專利名稱：：多糖粘液形成菌的靶基因缺失的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鞘氨醇膠多糖制備領(lǐng)域。特別地，其涉及用于改進(jìn)制備鞘氨醇膠的菌抹的定點(diǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
：鞘氨醇單胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC53159和ATCC31461產(chǎn)生大量的莢膜多糖。盡管在某些條件下，多糖可以由細(xì)胞釋放[5,6]，但在具有豐富碳源的生長(zhǎng)過(guò)程中(如發(fā)酵)，多糖牢固附著于細(xì)胞表面。提高丟坦糖膠(diutan)和吉蘭糖膠(gellan)發(fā)酵產(chǎn)率的嘗試受到莢膜性質(zhì)的多糖的限制，所述莢膜性質(zhì)的多糖可以破壞營(yíng)養(yǎng)素的吸收。另外，如果用于多糖的生物合成的位點(diǎn)數(shù)量有限，就會(huì)有由各細(xì)胞能產(chǎn)生多糖的最大量。已經(jīng)觀察到多糖吉蘭糖膠與細(xì)胞凝集有關(guān)，這是由于不產(chǎn)生任何多糖的突變體在懸浮液中均勻地生長(zhǎng)[3]。這些細(xì)胞凝集塊可以干擾多種技術(shù)，例如通過(guò)光密度測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞的離心(例如用于分離DNA或蛋白質(zhì))，以及用于多糖純化的細(xì)胞分離或裂解。先前尚未確定與鞘氨醇單胞菌中多糖附著于細(xì)胞表面有關(guān)的附著機(jī)制和基因。已經(jīng)分離了以粘液形式產(chǎn)生多糖的鞘氨醇單胞菌菌林ATCC31461、ATCC31555、ATCC31554和ATCC21423的誘導(dǎo)突變體，但是未確定突變基因，且未公開誘導(dǎo)和篩選突變體的方法[IO]。已經(jīng)分離了用于吉蘭糖膠[3，8]、丟坦糖膠[l]和鞘氨醇膠S-88[9]生物合成的基因。許多這些基因的功能通過(guò)生物化學(xué)試驗(yàn)給出或者通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank中的已知功能的基因的同源性給出。例如，已經(jīng)鑒定了與四糖重復(fù)單元[7,8]的裝配和前體dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有關(guān)的基因。預(yù)期僅影響多糖附著于細(xì)胞表面的基因仍具有產(chǎn)生多糖的表型(即固體培養(yǎng)基和粘性發(fā)酵液上的粘液樣菌落)。除了不在基因簇中的用于吉蘭糖膠合成的四種基因外，還描述了if爭(zhēng)越21kb的18種用于吉蘭糖膠生物合成的基因的基因簇。HardingN.E.，Y.N.Patel,andR.Coleman,2004。伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌ATCC31461中具有吉蘭糖膠多糖生物合成所需的基因的結(jié)構(gòu)。JIndMicrobiolBiotech31:70-82，參考文獻(xiàn)3。其DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號(hào)AY217008)?；虼刂械幕蛴術(shù)elM、gelN以及gell。構(gòu)建了大多數(shù)相鄰基因gelM和gelN的缺失。通過(guò)插入滅活gell基因。gelM-gelN缺失抹和gell突變株顯示產(chǎn)生數(shù)量有所減少的吉蘭糖膠和更具流動(dòng)性的發(fā)酵液，且顯示所產(chǎn)生的吉蘭糖膠具有與野生株的吉蘭糖膠相同的組成。多糖至細(xì)胞的附著未有報(bào)道。伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌的geR、gelS及gelG基因似乎以與S-88sps基因簇中相同的順序存在于操縱子中，但不鄰近18個(gè)基因的基因蔟中的基因(參考文獻(xiàn)3)。GelR蛋白較其S-88同源物稍小(659和670個(gè)氨基酸相比)，具有49%的同源性，且與表層蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及geiG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號(hào)AY220099)。該報(bào)道中未構(gòu)建gelR的突變(參考文獻(xiàn)3)。Yamazaki等報(bào)道在基因spsR中具有突變的菌抹仍為粘液樣，表明它們產(chǎn)生多糖，但多糖不具有流變學(xué)或附著于細(xì)胞的特征([9]和T.J.Pollock等，DNAsegmentsandmethodsforincreasingpolysaccharideproduction.U.S.PatentNo.5,854,034)。Yamazaki描述了四種鞘氨醇單胞菌菌抹的典型突變體，其產(chǎn)生作為粘液而非附著于細(xì)胞的多糖。美國(guó)專利第6,605,461號(hào)。Yamazaki未描述如何篩選粘液表型的誘變培養(yǎng)物。Yamazaki未鑒定出哪個(gè)基因或哪些基因被誘變。Sa-Correia綜述了關(guān)于吉蘭糖膠合成的基因的分離的工作。Sa-CorreiaI.,A.M.Fialho,P.Videira，L.M.Moreira,A.R.MarquesandH.Albano。GellangumbiosynthesisinSphingomonaspaucimobilisATCC31461:Genes,enzymesandexopolysaccharideproductionengineering.JIndMicrobiolBiotechnol.29:170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分測(cè)序，包括urf32和urf26—上述的參考文獻(xiàn)3的gelM和gelN)。這些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank(GenBank登錄號(hào)AY242074)。這些基因的功能未有l(wèi)艮道。在GenBank遞交中，僅分別將基因urfi2和urf26指定為推定的膜蛋白和推定的運(yùn)輸?shù)鞍?。未存放gell或gdR的序列。Coleman描述了用于丟坦糖膠生物合成的基因的分離和某些基因功能的研咒。R.Coleman,2001,CloningandanalysisofSphingomonassp.ATCC53159polysaccharidegenes.Master'sThesis,SanDiegoStateUniversity。4苗述了dpsM和dpsN基因(由Coleman命名為orf3和orf4)，但未指明功能。描述了來(lái)自鞘氨醇單胞菌菌抹ATCC31554的用于S-88多糖的生物合成的基因蔟。YamazakiM.,L.Thome,M.Mikolajczak，R.W.Armentrout和T.J.Pollock.1996.LinkageofgenesessentialforsynthesisofapolysaccharidecapsuleinSphingomonasstrainS88.JBacteriol178:2676-2687和美國(guó)專利第5,854,034號(hào)。未描述基因urG2和urf26的功能(dpsM、gelM和dpsN、gelN的同源物)和spsl(gell、dpsl的同源物)。將spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述為編碼與細(xì)菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登錄號(hào)U51197)。本領(lǐng)域仍需要改進(jìn)制備工業(yè)上實(shí)用的鞘氨醇膠的方法和改進(jìn)鞘氨醇月交的性質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種制備細(xì)菌的方法。所述細(xì)菌是鞘氨醇單胞菌屬，并含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M、N、I或R基因的一種或多種基因的突變。在某些出版物中(例如參考文獻(xiàn)8和9),所述基因M和N還分別稱為urf2、urf26基因(未知的閱讀框)。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段。所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N或I或R的全部或部分。誘導(dǎo)所述片段中的片段以形成突變的片段。將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌。所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細(xì)菌的子代，其中突變的片段整合入所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換的野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂(lè)藻菌(伊樂(lè)藻菌)或者不是伊樂(lè)藻菌。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，提供了制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的另一種方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇多糖生物合成基因簇的基因M、N、I和R的一種或多種基因的突變。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA的兩個(gè)非連續(xù)片段。所述片段側(cè)鄰或包括鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N。相似地，可分離側(cè)鄰基因I或R的片段。將所述兩個(gè)非連續(xù)片段連接在一起。將所述連接的非連續(xù)片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌。所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述連接的片段整合入所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂(lè)藻菌或者不是伊樂(lè)藻菌。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有吉蘭糖膠多糖，所述吉蘭糖膠多糖賦予改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)，包括凝膠強(qiáng)度。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予液體較由ATCC53159菌株產(chǎn)生的等重的丟坦糖膠增加的粘度。根據(jù)本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案，提供了分離和純化的鞘氨醇單胞菌屬的細(xì)菌。所述細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M、N、I或R的一種或多種基因的突變。所述細(xì)菌可以在適于產(chǎn)生鞘氨醇膠多糖的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)而在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生鞘氨醇膠多糖。所述細(xì)菌的13培養(yǎng)物發(fā)酵液可以直接或在使用乙醇沉淀之后用作增粘劑或膠凝劑?？蛇x地，所述培養(yǎng)物發(fā)酵液可進(jìn)行下述步驟在其用作增粘劑或膠凝劑之前從所述培養(yǎng)物發(fā)酵液去除細(xì)菌或從所述發(fā)酵液回收。所述鞘氨醇單胞菌可以是伊樂(lè)藻菌或者不是伊樂(lè)藻菌。一經(jīng)閱讀該說(shuō)明書，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的這些和其他實(shí)施方案提供了本領(lǐng)域用于制備增粘劑和膠凝劑的新的方法、菌株以及組合物。附圖簡(jiǎn)述圖1.鞘氨醇單胞菌菌林ATCC31554、ATCC31461和ATCC53159中多糖生物合成的基因簇的比較。圖2.S60WTCgelM-gelN突變體的粘液形成特征。圖3.S60WTCgelN和gell突變體的粘液形成特征。圖4.dpsN的缺失位點(diǎn)的DNA序列(SEQIDNO:19),和融合肽的氨基酸序列(SEQIDNO:20)。圖5A-5C.dpsN突變體的粘液形成特征。圖6A-6B.dpsM突變體的粘液形成特征。具體實(shí)施例方式在兩種鞘氨醇單胞菌菌抹中，已經(jīng)鑒定了控制多糖附著于細(xì)菌細(xì)胞的的基因。gelM(dpsM)和gelN(dpsN)任一者或二者的缺失或gell的失活導(dǎo)致多糖作為粘液釋放至培養(yǎng)基中而非作為莢膜多糖附著于細(xì)胞表面。粘液型多糖的形成使得細(xì)菌培養(yǎng)物易于處理，改進(jìn)了在發(fā)酵過(guò)程中的混合，可以增加產(chǎn)量，且在某些情況下，改進(jìn)多糖的流變學(xué)性質(zhì)。定點(diǎn)誘變基于多種原因較隨機(jī)誘變用于篩選粘液形成突變體更有利，所述多種原因包括速度和無(wú)關(guān)突變的避免。發(fā)現(xiàn)基因gelR的失活可以改進(jìn)粘液形式的膠凝多糖的流變學(xué)性質(zhì)(凝膠強(qiáng)度)。14可以對(duì)任何鞘氨醇單胞菌菌抹中的dpsM、dpsN、gelM、gelN和geil的直向同源物進(jìn)行滅活以獲得粘液形成表型。可以對(duì)gelR的直向同源物進(jìn)行滅活以防止多糖降解，從而導(dǎo)致改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)。合適的鞘氨醇單胞菌包括但不限于產(chǎn)生鼠李糖膠(rhamsan,ATCC31961)、韋蘭糖膠(welan，ATCC31555)、吉蘭糖膠(ATCC31461)和丟坦糖膠(ATCC53159)的那些菌抹，以及產(chǎn)生多糖的菌抹S7(ATCC21423)、S88(ATCC31554)、S198(ATCC31853)和NW11(ATCC53272)。ATCC號(hào)指美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏所(AmericanTypeCultureCollection)的菌才朱的存》文號(hào)。這些細(xì)菌通過(guò)^f尹樂(lè)藻菌ATCC31461和鞘氨醇單胞菌ATCC53159來(lái)舉例說(shuō)明，但也可以使用其他菌抹?？墒褂玫暮线m的鞘氨醇單胞菌包括adhaesiva鞘氨醇單胞菌,aerolata鞘氨醇單胞菌，alaskensis鞘氨醇單胞菌，aquatilis鞘氨醇單胞菌，aromaticivorans鞘氨醇單胞菌，asaccharolytica鞘氨醇單胞菌，aurantiaca鞘氨醇單胞菌，莢膜鞘氨醇單胞菌，chlorophenolica鞘氨醇單胞菌，chungbukensis鞘氨醇單胞菌，下水道鞘氨醇單胞菌，海膽鞘氨醇單胞菌，伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌，faeni鞘氨醇單胞菌，herbicidovorans鞘氨醇單胞菌,koreensis鞘氨醇單胞菌，macrogoltabidus鞘氨醇單胞菌，mali鞘氨醇單胞菌,melonis鞘氨醇單胞菌，游泳池鞘氨醇單胞菌，parapaucimobilis鞘氨醇單胞菌，paucimobilis鞘氨醇單胞菌，pituitosa鞘氨醇單胞菌，櫻桃鞘氨醇單胞菌,玫瑰鞘氨醇單胞菌，sanguinis鞘氨醇單胞菌，鞘氨醇單胞菌，stygda鞘氨醇單胞菌，subarctica鞘氨醇單胞菌，suberifaciens鞘氨醇單胞菌，地下鞘氨醇單胞菌，taejonensis鞘氨醇單胞菌，terrae鞘氨醇單胞菌，trueperi鞘氨醇單胞菌，ursincola鞘氨醇單胞菌，wittichii鞘氨醇單胞菌，xenophaga鞘氨醇單胞菌，yabuuchiae鞘氨醇單胞菌，以及矢野鞘氨醇單胞菌?？筛鶕?jù)基因定位和鞘氨醇膠生物合成基因簇中的結(jié)構(gòu)、根據(jù)總的同源性和/或根據(jù)結(jié)構(gòu)域同源性鑒定直向同源物。通常，與dpsM、dpsN、gelM、gelN、gelI或gelR基因之一的總的同源性的水平將大于44%,常大于55%、66%、77%、88%或98%。直向同源物理想地與這四種基因的至少之一具有大于80%的同源性。定點(diǎn)誘變可用于在所需的已知靶基因或基因組區(qū)產(chǎn)生突變。這消除了隨機(jī)誘導(dǎo)的誘變或自發(fā)誘變的試驗(yàn)與誤差。缺失的形成確保了突變將不會(huì)15復(fù)原，例如可能在點(diǎn)(替代)突變和插入突變中可見的。缺失也具有不應(yīng)用外源性DNA的益處，例如藥物抗性標(biāo)記或其他環(huán)境不需要的標(biāo)記?；蚪MDNA的分離片段是不連接在正常情況下與其結(jié)合的基因組DNA的DNA,其含有鞘氨醇膠生物合成基因蔟的M和/或N、I或R或側(cè)鄰的DNA。作為非限制性實(shí)施例，所分離的DNA可通過(guò)由天然來(lái)源純化、通過(guò)合成或通過(guò)擴(kuò)增來(lái)獲得。所分離的DNA通常位于體外的DNA片段上，但是所分離的DNA還可以位于載體上，例如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，其含有鞘氨醇單胞菌基因組的所需部分。側(cè)鄰的DNA通常來(lái)自緊鄰M和/或N、I或R的約500bp基因或約l-2kb基因內(nèi)的基因組區(qū)。本領(lǐng)域任何已知的方法可用于將突變引入所分離的片段，所述片段含有鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N、I或R的全部或部分。例如，可使用限制性內(nèi)切酶和再連接非連續(xù)的核苷酸而引入缺失?？赏ㄟ^(guò)擴(kuò)增和連接基因的兩個(gè)非連續(xù)片段或側(cè)鄰靶基因的DNA的兩個(gè)非連續(xù)片^:來(lái)形成缺失?？梢允褂煤怂醿?nèi)切酶消化和連接在所分離的片段中產(chǎn)生插入?；瘜W(xué)誘變可用于基因組DNA的分離片段。可選擇任何誘變方法并根據(jù)具體情況而使用。在誘導(dǎo)突變之后，基因組DNA的片段可再導(dǎo)入受者細(xì)菌。通常情況下，但不是一定，受者將是與片段的供者相同的物種。可使用本領(lǐng)域已知的任何方法用于將外源性DNA導(dǎo)入細(xì)菌。合適的方法包括但不限于電穿孔、接合、原生質(zhì)體形成、氯化鈣沉淀和轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)?？筛鶕?jù)具體情況選擇和使用任何核酸導(dǎo)入方法。如果導(dǎo)入受者細(xì)菌中的突變基因組DNA片段不具有復(fù)制自身的途徑，那么它必須在受者細(xì)菌中整合入復(fù)制子以得到維護(hù)。通常，這種整合事件將整合整個(gè)攝入的質(zhì)粒?？梢詸z測(cè)導(dǎo)入的DNA上的標(biāo)記，以鑒定所述DNA已經(jīng)整合。為了檢測(cè)整合的實(shí)現(xiàn)，可以篩選或選擇所導(dǎo)入的DNA上的標(biāo)記的喪失。實(shí)現(xiàn)該目的的合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域已知，JU壬何標(biāo)記可用作此處的指示物。為了確定其中所導(dǎo)入的鞘氨醇膠基因取代了受者的野生型基因的分離才朱，可通過(guò)例如PCR測(cè)定DNA的大小或序列。如下文所證明的，通過(guò)鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N產(chǎn)生粘液形式的鞘氨醇膠，突變體可以較附著于細(xì)菌細(xì)胞上的形式具有改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)。所述改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)通過(guò)相同重量的材料提供更具粘力的能力而得到反映。所述改進(jìn)可以是輕度的，例如至少5%、10%、15%、20%或25%，或其可為更顯著的，相對(duì)于由形成莢膜的親代產(chǎn)生的鞘氨醇膠改進(jìn)至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。流變學(xué)性質(zhì)可使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)測(cè)定。合適的技術(shù)包括但不限于自來(lái)水溶液中的低切變率粘度(LowShearRateViscosity,LSRV),和高鹽溶液中的海水粘度(SeaWaterViscosity,SWV)。由例如gelN突變體產(chǎn)生的粘液形式的吉蘭糖膠和推定的裂解酶基因gelR的突變相結(jié)合導(dǎo)致高凝膠強(qiáng)度的吉蘭糖膠的形成。凝膠強(qiáng)度通常大于1000,而莢膜菌抹通常產(chǎn)生凝膠強(qiáng)度為600至900但小于1000的吉蘭糖膠。根據(jù)本發(fā)明的純化細(xì)菌是已經(jīng)被微生物學(xué)純化的細(xì)菌，例如使用液體稀釋技術(shù)或于固體培養(yǎng)基上劃線以形成單菌落。微生物學(xué)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于該目的。根據(jù)本發(fā)明的突變體可使用用于親代菌抹相同或相似的技術(shù)來(lái)培養(yǎng)和增殖。所述突變體的液體培養(yǎng)物性質(zhì)可以得到改進(jìn)，允許增加通風(fēng)和混合。所述突變體的培養(yǎng)物發(fā)酵液也可以提供較附著形式的多糖具有較高效的回收。另外，所述突變體還可以提供較附著形式的多糖具有改進(jìn)的澄明度的產(chǎn)物。細(xì)菌可任選通過(guò)過(guò)濾、離心或通過(guò)沉降從所述突變體產(chǎn)生的多糖去除。所述培養(yǎng)物發(fā)酵液可根據(jù)需要在去除細(xì)菌之前或之后被化學(xué)、酶或溫度(熱或冷)處理。涉及吉蘭糖膠附著于細(xì)胞表面的伊樂(lè)藻菌ATCC31461的基因?yàn)間elM和gelN(圖1,SEQIDNO:13)和gell(圖1,SEQIDNO:25)。已經(jīng)構(gòu)建了具有大部分基因gelM和gelN缺失從而產(chǎn)生粘液形成表型的菌抹。已經(jīng)構(gòu)建了gelN特定缺失，并構(gòu)建了基因gell的插入。這兩種突變均產(chǎn)生了粘液形成表型。在SEQIDNO:13中，gelM和gelN的編碼序列分別位于核苷酸501-1382和1366-2064。在SEQIDNO:25中,gell的編碼序列分別位于核苦酸501-1403。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:26。發(fā)現(xiàn)基因gelR的缺失導(dǎo)致粘液形式的吉蘭糖膠的凝膠強(qiáng)度改進(jìn)。在SEQIDNO:27中，gelR的編碼序列分別位于核苷酸478-2457。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:28。涉及丟坦糖膠附著于細(xì)胞表面的鞘氨醇單胞菌ATCC53159的基因?yàn)閐psM和dpsN(圖1，SEQIDNO:14)，并根據(jù)與gell的同源性推測(cè)dpsl。已經(jīng)構(gòu)建了dpsM和dpsN的各基因的缺失，兩者均產(chǎn)生了粘液形成表型。在SEQIDNO:14中，dpsM和dpsN的編碼序列分別位于核苷酸456-1337和1321-2019。編碼的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:8和17。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，用于吉蘭糖膠合成的相同或相似的方法也可以用于丟坦糖膠合成?；騞psl和dpsR的這種突變可容易構(gòu)建。在SEQIDNO:29中，dpsl的編碼序列分別位于核香酸501-1472。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO:30。在SEQIDNO:31中，dpsR的編碼序列分別位于501-2498。編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO.32。上述公開內(nèi)容大體上描述了本發(fā)明。本文所公開的所有參考文獻(xiàn)明確地通過(guò)引用并入。通過(guò)參考本文提供的下述具體實(shí)施例，可以獲得更完整的理解，所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，不意于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1——吉蘭糖膠粘液形成突變體的制備對(duì)于伊樂(lè)藻鞘氨醇單胞菌的突變體的構(gòu)建，使用了名為S60wtc1的ATCC31461的衍生物，其具有改進(jìn)的DNA攝取。該菌株可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。PCR擴(kuò)增用于擴(kuò)增側(cè)鄰基因gelM-gelN的區(qū)域。見參考文獻(xiàn)3。通過(guò)雙交換同源性重組，將擴(kuò)增的片段克隆至pL02載體中并通過(guò)接合導(dǎo)入S60wtc中以置換具有缺失的基因組上的基因gelM和gelN。載體pL02不在S60wtc中復(fù)制，所以對(duì)于卡那霉素抗性的最初選沖奪選擇了其中質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合入染色體的那些菌落。所述載體還含有基因sacB。該基因賦予了對(duì)蔗糖的敏感性。這種對(duì)蔗糖的選擇性可用于篩選喪失質(zhì)粒的分離林并保留缺失或野生型基因的一個(gè)拷貝。('伊樂(lè)藻菌ATCC31461具有低的DNA攝取效率，特別是大質(zhì)粒(約10)。分離具有增加的DNA攝取效率的ATCC31461的自發(fā)突變體。懷疑這些少數(shù)的細(xì)胞為成功的質(zhì)粒受者，例如廣泛宿主范圍的質(zhì)粒pLAFR3，表現(xiàn)受者群體具有增加的攝取該質(zhì)粒DNA能力的突變。為了使得質(zhì)粒喪失，在非選項(xiàng)性條件下增殖三種含有pLAFR3的轉(zhuǎn)接合子(即無(wú)四環(huán)素抗生素)，連續(xù)傳代約30代。檢測(cè)了三種獨(dú)立的質(zhì)粒處理的菌抹(即來(lái)自每一起始轉(zhuǎn)接合子的四環(huán)素敏感性衍生物)，所有三種顯示的增加的接合率(4.2XIO"3、0.6X10"以及1.5X10"2)，表現(xiàn)與野生型菌林相比具有105倍的增加。該增加的"l妄合率是穩(wěn)定的且可再生的。這些菌4朱之一被命名為S60wtc。見參考文獻(xiàn)3。)使用提供轉(zhuǎn)移功能的pRK2013,并使用于YM-Sm(25ug/ml)-Km(7.5ug/ml)培養(yǎng)基上選擇的轉(zhuǎn)接合子，通過(guò)三親代偶配將含有g(shù)elM-gelN缺失區(qū)域的質(zhì)粒導(dǎo)入S60wtc。鏈霉素防止大腸桿菌菌林的生長(zhǎng)。分離卡那霉素抗性質(zhì)粒整合體。蔗糖敏感性用于選擇消除載體的第二重組事件。在非選擇性條件下，即無(wú)抗生素，將五個(gè)分離抹傳代兩次。然后將整分等份鋪于含有8%蔗糖的培養(yǎng)基上。分離蔗糖抗性菌落，并檢測(cè)卡那霉素敏感性。分離基因組DNA，并使用PCR測(cè)定哪些Kms分離抹保留了缺失。對(duì)于缺失的預(yù)期大小的擴(kuò)增片段由四種菌林的基因組DNA產(chǎn)生。于YM培養(yǎng)基上純化這四種缺失菌抹。四種菌抹均顯示比野生型粘性較小、較軟、較平坦且黃色較深。實(shí)施例2-gelM-gelN缺失菌抹的特征在搖瓶發(fā)酵中評(píng)價(jià)gelM-gelN缺失分離抹。與較堅(jiān)固、粘度較大的S60wtc發(fā)酵液相比，AgelM-gelN培養(yǎng)物發(fā)酵液為液體且光滑。與S60wtc纖維相比，由突變菌4朱使用異丙醇沉淀產(chǎn)生較長(zhǎng)、較厚的纖維。然而，缺失突變體的全部可沉淀物質(zhì)的產(chǎn)量減少22%,且僅產(chǎn)生30%的野生型的發(fā)酵液粘度。所產(chǎn)生的吉蘭糖膠具有正常的糖、甘油和乙?；〈M成。使用幾種技術(shù)評(píng)價(jià)突變體的粘液形成特征，包括顯孩t鏡評(píng)價(jià)、細(xì)胞凝集、細(xì)胞沉淀物形成以及熱沉降試驗(yàn)，如圖2所示。熱沉降試驗(yàn)包括在高壓滅菌器中加熱吉蘭糖膠發(fā)酵液10分鐘以熔化吉蘭糖膠，然后將熱發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至大試管中并在95。C過(guò)夜培養(yǎng)(以維持發(fā)酵液為液體)。對(duì)于莢膜菌林，細(xì)胞附著多糖并保持懸浮。對(duì)于粘液形成19菌，細(xì)胞未附著多糖并在過(guò)夜培養(yǎng)過(guò)程中沉降。通過(guò)該試^r顯示gelM-gdN缺失菌抹為粘液形成菌抹。對(duì)于離心試驗(yàn)，在含有1%葡萄糖的DM2培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)菌抹并在Eppendorf離心機(jī)中以最大速度進(jìn)行離心?；騡elM-N的失活導(dǎo)致細(xì)胞表面多糖的附著完全喪失，使得細(xì)胞可通過(guò)離心而沉淀。通過(guò)顯孩t鏡評(píng)^介，大部分S60wtcAgelM-N細(xì)胞游離并具有動(dòng)力，而S60wtc處于樹膠基質(zhì)中。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，S60wtcAgelM-N細(xì)胞在懸浮液中生長(zhǎng)，而S60wtc細(xì)胞形成凝塊。實(shí)施例3~~吉蘭糖膠粘液形成突變體的構(gòu)建構(gòu)建了gelN的缺失用于吉蘭糖膠生物合成。將PCR引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增gelN基因的上游DNA片段(500bp)和下游DNA片段(401bp)[3]。使用的引物示于表1中。表l.用于構(gòu)建gdN缺失突變體的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>引物Sacl-GelN引物1和XbaI-GelN引物2用于將基因gelM的500bp片段擴(kuò)增為Sacl-Xbal片段(共516bp)。引物XbaI-GelN引物3和SphI-GelN引物4用于將atrD基因的40]bp片段擴(kuò)增為Xbal-Sphl片段(共418bp)。由于gelM基因的末端與gelN基因重疊了17bp,保留了gelM的終止密碼子和gelN的起始密碼子，以及gelN的天然終止密碼子。將PCR片段順序連接于質(zhì)粒載體pL02的多酶切點(diǎn)的接頭(polylinker)[4]，產(chǎn)生帶有g(shù)elN缺失的克隆pL02-gelNdeln糾。然后，通過(guò)接合和同源重組將質(zhì)粒pL02-gelNdeln#l用于將缺失轉(zhuǎn)移至菌林S60wtc氣S60wtc菌林是作為自發(fā)突變體衍生自ATCC31461的菌抹，攝取質(zhì)粒DNA的能力增加[2]。通過(guò)卡那霉素抗性選擇染色體整合體。隨后在無(wú)抗生素的情況下培養(yǎng)大約30代使得除去質(zhì)粒。然后，由于編碼質(zhì)粒的基因sacB喪失，通過(guò)蔗糖(8%)耐性篩選喪失質(zhì)粒的重組子，然后篩選菌落的卡那霉素敏感性。sacB基因編碼用于由蔗糖合成果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果聚糖對(duì)細(xì)胞具有毒性。喪失基因sacB的細(xì)胞可以在蔗糖條件下生長(zhǎng)。耐受蔗糖的分離抹可為野生型或缺失。由幾個(gè)分離抹制備基因組DNA,以鑒定較野生型基因而保留gelN缺失的那些分離抹，如通過(guò)PCR測(cè)定。與野生型gelN+分離抹的硬菌落相比，具有g(shù)elN缺失的分離株具有較軟和較稀薄的菌落。實(shí)施例4——gelN缺失突變體的特征GelN缺失突變體具有與gelM-gelN缺失突變體相似的性質(zhì)。通過(guò)離心可容易地沉淀細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，gelN缺失突變體在懸浮液中生長(zhǎng)，而野生型細(xì)胞形成凝塊。因此，基因gelN的失活可導(dǎo)致粘液表型，如圖3所示。在搖瓶發(fā)酵中，評(píng)價(jià)gelN缺失突變體的五種單個(gè)的分離抹。gelN突變體的平均產(chǎn)量(全部可沉淀物質(zhì)，TPM，1.10g/100ml)與S60wtc對(duì)照的平均產(chǎn)量(1.08g/100ml)具有可比性。在20LApplikon發(fā)酵罐中使用含有有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮、鹽和玉米糖漿的培養(yǎng)基評(píng)價(jià)gelN突變體。使用異丙醇沉淀吉蘭糖膠多糖，并干燥和稱重。突變體的全部可沉淀物質(zhì)的平均產(chǎn)量為野生型對(duì)照的平均產(chǎn)量的94%，然而，發(fā)酵液粘度減少約40%。發(fā)酵液粘度的這一減少促進(jìn)了發(fā)酵罐中的混合。表2.gelN突變體的發(fā)酵特征<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在BrookfieldLVF粘度計(jì)中^f吏用4號(hào)轉(zhuǎn)子在60rpm下測(cè)量粘度。實(shí)施例5——產(chǎn)生具有改進(jìn)質(zhì)量的吉蘭糖膠粘液的突變體的構(gòu)建吉蘭糖膠的粘液突變體具有較低的發(fā)酵液粘度，如實(shí)施例4所述，這促進(jìn)發(fā)酵罐中的混合。膠凝多糖在加熱和冷卻之后形成凝膠，吉蘭糖膠由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和流變學(xué)性質(zhì)而用于多種食品用途中。因此，評(píng)價(jià)了由粘液突變體產(chǎn)生的吉蘭糖膠的凝膠強(qiáng)度。使用柱塞破壞或破裂所制備的凝膠表面來(lái)測(cè)定凝膠強(qiáng)度。(2見腳注1關(guān)于攝取DNA能力增加的的突變體的用途。)將吉蘭糖膠發(fā)酵液調(diào)整至pH4.6(防止去乙?；?并通過(guò)加熱至約100。C持續(xù)幾分鐘來(lái)滅菌。通過(guò)添加三倍體積的異丙醇沉淀吉蘭糖膠產(chǎn)物，并在6(TC下干燥纖維2小時(shí)并研磨。通過(guò)在去皮重的600ml不銹鋼燒杯中添加2ml0.3MCaCl2.2H20原溶液至295ml去離子水來(lái)制備鉤溶液。在700rpm下攪拌溶液的同時(shí)，添加3.0g吉蘭糖膠產(chǎn)物并使得分散1至2分鐘。將燒杯置于預(yù)熱的94-95。C水浴中，覆蓋并加熱15分鐘，然后攪拌3分鐘。使用加熱的去離子水將溶液重量調(diào)整至300g,混合并然后在94-95。C下放置4分鐘。將溶液轉(zhuǎn)移至六個(gè)環(huán)形模(ringmolds)(0.5英寸高，1.375英寸外徑,0.125英寸壁厚)，并使用塑料蓋板覆蓋并使得在室溫(20-21°C)下冷卻20至24小時(shí)。從模子中取出圓盤，將其放置于有機(jī)玻璃盤上。在TA-TX2TextureAnalyzer中使用Kobe柱塞(TA-19)以1.0mm/s測(cè)定凝膠強(qiáng)度或斷裂的力(以g/cn^記錄)。粘液突變體的吉蘭糖膠較野生型莢膜菌株的吉蘭糖膠具有較低的凝膠強(qiáng)度，如表4所示。該結(jié)果與產(chǎn)生粘液形式的丟坦糖膠的ATCC53159突變體相比，具有改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)特征，如實(shí)施例11所述。認(rèn)為粘液形式的吉蘭糖膠可被伊樂(lè)藻菌產(chǎn)生的吉蘭糖膠裂解酶降解。因此，構(gòu)建了具有基因gelR缺失的菌株，其產(chǎn)生與降解多糖的蛋白質(zhì)如裂解酶具有同源22性的蛋白質(zhì)。在伊樂(lè)藻菌菌抹S60wtc和GBAD-l菌抹中構(gòu)建了gelR缺失(美國(guó)專利申請(qǐng)第20060003051號(hào)[11])。將PCR引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增基因gelR的上游DNA片段(502bp)和下游DNA片段(435bp)。所使用的PCR引物示于表3。表3.構(gòu)建gelR缺失的引物引物序列目的Sacl-GelR引物15'ACGAGCTC-AGATCAGCCGCAACCTCCT3'(SEQIDNO:21)擴(kuò)增gelR的上游486bpXbaI國(guó)GelR引物25'GCTCTAGA-CGCCGGCATGTTAATCACC3'(SEQIDNO:22)XbaI-GelR引物35'GCTCTAGA-GATGCGTTCCACGCCTGAC3'(SEQIDNO:23)擴(kuò)增gelR的下游419bpSphI-GelR引物45'ATGCATGC-CGATCGCGCTCATCAGGGT3'(SEQIDNO:24)引物Sacl-GelR引物1和XbaI-GelR引物2用于將gelR的498bp上游片段擴(kuò)增為Sacl-Xbal片段(共502bp)。引物XbaI-GelR引物3和SphI-GelR引物4用于將gelR的419bp下游片段擴(kuò)增為Xbal-SphI片段(共435bp)。使用限制性酶消化PCR片段并將其順序地連接于質(zhì)粒載體pL02的多酶切點(diǎn)的接頭[4]，產(chǎn)生帶有g(shù)elR缺失的克隆pL02-gelRdeletn#4。通過(guò)使用提供轉(zhuǎn)移功能的輔助質(zhì)粒pRK2013,由大腸桿菌DH5a接合，將不能在鞘氨醇單胞菌中復(fù)制的質(zhì)粒pL02-gelRdeletn斜轉(zhuǎn)移至伊樂(lè)藻菌菌抹S60wtc和GBAD-1[2]。于含有卡那霉素和鏈霉素的YM培養(yǎng)基上通過(guò)卡那霉素抗性篩選染色體整合體(反向選擇大腸桿菌)。隨后在無(wú)抗生素的情況下培養(yǎng)鞘氨醇單胞菌整合體大約30代，使得去除質(zhì)粒。由于喪失編碼基因sacB的質(zhì)粒，通過(guò)蔗糖耐性篩選已喪失質(zhì)粒的重組子，篩選菌23落的卡那霉素敏感性。PCR用于檢測(cè)哪些分離抹保留了gdR缺失。然后將gelN缺失轉(zhuǎn)移至GBAD-1菌林的gelR缺失突變體，如上實(shí)施例3所述。質(zhì)粒pL02-gelNdeln#l用于通過(guò)接合和同源性重組將gelN缺失轉(zhuǎn)移至GBADgelR。通過(guò)于含有Km(20ug/ml)和Sm(25ug/ml)的YM瓊脂上篩選染色體整合體的卡那霉素抗性。隨后在無(wú)抗生素的情況下培養(yǎng)使得去除質(zhì)粒。由于喪失編碼基因sacB的質(zhì)粒，通過(guò)蔗糖耐性篩選已喪失質(zhì)粒的重組子，然后篩選這些菌落的卡那霉素^:感性。gelR缺失突變體較野生型菌株表現(xiàn)有不同的菌落形態(tài)。gelR缺失菌林與具有透明邊緣的S60wtc或GBAD-1的gelR+的較光滑的樹膠狀菌落相比具有較小的粗糙樹膠狀菌落。gelN-gelR缺失突變體具有與gelN粘液突變體相似的菌落形態(tài)。實(shí)施例6-gelN-gelR突變體的特征在20LApplikon發(fā)酵罐中使用含有有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮、鹽和玉米糖漿的培養(yǎng)基評(píng)價(jià)這些菌抹。使用異丙醇沉淀吉蘭糖膠多糖，干燥并稱重。通過(guò)實(shí)施例5中所述的方法測(cè)定凝膠強(qiáng)度。GBAD-lgelNgelR菌株產(chǎn)生的吉蘭糖膠的凝膠強(qiáng)度較gelN粘液突變體或野生型莢膜菌抹產(chǎn)生的吉蘭糖膠的凝膠強(qiáng)度高。表4.突變體的吉蘭糖膠的流變學(xué)性質(zhì)菌抹表型n=野生型的發(fā)酵液粘度的平均值平均凝膠強(qiáng)度平均TPM%cPS60wtc莢膜3-7292411GBAD1莢膜1914600629GelN突變體粘液7932900132GBADlgelRgelN粘液39650831447實(shí)施例7——gell突變體的構(gòu)建構(gòu)建了基因gell的插入突變。將PCR引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增基因gell的插入片段(見參考文獻(xiàn)3)。將擴(kuò)增的片段克隆至pL02質(zhì)粒載體并通過(guò)接合導(dǎo)入S60wtc,在YM-Sm(25ug/ml)—Km(7.5ug/ml)培養(yǎng)基上篩選。篩選那些轉(zhuǎn)接合子的卡那霉素抗性，所述轉(zhuǎn)接合子具有通過(guò)同源重組而插入基因gell從而使該基因失活的質(zhì)粒。gell突變體具有改變的菌落形態(tài)，與gelM-gelN和gelN缺失菌抹的菌落形態(tài)相似，即粘性但較軟的菌落。實(shí)施例8-gell突變體菌抹的特征在搖瓶發(fā)酵中評(píng)價(jià)gell突變體。所述突變體與野生型菌抹相比具有粘性較小的發(fā)酵液，且全部的可沉淀物質(zhì)的產(chǎn)量減少約20%。所產(chǎn)生的吉蘭糖膠具有正常的糖、甘油和乙?；〈M成(參考文獻(xiàn)3)。使用幾種技術(shù)評(píng)價(jià)gell突變體的粘液形成特征，包括上述的顯微鏡評(píng)價(jià)、細(xì)胞凝集、細(xì)胞沉淀形成以及熱沉降試驗(yàn)。gell插入突變體具有與gelM-gelN和gelN缺失突變體相似的特征。顯微鏡評(píng)價(jià)顯示細(xì)胞游離并且有動(dòng)力。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，gell突變體在懸浮液而非凝塊中生長(zhǎng)。通過(guò)離心，細(xì)胞容易從DM2培養(yǎng)基沉淀。在熱沉降試驗(yàn)中細(xì)胞也很好地沉降。因此，基因gell的突變也產(chǎn)生了粘液表型，如圖3所示。實(shí)施例9-l:坦糖膠粘液形成突變體的制備鞘氨醇單胞菌ATCC53159(S-657)產(chǎn)生具有與吉蘭糖膠相似的結(jié)構(gòu)的多糖(丟坦糖膠)(即其具有葡萄糖-葡萄糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖重復(fù)單位)，但具有附著于一個(gè)葡萄糖殘基的兩個(gè)鼠李糖殘基的側(cè)鏈。丟坦糖膠具有兩個(gè)乙?；〈⑷鄙俑视突鶊F(tuán)。丟坦糖膠可用作油田和水泥應(yīng)用中的增粘劑。鞘氨醇單胞菌菌株產(chǎn)生作為莢膜牢固附著于細(xì)胞表面的多糖。附著的確切機(jī)制尚屬未知。莢膜可通過(guò)破壞氧攝取而限制繁殖力。多糖的功能可通過(guò)其附著于細(xì)胞而非游離于溶液中而受阻礙。菌林構(gòu)建構(gòu)建了鞘氨醇單胞菌ATCC53159的相應(yīng)基因dpsM和dpsN的缺失，其產(chǎn)生丟坦糖膠(S-657)。獨(dú)立地使各基因缺失，并測(cè)定對(duì)莢膜至粘液的影響。簡(jiǎn)言之，PCR用于擴(kuò)增側(cè)鄰靶基因DNA的同源的兩個(gè)片段。將這些片段克隆至窄宿主范圍的質(zhì)粒pL02,所述質(zhì)粒pL02不能在鞘氨醇單胞菌中復(fù)制并含有兩個(gè)選擇性標(biāo)記kanR和sacB。對(duì)于其中質(zhì)粒已整合入染色體中的一個(gè)同源性區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行卡那霉素抗性篩選。然后在非選擇性條件下，培養(yǎng)卡那霉素抗性菌抹，使得通過(guò)二次重組喪失質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)蔗糖的耐性篩選質(zhì)粒的喪失。sacB基因編碼用于由蔗糖合成果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果聚糖對(duì)細(xì)胞具有毒性。喪失基因sacB的細(xì)胞可以在蔗糖的條件下生長(zhǎng)。耐受蔗糖的分離抹可為野生型或缺失。通過(guò)PCR確認(rèn)缺失的存在。檢測(cè)突變體的粘液或莢膜產(chǎn)生。在最終的菌林中無(wú)外源性DNA、質(zhì)?；蚩股乜剐曰颉psN和dpsM缺失菌株的詳細(xì)構(gòu)建使用與所述的伊樂(lè)藻菌缺失突變體相似的基因置換策略，在質(zhì)粒上構(gòu)建dpsM和dpsN的缺失并將其轉(zhuǎn)移至ATCC53159的基因組[3]。PCR用于擴(kuò)增側(cè)鄰把基因的DNA區(qū)域，然后將片段克隆至質(zhì)粒pL02中[4]，然后將其用于替換染色體中耙基因的缺失。用于PCR的引物示于表5。將用于克隆的限制性位點(diǎn)(以斜體字顯示)添加至引物的末端。表5.用于構(gòu)建缺失突變體的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>將缺失構(gòu)建體設(shè)計(jì)成保持剩余用于丟坦糖膠合成的基因完整無(wú)缺。對(duì)于dpsN缺失來(lái)說(shuō)，51物SacI-DpsN引物1和Xbal-DpsN引物2用于將dpsM基因的497bp片段擴(kuò)增為Sacl-Xbal片段(共513bp)。引物Xbal-DpsN引物3和SpM-DpsN引物4用于將基因atrD的396bp片段擴(kuò)增為Xbal-Sphl片段(共413bp)。由于基因dpsM的末端與基因dpsN的起始部重疊17bp,保留dpsM的終止密碼子和dpsN的起始密碼子，以及dpsN的天然終止密碼子。因此，該構(gòu)建體導(dǎo)致形成13個(gè)氨基酸的小肽，如圖2所示。將PCR片段順序地連接于質(zhì)粒載體pL02的多酶切點(diǎn)的接頭[4],產(chǎn)生帶有dpsN缺失的克隆pL02-dpsNdeln#3。通過(guò)使用提供轉(zhuǎn)移功能的輔助質(zhì)粒pRK2013,由大腸桿菌DH5a接合[2]，將不能在鞘氨醇單胞菌中復(fù)制的這種質(zhì)粒pL02-dpsNdeln弁3轉(zhuǎn)移至鞘氨醇單胞菌菌抹ATCC53159。于含有7.5ug/ml卡那霉素和25ug/ml鏈霉素的YM培養(yǎng)基上篩選染色體整合體的卡那霉素抗性(反向篩選大腸桿菌)。隨后在無(wú)抗生素的情況下培養(yǎng)鞘氨醇單胞菌大約30代，使得去除質(zhì)粒。然后，由于編碼基因sacB的質(zhì)粒喪失，通過(guò)蔗糖(8%)耐性篩選已喪失質(zhì)粒的重組子，然后篩選菌落的卡那霉素敏感性。由幾個(gè)分離株制備基因組DNA,以鑒定較野生型基因而保留dpsN缺失的那些分離抹，如PCR所測(cè)定。相似地，構(gòu)建dpsM的缺失。引物SacI-DpsM引物1和XbaI-DpsM引物2用于將基因dpsE的474bp片段擴(kuò)增為Sacl-Xbal片段(共490bp)。引物Xbai-DpsM引物3和SphI隱DpsM引物4用于將基因dpsN的509bp片段擴(kuò)增為Xbal-Sphl片段(共525bp)。由于基因dpsM的末端與dpsN基因的起始部重疊了17bp，保留了dpsM的終止密碼子和dpsN的起始密碼子。將終止密碼子并入Xbal克隆位點(diǎn)。7氨基酸肽可由dpsM起始位點(diǎn)形成。將PCR片段順序地連接于質(zhì)粒載體pL02[4]的多酶切點(diǎn)的接頭，產(chǎn)生帶有dpsM缺失的克隆pL02-dpsMdeln糾。將該質(zhì)粒4妄合至ATCC53159,篩選卡那霉素抗性整合體，隨后在無(wú)抗生素情況下培養(yǎng)，并;f企測(cè)蔗糖耐受性，篩選卡那霉素敏感性重組子。從所篩選的重組子分離基因組DNA,并通過(guò)PCR篩選缺失的存在。實(shí)施例10-^坦糖膠粘液形成突變體的特征幾個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果顯示dpsM和dpsN缺失均導(dǎo)致莢膜形成菌至粘液形成菌的轉(zhuǎn)變，如圖3和4所示。1.在高碳發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)約16小時(shí)的兩種缺失突變體(#3和#5)和兩種dpsM缺失突變體(#1and#5)的顯微鏡評(píng)價(jià)表明來(lái)自這些突變體的細(xì)月包沒有形成鞘氨醇單胞菌莢膜菌林S-657特有的大的細(xì)胞凝集物(圖3A和圖4A)。2.野生型ATCC5359細(xì)胞在含有1%葡萄糖的已知成份培養(yǎng)基(DM2)中生長(zhǎng)24小時(shí)，并稀釋10倍，形成可見的凝塊，而dpsM和dpsN粘液突變體形成與非粘液樣菌抹DPSI(圖3C，dpsN)相似的均勻懸浮液。3.在含有r/。葡萄糖的DM2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)物的離心顯示，dpsM和dpsN粘液突變體的細(xì)胞可纟皮沉淀，而野生型ATCC5315928(S-657)的那些細(xì)胞仍附著多糖并因此沒有沉淀(圖3B和圖4B)。在搖瓶發(fā)酵中，與野生型對(duì)照相比，dpsN缺失突變體的六種獨(dú)立分離抹顯示全部可沉淀物質(zhì)平均增加5.4%。在20LApplikon發(fā)酵罐中4吏用含有有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮、鹽和不同碳濃度(3-5%)的培養(yǎng)基評(píng)價(jià)所選擇的dpsN和dpsM突變體分離株。使用異丙醇沉淀多糖，并干燥和稱重。dpsN突變體始終表現(xiàn)較野生型莢膜對(duì)照菌抹全部可沉淀物質(zhì)輕度增加。dpsM突變體提供了更為變異的和大體較低的繁殖力，如表6所示。表6.dps突變體多糖產(chǎn)量的增加5%碳源n=35.9%n=23.9%咖M弁1n=l-30.2%ii=49.3%3%碳源傘扁34.2%-10.1%咖M弁5-2.7%實(shí)施例11-l:坦糖膠粘液形成多糖的特征測(cè)定了通過(guò)使用異丙醇沉淀來(lái)從這些發(fā)酵物中回收的丟坦糖膠的流變學(xué)性質(zhì)，如表7所示。dpsM和dpsN粘液突變導(dǎo)致丟坦糖膠的粘度改進(jìn)。表7.粘液突變體的丟坦糖膠的流變學(xué)性質(zhì)%0*06s-l%%菌棘'SWV3增加粘皮增加LSRV增加w脅typen=526.727,7602010薩535.332%37,鄉(xiāng)37%387393%n-237.3德41，柳49%4075103%咖Af#1n=3樣552%37,73336%390594%iw然39.146%3944042%372085%平均42%平均41%平均94%29還觀察到粘液突變體的纖維質(zhì)量(如長(zhǎng)度)得到改進(jìn)。由于多糖分子在溶液中游離，而非附著于細(xì)胞表面，促進(jìn)了這些分子的沉淀。低切變率粘度測(cè)量低切變率粘度是在3rpm下0.25%丟坦#唐膠溶液的粘度。通過(guò)在10升去離子水中溶解0gNaCl和1.47gCaCl2-2H20制備標(biāo)準(zhǔn)或合成的自來(lái)水。直接于400ml高型燒杯中稱量4.5g聚乙二醇(PEG)200。稱量0.75g等份的丟坦糖膠產(chǎn)物，并在PEG200中分散，形成均勻的液漿。將299ml合成的自來(lái)水添加至燒杯中，并在800±20rpm下攪拌混合物約4小時(shí)。從攪拌臺(tái)去除燒杯，并放置于25匸水浴中，使得放置30分鐘。使用BrookfieldLVViscometer使用2號(hào)轉(zhuǎn)子在3rpm下測(cè)量粘度。海水粘度測(cè)量使用下述步驟測(cè)量海水粘度。通過(guò)每980g去離子水溶解41.95g海鹽(ASTMD-l141-52,來(lái)自LakeProductsCo.,Inc.MarylandHeights,Missouri)制備海水溶液，根據(jù)需要使用HC1或NaOH調(diào)整pH至8.2。將307g海水溶液轉(zhuǎn)移至混合杯中，將0.86g丟坦糖膠產(chǎn)物經(jīng)15-30秒緩慢添加至混合杯中，并使得在9B5型FannMulti-Mixer(FannInstruments,Inc,HoustonTX)中于1,500rpm下混合45分鐘。添加3滴BaraDefoam(NLBaroid/NLIndustries,Inc.,Houston,TX)并再繼續(xù)攪拌30秒。從混合器去除混合杯并將其浸于冷水中以降低液體的溫度，然后將其置于25。C恒溫水浴中。將溶液轉(zhuǎn)移至400ml高型燒杯。在低速(3rpm)下混合的同時(shí)，測(cè)量Fann粘度(Fann粘度計(jì)，35A型)。從刻度盤讀耳又切應(yīng)力值，并記錄為在3rpm下的SWV值。還在BrookfiddLVDV-II或DV-II粘度計(jì)上使用LV-2C轉(zhuǎn)子測(cè)量粘度。在0.3rpm下觀'J量0.06sec隱1讀數(shù)。實(shí)施例12——材津+和方法培養(yǎng)基。每升YM含有3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麥芽提取物，以及10g葡萄糖。每升DM2培養(yǎng)基含有2.68gK2HP04，1.31gKH2P04，2.0gNH4SO4,0.1gMgS04-7H20，15mgCaCl22H20,8.34mgFeS04.7H20，0.05mgMnCl2.4H20,0.03mgCoCl2'6H20,0.8mgCuS04.5H20，0.02mgNa2Mo04.2H20,l.OmgZnS04'7H20，0.2mgH3B03以及10g葡萄糖。每升吉蘭糖膠燒瓶發(fā)酵培養(yǎng)基含有0.23gNaCl,0.165gCaa2.2H20,2.8gK2HP04,1.2gKH2P04，1.9gNaN03，l.OgN畫Z-胺型EKC(SheffieldProducts),36.46gStar畫Dri玉米糖漿，2.5mgFeS04.7H20，24嗎CoCl2.6H20以及0.1gMgSO4'7H20。粘液的離心試驗(yàn)。在含有1%葡萄糖的DM2培養(yǎng)基中于30。C培養(yǎng)菌林約24小時(shí)，在350rpm下?lián)u動(dòng)，然后在Eppendorf離心機(jī)中以最大速度(10,000rpm)離心5分鐘。熱沉降試驗(yàn)。在吉蘭糖膠燒瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株。在高壓滅菌器中加熱發(fā)酵液10分鐘以液化吉蘭糖膠。然后將熱發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至大試管中并使得在95。C過(guò)夜沉降(以維持發(fā)酵液為液體)。對(duì)于莢膜菌抹，細(xì)胞附著多糖并保持懸浮。對(duì)于粘液形成菌，細(xì)胞未附著多糖并且在過(guò)夜培養(yǎng)過(guò)程中沉淀。PCR擴(kuò)增。使用了來(lái)自Stratagene(LaJolla,CA)的高保真度PCR酶"PfuUltra熱啟動(dòng)DNA聚合酶"。31參考文獻(xiàn)所引用的每一參考文獻(xiàn)的內(nèi)容明確地并入本文。1.CotemanRC.2001.Cloningandanalysisof融i，卿nassp.ATCC53159polysaccharidegeaes.SanDiegoStateUniversityMSthesis2..DirtaG,SStanfield,DCoAtaandDRHdinskL1980.BroadhostrangeDNAdoningsystemforGram-negativebacteria:constructionofagenebanJcofme/f/off.ProcNatlAcadSciUSA77:7347-7351.3.HardingNE,YNPatelandRJCoieman.2004.Organizationofgenesrequiredforgeil邸polysaccharidebiosynthesisinS盧wgo柳nayeforfe。ATCC31461.JIndMicrobiolBiotechnol31:70-82.4.Le叫O.,E,Sdwartz,J.Demedde，M.EitingerandB.FriedriclL1994.Th"fca,扭臘eu^ro/A縱肌6hoxXgeneparticipatesinbydrogenasereguiatioitJ.Bacteriol.176:4385-4393.5.MatthewsTD,2004,Idmtificationofgenesinvolvedinphenotypicphaseshiftingof分/w'，mowass/j.ATCC53159SanDiegoStateUuivershyMSthesis6.PollockTJandRWArmentrot.l卿.Planktonic/s然siledimorphismofpolysaccharide^encapsulatedSphingomonads.JIndMicrobiolBiotechnol23:436-441.7.Pollock,TJ,WATvanWoitaim,LThornyMMikokjczak,MYamazaki,JWKijneandRWArmentroiit.l艦.AssignmentofbiochemicalfimctionstoglycosyltransferasegeneswhictiareessentialforWosynthsisofex叩olysaccharidrainSpAi'ng柳oiasstrainS88andJW206/"附/eguffK'womn肌JBacteriol180:586-593.8.Sa-CorreiaI，AMFialho，PVideira,LMMweira^ARMarquesandHAftano.2002,Gellangumbiosynth從isin^A!'wgo挑onos1pw"a'mofo7feATCC31461:Genes，enzymesandexopolysaccharideproductionengineering,JladMicrobiolBiotedinol.29:170-176.9.Y咖azakiM，LThome,.MMikolajczakRWArm幼troutandTJPollock.1996,Linkageofgenesessentialforsynthesisofapolysaccharidecapsulein^&gwomsstrainS88.JBacteriol178:2676>2,>10.Y咖azaldM,MMitolajczak^TJPollockandRWA鵬ntrout.2003.Productionofexopolysacctoaridesunattachedtothesurfeoeofbacterialcells.U.S.PatentNo.6,605,461.:11.Cleary,Joseph.M.,e/.。/Geneticallypurifiedgellan.gum.U.S.PatentApplicationNo.20060003051.權(quán)利要求1.一種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和N基因的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和/或N基因的全部或部分；誘導(dǎo)所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N；分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述突變的片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。2.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和N基因的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA的兩個(gè)非連續(xù)片段，其中所述片段側(cè)鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和/或N基因；將所述兩個(gè)非連續(xù)片段連接在一起；將所述連接的非連續(xù)片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述連接片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。3.權(quán)利要求l所述的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。5.權(quán)利要求l所述的方法，其中通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。6.權(quán)利要求2所述的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。7.權(quán)利要求2所述的方法，其中通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。8.權(quán)利要求2所述的方法，其中通過(guò)由所述基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。9.一種組合物，其含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予流體對(duì)于由菌抹ATCC53159產(chǎn)生的等量丟坦糖膠增加的粘度。10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌林ATCC53159至少30%。11.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌林ATCC53159至少40%。12.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少50%。13.權(quán)利要求9所迷的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少60%。14.權(quán)利要求9所迷的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少70%。15.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少80%。16.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌抹ATCC53159至少90%。17.—種分離和純化的鞘氨醇菌屬細(xì)菌，其含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M和N基因的一種基因或兩種基因的缺失。18.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其是伊樂(lè)藻菌種。19.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其不是伊樂(lè)藻菌種。20.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其是與作為ATCC53159存放的細(xì)菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。21.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是丟坦糖膠。22.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是吉蘭糖膠。23.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述鞘氨醇膠多糖不是吉蘭糖膠。24.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是韋蘭糖膠。25.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述鞘氨醇膠多糖是鼠李糖膠。26.權(quán)利要求7所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌不含有外源性DNA。27.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有一些或全部gdM缺失。28.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有一些或全部gelN缺失。29.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有一些或全部dpsM缺失。30.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有一些或全部dpsN缺失。31.權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有一些或全部gelM和gelN缺失。32.4又利要求17所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。33.—種制備鞘氨醇膠多糖的方法，其包括在適于制備鞘氨醇膠多糖的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的細(xì)菌，由此在所述培養(yǎng)基中制備鞘氨醇膠多糖。34.權(quán)利要求33所述的方法，其還包括下述步驟從所述培養(yǎng)基中的細(xì)菌分離鞘氨醇膠多糖。35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離步驟通過(guò)離心進(jìn)行。36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離步驟通過(guò)沉降進(jìn)行。37.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離步驟包括使用堿處理培養(yǎng)基。38.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述物理分離步驟包括使用酶處理培養(yǎng)基。39.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是丟坦糖膠40.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是吉蘭糖膠。41.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖不是吉蘭糖膠。42.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌是伊樂(lè)藻菌種。43.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌不是伊樂(lè)藻菌種。44.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌是與作為ATCC53159存放的細(xì)菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。45.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是韋蘭糖膠。46.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述鞘氨醇膠多糖是鼠李糖膠。47.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌含有一些或全部gelM缺失。48.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌含有一些或全部gelN錄:失。49.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌含有一些或全部dpsM缺失。50.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌含有一些或全部dpsN缺失。51.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌含有一些或全部gdM和gelN缺失。52.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。53.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求17所述的細(xì)菌。54.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求18所述的細(xì)菌。55.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求19所述的細(xì)菌。56.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求20所述的細(xì)菌。57.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求21所述的細(xì)菌。58.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求22所述的細(xì)菌。59.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求23所述的細(xì)菌。60.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求24所述的細(xì)菌。61.—種培養(yǎng)物發(fā)酵液，其含有權(quán)利要求25所述的細(xì)菌。62.—種權(quán)利要求53所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。63.—種權(quán)利要求54所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。64—種權(quán)利要求55所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。65.—種權(quán)利要求56所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。66.—種權(quán)利要求57所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。67.—種權(quán)利要求58所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。68.—種權(quán)利要求59所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。69.—種權(quán)利要求60所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。70.—種權(quán)利要求61所述的培養(yǎng)物發(fā)酵液，其中所述培養(yǎng)物發(fā)酵液已經(jīng)進(jìn)行從培養(yǎng)物發(fā)酵液中除去細(xì)菌的步驟。71.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的I基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的I基因的全部或部分；誘導(dǎo)所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述突變的片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。72.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I中的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段側(cè)鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I;將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述片段已經(jīng)整合入基因組并置換所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。73.權(quán)利要求71所述的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。74.權(quán)利要求71所述的方法，其中通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。75.權(quán)利要求71所述的方法，其中通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。76.權(quán)利要求72所述的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。77.權(quán)利要求72所述的方法，其中通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。78.權(quán)利要求72所述的方法，其中通過(guò)由基因組DNA純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。79.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的全部或部分；誘導(dǎo)所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述突變的片段已經(jīng)整合入基因組并取代所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。80.—種制備鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細(xì)菌的基因組DNA片段，其中所述片段側(cè)鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R;將所述片段導(dǎo)入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細(xì)菌，其中所述第二種細(xì)菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R;分離所述第二種細(xì)菌的子代，其中所述片段已經(jīng)整合入基因組并取代所述第二種細(xì)菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。81.權(quán)利要求79所述的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。82.權(quán)利要求79所述的方法，其中通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。83.權(quán)利要求79所述的方法，其中通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。84.權(quán)利要求80所述的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)分離所述基因組DNA的片段。85.權(quán)利要求80所述的方法，其中通過(guò)合成來(lái)分離所述基因組DNA的片段。86.權(quán)利要求80所述的方法，其中通過(guò)由基因組DNA的純化來(lái)分離所述基因組DNA的片段。全文摘要鞘氨醇單胞菌菌株具有牢固附著于細(xì)胞表面的細(xì)胞外多糖(即吉蘭糖膠、丟坦糖膠)。所述附著可通過(guò)破壞營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入細(xì)胞或由于細(xì)胞表面多糖生物合成的限制位點(diǎn)而限制多糖產(chǎn)生。多糖生物合成的兩種基因——產(chǎn)生吉蘭糖膠的菌株中的gelM和gelN以及產(chǎn)生丟坦糖膠的菌株中的dpsM和dpsN，已經(jīng)通過(guò)缺失突變而被滅活，并顯示產(chǎn)生非牢固附著于細(xì)胞表面的多糖，即粘液形式。多糖生物合成的另一種基因——產(chǎn)生吉蘭糖膠的菌株中的gelI，通過(guò)插入突變而被滅活，并也顯示產(chǎn)生粘液表型。產(chǎn)生丟坦糖膠的菌株中的同源性基因dpsI也與多糖至細(xì)胞表面的附著有關(guān)。粘液特征通過(guò)細(xì)胞被離心的能力和在顯微鏡下或在稀釋的懸浮液中沒有可見的細(xì)胞凝集而證明。丟坦糖膠粘液突變體的繁殖力稍增加，且回收的丟坦糖膠產(chǎn)物具有顯著改進(jìn)的流變學(xué)性質(zhì)。吉蘭糖膠粘液突變體的發(fā)酵液粘度較低，這便于在發(fā)酵過(guò)程中混合，然而，回收的吉蘭糖膠產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度較由莢膜菌株產(chǎn)生的吉蘭糖膠的凝膠強(qiáng)度低。gelR基因的缺失，所述gelR基因編碼與表面蛋白和外膜蛋白具有同源性以及與帶有多糖的蛋白質(zhì)具有弱同源性的蛋白質(zhì)。文檔編號(hào)C07G99/00GK101501213SQ200680009973公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2006年2月3日優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日發(fā)明者南茜·E·哈丁,帕特洛·雅美尼,拉塞爾·J·科爾曼申請(qǐng)人:Cp凱爾科美國(guó)公司