳動(dòng)物中風(fēng)或其它CNS損傷的后果的方法，包括將sHASEGP引入所述中風(fēng)或CNS損傷之后的哺乳動(dòng)物。120.權(quán)利要求12或19的任何一項(xiàng)所述的多肽，其中所述聚合物是PEG。121.權(quán)利要求120所述的多肽，其中所述多肽每一個(gè)多肽包含至少約3個(gè)PEG部分。122.權(quán)利要求120所述的多肽，其中所述的PEG部分是分支的。123.權(quán)利要求120所述的多肽，其中所述的PEG部分選自mPEG-SBA(5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素?；?、PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙酸(30kDa)。124.制備聚乙二醇化的多肽的方法，包括使權(quán)利要求12或19中的任一項(xiàng)的多肽與摩爾過量的選自下列的PEG試劑反應(yīng)PEG-琥珀酰亞胺丁酸酯、PEG-琥珀酰亞胺甲基丁酸酯、PEG-琥珀酰亞胺丙酸酯、PEG-N-羥基琥珀酰亞胺、PEG-醛、PEG-碳酸酯、PEG-丙醛和PEG-馬來酰亞胺。125.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述PEG試劑選自mPEG-SBA(5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG陽SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素?；?、PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。126.聚乙二醇化的多肽，其根據(jù)權(quán)利要求124所述方法生產(chǎn)。127.聚乙二醇化的多肽，其根據(jù)權(quán)利要求125所述方法生產(chǎn)。128.聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶，其中所述透明質(zhì)酸酶每個(gè)多肽包括至少約3個(gè)PEG部分。129.權(quán)利要求128所述的透明質(zhì)酸酶，其中所述的PEG部分是分支的。130.權(quán)利要求128所述的透明質(zhì)酸酶，其中所述的PEG部分選自mPEG-SBA(5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。131.權(quán)利要求128所述的透明質(zhì)酸酶，其中所述透明質(zhì)酸酶是聚乙二醇化的sHASEGP。132.權(quán)利要求128所述的透明質(zhì)酸酶，其中所述透明質(zhì)酸酶是聚乙二醇化的rHuP腦。133.權(quán)利要求128所述的透明質(zhì)酸酶，其中所述透明質(zhì)酸酶是聚乙二醇化的動(dòng)物來源或細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸酶。134.制備聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶的方法，包括使透明質(zhì)酸酶與摩爾過量的選自下列的PEG試劑反應(yīng):PEG-琥珀酰亞胺丁酸酯、PEG-琥珀酰亞胺甲基丁酸酯、PEG-琥珀酰亞胺丙酸酯、PEG-N-羥基琥珀酰亞胺、PEG-醛、PEG-碳酸酯、PEG-丙醛和PEG-馬來酰亞胺。135.權(quán)利要求134所述的方法，其中所述PEG試劑選自mPEG-SBA(5kDa)、mPEG-SBA(20kDa)、mPEG-SBA(30kDa)、mPEG-SMB(20kDa)、mPEG-SMB(30kDa)、mPEG-丁醛(30kDa)、mPEG-SPA(20kDa)、mPEG-SPA(30kDa)、mPEG2-NHS(10kDa分支的)、mPEG2-NHS(20kDa分支的)、mPEG-NHS(40kDa分支的)、mPEG2-NHS(60kDa分支的)、PEG-NHS-生物素(5kDa生物素酰化的)、PEG-p-硝基苯基碳酸酯(30kDa)和PEG-丙醛(30kDa)。136.聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶，其根據(jù)權(quán)利要求134所述方法生產(chǎn)。137.聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶，其根據(jù)權(quán)利要求135所述方法生產(chǎn)。138.將分子輸送到含過量糖胺聚糖的組織的方法，包括將權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶以如此量施用到組織，所述量足以充分降解糖胺聚糖，以打開直徑在大約500nm以下的通道；和將分子施用到包含所述降解的糖胺聚糖的組139.藥物組合物，包括權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶和藥物學(xué)載體。140.用于增加直徑小于約0.5微米的治療物質(zhì)或其它分子或大分子復(fù)合物(各種藥劑)在對象中的擴(kuò)散的方法，包括施用給對象權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶和藥劑，所述聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶的量足以打開或形成直徑小于約0.5微米的通道，從而增加所述藥劑的擴(kuò)散。141.權(quán)利要求140所述的方法，其中所述藥劑選自化療劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、抗毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、a-腎上腺素能激動(dòng)劑、a阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、(3腎上腺素能阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心血管藥劑、避孕藥劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、高血糖藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮劑、鎮(zhèn)定劑、促睡眠劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇抗炎藥劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物或有機(jī)分子。142.試劑盒，包括(a)在可接受的iH本中的、劑量在O.l至1500單位/ml之間的權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶；(b)在可接受的載體中的至少一種治療物質(zhì)或其它分子或大分子復(fù)合物(每一種都為藥劑)；和(c)可選地，輸送治療物質(zhì)或其它藥劑的說明書。143.從玻璃體液去除糖胺聚糖的方法，包括施用權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶。144.誘導(dǎo)玻璃體液液化以治療哺乳動(dòng)物眼障礙的方法，包括將所述玻璃體液與一定量的權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶接觸，所述聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶的量足以有效液化所述的玻璃體液，從而治療所述障礙。145.緩解哺乳動(dòng)物中風(fēng)或其它CNS損傷的后果的方法，包括將權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶引入所述中風(fēng)或CNS損傷之后的哺乳動(dòng)物。146.將一種或多種藥理劑或其它藥劑(A-X)引入機(jī)體的組織的方法，包括在施用所述的藥劑之前或同時(shí)，將權(quán)利要求128的聚乙二醇化的透明質(zhì)酸酶施用到所述的組織。147.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X選自可檢測到的分子或其它診斷試劑、麻醉劑或其它組織修飾劑、藥理劑或藥物學(xué)上有效的試劑、和整型或其它美容化妝試劑。148.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X是抗癌藥或抗感染藥。149.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X是修飾血液的藥理劑。150.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X是直徑約20nm到200nm之間的分子或大分子復(fù)合物。151.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X選自阿達(dá)木單抗(例如HUMIRA)、(3-半乳糖苷酶(例如FABRAZYMEtm)、阿地白介素(PROLEUKINtmIL-2)、阿法賽特(例如AMEVIVEtm)、氨芐青霉素(例如UNASYNTM注射劑)、阿那白滯素(例如KINERETtm)、抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗(例如PEDIARIXtm)、抗胸腺細(xì)胞(例如THYMOGLOBULIN)、阿奇霉素(例如ZITHROMAXIV)、貝卡普勒明(例如REGRANEX)、卡泊芬凈(例如CANCIDAS)、頭孢挫啉(例如ANCEFtm禾口CEFAZOLIN)、頭孢吡肟(例如MAXIPIMEtm)、頭孢替坦(例如CEFOTAN)、頭孢他啶(例如FORTAZ)、頭孢曲松(例如ROCEFINtm)、西妥昔單抗(例如ERBITUX)、西司他丁(例如PRIMAXINIV)、克拉維酸(例如，與阿莫西林聯(lián)合，諸如AUGMENTIN)、克林霉素(例如CLEOCINtm)、a-達(dá)貝泊汀(例如ARANESP)、Deaclizumabs(例如ZENAPAXtm)、白喉類毒素(一般為藥物聯(lián)合，例如DAPTACELTM、INFANRIXtm和PEDIARIX)、依法利珠單抗(例如RAPTIVA)、腎上腺素(例如EPIPEN)、a-促紅細(xì)胞生成素(例如EPOGENtm禾口PROCRIT)、依那西普(例如ENBREL)、非格司亭(例如NEUPOGEN)、氟康唑(例如DIFLUCANTM注射劑)、促濾泡素例如a-促濾泡素(例如GONAL-Ftm)和P-促濾泡素(例如FOLLISTIM)、磷苯妥英(例如CEREBYX)、氟康唑(例如DIFLUCAN)、釓雙胺(例如OMMSCANTM)、釓噴酸(例如MAGNEVISTTM)、加替沙星(例如TEQUIN)、格拉默(例如COPAXONE)、GM-CSFs(例如LEUKINE)、戈舍瑞林(例如ZOLADEXTM)、格拉司瓊(例如KYTRILTM)、流感嗜血桿菌B's(例如COMVAXtm和HibTTTER)、氟哌啶醇(例如HALDOL)、甲型肝炎疫苗(例如HAVRIX、TWINRIXtm和VAQTA)、乙型肝炎疫苗(例如重組體COMVAXtm、ENGERIXTM-B、RECOMBIVAXTM-HB、TWINRIXTM，和非重組體BAYHEPTM-B和NABIM-HB)、替伊莫單抗(例如ZEVALIN)、免疫球蛋白(包括免疫球蛋白的混合物，如GAMMAGARDTM和類似物，以及各種純化的免疫球蛋白中的任意種)、流感病毒疫苗(例如FLUMISTtm)、英利昔單抗(例如REMICADE)、胰島素(例如HUMALOG、HUMALOGMIX75/25、HUMULINTM產(chǎn)品(包括50/50、70/30、Regular、NPH、Ultra和Ultralente)，和NOVOLIN)、甘精胰島素(例如LANTUS)、干擾素a-2a(ROFERAN-A)、干擾素a-2b(例如INTRON-atm)、復(fù)合a干擾素(例如INFERGENtm)、干猶素a-n3(例如ALFERONNtm)、干枕素卩(例如BETASERONfPBETAFERONtm)、干猶素(3-la(例如AVONEXtm和REBIFTM)、干擾素y(例如ACTIMMUNE)、碘克沙醇(例如VISIPAQUE)、碘海醇(OMNIPAQUETM)、碘帕醇、碘佛醇(例如OPTIRAY)、酮咯酸(例如TORADOL)、艾杜糖醛酸水解酶(例如ALDURAZYME)、左氧氟沙星(例如LEVAQUINtm)、利多卡因、利奈唑酮(例如ZYVOX)、勞拉西泮(例如ATIVAN)、麻疹疫苗(例如ATTENUVAX)、麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹病毒疫苗(例如M-M-R11)、甲羥孕酮(例如DEPO-PROVERA)、美洛培南(例如MERREMIV)、甲基強(qiáng)的松龍(例如SOLU-MEDROL)、咪達(dá)唑侖(例如VERSED)、嗎啡(例如ASTRAMORPH/PF)、奧曲肽(例如SANDOSTATIN)、奧馬佐單抗(例如XOLAIRtm)、昂丹司瓊(例如ZOFRAN)、帕利珠單抗(例如SYNAGIS)、泮托拉唑(例如PROTONIX)、培門冬酶(例如ONCASPAR)、聚乙二醇化非格司亭(例如NEULASTA)、聚乙二醇化干擾素a-2a(例如PEGASYS)、聚乙二醇化干擾素a-2b(例如PEG-INTRON)、培維索孟(例如SOMAVERT)、百閂咳疫苗、哌拉西林(例如ZOSYN)、肺炎球菌疫苗(例如PNEUMOVAXTM23)和肺炎球菌組合疫苗(例如PREVNARtm)、異丙嗪(例如PHENERGAN)、瑞替普酶(例如RETAVASE)、生長激素(例如GENOTROPIN、HUMATROPE、NORDI丁ROPINtm、NUTROPIN、SAIZENTM、SEHOSTIM、ZORB丁IV『m)、舒巴坦、舒馬曲坦(例如IMITREXTM)、他左巴坦、替奈普酶(例如TNKASE)、精制破傷風(fēng)類毒素、替卡西林(例如TIMENTIN)、托西莫單抗(例如BEXXARtm)、曲安奈德、萬古霉素(例如VANCOCIN)、水痘疫苗(例如VARIVAXtm)和其它疫苗。152.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X是選自下列的抗生素藥劑或藥劑的組合氨基苷類抗生素；酰胺醇；袢霉素；碳頭孢烯；碳青霉烯；頭孢菌素或頭孢烯；頭霉素；克拉維垸；環(huán)式脂酰肽；二氨基嘧啶；酮內(nèi)酯類；林可胺類藥物；大環(huán)內(nèi)酯類；單環(huán)內(nèi)酰胺；硝基呋喃；氧頭孢烯；p惡唑垸酮；青霉烯、硫霉素和e-內(nèi)酰胺類；青霉素；多肽抗生素；喹諾酮；氨磺酰；砜；四環(huán)素；和其它抗生素(例如氯福克酚、梭鏈孢酸、海克西定、六胺、呋喃妥因、硝羥喹啉、利替培南、?；橇_定、Xibomols)。153.權(quán)利要求146所述的方法，其中A-X選自下列的抗癌劑或抗癌劑的組合阿克拉霉素、放線菌素、阿霉素、安西他濱、氨曲霉素、阿扎胞苷、氮絲氨酸、6-氮尿苷、雙蒽生、博來霉素、放線菌素C、卡莫氟、卡莫司汀、卡柔比星、嗜癌素、色霉素、順鉑、克拉立濱、阿糖胞苷、放線菌素D、柔紅霉素、二甲葉酸、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、去氧氟尿苷、多柔比星、依達(dá)曲沙、乙嘧替氟、依諾他濱、Fepirubicins、氟達(dá)拉濱、氟尿噴啶、吉西他濱、伊達(dá)比星、Loxuridines、美諾立爾、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、光輝霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、吡柔比星、吡曲克辛、普卡霉素、泊非霉素、蝶羅呤、嘌羅霉素、維生素A酸、鏈黑霉素、鏈脲菌素、呋喃脲嘧啶、他莫昔芬、硫唑嘌呤胺、硫鳥嘌呤、曲安西龍、三甲曲沙、殺結(jié)核菌素、長春堿、長春新堿、凈司他丁和佐柔比星。全文摘要本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)新的可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGPs)、制備方法，和它們幫助其他分子的給藥或者緩解糖胺聚糖相關(guān)的病理的用途。描述了可溶性中性活性sHASEGP結(jié)構(gòu)域的最小化的活性多肽結(jié)構(gòu)域，其包括對于功能性的中性活性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域而言所必需的天冬酰胺-連接的糖部分。包括了經(jīng)修飾的可增強(qiáng)sHASEGP的分泌的氨基末端前導(dǎo)肽。本發(fā)明進(jìn)一步包括重組sHASEGP的唾液酸化和聚乙二醇化形式，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和血清藥物動(dòng)力學(xué)，使其優(yōu)于天然發(fā)生的來自屠宰場的酶。進(jìn)一步描述了基本上純的重組sHASEGP糖蛋白的合適制劑，所述的重組sHASEGP糖蛋白來自于可產(chǎn)生適當(dāng)?shù)奶腔饔玫恼婧思?xì)胞，所述糖基化對于所述蛋白的最佳活性是必需的。文檔編號C07H21/04GK101163717SQ200680013224公開日2008年4月16日申請日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者A·昆度,G·A·凱勒,G·I·弗羅斯特,L·H·布賓楓,M·F·哈勒,T·M·迪蘭申請人:海洋酶醫(yī)療公司