專利名稱：抑制血小板聚集的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單-和二核苷多磷酸化合物和使用這些化合物預(yù)防或治療與血小板聚集有關(guān)的疾病或病況，包括人和其它哺乳動(dòng)物的血栓生成的方法。
背景技術(shù)：
止血是受損血管停止出血的自發(fā)過(guò)程。當(dāng)切開時(shí)前毛細(xì)血管立即收縮；在幾秒鐘內(nèi)，凝血細(xì)胞或血小板通過(guò)稱為血小板粘附的過(guò)程向受損血管暴露的基質(zhì)集中。在稱為血小板聚集的現(xiàn)象中，血小板還彼此粘合形成血小板栓，以迅速停止出血。
血管內(nèi)血栓導(dǎo)致止血的病理性紊亂。血小板粘附和聚集是血管內(nèi)血栓形成的關(guān)鍵事件。在患病血管中的湍流血流條件下，或由于其它循環(huán)細(xì)胞和血管中排列的受損內(nèi)皮細(xì)胞釋放介導(dǎo)物，血小板被活化，在血管損傷位點(diǎn)聚集，并引來(lái)更多血小板開始形成血栓。血栓可長(zhǎng)到足夠大，以封閉動(dòng)脈血管。血栓還可以在靜脈內(nèi)的靜止區(qū)域或緩慢血流中形成。靜脈血栓可以容易地部分分離，稱為栓塞，它通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)，可導(dǎo)致其它血管，例如肺動(dòng)脈堵塞。因此，動(dòng)脈血栓通過(guò)局部堵塞可引起嚴(yán)重的疾病，而靜脈血栓主要是通過(guò)遠(yuǎn)端堵塞，或形成栓塞起作用。這些病況包括靜脈血栓形成、血栓性靜脈炎、動(dòng)脈栓塞、冠狀和大腦動(dòng)脈血栓生成、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗塞、中風(fēng)、腦栓塞、腎栓塞和肺栓塞。
許多聚集途徑導(dǎo)致血小板聚集。不論最初的刺激是什么，最終的共同事件是通過(guò)纖維蛋白原與膜結(jié)合位點(diǎn)，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)結(jié)合來(lái)交聯(lián)血小板。作為GPIIb/IIIa受體絡(luò)合物拮抗劑的化合物已顯示抑制血小板聚集(美國(guó)專利號(hào)6,037,343和6,040,317)。針對(duì)GPIIb/IIIa的抗體也顯示具有高抗血小板效力(EPIC調(diào)查員，New Engl.J.Med.(1994)330956-961)。然而，該類抗血小板劑有時(shí)導(dǎo)致出血問(wèn)題。
凝血酶可幾乎不依賴于其它途徑，產(chǎn)生血小板聚集，但在其它機(jī)制首先活化血小板前，不太可能存在足夠數(shù)量的凝血酶。凝血酶抑制劑，例如水蛭素是非常有效的抗血栓藥。然而，由于起著抗血小板和抗凝血藥物的功能，凝血酶抑制劑也能產(chǎn)生過(guò)量出血。(TIMI 9a調(diào)查員，GUSTO Iia調(diào)查員，Circulation，901624-1630(1994)；Circulation，901631-1637(1994)；Neuhaus K.L.等，Circulation，901638-1642(1994))。
對(duì)各種抗血小板藥物作為抑制血栓形成的可能目標(biāo)進(jìn)行了多年的研究，。些藥物，例如阿司匹林和雙嘧達(dá)莫已被用作預(yù)防性抗血栓藥，其它也是臨床研究的目標(biāo)。迄今，顯示強(qiáng)有效的藥物，例如解離素和噻吩并吡啶噻氯匹定和氯吡格雷已顯示出很強(qiáng)的副作用，而阿司匹林等藥物是有用的但是效力有限(Hass等，N.Engl.J.Med.，321501-507(1989)；Weber等，Am.J.Cardiol.661461-1468(1990)；Lekstrom和Bell，Medicine 70161-177(1991))。特別是，噻吩并吡啶在抗血小板治療中的使用已顯示提高了可能的有生命危險(xiǎn)的血栓性血小板減少性紫癜的發(fā)病率(Benett，C.L等，N.Engl.J.Med(2000)3421771-1777)。阿司匹林對(duì)血小板聚集有有益效果(Br.Med.J.(1994)30881-106；159-168)是通過(guò)誘導(dǎo)前列腺素合成的阻礙起作用的。阿司匹林對(duì)于ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集沒(méi)有作用，因此對(duì)血小板聚集作用有限。另外，在文獻(xiàn)中充分記載了它對(duì)于腸胃副作用的高發(fā)生率，限制了其在很多病人中的使用。一些較新的藥物，例如ReoPro(7E3)的臨床效力是令人印象深刻的，但是近來(lái)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些方法與大出血風(fēng)險(xiǎn)增加有聯(lián)系，有時(shí)需要輸血(New.Engl.J.Med.(1994)330956-961)。因此似乎理想的“益處/風(fēng)險(xiǎn)”比還未達(dá)到。
近來(lái)的研究提示，5’-二磷酸腺苷(ADP)，一種常規(guī)激動(dòng)劑，在激發(fā)和進(jìn)行動(dòng)脈血栓形成中起到了關(guān)鍵作用(Bernat等，Thromb.Haemostas(1993)70812-826；Maffrand等，Thromb.Haemostas.(1988)59225-230；Herbert等，Arterioscl.Thromb.(1993)131171-1179)。ADP誘導(dǎo)血小板聚集，形狀改變，分泌，Ca2+的注入和胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，以及腺苷酸環(huán)化酶的抑制。ADP與血小板受體的結(jié)合是引起ADP-誘導(dǎo)的血小板應(yīng)答所必需的。在人血小板中至少表達(dá)三種P2受體陽(yáng)離子通道受體P2X1，一種G蛋白偶聯(lián)受體P2Y1，和一種G蛋白偶聯(lián)受體P2Y12(也稱為P2Yac和P2T)。P2X1受體負(fù)責(zé)迅速鈣流入，由ATP激活。尚未完全了解P2X1受體在血小板聚集中的作用。然而，已經(jīng)提出P2X1受體參與血小板形狀的變化(Rolf等，ThrombHaemost，85303-308，2001)，并在高剪切力下參與血小板thombi的形成。(Hechler等，J Exp Med.198661-667，2003)P2Y1受體負(fù)責(zé)鈣遷移，形狀改變和聚集的引發(fā)。P2Y12受體負(fù)責(zé)腺苷酸環(huán)化酶的抑制，是完全聚集所必需的(Hourani等，ThePlatelet ADP Receptors Meeting，La Thuile，Italy，三月29-31日，2000)。
Ingall等(J.Med.Chem.42213-220(1999))描述了三磷酸腺苷(ATP)的類似物對(duì)ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集的劑量相關(guān)抑制，該類似物是一種弱的非選擇性但是競(jìng)爭(zhēng)性的P2Y12受體拮抗劑。Zamencnik(USPN5,049,550)公開了一種抑制哺乳動(dòng)物中血小板聚集的方法，通過(guò)對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用App(CH2)ppA或其類似物的四磷酸二腺苷化合物。Kim等(USPN5,681,823)公開了P1，P4-二硫代-P2，P3-一氯亞甲基5’，5二腺苷P1，P4四磷酸作為抗血栓生成藥物。噻吩并吡啶噻氯匹定和氯吡格雷被代謝為血小板P2Y12受體的拮抗劑，顯示了在體內(nèi)抑制血小板的功能(Quinn和Fitzgerald，Circulation 1001667-1672(1999)；Geiger等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.192007-2011(1999))。然而，這些噻吩并吡啶有許多治療上的缺點(diǎn)●起效慢(Gurbel等，Am J.Cardiol.90312-315，2002)●由于這些抑制劑對(duì)P2Y12受體的不可逆性質(zhì)，如果必須進(jìn)行外科手術(shù)的話，用噻吩并吡啶治療的對(duì)象具有很高的出血風(fēng)險(xiǎn)。由于需要產(chǎn)生新的血小板以恢復(fù)止血作用，對(duì)于選擇性外科手術(shù)，必須停止使用該藥物至少5-10天，從而使對(duì)象在此期間處于血栓形成事件的高風(fēng)險(xiǎn)中(Kapetanakis等，Eur Heart J.26576-583，2005)。
●以這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)給藥方案治療的對(duì)象在藥物的藥效上顯現(xiàn)出很大的個(gè)體差異性，且很高比例的患者對(duì)局部缺血事件發(fā)生的保護(hù)低下(Gurbel等，Circulation 1072908-2913，2003；Aleil等，J Thromb Haemost.385-92，2005).
在心血管和腦血管治療領(lǐng)域中，需要一種無(wú)需代謝、可快速起效并快速解除反應(yīng)的直接、可逆的P2Y12受體抑制劑，可將其用于預(yù)防和治療血栓形成，且其副作用(例如過(guò)度不良的出血延長(zhǎng))小，同時(shí)預(yù)防或治療靶標(biāo)血栓。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明針對(duì)一種治療或預(yù)防與血小板聚集和/或血小板活化有關(guān)的疾病或病況的方法，這些疾病包括靜脈血栓形成、血栓性靜脈炎、動(dòng)脈栓塞、冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血檢形成、不穩(wěn)定心絞痛、心肌梗塞、中風(fēng)、腦動(dòng)脈栓塞、腎動(dòng)脈栓塞和肺動(dòng)脈栓塞。該方法還針對(duì)一種預(yù)防、治療或減輕血栓形成、血栓性事件、栓子事件，或與手術(shù)中或手術(shù)后與血栓形成、血栓性事件、栓子事件相關(guān)的病理狀況發(fā)病率的方法。
該方法包括對(duì)個(gè)體施用一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的P2Y12受體拮抗劑化合物，其中所述量有效結(jié)合血小板上的P2Y12受體，并抑制ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集。
本發(fā)明有用的P2Y12受體拮抗劑化合物包括通式I的化合物或其鹽 其中X1、X2和X3分別是氧、亞甲基、一氯亞甲基、二氯亞甲基、一氟亞甲基、二氟亞甲基或亞氨基(imido)；T1、T2、W和V分別是氧或硫m＝0，1或2；n＝0或1；p＝0，1，或2；其中m+n+p之和是0-5；(單磷酸-六磷酸)M＝H或藥物學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；D1＝O或CH2；B′是通式IV和V的嘌呤或嘧啶殘基，它分別通過(guò)堿基的9-或1-位與呋喃糖或碳環(huán)的1′位連接；Y′＝H、OH或OR1；Z′＝H、OH或OR2；條件是當(dāng)A＝M時(shí)，Y′和Z′中的至少一個(gè)分別等于OR1或OR2；A＝M或A是核苷殘基，定義為 其通過(guò)呋喃糖或碳環(huán)的5′位與磷酸鏈連接，其中D2＝O或CH2；Z＝H、OH或OR3；Y＝H、OH或OR4；條件是Y′、Z′、Y和Z中的至少一個(gè)分別等于OR1、OR2、OR3或OR4；B是通式IV和V的嘧啶殘基，它分別通過(guò)堿基的9-或1-位與呋喃糖或碳環(huán)的1′-位連接；R1、R2、R3和/或R4是如通式II的通過(guò)碳原子直接與呋喃糖或碳環(huán)各自的2′-和/或3′-羥基連接的殘基，或如通式III的通過(guò)所述的共用碳原子與呋喃糖或碳環(huán)各自的兩個(gè)(2′-和3′-)羥基直接連接的殘基，即存在符合式II定義的R1、R2、R3和R4的一個(gè)至四個(gè)獨(dú)立殘基，或存在由R1+R2和/或R3+R4構(gòu)成的1-2個(gè)獨(dú)立殘基。
本發(fā)明還提供了新穎的單核苷5′-單磷酸和二核苷5′-二磷酸化合物。本發(fā)明還提供了一種包含通式I的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了通過(guò)不同化合物抑制ADP誘導(dǎo)的聚集的效果。
圖2顯示了將INS50589靜脈注射入小鼠后，抑制ADP誘導(dǎo)的聚集作用的動(dòng)力學(xué)。
圖3顯示了INS50589治療在小鼠中對(duì)由血栓栓塞引發(fā)的死亡率的保護(hù)作用。
圖4顯示了通過(guò)對(duì)狗進(jìn)行INS50589連續(xù)靜脈輸液而產(chǎn)生的對(duì)血小板聚集的劑量依賴性抑制。
圖5A顯示了以0.3mg/kg/小時(shí)的劑量給予狗INS50589的過(guò)程中預(yù)設(shè)時(shí)間和給藥之后的血小板聚集。圖5B顯示了輸液給藥INS50589過(guò)程中預(yù)設(shè)時(shí)間和給藥之后的INS50589血漿水平。
發(fā)明詳述定義除非另有說(shuō)明，以下術(shù)語(yǔ)如果存在的話通常如下所定義，包括但不限于烷基包含直鏈或直鏈、不飽和或飽和、含有或不含雜原子的1-12個(gè)碳原子，更優(yōu)選包含2-8個(gè)碳，最優(yōu)選包含2-6個(gè)碳。
環(huán)烷基包含3-12個(gè)碳，更優(yōu)選包含3-10個(gè)碳，最優(yōu)選包含3-6個(gè)碳，其可為不飽和或飽和、含有或不含雜原子。
芳烷基在其烷基部分包含1-8個(gè)碳原子，更優(yōu)選在其烷基部分包含1-6個(gè)碳，最優(yōu)選在其烷基部分包含1-4個(gè)碳；如上文對(duì)烷基的定義所述，芳烷基的烷基部分可包含一個(gè)或多個(gè)不飽和位點(diǎn)，例如當(dāng)鏈中包含兩個(gè)或兩個(gè)以上碳原子時(shí)，該鏈中可具有雙鍵或三鍵；芳烷基的烷基部分還可包含一個(gè)或多個(gè)雜原子和/或取代基；芳烷基的芳基部分可為在芳基部分的每個(gè)環(huán)中包含3-8個(gè)碳的單環(huán)或多環(huán)部分，更優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含4-6個(gè)碳，最優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含5-6個(gè)碳；芳烷基的芳基部分還可帶有一個(gè)或多個(gè)取代基和/或雜原子。
芳基為單環(huán)或多環(huán)，在每個(gè)環(huán)中包含3-8個(gè)碳，更優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含4-6個(gè)碳，最優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含5-6個(gè)碳；芳基還可帶有一個(gè)或多個(gè)取代基和/或雜原子。
雜芳烷基在其烷基部分包含1-8個(gè)碳原子，更優(yōu)選在其烷基部分包含1-6個(gè)碳，最優(yōu)選在其烷基部分包含1-4個(gè)碳；如上文對(duì)烷基的定義所述，雜芳烷基的烷基部分可包含一個(gè)或多個(gè)不飽和位點(diǎn)，例如當(dāng)鏈中包含兩個(gè)或兩個(gè)以上碳原子時(shí)，該鏈中可具有雙鍵或三鍵；雜芳烷基的烷基部分還可包含一個(gè)或多個(gè)雜原子和/或取代基；雜芳烷基的雜芳基部分可為在雜芳基部分的每個(gè)環(huán)中包含3-8個(gè)碳的單環(huán)或多環(huán)部分，每個(gè)環(huán)中含有1-4個(gè)雜原子，更優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含4-6個(gè)碳，最優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含5-6個(gè)碳；雜芳烷基的雜芳基部分還可帶有一個(gè)或多個(gè)取代基和/或雜原子。
雜芳基為單環(huán)或多環(huán)，在每個(gè)環(huán)中包含1-4個(gè)雜原子，且每個(gè)環(huán)中包含3-8個(gè)原子，更優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含4-6個(gè)原子，最優(yōu)選在每個(gè)環(huán)中包含5-6個(gè)原子；雜芳基還可帶有取代基和/或雜原子。
前述基團(tuán)中的取代基可為(但不限于)羥基、硝基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、丙基、丁基、硫代烷基(thioalkyl)、烷氧基、羧基、酰胺基、烷基磺酰基、烷基磺?；被?、磺酰氨基、氰基、氨基、取代的氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、苯基、吡啶基、咪唑基、環(huán)丙基、環(huán)戊基和環(huán)己基；優(yōu)選的雜原子為氧、氮和硫。
非對(duì)映體為立體異構(gòu)體(具有相同構(gòu)成但在三維結(jié)構(gòu)上有所不同的異構(gòu)體)，它們彼此不為鏡像關(guān)系。
藥學(xué)上可接受的鹽是指保留了母體化合物所希望的生物活性且不具有不希望的毒理作用的鹽類。藥學(xué)上可接受的鹽的形式包括衍生自酸或堿加成反應(yīng)的不同鹽的無(wú)定形形式和各種多晶型物?？捎脽o(wú)機(jī)或有機(jī)酸形成酸加成鹽。此類酸的示例包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、醋酸、丙酸、苯甲酸、napthoic、草酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、己二酸、乳酸、酒石酸、水楊酸、甲磺酸、2-羥基乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、樟腦磺酸和乙磺酸。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽可由金屬或有機(jī)抗衡離子形成，包括但不限于堿金屬鹽，例如鈉鹽或鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鎂鹽或鈣鹽；以及銨鹽或四烷基銨鹽，即，NX4+(其中X為C1-4)。在本發(fā)明的核苷單-或二-磷酸的情況下，所述鹽的形式通常為堿-堿土金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽)或堿性鹽(例如銨鹽)。
溶劑化物是加成的復(fù)合物，在溶劑化物中化合物與藥學(xué)上可接受的共溶劑以一定的混合比結(jié)合。共溶劑包括但不限于水、甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇、1-丁醇、異丁醇、叔丁醇、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、乙酸乙酯、苯、甲苯、二甲苯、乙二醇、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N-甲基甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基乙酰胺、吡啶、二氧六環(huán)和二乙醚。水合物是其中的共溶劑為水的溶劑化物。應(yīng)理解的是本發(fā)明化合物的定義中包含了占任何比例的所有可能的水合物和溶劑化物，這些水合物和溶劑化物具有穩(wěn)定的活性。
P2Y12受體拮抗劑化合物可用于預(yù)防或治療與血小板聚集和/或血小板活化有關(guān)的疾病或病況的P2Y12受體拮抗劑化合物包括通式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物 其中X1、X2和X3分別是氧、亞甲基、一氯亞甲基、二氯亞甲基、一氟亞甲基、二氟亞甲基或亞氨基；T1、T2、W和V分別是氧或硫m＝0，1或2；n＝0或1；p＝0，1，或2；其中m+n+p之和是0-5(從單磷酸到六磷酸)；M＝H或藥物學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；D1＝O或CH2；B′是通式IV和V的嘌呤或嘧啶殘基，它分別通過(guò)堿基的9-或1-位與呋喃糖或碳環(huán)的1′位連接；Y′＝H、OH或OR1；Z′＝H、OH或OR2；條件是當(dāng)A＝M時(shí)，Y′和Z′至少一個(gè)是OR1或OR2；A＝M，或A為如下式所定義的核苷殘基
其通過(guò)呋喃糖或碳環(huán)的5′位與磷酸鏈連接；其中D2＝O或CH2；Z＝H、OH或OR3；Y＝H、OH或OR4；條件是Y′、Z′、Y和Z中至少一個(gè)分別等于OR1、OR2、OR4或OR3；根據(jù)通式IV和V，B是分別通過(guò)堿基的9-或1-位與呋喃糖或碳環(huán)的1′位連接的嘌呤或嘧啶殘基；R1、R2、R3和/或R4是如式II的通過(guò)碳原子分別與呋喃糖或碳環(huán)的2′-和/或3′-羥基直接連接的殘基，或如式III的通過(guò)的共用碳原子分別與呋喃糖或碳環(huán)的兩個(gè)(2′-和3′-)羥基直接連接，從而R1、R2、R3和/或R4中存在符合通式II定義的1-4個(gè)獨(dú)立殘基，或存在由R1+R2和/或R3+R4組成的1-2個(gè)獨(dú)立殘基， 其中O是各呋喃糖或碳環(huán)相應(yīng)的2′-和/或3′-氧；C是碳原子；R5、R6和R7是H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，這樣式II定義的基團(tuán)是醚；或R5和R6是H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，R7是烷氧基、環(huán)烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基或取代的芳氧基，這樣式II定義的基團(tuán)是非環(huán)狀縮醛或縮酮；或R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，R7是烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，這樣式II定義的基團(tuán)是酯或硫代酸酯(thioester)；或R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，R7是氨基或一或二取代的氨基，其中取代基是烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，這樣式II的基團(tuán)是氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯；或R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，R7是烷氧基、環(huán)烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基或取代的芳氧基，這樣式II的基團(tuán)是碳酸酯或硫代碳酸酯；或R7不存在，R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，呋喃糖或碳環(huán)各自的2′-和3′-氧直接與C鍵合，形成環(huán)狀碳酸酯或硫代碳酸酯； 其中所述O原子是呋喃糖或碳環(huán)的2′-和3′-氧，呋喃糖或碳環(huán)的2′-和3′-氧與共用碳原子(C)連接，形成環(huán)狀縮醛、環(huán)狀縮酮或環(huán)狀原酸酯；對(duì)于環(huán)狀縮醛和環(huán)狀縮酮，R8和R9分別是氫、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基、取代的芳基，或能合起來(lái)形成由3-8個(gè)原子，優(yōu)選3-6個(gè)原子組成的碳環(huán)或雜環(huán)；對(duì)于環(huán)狀原酸酯，R8是氫、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基、或取代的芳基，R9是烷氧基、環(huán)烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基、或取代的芳氧基。
當(dāng)R5、R6和R7不相同時(shí)，或當(dāng)R8和R9不相同時(shí)，通式I的化合物可以多種非對(duì)映體形式存在。除非特別說(shuō)明，通式I的通用結(jié)構(gòu)中包括了這些材料的所有非對(duì)映體形式。通式I還包括通式I化合物的混合物，其中包括由任何比例的對(duì)映體、非對(duì)映體和/或其它異構(gòu)體構(gòu)成的混合物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是A＝M，其中M＝H或藥物學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子。在該實(shí)施例中，化合物可為單磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、四磷酸核苷、五磷酸核苷或六磷酸核苷，其呋喃糖或碳環(huán)的2′-和/或3′-位中的一個(gè)或兩個(gè)被修飾。最優(yōu)選的是單磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷和四磷酸核苷。當(dāng)T2、W、V或T1是硫時(shí)，該原子的優(yōu)選取代位是在多磷酸鏈的末端磷上(即從核苷殘基開始離得最遠(yuǎn)的磷)。
對(duì)于單磷酸，當(dāng)m、n和p均等于0時(shí)，優(yōu)選R8為氫，且R9為芳基或芳烷基，其中在芳烷基的烷基部分中包含1、2、3或4個(gè)碳，而在芳烷基或芳基的芳基部分中包含6個(gè)碳；當(dāng)芳烷基中烷基部分的碳數(shù)為2時(shí)，最優(yōu)選通過(guò)雙鍵或三鍵來(lái)連接所述碳原子。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是A是核苷殘基，定義如下 并通過(guò)呋喃糖或碳環(huán)的5′-位與磷酸鏈連接(從而得到多磷酸二核苷，呋喃糖或碳環(huán)部分的2′-、3′-、2″-和3″-位至少之一被修飾為OR1、OR2、OR4和OR3)當(dāng)T2、W、V和/或T1是硫時(shí)，優(yōu)選位置(針對(duì)硫而言)是T1和T2。
其它條件是當(dāng)D1或D2是氧時(shí)，對(duì)應(yīng)的呋喃糖優(yōu)選是β-構(gòu)型；相應(yīng)的呋喃糖優(yōu)選是β-D-構(gòu)型。
在一個(gè)實(shí)施例中，通式I的化合物是其結(jié)構(gòu)符合式Ia和式Ib定義的分子 其中D1＝O或CH2；D2＝O或CH2；B和B′分別是通式IV或V的嘌呤或嘧啶殘基；m和p＝0、1或2；n＝0或1；這樣m+n+p的和是0-5，優(yōu)選0-4，最優(yōu)選0-3；X1、X2和X3＝分別是O、NH、CH2、CHF、CHCl、CF2、CCl2；T1、T2、V和W分別是O或S；M＝H+、NH4+、Na+或其它藥物學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；Y′＝H、OH或OR1；Z′＝OH或OR2；Z＝OH或OR3；
Y＝H、OH或OR4，其中R1、R2、R3和R4符合通式II或III的定義，條件是Y′、Z′、Z和Y中至少一個(gè)是OR1、OR2、OR3或OR4。
式Ia的優(yōu)選化合物包括D1＝O或CH2；D2＝O或CH2；X1、X2和X3＝O；T1、T2、V和W＝O；或D1＝O或CH2；D2＝O或CH2；X1和X3＝O；X2＝亞甲基、一氯亞甲基、二氯亞甲基、一氟亞甲基、二氟亞甲基或亞氨基；T、T1、T2、V和W＝O；或D1＝O或CH2；D2＝O或CH2；m、n和p＝1；或X1和X3＝O；X2＝亞甲基、一氯亞甲基、二氯亞甲基、一氟亞甲基、二氟亞甲基或亞氨基；T1和T2＝S；V和W＝O。
D1＝O或CH2；n和p＝0，1，或2，這樣n+p之和是0-3；A＝M；其中M＝H+、NH4+、Na+或其它藥物學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；B是通式IV和V的嘌呤或嘧啶殘基；
X1和X2分別是O、NH、CH2、CHF、CHCl、CF2、CCl2；T1、V和W分別是O或S；Y′＝H、OH或OR1，Z′＝H、OH或OR2，其中R1和Rx符合通式II或III的定義；條件是Y′和Z′的至少一個(gè)分別是OR1或OR2。
式Ib的優(yōu)選化合物包括D1＝O或CH2；n和p＝0，1，或2，這樣n+p之和是0-3，優(yōu)選1-2；X1和X2＝O；T1、V和W＝O；或D1＝O或CH2；X1和X2＝O；T1和V＝O；W＝S；或D1＝O；n和p＝0，這樣n+p的和是0；V＝O；B′是通式IV的嘌呤殘基；Y′和Z′符合通式III的定義；或D1＝O或CH2；p＝0，1或2，n＝1，這樣n+p之和是1-3；X1＝O；X2＝亞甲基、一氯亞甲基、二氯亞甲基、一氟亞甲基、二氟亞甲基或亞氨基；T1、V和W＝O；Y′＝H、OH或OR1；Z′＝H、OH或OR2，其中R1和R2符合通式II或III的定義；條件是Y′和Z′中至少一個(gè)分別是OR1或OR2。
還可用式Ia-1和Ib-2描述多個(gè)優(yōu)選的化合物。
對(duì)于式I的化合物，B和B′可分別是式IV中的嘌呤殘基，通過(guò)9-位連接，或式V的嘧啶殘基，通過(guò)1-位連接。式Ia、Ib、Ia-1和Ib-1中的核糖基部分是如所示的D-構(gòu)型，但也可以是L-或D-和L-。對(duì)于核糖基部分，D-構(gòu)型是優(yōu)選的。
其中
R10和R14各自是羥基、氧代、氨基、巰基、烷硫基、烷氧基、芳氧基、烷基氨基、環(huán)烷基氨基、芳烷基氨基、芳基氨基、二芳烷基氨基、二芳基氨基或二烷基氨基，其中烷基可任選的連接，形成雜環(huán)；或R10和R14各自是酰氨基，條件是它們摻入嘌呤C-6位或嘧啶C-4位的氨基殘基；或當(dāng)嘌呤中的R10，或嘧啶中的R14的第一個(gè)原子是氮時(shí)，R10和R11或R14和R15可合起來(lái)形成5-元稠合咪唑環(huán)(以形成亞乙烯基(etheno)化合物)，在亞乙烯基環(huán)上可任選的被如上R5-R9所述的一個(gè)或多個(gè)烷基、環(huán)烷基、芳烷基或芳基基團(tuán)取代；J是碳或氮，條件是當(dāng)J＝氮時(shí)，R12不存在；R11是氫、O(1-氧化腺嘌呤衍生物)或不存在(腺嘌呤衍生物)；R15是氫或酰基(例如取代或未取代的乙?；?、苯甲酰基、苯基?；?，具有或不具體取代基)R12是氫、烷基、溴、疊氮基、烷基氨基、芳基氨基或芳烷基氨基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基、烷硫基、芳硫基或芳烷硫基、或ω-A(C1-6烷基)B-，其中A和B分別是氨基、巰基、羥基或羧基；R13是氫、氯、氨基、一取代氨基、二取代氨基、烷硫基、芳硫基或芳烷硫基，其中硫上的取代基含有最多達(dá)20個(gè)飽和或不飽和的碳原子，在該鏈上含有或不含取代基；R16是氫、甲基、烷基、鹵素、烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、炔基或取代的炔基。
R10或R14是酰氨基的式IV和V的化合物符合式VI的范圍 其中NH是嘌呤的C-6位的氨基殘基或嘧啶C-4位的氨基殘基；C是碳原子；W1是氧或硫；
R17是氨基或一或二取代的氨基，所述一個(gè)或兩個(gè)氨基的取代基為烷基、環(huán)烷基、芳烷基或芳基，所述取代基包含或不含進(jìn)一步的取代基、不飽和或雜原子，這樣式VI的基團(tuán)是脲或硫脲；或R17是烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基或取代的芳氧基，這樣式VI的基團(tuán)是氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯；或R17是具有或不具有取代基或雜原子的烷基、環(huán)烷基、芳烷基或芳基，這樣式VI的基團(tuán)是酰胺；烷基、環(huán)烷基、芳烷基或芳基的定義如先前在R5-R9的可比較基團(tuán)中定義的。
新化合物本發(fā)明的新化合物包括如下的式Ia化合物其中B和B′獨(dú)立地為嘧啶(嘧啶/嘧啶二核苷酸)，條件是當(dāng)m+n+p＝1，R16＝CH3，且R5和R6一起作為氧雙鍵連接于C時(shí)，R7不等于CH3(Z′不等于乙酸酯)；另一條件是當(dāng)m+n+p＝3，B和B′＝尿苷，且R5和R6一起作為氧雙鍵連接于C時(shí)，對(duì)于Y′＝OR1和/或Y＝OR4，R7不等于苯基(Y和Y′不等于苯甲?；?；另一條件是當(dāng)m+n+p＝1時(shí)，R8和R9不都為CH3(Z′和Y′在一起不等于異亞丙基(isopropylidine))。
本發(fā)明的新化合物還包括如下的式Ia化合物其中B是嘌呤或通式IV的殘基，B′為通式V的嘧啶殘基(嘌呤/嘧啶二核苷酸)；條件是當(dāng)Z′、Y或Y′＝H或OH時(shí)，Y′不等于OCH3；另一條件是當(dāng)R9＝H時(shí)，R8不等于OCH2CH3(Z′和Y′或Z和Y一起不等于原乙酯(orthoethylester))。
本發(fā)明的新化合物還包括如下的式Ia化合物其中B和B′獨(dú)立地為通式IV的嘌呤殘基(嘌呤/嘌呤二核苷酸)；條件是(a)當(dāng)R10＝NH2或O時(shí)，Y或Y′不等于OCH3；(b)當(dāng)R9＝H時(shí)，R8不等于OCH3或OCH2CH3；(c)R8和R9不都等于CH3；(d)當(dāng)m+n+p＝1時(shí)，R8和R9不等于OCH2CH3；(e)當(dāng)R10＝NH2，且R5和R6一起作為氧雙鍵連接于C時(shí)，R7不等于鄰-甲氨基苯基；(f)當(dāng)m+n+p＝1，且R5和R6一起作為氧雙鍵連接于C，R7不等于CH(CH2CH2SCH3)NHS(o-NO2-Ph)或CH(CH2Ph)NHS(o-NO2-Ph)。
本發(fā)明的新化合物包括式Ib的化合物(單核苷酸)，條件是但n＝1時(shí)，X1和X2不都是O；和當(dāng)n＝0時(shí)，X1不為O；以及條件是當(dāng)Y′＝H，X2獨(dú)立地為O、CH2、CHF、CHCl、CF2、CCl2；另外的條件是當(dāng)R10＝NH2或O，且R5和R6一起作為氧雙鍵連接于C時(shí)，R7不等于鄰-甲氨基苯基；另一條件是當(dāng)n＝p＝1，X2＝CH2且B′＝腺苷時(shí)，R1和R2不等于亞萘基甲基(napththylenylmethyl)、亞萘基亞甲基或苯基亞甲基。
新的二核苷5’-二磷酸化合物包括式Ia-1的化合物 其中V＝O；M＝H或藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；D1和D2＝O；Y’＝H、OH或OR1；Z′＝H，OH或OR2；Z＝H，OH或OR3；Y＝H、OH或OR4，其中R1、R2、R3和R4符合通式II或III的定義，條件是Y’、Z’、Z和Y中的至少一個(gè)是OR1、OR2、OR3或OR4；R1、R2、R3和R4是如式II所示的通過(guò)碳原子直接連接于呋喃糖的2′和/或3′羥基的殘基，或者，優(yōu)選含有如式III所示的包含通過(guò)共用的碳原子連接于呋喃糖的2′和3′羥基的部分， 式中，所述O原子為呋喃糖的2’-和3’-氧；和所述呋喃糖的2’-和3’-氧通過(guò)共用的碳原子相連，形成環(huán)狀縮醛；和R8是氫；和R9為選自下組的基團(tuán)芳烷基、芳基、取代的芳烷基和取代的芳基；其中所述芳烷基的烷基部分為飽和或不飽和、不含雜原子的1-5個(gè)碳的直鏈，芳基部分為5-6個(gè)碳的單環(huán)部分；所述芳基是包含或不含雜原子的4-6個(gè)碳的單環(huán)部分；B′是通式IV的嘌呤殘基其中R10是式VI的酰氨基；和R17是氨基或單-或二取代的氨基，從而使得式VI所示部分為脲；J＝碳；R11不存在；R12是氫；和R13是氫。
新的單核苷5’-單磷酸化合物包括式Ib-1的化合物 其中V＝OM＝H或藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；D1＝O；Y′＝H、OH或OR1；Z′＝H、OH或OR2；條件是Y′和Z′中的至少一個(gè)是OR1或OR2；R1和R2是如式II所示的通過(guò)碳原子直接連接于呋喃糖的2′和/或3′羥基的殘基，或者，或者R1和R2如式III所示通過(guò)共用的碳原子連接于呋喃糖的2′和3′羥基 其中所述O原子為呋喃糖的2’-和3’-氧；和所述呋喃糖的2’-和3’-氧通過(guò)共用的碳原子相連，形成環(huán)狀縮醛；和R8是氫；和R9為選自下組的基團(tuán)芳烷基、芳基、取代的芳烷基和取代的芳基；其中所述芳烷基的烷基部分為飽和或不飽和、不含雜原子的1-5個(gè)碳的直鏈，芳基部分為5-6個(gè)碳的單環(huán)部分；所述芳基是包含或不含雜原子的4-6個(gè)碳的單環(huán)部分；B′是通式IV的嘌呤殘基其中R10是式VI的酰氨基；和R17是氨基或單-或二取代的氨基，從而使得式VI所示部分為脲；J＝碳；R11不存在；R12是氫；和R13是氫。
本發(fā)明的化合物符合通式I的定義，所述通式I可進(jìn)一步劃分為通式Ia(二核苷酸)、Ib(單核苷酸)、Ia-1(二核苷二磷酸)和Ib-l(單核苷單磷酸)。雖然在任一這些小類中均能找到強(qiáng)效和選擇性的P2Y12拮抗劑，但是單核苷酸由于其易于合成和成本低而優(yōu)于二核苷酸。通常，符合通式Ib的單核苷二磷酸和單核苷三磷酸是比對(duì)應(yīng)于式Ib-1的單核苷單磷酸更強(qiáng)的P2Y12拮抗劑。然而，與單核苷二磷酸和單核苷三磷酸相比，核苷5’-單磷酸及其類似物更容易制備，且具有更大的化學(xué)和生物穩(wěn)定性。因此，出于合成的理由，具有適宜的藥物樣特性的核苷5’-單磷酸有時(shí)比帶有多于一個(gè)磷酸的其它單核苷酸或相應(yīng)的二核苷酸更具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于符合通式Ia的二核苷酸，由式Ia-1所示的僅具有2個(gè)磷酸的那些二核苷酸最為理想，這是由于與符合式Ib-1的單核苷5’-單磷酸相比，它們的制備可在簡(jiǎn)單的反應(yīng)條件下以良好的產(chǎn)率進(jìn)行。在血流中受到酶攻擊時(shí)，核苷5’-單磷酸因失去磷酸而僅產(chǎn)生一種副產(chǎn)物。二核苷二磷酸是最容易制備的二核苷酸；與具有較長(zhǎng)的磷酸鏈長(zhǎng)度的二核苷酸相反，二核苷二磷酸穩(wěn)定且產(chǎn)生有限數(shù)量的分解產(chǎn)物。對(duì)于抑制血小板聚集，核苷5’-單磷酸和二核苷二磷酸均為優(yōu)選的化合物。
可對(duì)通式Ia-1和Ib-1的化合物進(jìn)行兩種修飾，從而使它們成為血小板P2Y12受體的強(qiáng)拮抗劑。通常，優(yōu)選的核苷5’-單磷酸起始材料為腺苷5’-單磷酸(AMP)或AMP衍生物，其含有用于所需修飾的適宜官能團(tuán)，且與其它可常規(guī)得到的核苷酸單磷酸類似修飾相比，由所述起始材料可得到更為強(qiáng)效和更具選擇性的拮抗劑。第一種修飾是加載入與核糖的2′-和3′-羥基橋連的芳基或芳烷基縮醛，所述芳基或芳烷基的性質(zhì)如前所述。在這些描述的基團(tuán)中，最優(yōu)選的是苯基、芐基和苯乙烯基，它們是由核糖的2′-和3′-羥基分別與苯甲醛、苯基乙醛和肉桂醛反應(yīng)產(chǎn)生的縮醛。這些部分具有超出許多類似修飾物的多個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)。首先，它們衍生自易于獲得、低成本的醛或醛等價(jià)物(例如，醛、二烷基縮醛)。其次，可通過(guò)這些部分合成一種或兩種可能的非對(duì)映體，所述非對(duì)映體可采用數(shù)個(gè)合成方案，由縮醛與手性核糖殘基加成反應(yīng)產(chǎn)生。最后，含有這些縮醛部分的分子提供了本發(fā)明的強(qiáng)效類似物。
第二種修飾是在腺嘌呤堿基的6-氨基位上加入氨基羰基或取代的氨基羰基，從而在該位置得到脲部分。在所述脲部分上的取代基符合對(duì)R17的氨基取代基的定義，即含有或不含取代基或雜原子的飽和或不飽和烷基、環(huán)烷基、芳烷基或芳基?？蓪⑦@些脲取代基根據(jù)性質(zhì)廣義分類為芳族或脂族。選自芳基的優(yōu)選取代基為苯基。當(dāng)所述脲基團(tuán)為脂族脲時(shí)，氮上優(yōu)選的取代基為飽和或不飽和的直鏈、支鏈或環(huán)狀C1-C6烷基。優(yōu)選的脲部分為包含2-6個(gè)碳的直鏈烷基脲，或環(huán)中包含3-6個(gè)碳的環(huán)狀烷基脲。更優(yōu)選的脲部分為在鏈中含有2-4個(gè)碳的直鏈烷基脲，或環(huán)中包含3-5個(gè)碳的環(huán)烷基脲。
式Ia-2和Ib-2顯示了具有上述修飾的新化合物。

其中R18和R18′獨(dú)立地為苯基、芐基或苯乙烯基；和R19和R19′獨(dú)立地為C2-C6烷基；C3-C6環(huán)烷基；在烷基部分包含1-2個(gè)碳原子、在環(huán)烷基部分包含3-6個(gè)碳的烷基環(huán)烷基；苯基；它們可被取代或未被取代。
例如，R19和R19獨(dú)立地為乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或苯基。
雖然R18和R18′、R19和R19′可為獨(dú)立給定的基團(tuán)，但是出于合成的原因，優(yōu)選它們是相同的對(duì)。
其中R18是苯基(苯甲醛縮醛)、芐基(苯基乙醛縮醛)或苯乙烯基(肉桂基縮醛)；R19是C2-C6烷基；C3-C6環(huán)烷基；在烷基部分包含1-2個(gè)碳原子、在環(huán)烷基部分包含3-6個(gè)碳的烷基環(huán)烷基；苯基；它們可被取代或未被取代。
例如，R19為乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或苯基。
本發(fā)明的一個(gè)方面是雖然任何式I的化合物均能拮抗ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集，但在同一分子中具有2’/3′和6-N修飾的組合產(chǎn)生了高度強(qiáng)效和選擇性的P2Y12拮抗劑化合物。
本發(fā)明的另一方面是化合物結(jié)構(gòu)對(duì)于所得效力的作用，在洗出的血小板(washed platelet)和全血中是可比的。通常，給定化合物在全血中的效力低于其在洗出的血小板中的效力，表面上這是由所述化合物與前者中較高水平血液蛋白質(zhì)的結(jié)合增加而導(dǎo)致的。這一特性在核苷5’-單磷酸中比在相應(yīng)的二-和三磷酸中更為突出，這是由于前者中具有較少的可電離基團(tuán)來(lái)中和推測(cè)會(huì)提高全血中蛋白質(zhì)結(jié)合的親脂縮醛和脲基。出人意料地是，在全血和洗出的血小板分析測(cè)試中，我們發(fā)現(xiàn)具有脂族脲的化合物產(chǎn)生了可比的結(jié)果。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在洗出的血小板中，具有脂族脲的化合物比它們的芳族對(duì)應(yīng)物具有更強(qiáng)的效力。
本發(fā)明的新化合物包括下列化合物2′-或3′-苯基氨基甲酸酯UTP、2′，3′-二苯基氨基甲酸酯UTP、2′，3′-苯基乙醛縮醛ADP、二[3′(苯基氨基甲酸酯)dUp2dU]、2′，3′-苯基乙醛縮醛Up3U、二2′，3′-苯基乙醛縮醛Up3U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Up4A、2′，3′-苯基乙醛縮醛Ap4U、二2′，3′-苯基乙醛縮醛Ap4U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Ip4U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Up4U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Ip4U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Up4dC、四苯基氨基甲酸酯Up4U、二2′，3′-苯甲醛縮醛Ip4U、二2′，3′-苯甲醛縮醛Up4U、2′，3′-苯甲醛縮醛Up4U、二2′，3′-苯基乙醛縮醛Cp4U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Cp4U、2′，3′-苯基乙醛縮醛Up4C、2′，3′-苯基乙醛縮醛Up4T、二2′，3′-苯甲醛縮醛Cp4U、2′，3′-苯甲醛縮醛Ip4U、2′，3′-苯甲醛縮醛Up4U、2′，3′-苯甲醛縮醛Up4dC、2′，3′-苯甲醛縮醛Cp4U、2′，3′-苯甲醛縮醛Up4C、2′，3′-苯基丙醛縮醛Up4U、二2′，3′-苯基丙醛縮醛Up4U、2′，3′-苯甲醛縮醛Cp4C、二MANT Up4U、Mant Up4U、二2′/，3′-芐基縮醛Up4U、單2′/，3′-芐基縮醛Up4U、三苯基氨基甲酸酯Up4U、2′，3′-苯基氨基甲酸酯Up4U和一苯基氨基甲酸酯Up4U。
新的二核苷5’-二磷酸化合物包括P1，P2-二-(2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物44)、P1，P2-二-(2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物45)、P1，P2-二-(2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物46)和P1，p2-二-(2’，3’-苯基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物47)。
新的單核苷5’-單磷酸化合物包括2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-苯脲AMP(化合物22)、2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-正己基脲AMP(化合物23)、2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物24)、2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-環(huán)戊基脲AMP(化合物25)、2’，3’肉桂基縮醛-6-N-正己基脲AMP(化合物26)、2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物27)、2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-苯脲AMP(化合物28)、2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-正丙基脲AMP(化合物29)、2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-正丁基脲AMP(化合物30)、2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-苯脲AMP(化合物31)、2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-正己基脲AMP(化合物32)、2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-正丁基脲AMP(化合物33)、2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-正丙基脲AMP(化合物34)、2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物35)、2’，3’-苯甲醛縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物36)、2’，3’-苯甲醛縮醛-6-N-正丙基脲AMP(化合物37)、2’，3’-苯甲醛縮醛-6-N-正丁基脲AMP(化合物38)、2’，3’-苯甲醛縮醛-6-N-正己基脲AMP(化合物39)、2’，3’-苯甲醛縮醛-6-N-環(huán)戊基脲AMP(化合物40)、2’3’-(反式)肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物41)、2’3’-(反式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物42)和2’3’-(順式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物43)。在化合物41-43中，順式或反式指氫原子在間二氧雜環(huán)戊烯環(huán)上的相對(duì)位置。
新化合物1-47的結(jié)構(gòu)如下所示。在以下的結(jié)構(gòu)中，為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)已省略了可理解的存在的氫。所示的互變異構(gòu)體代表所有可能的互變異構(gòu)體。由于引入縮醛基團(tuán)時(shí)產(chǎn)生了非對(duì)映體，并未用立體化學(xué)明確定義的包含此部分的結(jié)構(gòu)(化合物1-20和23-26)應(yīng)理解為表示單獨(dú)的可能的非對(duì)映體或以任何比例存在的非對(duì)映體混合物。

2-(3-三氟甲基丙基)硫代-6-(2-甲硫基)乙基氨基-2’，3’-(芐基)亞甲二氧基嘌呤核糖核苷5’-α，β-二氟亞甲基二磷酸




P1-[2-(3-三氟甲基丙基)硫代-6-(2-甲硫基)乙基氨基2’，3’-(芐基)亞甲二氧基嘌呤核糖核苷]-P4-(2’，3’-(芐基)亞甲二氧基尿苷)四磷酸












藥物制劑本發(fā)明還提供了新的藥物制劑，所述藥物制劑包含式I、Ia、Ib、Ia-1、Ib-1、Ia-2或Ib-2的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體?？捎杀绢I(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行選擇。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于鹽溶液、電解質(zhì)水溶液、等滲調(diào)節(jié)劑、水聚醚(water polyether，例如聚乙二醇)、聚乙烯(例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)、纖維素衍生物(例如甲基纖維素和羥丙基甲基纖維素)、丙烯酸聚合物(例如聚丙烯酸凝膠)、多糖(例如葡聚糖)、氨基葡聚糖(例如透明質(zhì)酸鈉)和鹽類(例如氯化鈉和氯化鉀)。
本發(fā)明的藥物制劑提供了一種水溶液，所述水溶液包含水、適宜的離子或非離子張力調(diào)節(jié)劑、適宜的緩沖劑、螯合劑、pH調(diào)節(jié)劑和0.005-3％w/v的式I、Ia、Ib、Ia-1、Ib-1、Ia-2或Ib-2化合物，其中所述水溶液的張力為200-400mOsm/kG，pH為4-9。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物制劑包含0.025-3、0.05-2.5％或0.01-1.5％w/v的式I、Ia、Ib、Ia-1、Ib-1、Ia-2或Ib-2化合物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物制劑的張力為220-360或250-350mOsm/kG。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述藥物制劑的pH為4.5-8.5或5.5-7.5。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述螯合劑的含量為0.005-0.01％w/v；優(yōu)選0.008-0.01％w/v。
可將所述藥物制劑濾過(guò)滅菌級(jí)的濾器，對(duì)其進(jìn)行滅菌，所述濾器的額定孔徑優(yōu)選為0.22微米。也可采用一種或多種滅菌技術(shù)對(duì)藥物制劑進(jìn)行終點(diǎn)滅菌，所述技術(shù)包括但不限于熱處理，例如高壓滅菌處理；或輻射滅菌處理；或使用脈沖光，以生產(chǎn)出無(wú)菌制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物制劑是活性成分的濃縮液；靜脈注射給藥前，可用適宜的可接受的無(wú)菌稀釋劑對(duì)所述制劑進(jìn)行系列稀釋。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述張力調(diào)節(jié)劑是諸如NaCl的離子型張力調(diào)節(jié)劑，其含量為例如0.5-0.9％w/v，優(yōu)選0.6-0.9％w/v。
在另一實(shí)施方式中，所述張力調(diào)節(jié)劑是諸如甘露醇、右旋糖的非離子型張力調(diào)節(jié)劑，其含量至少為2％，或至少為2.5％，或至少為3％以及不超過(guò)7.5％；例如，其范圍為3-5％，優(yōu)選3.5-5％，更優(yōu)選4.2-5％w/v。相對(duì)于其它可用的非離子型張力調(diào)節(jié)劑而言，甘露醇和右旋糖更為優(yōu)選，所述其它張力調(diào)節(jié)劑包括例如丙二醇和相關(guān)的二醇、各種分子量范圍的聚乙二醇、山梨醇、聚合物(例如聚乙烯醇、PVP)、山梨醇、蔗糖和海藻糖，這是由于這些非離子張力調(diào)節(jié)劑大部分不適于通過(guò)靜脈給藥途徑長(zhǎng)期給藥。例如，當(dāng)通過(guò)靜脈給藥途徑給予蔗糖和海藻糖時(shí)，它們不發(fā)生代謝并以原型排泄，因此它們不能作為靜脈用劑型的候選物。此外，包含甘露醇的制劑具有可進(jìn)行冷凍干燥或凍干的優(yōu)點(diǎn)。
在另一實(shí)施方式中，所述藥物制劑包含0.5-0.9％的離子型張力調(diào)節(jié)劑，例如氯化鈉；所述制劑可任選含有附加的0.01-0.2％w/v的緩沖劑(例如磷酸鈉和/或檸檬酸鈉)、0.005-0.01％w/v的螯合劑以及pH調(diào)節(jié)劑。該水性組合物的張力為250-350mOsm/kG，并調(diào)配到生理學(xué)上可接受的pH。然而，根據(jù)化合物的類型和濃度，較高濃度(＞0.1％w/v)某些化合物的NaCl制劑傾向于形成沉淀。
包括單-磷酸核苷、二-磷酸核苷和三-磷酸核苷在內(nèi)的核苷化合物在水性溶液中通常是可溶的。然而，根據(jù)取代基和鹽形式的程度和性質(zhì)，相應(yīng)的水溶性是可變的。
為了制備靜脈給藥用水溶液制劑，所述溶液優(yōu)選是澄清(即，沒(méi)有沉淀)、等張的，且具有生理學(xué)上可接受的pH。本發(fā)明化合物的水溶性隨取代基和鹽形式的變化而改變，而鹽形式對(duì)水溶性的影響更大。某些化合物的鹽形式，即便在低濃度下(例如＜0.05％w/v)也傾向于形成沉淀或在靜脈給藥常用的載體——普通的鹽水溶液中(0.9％NaCl)的溶解度有限。
申請(qǐng)人己揭示了在非離子型、等滲基載體中制備的本發(fā)明化合物的藥物制劑為澄清、生理pH的等張制劑。藥物制劑中非等張的張力調(diào)節(jié)劑(例如甘露醇或右旋糖)的水平隨所述化合物的期望目標(biāo)濃度的變化而改變(由于化合物本身對(duì)張力有影響并對(duì)制劑的整體張力產(chǎn)生作用)?？蓪⒃诜请x子型載體中制備的所述藥物制劑的pH由大范圍調(diào)節(jié)到目標(biāo)pH而不影響母體化合物的溶解度。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，所述藥物制劑包含0.0005-0.3％w/v的式I、Ia、Ib、Ia-1、Ib-1、Ia-2或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物、緩沖劑、螯合劑(例如EDTA)、非離子型張力調(diào)節(jié)劑，其中所述藥物制劑的張力為250-350mOsm/kG，pH為4-9。優(yōu)選的非離子型張力調(diào)節(jié)劑是右旋糖或甘露醇，其含量至少為2％，或至少2.5％，或至少3％，而不超過(guò)7.5％；例如，其范圍為3-5，優(yōu)選3.5-5，更優(yōu)選4.2-5％w/v。該藥物制劑可含有或不含有任何離子型張力調(diào)節(jié)劑，例如NaCl。例如，所述藥物制劑可包含如下化合物2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物24)、2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物27)、2’，3’-苯甲醛縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物36)、P1，p4-二-(2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物44)、P1，p4-二-(2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物46)或P1，P4-二-(2’，3’-苯基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸(化合物47)。
化合物的制備本領(lǐng)域技術(shù)人員能方便的用熟知化學(xué)方法合成本發(fā)明的化合物?？蓮纳唐穪?lái)源獲得一、二和三磷酸單核苷，或用化學(xué)文獻(xiàn)中找到的各種磷酸化反應(yīng)方法從核苷合成?？赏ㄟ^(guò)用偶聯(lián)劑，例如但不限于二環(huán)己基碳二亞胺或1，1′-羰基二咪唑活化一、二或三磷酸核苷，然后與另一個(gè)一、二或三磷酸核苷(可以與活化的分子相同或不同)縮合，制備對(duì)稱或非對(duì)稱的多磷酸二核苷。用二環(huán)己基碳二亞胺活化三磷酸核苷得到作為活化物質(zhì)的環(huán)狀三偏磷酸酯，它可以有利的與各種親核試劑反應(yīng)，將特定取代基加到三磷酸酯的末端磷酸酯上。
可通過(guò)在核苷水平衍生或取代，然后如前所述磷酸化或縮合制備本發(fā)明的化合物，或反應(yīng)可以直接在預(yù)先形成的單或二核苷酸上進(jìn)行。在通式Ia和Ib中，Y′、Z′、Y和Z的取代基可以是酯、氨基甲酸酯或碳酸酯，如式II一般描述的。酯可以方便的通過(guò)使核苷或核苷酸中呋喃糖的羥基與合適的有機(jī)酸的活化形式，例如酸酰鹵或酸酐在有機(jī)或無(wú)機(jī)堿的存在下反應(yīng)制備。另外，可用合適的偶聯(lián)試劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺、1，1′-羰基二咪唑等活化有機(jī)酸，達(dá)到相同的結(jié)果。
通過(guò)在惰性溶劑中，使核苷或核苷酸中呋喃糖上的羥基與許多市售異氰酸酯或異硫氰酸酯之一反應(yīng)，可最方便地制備氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯。另外，當(dāng)不能從商品來(lái)源獲得所需異氰酸酯或異硫氰酸酯時(shí)，可從相應(yīng)的胺，分別使用光氣或硫光氣或其化學(xué)等價(jià)物制備。可通過(guò)在有機(jī)或無(wú)機(jī)堿的存在下，使核苷或核苷酸中的呋喃糖的羥基與合適的鹵代甲酸酯反應(yīng)，合成碳酸酯或硫代碳酸酯。
在通式Ia、Ib和Ib-1中，Y′和Z、Y和Z上的取代基可合起來(lái)意味著縮醛基、縮酮基或原酸酯，如通式III所示。
可通過(guò)在酸性催化劑的存在下，使合適的核苷或核苷酸中呋喃糖的鄰近2′-和3′-羥基分別與醛或酮或其等價(jià)物反應(yīng)，容易地制備縮醛和縮酮。特別有利的是使用有機(jī)酸，它可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化而不影響分子其余部分的完整性。另外，可以催化量使用強(qiáng)酸，例如三氯乙酸、對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸等和惰性溶劑。最優(yōu)選的是甲酸，可通過(guò)減壓蒸發(fā)將其去除，它理想地適合作為這些反應(yīng)的溶劑和催化劑?；蛘撸诜磻?yīng)中也可用三氟乙酸代替甲酸；條件是該反應(yīng)在低溫下進(jìn)行，且用于制備縮醛的乙醛或乙醛等價(jià)物在強(qiáng)酸性條件下是穩(wěn)定的。
可通過(guò)不同的過(guò)程合成由縮醛與手性核糖殘基加成而形成的兩種可能的非對(duì)映體中的任何一種。在制備2′，3′-苯基縮醛-6-N-乙脲AMP的實(shí)施例中，使苯甲醛與核糖的2′和3′羥基在低溫(例如-10到0℃)下反應(yīng)，制備了由苯基取代的縮醛非對(duì)映體中的一個(gè)(順式異構(gòu)體，化合物43)。如下制備了另一反式異構(gòu)體(化合物42)首先在室溫下進(jìn)行同樣的縮醛形成反應(yīng)以產(chǎn)生順式和反式非對(duì)映異構(gòu)體的平衡混合物，然后在酸性水溶液條件下，對(duì)順式異構(gòu)體進(jìn)行選擇性降解。在另一制備2′，3′-肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP(化合物27)的實(shí)施例中，使肉桂醛與核糖的2′和3′羥基在例如20℃的溫度下反應(yīng)，制備了由苯乙烯基取代的縮醛順式和反式異構(gòu)體的混合物。通過(guò)在酸性水溶液條件下，對(duì)順式異構(gòu)體進(jìn)行選擇性降解，制備了反式異構(gòu)體(化合物41)。
環(huán)狀原酸酯可以通過(guò)在酸存在下使呋喃糖的鄰位2′-和3′-羥基與非環(huán)狀原酸酯反應(yīng)而制備。當(dāng)要衍生的核苷或核苷酸是含有6-氨基官能團(tuán)的嘌呤或含有4-氨基官能團(tuán)的嘧啶時(shí)，它可以通過(guò)分別用一種異氰酸酯或異硫氰酸酯處理而轉(zhuǎn)化為各自的脲或硫脲，如先前對(duì)于呋喃糖2′或3′羥基的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯所述。發(fā)現(xiàn)此氨基與異氰酸酯或異硫氰酸酯的反應(yīng)可通過(guò)合適操縱反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量在呋喃糖上一個(gè)或多個(gè)羥基的存在下進(jìn)行。
本文所述的所有衍生化反應(yīng)可在預(yù)先形成的多磷酸二核苷酸上進(jìn)行，根據(jù)反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量和是否存在多種反應(yīng)性基團(tuán)得到多種產(chǎn)物。當(dāng)獲得多種產(chǎn)物時(shí)，這些可以通過(guò)使用制備性反相高效液相層析(HPLC)方便地分離。特別有利的是使用C18或苯基反相柱并結(jié)合使用梯度液，從乙酸銨緩沖液開始，以甲醇結(jié)束。緩沖液的使用提供了核苷酸穩(wěn)定性，改善了洗脫產(chǎn)物的峰形狀，使用甲醇能夠有效地使這些親脂化合物從柱上解吸。特別有利的是使用乙酸銨緩沖溶液聯(lián)合甲醇，因?yàn)檫@些溶劑可以任何比例混合，并不難從層析產(chǎn)物中通過(guò)蒸發(fā)，然后凍干除去。
雖然可用HPLC進(jìn)行多種產(chǎn)物的分離，另一種策略是使用含有僅一個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)的核苷或核苷酸，不論是僅存在一個(gè)基團(tuán)，或使用保護(hù)性基團(tuán)封閉分子內(nèi)其它位置的副反應(yīng)。這可以在預(yù)先形成的多磷酸二核苷酸水平進(jìn)行，或者可以在一、二或三磷酸核苷進(jìn)行，生成它們自身的新產(chǎn)物，或可以與其它一、二或三磷酸核苷通過(guò)先前所述的方法偶聯(lián)。
也可將上述反應(yīng)和純化技術(shù)應(yīng)用于核苷、核苷酸及其衍生物的卡巴-核糖(carba-ribose)類似物(例如D1＝CH2)，例如“單核苷酸”和“二核苷酸”的術(shù)語(yǔ)也用于描述以式I-IV定義的卡巴-核糖類似物以及其它衍生物。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)知曉用于制備所述化合物無(wú)毒性的藥學(xué)上可接受的鹽和酰化前藥的不同合成方法。
P2Y12受體拮抗劑化合物的用途本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療與血小板聚集和/或血小板活化相關(guān)的疾病或病況的方法。該方法還提供了一種治療血栓形成的方法。該方法包括給對(duì)象施用一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的P2Y12受體拮抗劑化合物，其中所述量有效結(jié)合血小板上的P2Y12受體，并抑制ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集。
通式I的化合物是ADP對(duì)其血小板膜受體(即P2Y12受體)作用的拮抗劑。通式I的化合物在治療中有效，尤其是在血小板聚集的預(yù)防或治療中。該化合物通過(guò)其封閉ADP，阻止其作用于其血小板受體位點(diǎn)，從而防止血小板聚集提供作為抗血栓藥物的效力。所述化合物以比阿司匹林提供更有效的抗血栓作用，但對(duì)于出血的影響比纖維蛋白受體的拮抗劑較小。
與目前可市售獲得的產(chǎn)品氯吡格雷(Plavix)和噻氯匹定(Ticlid)相反，本發(fā)明的P2Y12受體拮抗劑與P2Y12受體以可逆的方式結(jié)合，由此可通過(guò)簡(jiǎn)單地停止用藥治療來(lái)逆轉(zhuǎn)本發(fā)明化合物的治療效果，從而重獲所需的血小板的止血功能。由于血小板是缺乏合成新蛋白質(zhì)的能力的無(wú)核細(xì)胞顆粒，用不可逆的P2Y12拮抗劑治療對(duì)象會(huì)導(dǎo)致血小板生命周期(約8-10天)中的功能缺陷。使用不可逆的P2Y12拮抗劑(例如氯吡格雷)已關(guān)系到血液流失的提高、對(duì)輸血的需要以及心臟手術(shù)后的再手術(shù)比率(Kapetanakis等，Eur Heart J.26576-83，2005)。為了防止這些并發(fā)癥，進(jìn)行選擇性外科手術(shù)的對(duì)象，需要在手術(shù)前至少5天停止用不可逆拮抗劑進(jìn)行的治療，這就提高了在此期間發(fā)生血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)性。因此，本發(fā)明所述的化合物表現(xiàn)出勝過(guò)目前市場(chǎng)上銷售的化合物的優(yōu)勢(shì)。
ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集是通過(guò)同時(shí)活化P2Y12和P2Y1受體介導(dǎo)的，因此將式I的化合物與血小板P2Y1受體拮抗劑的聯(lián)合給藥在各拮抗劑的濃度低于在其它系統(tǒng)中封閉各受體亞型的有效濃度下，能提供更有效的抗血栓效果，導(dǎo)致副作用的發(fā)生可能性下降。另外，這些化合物可與較低劑量的通過(guò)不同機(jī)制起作用的其它血小板聚集抑制劑的聯(lián)合使用，來(lái)減少所述藥物可能引起的副作用。
本發(fā)明的化合物可用作抗血栓藥物，因此用于治療或預(yù)防不穩(wěn)定型心絞痛、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)和心肌梗塞。
本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的原發(fā)性動(dòng)脈血栓并發(fā)癥，例如血栓性中風(fēng)、周圍血管疾病和心肌梗塞而不溶栓。
本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防由于動(dòng)脈粥樣硬化疾病的干預(yù)，例如血管成形術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、支架放置、冠狀和其它血管移植手術(shù)引起的動(dòng)脈血栓并發(fā)癥。
本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防手術(shù)或機(jī)械損傷，例如手術(shù)或偶然創(chuàng)傷后的組織補(bǔ)救，重建性手術(shù)包括皮瓣，和“還原性”手術(shù)例如乳房減小的血栓并發(fā)癥。
本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防體內(nèi)機(jī)械誘導(dǎo)的血小板活化，例如由導(dǎo)致暫時(shí)性血小板功能障礙的心肺分流術(shù)引起的血小板活化(預(yù)防微血栓栓塞)。本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防體外機(jī)械誘導(dǎo)的血小板活化。例如可將本發(fā)明的化合物用于血液產(chǎn)品(例如血小板濃縮物)的防腐化合物、預(yù)防分流阻塞，例如腎透析和血漿置換、以及預(yù)防由于血管損傷/炎癥，例如血管炎、動(dòng)脈炎、腎小球腎炎和器官移植排斥造成的血栓形成。
本發(fā)明化合物可用于具有彌散性血栓/血小板消耗成分的病癥，例如播散性血管內(nèi)凝結(jié)、血栓性血小板減少性紫癜、溶血性尿毒癥綜合征、肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥和先兆子癇/子癇。
本發(fā)明化合物可用于治療或預(yù)防靜脈血栓，例如深靜脈血栓、靜脈栓塞疾病、血液學(xué)病況，例如血小板增多癥和紅細(xì)胞增多癥，以及偏頭痛。
本發(fā)明的化合物可用于治療哺乳動(dòng)物，減輕動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化、急性MI、慢性穩(wěn)定性心絞痛、不穩(wěn)定性心絞痛、短暫性局部缺血發(fā)作和中風(fēng)、周圍血管疾病、動(dòng)脈血栓形成、先兆子癇、栓塞、血管成形術(shù)、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)和血管移植吻合術(shù)后的再狹窄或突然閉合。
本發(fā)明的化合物可用于治療過(guò)聚集性的慢性或急性狀態(tài)，例如彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、敗血癥、手術(shù)或感染性休克、手術(shù)后和產(chǎn)后創(chuàng)傷、心肺分流術(shù)、不兼容輸血、胎盤早期脫離、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、蛇毒和免疫疾病也可能對(duì)這些治療有反應(yīng)。
本發(fā)明的化合物可用于治療因血液與人造裝置接觸而造成的與血小板聚集和/或血小板活化相關(guān)的疾病或病況。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人造裝置是體旁人造肺(paracorporeal artificial lung)和體外膜產(chǎn)氧裝置(extracorporeal membrane oxigenationdevice)。在另一實(shí)施方式中，所述人造裝置是可植入的人造心臟。在另一實(shí)施方式中，所述人造裝置是用于去除或分離血液中特定成分并將其余的血液成分返還給供血者的血液成分部分清除儀器(apheresis instrument)。在另一實(shí)施方式中，所述人造裝置是血液透析儀。
本發(fā)明的化合物可用于在體外抑制血液和血液制品中的血小板聚集，例如用于儲(chǔ)存或離體操作(例如用于診斷或研究)。在這些應(yīng)用中，可將所述化合物施用于血液或血液制品。
最后，如果本發(fā)明的化合物具有足夠的結(jié)合親和力并帶有熒光部分，可將其用作P2Y12受體的生物探針。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述化合物用于治療不穩(wěn)定心絞痛、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和心肌梗塞。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述化合物用作預(yù)防或治療血栓形成性疾病中的輔助療法，所述血栓形成性疾病為例如不穩(wěn)定心絞痛治療中的冠狀動(dòng)脈血栓形成、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和急性心肌梗塞，即perithrombolysis。將所述化合物與其它抗血小板和/或抗凝血藥物(例如肝素、阿司匹林、GP IIb/IIIa拮抗劑或凝血酶抑制劑)聯(lián)合用藥。
本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物(尤其是人)中抑制血小板聚集和凝塊形成的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象式(I)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了一種在纖維蛋白溶解治療后抑制動(dòng)脈或靜脈重新阻塞的方法，它包括給予對(duì)象式(I)的化合物和纖維蛋白溶解劑。當(dāng)在本發(fā)明中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)纖維蛋白溶解劑是指任何化合物，不論天然或合成產(chǎn)物，直接或間接導(dǎo)致纖維蛋白凝塊的溶解。纖溶酶原活化劑是一類熟知的纖維蛋白溶解劑。有用的纖溶酶原活化劑包括例如復(fù)合纖溶酶鏈激酶、尿激酶(UK)、前尿激酶(pUK)、鏈激酶(SK)、組織纖溶酶原活化劑(tPA)和突變劑，或其變體，它維持纖溶酶原活化劑活性，例如化學(xué)修飾過(guò)，或其中加入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或其中通過(guò)聯(lián)合一種纖溶酶原活化劑的活性位點(diǎn)或另一種纖溶酶原活化劑或纖維蛋白結(jié)合分子的纖維蛋白結(jié)合域，加入、缺失或改變一個(gè)或多個(gè)功能域的變體。
在心血管手術(shù)中常規(guī)使用體外循環(huán)，以對(duì)血液充氧。血小板粘附在體外回路表面。從人工表面釋放的血小板顯示受損的止血功能。本發(fā)明的化合物可用于防止粘附。
這些化合物的其它應(yīng)用包括預(yù)防血栓治療期間和血栓治療后的血小板血栓形成、血栓栓塞和重新阻塞，和預(yù)防冠狀和其它動(dòng)脈的血管成形術(shù)后和冠狀動(dòng)脈分流術(shù)后的血小板血栓形成、血栓栓塞和重新阻塞。
本發(fā)明活性化合物可全身施給需要治療的個(gè)體的目標(biāo)位點(diǎn)，這樣來(lái)提高P2Y12激動(dòng)劑的胞外濃度，以封閉ADP與P2Y12受體的結(jié)合，從而抑制血小板聚集。本文所用的術(shù)語(yǔ)“全身性”包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射、玻璃體內(nèi)注射、輸液、吸入、透皮給藥、口腔給藥、直腸給藥和手術(shù)內(nèi)滴注。還包括泵導(dǎo)管系統(tǒng)和連續(xù)或選擇性釋放裝置的裝置將所述化合物輸注給目標(biāo)血小板。
對(duì)于全身性給藥，例如注射和輸液，藥物制劑可制備在無(wú)菌介質(zhì)中。根據(jù)所用的載體和濃度，活性成分可以懸浮或溶解在載體內(nèi)。佐劑，例如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可溶于載體。無(wú)菌可檢控制劑可以是無(wú)毒可接受的去污劑(diligent)或溶劑中的無(wú)菌可檢控溶液或懸液。在使用的可接受的載體和溶劑中有無(wú)菌水、鹽水溶液或Ringer氏溶液。
全身施用活性化合物的另一種方法涉及口腔給藥，其中含有活性化合物的藥物組合物的形式是片劑、錠劑、水相或油相懸液、粘性凝膠、口香糖、可分散粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊或糖漿或酏劑。
對(duì)于口腔使用，在可分散粉末和顆粒中加入水和分散或濕潤(rùn)劑、懸浮劑、一種或多種防腐劑和其它賦形劑，制備水相懸液。懸浮劑包括例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素和海藻酸鈉。分散劑或濕潤(rùn)劑包括天然存在的磷脂，丙炔化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物、環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物、環(huán)氧乙烷與脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，和環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產(chǎn)物。防腐劑包括例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯正丙酯。其它賦形劑包括甜味劑(例如蔗糖、糖精)、調(diào)味劑和著色劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到上面的一般描述包括許多具體的賦形劑和濕潤(rùn)劑。
對(duì)于口腔給藥，通過(guò)將活性化合物與適用于制造片劑的無(wú)毒的藥物學(xué)上可接受的賦形劑混合來(lái)制備片劑。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化劑和崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是不上糖衣或可以通過(guò)已知技術(shù)上糖衣，以延遲在胃腸道內(nèi)崩解和吸收的時(shí)間，從而在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)提供緩釋作用。例如，可使用一種時(shí)間延遲材料，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。口腔使用的制劑還可做成硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固相稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或做成軟明膠膠囊，其中活性成分與水或油基質(zhì)，例如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油混合?？谇皇褂玫闹苿┻€可做成口香糖，通過(guò)將活性成分包埋在膠中，從而活性成分可以隨著咀嚼緩慢釋放。
對(duì)個(gè)體目標(biāo)血小板全身性施用活性化合物的另一種方法涉及活性化合物的栓劑形式，這樣化合物的治療有效量可通過(guò)全身性吸收和循環(huán)到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)。
對(duì)于直腸給藥，可以通過(guò)將活性成分與合適的無(wú)刺激性賦形劑(在常溫是固體但在直腸溫度下是液體，從而能夠在直腸中融化，以釋放化合物)混合，制備栓劑形式的組合物。這些賦形劑包括可可脂和聚乙二醇。
還可用透皮貼片或墊通過(guò)皮膚吸收，對(duì)血小板聚集位點(diǎn)全身性施用活性化合物?；钚曰衔锟赏ㄟ^(guò)皮膚吸收到血流中?？捎煤胁煌瑵舛然钚曰衔锏馁N片控制活性化合物的血漿濃度。
一種全身性方法涉及含有活性化合物的可呼吸顆粒的氣溶膠懸液，它被個(gè)體吸入?；钚曰衔锟梢酝ㄟ^(guò)肺被吸收入血流，然后以藥物有效量接觸目標(biāo)血小板?？珊粑w?？梢允且后w或固體，顆粒尺寸足夠小，在吸入后能通過(guò)口腔和喉嚨；一般約1-10微米，但更優(yōu)選是1-5微米大小的顆粒被認(rèn)為是合適的。
另一種對(duì)個(gè)體的血小板聚集位點(diǎn)全身性施用活性化合物的方法涉及施用滴眼液或洗眼液的液體/懸液，或液體形式的滴鼻液，或讓個(gè)體吸入的可呼吸顆粒的鼻部噴霧?？赏ㄟ^(guò)將活性化合物與合適的載體，例如無(wú)菌無(wú)熱原水或無(wú)菌鹽水，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)混合，來(lái)制備用于制備鼻部噴霧或鼻或眼藥水的活性化合物的液體藥物組合物。
玻璃體內(nèi)傳遞可包括一次或多次玻璃體內(nèi)注射，或通過(guò)以緩釋形式釋放P2Y12拮抗劑的可植入玻璃體內(nèi)裝置。玻璃體內(nèi)傳遞還可包括在手術(shù)過(guò)程中作為眼內(nèi)沖洗溶液的附加成分傳遞，或直接在手術(shù)過(guò)程中對(duì)玻璃體施用。
對(duì)于全身性給藥，傳遞的活性化合物的血漿濃度可根據(jù)化合物改變，但通常是1×10-10-1×10-4摩爾/升，優(yōu)選1×10-8-1×10-5摩爾/升。
本發(fā)明的P2Y12拮抗劑化合物的藥物利用性是由其對(duì)ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制表示的。該廣泛使用的試驗(yàn)，如S.M.O.Hourani等，Br.J.Pharmacol.105，453-457(1992)所述，依賴于在添加聚集劑，例如ADP后血小板懸液的聚集的測(cè)定。
用下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明。這些實(shí)施例不是為了將本發(fā)明限于說(shuō)明書所描述的方法范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例12′(3′)-O-((苯基氨基羰基)-尿苷5′-)三磷酸在無(wú)水DMF(1ml)中溶解5′-三磷酸尿苷二三丁基銨鹽(100mg，0.176mmol；從三鈉鹽通過(guò)用Dowex 50Wx4H+在水中處理，然后將質(zhì)子化的物質(zhì)與過(guò)量三丁胺反應(yīng)，反萃取并凍干)，加入異氰酸苯酯(19微升，0.176mmol)。反應(yīng)混合物在45℃加熱15分鐘，此時(shí)再加入一份異氰酸苯酯(19微升，0.176mmol)。溶液在45℃加熱過(guò)夜，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去DMF。剩余的油在水(2mL)和乙酸乙酯(2ml)之間分配，并分層。用乙酸乙酯(各2ml)再萃取水層2次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去水。剩余物溶于水(1.5ml)，重復(fù)將產(chǎn)物注射入制備級(jí)HPLC柱(Alltech核苷酸/核苷C18，7微米，10×250mm，梯度為0.1M乙酸銨-甲醇，經(jīng)過(guò)30分鐘，5ml/分鐘，在260nm監(jiān)測(cè))分離產(chǎn)物。氨基甲酸酯的產(chǎn)率是26mg(22％，對(duì)于季銨鹽計(jì)算)。1H NMR顯示產(chǎn)物是2′和3′氨基甲酸酯的混合物。如此獲得的產(chǎn)物本身可用于本發(fā)明，或可用適合的偶聯(lián)劑(例如碳二亞胺)活化，并與各種核苷酸反應(yīng)，以產(chǎn)生新穎的多磷酸二核苷。
1H NMR(D2O，300MHz)δ4.10-4.47(m，4H)，5.17(m，1H)，5.83(dd，1H)，5.96(m，1H)，7.04(t，1H)，7.25(m，4H)，7.79(m，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-9.54(m，1P)，-10.20(m，1P)，-21.87(m，1P)。
實(shí)施例22′(3′)-O-(苯基氨基羰基)-P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸[“一苯基氨基甲酸酯Up4U”]，二-2′(3′)-O-(苯基氨基羰基)-P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸[“二苯基氨基甲酸酯Up4U”]和三-2′(3′)-O-(苯基氨基羰基)-P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸[“三苯基氨基甲酸酯Up4U”]在無(wú)水DMF(2ml)中溶解P1，P4-二(尿苷5′)′-四磷酸二三丁基改鹽(211mg，0.182mmol；從四鈉鹽通過(guò)用Dowex 50Wx4H+的水溶液處理，然后將質(zhì)子化物質(zhì)與過(guò)量三丁胺反應(yīng)，反萃取并凍干)，加入一份異氰酸苯酯(40微升，3.64mmol)。均勻反應(yīng)混合物在45℃加熱過(guò)夜，此時(shí)TLC(硅膠，50％異丙醇/50％氫氧化銨)表明基本轉(zhuǎn)化成兩種產(chǎn)物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑，剩余物在水(7mL)和乙酸乙酯(10ml)之間分配。分離層，用乙酸乙酯(各10ml)再萃取水層2次。從水萃取物中除去水，剩余的油凍干過(guò)夜。獲得的固體在水(3ml)中重建，重復(fù)將產(chǎn)物注射入半制備級(jí)HPLC柱(Alltech核苷酸/核苷C18，7微米，10×250mm，梯度為0.1M乙酸銨-甲醇，經(jīng)過(guò)30分鐘，5ml/分鐘，在260nm監(jiān)測(cè))分離兩種產(chǎn)物。反萃取和凍干得到一苯基氨基甲酸酯(48mg，產(chǎn)率27％)、二苯基氨基甲酸酯(16mg，產(chǎn)率8％)和痕量的三苯基氨基甲酸酯，作為四銨鹽。所有三種產(chǎn)物是相應(yīng)的2′/3′區(qū)域異構(gòu)體的混合物。
一苯基氨基甲酸酯1H NMR(D2O，300MHz)δ4.08-4.65(m，9H)，5.14(d，1H)，5.75-5.94(m，4H)，7.01(t，1H)，7.22(m，4H)，7.76(m，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.17(m，2P)，-21.81(m，2P)。
二苯基氨基甲酸酯1H NMR(D2O，300MHz)δ4.13-4.43(m，8H)，5.12(m，2H)，5.84(m，4H)，7.01(m，2H)，7.21(m，8H)，7.75(dd，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.19(m，2P)，-21.65(m，2P)。
三苯基氨基甲酸酯1H NMR(D2O，300MHz)δ4.29(m，7H)，4.5.10(m，1H)，5.27(m，2H)，5.87(m，4H)，7.09(m，15H)，7.76(d，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.30(m，2P)，-21.73(m，2P)。
實(shí)施例3P1，P4-四(2′(3′)-O-(苯基氨基羰基)-二(尿苷5′-)四磷酸[四苯基氨基甲酸酯Up4U”]根據(jù)實(shí)施例2的方法制備了該衍生物。用16當(dāng)量異氰酸苯酯(300微升，2.76mmol)的DMF溶液處理P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸二三丁基銨鹽(200mg，0.172mmo)，35℃攪拌過(guò)夜。蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物水溶液除去過(guò)量試劑。如前所述制備級(jí)HPLC后，獲得93mg(30％產(chǎn)率)的四苯基氨基甲酸酯。
四苯基氨基甲酸酯1H NMR(D2O，300MHz)δ7.75(d，2H)，7.11(m，16H)，6.94(m，4H)，5.95(d，2H)，5.80(d，2H)，5.32(m，2H)，5.23(m，2H)，4.42(m，2H)，4.25(m，2H)，4.16(m，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.30(m，2P)，-22.32(m，2P)。
實(shí)施例42′，3′-(芐基)亞甲基二氧基-P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸[“一2′/3′芐基縮醛Up4U”]和P1，P4-二-(2′，3′-((芐基)亞甲基二氧基)二(尿苷5′-)四磷酸[“二2′/3′芐基縮醛Up4U”]在98％甲酸中溶解P1，P4-二(尿苷5′)′-四磷酸四鈉鹽(290mg，0.332mmol)，加入苯基乙醛二甲基縮醛(110微升，0.662mmol)。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物3天，此時(shí)TLC(硅膠，50％異丙醇/50％氫氧化銨)和HPLC(C18)表明良好轉(zhuǎn)化成兩種極性較小的產(chǎn)物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去甲酸，剩余物在0.7M碳酸氫銨(15mL)和乙酸丁酯(15ml)之間分配。分離層，用另一份乙酸丁酯(10ml)洗滌水層。反萃取水層，剩余物凍干過(guò)夜。將粗產(chǎn)物溶于水(5ml)，通過(guò)制備級(jí)HPLC柱(Waters Novapak C18，6微米，25×100mm，梯度為0.1M乙酸銨-甲醇，經(jīng)過(guò)30分鐘，30ml/分鐘，在260nm監(jiān)測(cè))分離組分。單縮醛的產(chǎn)率是88mg(28％)，二縮醛是60mg(17％)都是四銨鹽。
單縮醛1H NMR(D2O，300MHz)δ2.99(d，2H)，4.01-4.32(m，8H)，4.77(m，2H)，5.33(m，2H)，5.74(d，1H)，5.81(m，2H)，7.21(m，5H)，7.64(d，1H)，7.79(d，1H).31P NMR (D2O，121.47 MHz)δ-10.18(m，1P)，-10.78(m，1P)，-22.00(m，2P)。
二縮醛1H NMR(D2O，300MHz)δ2.98(d，4H)，3.99(m，4H)，4.27(m，2H)，5.27(m，2H)，5.36(m，2H)，5.73(d，J＝8.1Hz，2H)，7.21(m，10H)，7.61(d，J＝8.1Hz，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.57(m，2P)，-21.81(m，2P)。
實(shí)施例52′，3′-((芐基)亞甲基二氧基)P1，P3-尿苷5′-)三磷酸[“2′3′苯基乙醛縮醛Up3U”]和P1，P3-二-(2′，3′-((芐基)亞甲基二氧基)尿苷5′-)三磷酸[“二2′3′苯基乙醛縮醛Up3U”]在98％甲酸中溶解P1，P3-二(尿苷5′)′-三磷酸三鈉鹽(100mg，0.129mmol)，加入苯基乙醛二甲基縮醛(64微升，0.386mmol)。在室溫下攪拌過(guò)夜后，除去甲酸，剩余物在1M碳酸氫鈉和乙酸乙酯之間分配。除去有機(jī)層，用制備級(jí)HPLC柱如前所述純化產(chǎn)物。凍干后，獲得40mg(36％)單縮醛和24mg(19％)二縮醛。
單縮醛1H NMR(D2O，300MHz)δ7.7s(d，2H)，7.54(d，2H)，7.16(s，5H)，5.70(m，3H)，5.31(s，1H)，5.23(s，1H)，4.66(m，2H)，4.10(m，8H)，2.93(d，2H).31PNMR(D2O，121.47MHz)δ-10.30(m，1P)，10.81(m，1P)，-21.99(m，1P)。
二縮醛1H NMR(D2O，300MHz)δ7.51(d，2H)，7.15(m，10H)，5.65(d，2H)，5.31(d，2H)，5.20(t，2H)，4.63(m，2H)，4.13(m，2H)，3.88(m，4H)，2.90(d，4H).31PNMR(D2O，121.47MHz)δ-10.75(m，2P)，-21.97(m，1P)。
實(shí)施例6P1-2′，3′-((芐基)亞甲基二氧)(尿苷5′-)P4-(脫氧胞苷5′-)四磷酸[“2′3′苯基乙醛縮醛Up4dC”]在98％甲酸(1ml)中溶解P1-(尿苷5′-)P4-(脫氧胞苷5′-)四磷酸四鈉鹽(100mg，0.16mmol)，加入苯基乙醛二甲基縮醛(57微升，0.384mmol)。攪拌過(guò)夜后，除去甲酸，剩余物在1M碳酸氫鈉和乙酸乙酯之間分配。分離層后，用制各級(jí)HPLC柱如前所述純化產(chǎn)物。產(chǎn)率40mg(36％)。該產(chǎn)品易于用實(shí)施例9-13所述的方法隨后修飾脫氧胞苷堿基，產(chǎn)生在本發(fā)明范圍內(nèi)的親脂性雙功能分子。
單縮醛1H NMR(D2O，300MHz)δ7.98(d，1H)，7.62(d，1H)，7.21(m，5H)，6.11(m，2H)，5.74(d，1H)，5.39(d，1H)，5.31(t，1H)，4.77(m，2H)，4.45(m，1H)，4.32(m，1H)，4.03(m，5H)，2.99(d，2H)，2.29和2.21(M，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.15(m，1P)，-10.68(m，1P)，-21.98(m，2P)。
實(shí)施例73′-O-(苯基氨基羰基)-2′-脫氧(尿苷5′-)-單磷酸將脫氧尿苷5′-單磷酸四丁基銨鹽(135mg，0.274mmol；用Dowex 50Wx4H+處理，然后攪拌得到的中性物質(zhì)和過(guò)量三丁胺，反萃取和凍干)溶于無(wú)水DMF(1ml)。加入異氰酸苯酯(60微升，0.547mmol)，并45℃加熱過(guò)夜，此時(shí)TLC(硅膠，50％異丙醇/50％氫氧化銨)和HPLC(C18)表明基本轉(zhuǎn)化成極性較小的產(chǎn)物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去DMF，油狀殘余物在水(10ml)和乙酸乙酯(10ml)之間分配。分離層，重新用乙酸乙酯(2×10ml)洗滌水層。除去水并將剩余物溶于水(2ml)。通過(guò)重復(fù)注射入半制備級(jí)HPLC(Alltech核苷酸/核苷C18，7微米，10×250mm，0.1M乙酸銨到甲醇梯度，經(jīng)30分鐘，5ml/分鐘，260nm監(jiān)測(cè))分離產(chǎn)物。產(chǎn)量為67mg二銨鹽(53％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ2.21(m，2H)，3.84(s，2H)，4.13(s，1H)，5.08(d，1H)，5.63(d，1H)，6.06(t，1H)，6.89(br.t，1H)，7.10(m，4H)，7.72(d，1H)。
31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-2.31(s)。
P1-(3′-O-(苯基氨基羰基)-2′-脫氧尿苷5′-)P4-(尿苷5′-)四磷酸在室溫下用1.5當(dāng)量二環(huán)己基碳二亞胺的DMF溶液處理尿苷5′-三磷酸二三丁基銨鹽(從三鈉鹽通過(guò)用Dowex 50Wx4H+處理，然后將得到的中性物質(zhì)與過(guò)量三丁胺一起攪拌，反萃取并凍干制備)。濾去二環(huán)己基脲，用3′-O-(苯基氨基羰基)-2′-脫氧(尿苷5′)單磷酸(單三丁基銨鹽形式)處理得到的尿苷5′-環(huán)三磷酸。45℃攪拌反應(yīng)混合物數(shù)日，除去溶劑。如上所述用制備級(jí)HPLC分離產(chǎn)物。
實(shí)施例82′(3′)-(2-甲基氨基)苯甲?；?P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸(“MANT Up4U”)和P1，P4-二-(2′(3′)-(2-甲基氨基)苯甲?；蜍?′-)四磷酸(“二MANT Up4U”)將P1，P4-二(尿苷5′-)四磷酸四鈉鹽(800mg，0.93mmol)溶于水(5ml)，通過(guò)加入固態(tài)碳酸氫鈉將pH調(diào)節(jié)到7.6。加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF，5ml)，然后加入N-甲基靛紅酸酐(231mg，1.3mmol)，50℃加熱懸液2.5小時(shí)。TLC(硅膠，50％異丙醇，50％氫氧化銨)表明此時(shí)不進(jìn)行反應(yīng)，因此加入另一份N-甲基靛紅酸酐(100mg，0.56mmol)，反應(yīng)物再加熱一小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去DMF，并將剩余物溶于少量水，加到DEAE Sephadex A-25柱(3×60cm)上。用水到1M碳酸氫銨的分布梯度洗脫柱，用設(shè)定在254nm的UV檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)洗脫液。洗脫出的兩種產(chǎn)物分別收集，并從各自除去溶劑，剩余物凍干過(guò)夜。1H NMR表明洗脫的第一種產(chǎn)物是單?；衔铮笳呤嵌；苌?，而且它們都是在2′或3′羥基酰化的混合物，但在同一糖上沒(méi)有兩個(gè)氨基甲酸酯。一氨基苯甲?；a(chǎn)物的產(chǎn)率是150mg(16％)；二氨基苯甲?；衔锏漠a(chǎn)量是91mg(8.7％)。
一氨基苯甲?；苌?H NMR(D2O，300MHz)δ2.70(s，3H)，4.09-4.55(m，9H)，5.34(m，1H)，5.71(m，2H)，5.83(dd，1H)，6.01(m，1H)，6.57(m，1H)，6.65(m，1H)，7.25(t，1H)，7.72(d，2H)，7.81(m，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.20(m，2P)，-21.83(m，2P)。
二氨基苯甲?；苌?H NMR(D2O，300MHz)δ2.69(s，6H)，4.15-4.51(m，8H)，5.27(m，2H)，5.86(m，4H)，6.60(m，4H)，7.30(m，2H)，7.79(m，4H).31PNMR(D2O，121.47MHz)δ-10.16(m，2P)，-21.76(m，2P)。
實(shí)施例9P1-(4-N-(4-甲氧基苯基)氨基羰基胞苷-5′-)-P4-(尿苷5′-)四磷酸將P1-(胞苷5′)-P4-(尿苷5′-)四磷酸二三丁基銨鹽(50mg，0.043mmol；用Dowex50Wx4H+的水溶液處理四銨鹽，然后混合質(zhì)子化物質(zhì)和過(guò)量三丁胺的甲醇溶液，反萃取和凍干制備)溶于無(wú)水DMF(1ml)，一次性加入三丁胺(10微升，0.43mmol)和異氰酸對(duì)甲氧基苯酯(8.4微升，0.648mmol)。均勻反應(yīng)混合物在35℃加熱過(guò)夜，此時(shí)TLC(硅膠，50％異丙醇/50％氫氧化銨)和HPLC(C18)表明基本轉(zhuǎn)化成單一產(chǎn)物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑，剩余物溶于水(1ml)。通過(guò)重復(fù)注射入半制備級(jí)HPLC(Alltech核苷酸/核苷C18，7微米，10×250mm，0.1M乙酸銨到甲醇梯度，經(jīng)30分鐘，5ml/分鐘，260nm監(jiān)測(cè))分離產(chǎn)物。反萃取和凍干得到作為四銨鹽的對(duì)甲氧基苯基脲(24mg，55％產(chǎn)率)。
獲得的產(chǎn)物可根據(jù)上述方法(例如實(shí)施例2-6)在2′和/或3′羥基上衍生化。
1H NMR(D2O，300MHz)δ3.59(s，3H)，4.01-4.20(m，10H)，5.68(m，3H)，6.19(d，1H)，6.71(d，2H)，7.18(d，2H)，7.67(d，1H)，8.06(d，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.13(m，2P)，-21.76(m，2P)。
實(shí)施例10P1-((4-溴苯基)亞乙烯基胞苷5′-)-P4-(尿苷5′-)四磷酸將P1-(胞苷5′)-P4(尿苷5′-)四磷酸四鈉鹽(500mg，0.57mmol)溶于水(5ml)，加入2，4′-二溴苯乙酮(792mg，2.85mmol)的DMF(15ml)溶液。40℃加熱混合物過(guò)夜，加入另一份二溴酮(400mg，1.44mmol)的DMF(5ml)溶液。再加熱反應(yīng)物5小時(shí)，蒸發(fā)除去溶劑。剩余物在水(20ml)和乙酸乙酯(25ml)之間分配并分離層。再用乙酸乙酯(2×15ml)洗滌水層，蒸發(fā)水層至干。剩余物溶于水(5ml)，通過(guò)重復(fù)注射入半制各級(jí)HPLC(條件見(jiàn)實(shí)施例6)分離產(chǎn)物。純亞乙烯化合物的產(chǎn)量為80mg(13.5％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ4.06(m，8H)，4.36(m，2H)，5.64(dd，2H)，6.07(d，1H)，6.74(d，1H)，7.45(d，2H)，7.54(d，2H)，7.59(d，1H)，7.63(d，1H)，7.93(s，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.09(m，2P)，-21.59(m，2P)。
實(shí)施例11P1-((4-溴苯基)亞乙烯基-2′-脫氧胞苷5′-)-P4(尿苷5′-)四磷酸根據(jù)實(shí)施例10的通用方法，用100mg P1-(2′-脫氧胞苷5′)-P4-(尿苷5′-)四磷酸四鈉鹽和2，4′-二溴苯乙酮制備實(shí)施例11的產(chǎn)物。產(chǎn)率＝35mg(30％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ2.31(m，2H)，4.03(m，8H)，5.60(dd，2H)，6.41(t，1H)，6.73(d，1H)，7.53(m，5H)，7.65(d，1H)，7.93(s，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.11(m，2P)，-21.58(m，2P)。
實(shí)施例12P1，P4-二((4-溴苯基)亞乙烯基胞苷5′-)-四磷酸根據(jù)實(shí)施例10的通用方法，用50mgP1，P4-二(胞苷5′-)四磷酸四鈉鹽和2，4′-二溴苯乙酮制備實(shí)施例12的產(chǎn)物。產(chǎn)率＝20mg(29％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ4.24(m，10H)，5.98(d，2H)，6.39(d，2H)，7.14(m，8H)，7.45(m，4H).).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.13(m，2P)，-21.68(m，2P)。
實(shí)施例13P1-((4-苯基苯基)亞乙烯基胞苷5′-)-P4-(胞苷5′-)四磷酸根據(jù)實(shí)施例10的通用方法，用50mg P1，P4-二(胞苷5′-)四磷酸四鈉鹽和2-溴-4′-苯基苯乙酮制備實(shí)施例13的產(chǎn)物。產(chǎn)率＝15mg(13％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ4.10(m，10H)，5.48(d，1H)，5.87(m，2H)，6.68(d，1H)，7.20(m，3H)，7.36(m，6H)，7.68(m，3H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ-10.08(m，2P)，-21.78(m，2P)。
可根據(jù)實(shí)施例1-8的方法進(jìn)一步衍生化實(shí)施例11-13的產(chǎn)物，得到在本發(fā)明范圍內(nèi)的雙功能分子。
實(shí)施例142’，3’-苯基乙醛縮醛腺苷5’-單磷酸將腺苷5’-單磷酸的游離酸(10.0g，28.8mmol)溶于三氟乙酸(50mL)中，加入苯基乙醛二甲基乙縮醛(18.50mL，121mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物3小時(shí)，然后蒸發(fā)三氟乙酸，在1M碳酸氫鈉(80mL)和乙酸乙酯(40mL)中分配剩余物。分離各層，以C18制備型HPLC從水層中分離產(chǎn)物。產(chǎn)率＝7.50g(59％)。如下所述將由此獲得的銨鹽通過(guò)用稍許過(guò)量的三丁胺的水性N，N-二甲基甲酰胺溶液處理而轉(zhuǎn)化為單-三丁基銨鹽，然后蒸發(fā)和干燥。
1H NMR(D2O，300MHz)δ3.06(d，2H)，3.86(m，2H)，4.39(m，1H)，4.91(m，1H)，5.18(m，1H)，5.36(t，1H)，5.63(d，1H)，7.23(m，5H)，8.09(s，1H)，8.20(s，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ2.17(s).
實(shí)施例152’，3’-肉桂基縮醛腺苷5’-單磷酸將腺苷5’-單磷酸的游離酸(1.0g，2.88mmol)溶于98％甲酸(5mL)，加入肉桂醛(1.14g，8.65mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物3小時(shí)，然后蒸發(fā)甲酸，在1M碳酸氫鈉(25mL)和乙酸乙酯(20mL)中分配剩余物。分離各層，以制備型HPLC從水層中分離產(chǎn)物。產(chǎn)率＝0.202g(15％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ3.97(m，2H)，4.50(m，1H)，5.04(m，1H)，5.29(m，1H)，5.65(d，0.4H)，5.86(d，0.6H)，6.24(m，2H)，6.87(dd，1H)，7.27(m，3H)，7.43(m，2H)，8.12(d，1H)，8.28(d，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ1.42(d).
實(shí)施例162’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-苯脲腺苷5’-單磷酸(化合物22)
將2’，3’-苯基乙醛縮醛腺苷5’-單磷酸三丁基銨鹽(按照實(shí)施例14制備，1.0g，2.15mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10mL)，加入異氰酸苯酯(1.17g，10.72mmol)。將反應(yīng)物在35℃加熱4小時(shí)，然后去除溶劑，在1M碳酸氫鈉(30mL)和乙酸乙酯(25mL)中分配剩余物。分離各層，以制備型HPLC從水層中分離產(chǎn)物。產(chǎn)率＝0.85g(68％)。
1H NMR(D2O，300MHz)δ2.97(d，2H)，3.81(m，2H)，4.31(m，1H)，4.78(m，1H)，4.98(m，1H)，5.23(t，1H)，5.63(d，1H)，6.74(m，1H)，6.96(m，4H)，7.19(m，5)，8.12(s，1H)，8.30(s，1H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ1.19(s).
實(shí)施例172’，3’-肉桂基縮醛-6N-乙脲腺苷5'-單磷酸(化合物27)按照實(shí)施例16制備化合物27，以2’3’肉桂基縮醛腺苷5’-單磷酸(實(shí)施例15)起始，并用異氰酸乙酯代替異氰酸苯酯。產(chǎn)率＝65％。
1H NMR(D2O，300MHz)δ1.07(t，3H)，3.21(q，2H)，3.93(m，2H)，4.45(m，1H)，4.99(m，1H)，5.28(m，1H)，5.54(d，0.3H)，5.70(d，0.7H)，5.95(m，1H)，6.14(m，1H)，6.61(dd，1H)，7.14(m，5H)，8.29(m，2H).31P NMR(D2O，121.47MHz)δ1.93(d).
實(shí)施例18反式-2’，3’-肉桂基縮醛-6N-乙脲腺苷5’-單磷酸(化合物41)采用HPLC分離包含在化合物27(實(shí)施例17)中的兩種非對(duì)映體，獲得化合物41(反式-2’，3’-肉桂基縮醛-6N-乙脲腺苷5’-單磷酸)。典型地將化合物41轉(zhuǎn)化為二鈉鹽形式以促進(jìn)其從溶液中分離，并由此提高所得干燥粉末的穩(wěn)定性。
HPLC方法色譜柱Phenomenex Synergi Polar RP，4μm，80埃，150x3.0mm；流動(dòng)相0.1M醋酸銨緩沖液(pH＝5)∶乙腈(70∶30)；檢測(cè)UV，254nm；柱溫室溫；流速1.5mL/分鐘；化合物41的保留時(shí)間＝6.4分鐘。
實(shí)施例19反式-2’，3’-肉桂基縮醛-6N-乙脲腺苷5’-單磷酸(化合物41)的NMR數(shù)據(jù)
化學(xué)名磷酸單-{6-[6-(3-乙基-脲基)-嘌呤-9-基]-2-苯乙烯基-四氫-呋喃并[3，4-d][1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-4-基甲基}酯二鈉鹽分子式C22H23N6Na2O8P分子量576.411H NMR(D2O，300MHz)δ1.11(t，3H，J＝7.3Hz)，3.24(q，2H，J＝3.27Hz)，3.90(d，2H)，4.49(m，1H)，4.99(m，1H)，5.07(dd，1H，J＝3.3Hz)，5.32(dd，1H，J＝6.4Hz)，5.79(d，1H，J＝6.6Hz)，6.02(dd，1H，J＝6.6 and 16.0Hz)，6.18(d，1H，J＝3.7Hz)，6.62(d，1H，J＝16.0Hz)，7.14-7.23(m，5H)，8.33(s，1H)，8.47(s，1H).13CNMR(D2O，121MHz)14.2，63.9，80.24，83.54，83.9，87.83，119.23，142.11，149.27，149.34，150.8731PNMR(D2O，75MHz)δ5.168(s)。5mg/mL水溶液的旋光度＝-0.201°(比旋＝-50.4°)實(shí)施例20化合物31-40根據(jù)實(shí)施例15所述，使腺苷5’-單磷酸的游離酸和苯甲醛在三氟乙酸中反應(yīng)，制備2’，3’-苯基縮醛腺苷5’-單磷酸；產(chǎn)率為82％。
將2’，3’-苯基縮醛腺苷5’-單磷酸進(jìn)一步加工為化合物36-40。根據(jù)實(shí)施例16的通用方法，使腺苷的6位與異氰酸乙酯發(fā)生?；瘉?lái)制備化合物36。也可用2’，3’-苯基縮醛腺苷5’-單磷酸和適宜的異氰酸酯(分別為丙酯、丁酯、己酯和環(huán)戊酯)的類似反應(yīng)制備化合物37-40。
類似地，如下所述制備化合物31、32、33和35首先使腺苷5’-單磷酸的游離酸和苯基炔丙基醛在甲酸中反應(yīng)(產(chǎn)率為35％)，然后使腺苷的6位與和適宜的異氰酸酯(分別為苯酯、己酯、丁酯或乙酯)發(fā)生?；Ｓ?’，3’-苯基炔丙基縮醛腺苷5’-單磷酸和異氰酸丙酯類似地制備化合物34。
實(shí)施例21血小板聚集分析從健康志愿者中將血液采集入注射器中，所述注射器中含有1/6最終血液體積的抗凝血ACD(65mM檸檬酸、85mM檸檬酸鈉、110mM右旋糖)以用于制備洗出的血小板(WP)，或所述注射器中含有終濃度為10單位/mL肝素或300μM PPACK以用于全血(WB)分析。將收集用于全血分析的血液保持在室溫下，并立即進(jìn)行如下所述的分析。將收集用于WP的血液以180g離心15分鐘，取出上清(富含血小板的血漿)。離心所述富含血小板的血漿，血小板形成塊狀，將其重新懸浮在含有以下物質(zhì)的緩沖液中NaCl(137)、KCl(2.7)、CaCl2(2)、MgCl2(1)、NaH2PO4(3)、葡萄糖(5)、HEPES(10)，pH 7.4的0.2％BSA。重復(fù)離心和洗滌兩次，然后在含有0.25 U三磷酸腺苷雙磷酸酶/mL的上述介質(zhì)中重新懸浮。采用ChronoLog集合度計(jì)(Havertown，PA)的光學(xué)模式(optical mode)測(cè)定血小板聚集。將含有1mg/mL纖維蛋白原的500μl血小板懸液溫?zé)岬?7℃，以1000rpm攪拌。將標(biāo)示濃度的ADP加入到樣品中，監(jiān)測(cè)聚集8分鐘。用同樣的方案研究本發(fā)明所述化合物的效果，除了在加入最大有效濃度的ADP之前，先將抑制劑孵育2-5分鐘。對(duì)于全血聚集，用鹽水1∶1稀釋血液，然后使用集合度計(jì)的阻抗模式以上述相同的方式進(jìn)行聚集。采用了GraphPad軟件包(GraphPad Corp.San Diego，CA)使數(shù)據(jù)與四參數(shù)對(duì)數(shù)方程式擬合，從聚集率和每種測(cè)定所獲得的最大聚集程度來(lái)計(jì)算血小板聚集激動(dòng)劑和抑制劑的效力。
在本申請(qǐng)中將P2Y12拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制能力表示為由最大有效濃度的ADP誘導(dǎo)的聚集的抑制百分比。當(dāng)測(cè)試了很大濃度范圍的P2Y12拮抗劑(通常為1nM-100μM)時(shí)，還獲得IC50值。IC50值表示抑制50％由給定濃度ADP誘導(dǎo)的聚集所需的拮抗劑濃度。
實(shí)施例22不同化合物對(duì)ADP-誘導(dǎo)的聚集的作用對(duì)不同化合物進(jìn)行了它們對(duì)ADP-誘導(dǎo)的聚集的抑制試驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)施例19的方案測(cè)定了IC50；結(jié)果如圖1所示。附圖中的柱狀圖表明了100μM濃度的化合物對(duì)ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集的作用，該數(shù)據(jù)以對(duì)ADP應(yīng)答的抑制％表示。
圖1顯示了各化合物的結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)要命名以及它們的活性。為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，省略了可理解存在的氫。例如，對(duì)于圖中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)，其隱含了嘧啶環(huán)中3-位的氫、核糖3′-位氧上的氫以及核糖2′-位氨基甲酸酯的氮上的氫。此外，如本發(fā)明范圍所揭示，隱含了不以雙鍵形式連接于磷原子的氧可以離子化形式作為帶有抗衡離子的鹽存在，或于氫原子連接。為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，將附圖中的某些結(jié)構(gòu)描述成鹽的形式，但不應(yīng)將其解釋為排除了氫可替代存在的可能性。
在呋喃糖的羥基上不帶有修飾的多種母體化合物——Up4U、Ip4U、Up3U和Cp4U已包括在附圖的最末以說(shuō)明本發(fā)明的用途。然而，這些未經(jīng)修飾的母體化合物不能抑制由ADP-誘導(dǎo)的聚集，不包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例23鈣動(dòng)員分析關(guān)于鈣動(dòng)員分析，將表達(dá)P2Y1、P2Y2和P2Y6的細(xì)胞接種入黑壁/透明底的細(xì)胞培養(yǎng)板中(Corning Inc.，Corning，NY)，接種后48小時(shí)進(jìn)行分析。在分析當(dāng)天，吸棄生長(zhǎng)培養(yǎng)基，更換為含有Fluo-3 AM(2.5μM的終濃度)的分析緩沖液溶液，所述分析緩沖液由以下成分組成(mM)KCl(10.0)、NaCl(118)、CaCl2(2.5)、MgCl2(1.0)、HEPES(20)、葡萄糖(10)，pH7.4。與Fluo-3 AM在25℃共同孵育60分鐘后，清洗細(xì)胞去除染料。用不同濃度的受試化合物處理細(xì)胞，1-2分鐘后再加入最大有效濃度的同源受體(cognate receptor)激動(dòng)劑。通過(guò)用熒光圖像讀板儀(FLIPR，MolecularDevices Corp.，Sunnyvale，CA)測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化，同時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)各孔中應(yīng)答以受試化合物和受體激動(dòng)劑進(jìn)行的細(xì)胞處理的細(xì)胞內(nèi)鈣水平。本分析的結(jié)果示于表1中。
實(shí)施例24不同化合物對(duì)ADP-誘導(dǎo)的聚集和對(duì)P2Y受體激活的作用采用實(shí)施例21中所述的洗出的血小板制備方法，測(cè)試了不同化合物對(duì)ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用。此外，還按照實(shí)施例23所述的鈣動(dòng)員方法，評(píng)估了這些化合物對(duì)P2Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y6受體激活的作用。結(jié)果示于表1中。所有經(jīng)測(cè)試的化合物對(duì)P2Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y6受體均無(wú)應(yīng)答(NR)。數(shù)據(jù)表示為至少兩個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)的平均值。
表1

實(shí)施例25化合物對(duì)體內(nèi)血小板聚集的效果為了評(píng)估這些化合物在體內(nèi)抑制血小板聚集的能力，進(jìn)行了與R.G.Humphries等(Br.J.Pharmacol.1151110-1116，1995)的方法相似的實(shí)驗(yàn)方案。
手術(shù)準(zhǔn)備和儀器麻醉雄性斯普拉—道來(lái)(Sprague-Dawley)大鼠。用加熱燈將體溫維持在37℃±5℃。動(dòng)物自主呼吸，并進(jìn)行氣管切開以確保開放氣道。將含有肝素化的鹽水的套管插入左側(cè)股動(dòng)脈，并與傳感器連接，以記錄血壓和心跳速率。將含有非肝素化鹽水的套管插入左總頸動(dòng)脈和左頸靜脈，分別用于抽取動(dòng)脈血樣并靜脈施用化合物。
實(shí)驗(yàn)方案各化合物或載體通過(guò)輸液施給各動(dòng)物。在第一次輸液前，每次輸液結(jié)束時(shí)和最后一次輸液停止后20分鐘立即抽取血樣，以測(cè)定體外血小板聚集。采樣結(jié)束后，立即以一式兩份在0.5ml用鹽水1∶1稀釋的血樣中測(cè)定ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集，并在37℃孵育4分鐘。對(duì)于該階段的最后一分鐘，將比色杯轉(zhuǎn)移到聚集度計(jì)中，900rpm攪拌樣品。以20微升體積加入ADP(3lμM)，記錄聚集反應(yīng)。
實(shí)施例26麻醉的大鼠中血栓形成的抑制為了評(píng)估這些化合物對(duì)于體內(nèi)血栓形成的作用，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)方案用戊巴比妥鈉(70mg/kg腹膜內(nèi))麻醉大鼠(CD-1；雄性；約350g；Charles River，Raleigh，NC)。腹部剃毛，在側(cè)尾靜脈中插入22口徑靜脈內(nèi)導(dǎo)管。進(jìn)行中線切割，將小腸包扎在浸漬鹽水的紗布中，放置成可接觸腹主動(dòng)脈。小心分離下腔靜脈和腹主動(dòng)脈，解剖一段(約1cm)腹主動(dòng)脈(遠(yuǎn)離腎動(dòng)脈，靠近分叉)。將該段主動(dòng)脈中的所有分枝用4-0絲縫合線連接。在動(dòng)脈上安裝與Transonic流量表連接的2.5mm直徑流量探頭，記錄基線(狹窄前)流量。用兩個(gè)夾子夾住動(dòng)脈，將血管直徑減少約80％。記錄第二基線流量(狹窄后)，測(cè)試充血反應(yīng)。然后用化合物或鹽水通過(guò)尾靜脈導(dǎo)管靜脈內(nèi)處理動(dòng)物。用止血鉗重復(fù)外部壓縮血管后5分鐘引起血栓。受傷2分鐘后，重復(fù)壓縮血管，開始10分鐘的流量監(jiān)測(cè)期。連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物受傷后的最初10分鐘的最小值。20分鐘(受傷后)后，重復(fù)流量測(cè)定，使動(dòng)物安樂(lè)死。收集包括受傷區(qū)段的動(dòng)脈區(qū)段，并置于10％福爾馬林中用于可能的組織學(xué)評(píng)估。
實(shí)施例27在麻醉的犬中對(duì)血栓形成的抑制為了評(píng)估這些化合物對(duì)于體內(nèi)動(dòng)態(tài)血栓形成的作用，進(jìn)行了與J.L.Romson等(Thromb.Res.17841-853，1980)的方法相似的下列實(shí)驗(yàn)方案。
手術(shù)準(zhǔn)備和儀器簡(jiǎn)單說(shuō)，麻醉為特定目的而飼養(yǎng)的犬，插管并通室內(nèi)空氣。在第15根肋骨空間左側(cè)切開胸廓，暴露心臟，并用心臟吊架懸掛。通過(guò)鈍頭分離分離左冠狀動(dòng)脈回旋支(LCCA)的2-3cm區(qū)段。動(dòng)脈從近端到遠(yuǎn)端裝有流量探頭、刺激電極和Goldblatt夾。流量探頭監(jiān)測(cè)平均和階段LCCA血流速度。刺激電極和它在LCCA中的位置和誘導(dǎo)阻塞性冠狀動(dòng)脈血栓的方法如先前所述(J.K.Mickelson等，Circulation 81617-627，1990；R.J.Shebuski等，Circulation 82169-177，1990；J.F.Tschopp等，Coron.Artery Dis.4809-817，1993)。
實(shí)驗(yàn)方案隨即對(duì)狗進(jìn)行4種處理方案之一(每處理組n＝6)，其中對(duì)照組靜脈內(nèi)接受鹽水，三個(gè)藥物處理組靜脈內(nèi)施用化合物。在手術(shù)干預(yù)穩(wěn)定化后，犬接受鹽水或化合物。約30分鐘后，將陽(yáng)極電流施加到LCCAl80分鐘。記錄在形成阻塞性血栓前循環(huán)流動(dòng)變化(CFV)的數(shù)量和頻率。這些循環(huán)現(xiàn)象是由于血小板聚集在狹窄的管腔中形成的血小板血栓導(dǎo)致的(J.D.Folts等，Circulation 54365-370，1976；Bush等，Circulation 691161-l170，1984)。LCCA中的0流動(dòng)最少30分鐘表明缺乏抗血栓形成效力(L.G.Frederick等，Circulation 93129-134，1996)。
實(shí)施例28小鼠中的血小板聚集劑量依賴性抑制作用為了評(píng)估本發(fā)明化合物對(duì)體內(nèi)血小板聚集的作用，進(jìn)行了如Leon等(Circulation 103718-723，2001)所述的類似試驗(yàn)方案。
將鹽水或不同劑量(通常為1-100μg/kg)的反式-2’，3’-肉桂基縮醛-6N-乙脲腺苷5′-單磷酸二鈉鹽(化合物41，也稱INS50589)靜脈注射入麻醉小鼠中。給予化合物5分鐘后，從各動(dòng)物獲取700μL血液。合并兩只動(dòng)物的血液，立即進(jìn)行處理，獲得富含血小板的血漿，以用于對(duì)由1和5μM ADP激發(fā)的血小板聚集的評(píng)估。采用實(shí)施例21所述的光學(xué)集合度計(jì)測(cè)定血小板聚集。本文所述且用于該離體模型測(cè)試的P2Y12受體拮抗劑對(duì)血小板聚集產(chǎn)生了劑量依賴性抑制作用。
實(shí)施例29P2Y12受體拮抗劑對(duì)小鼠血小板聚集的可逆抑制作用本發(fā)明所述化合物的一個(gè)重要特征在于其對(duì)血小板聚集的可逆抑制性質(zhì)。在對(duì)所選化合物對(duì)體內(nèi)血小板聚集抑制的動(dòng)力學(xué)研究中也使用了實(shí)施例28所述的模型系統(tǒng)。簡(jiǎn)而言之，靜脈內(nèi)給予最大有效濃度的受試化合物，在給予反式-2’，3’-肉桂基縮醛-6N-乙脲腺苷5’-單磷酸二鈉鹽(化合物41，也稱INS50589)之前以及之后的不同時(shí)間(通常為0、1、5、15和30分鐘)獲取血樣。立即對(duì)血樣進(jìn)行處理，如實(shí)施例28所述評(píng)估由1μM和5μM ADP誘導(dǎo)的聚集。給予受試化合物5分鐘后觀察到對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的完全抑制，而30分鐘內(nèi)對(duì)ADP的聚集反應(yīng)回復(fù)到接近對(duì)照動(dòng)物中觀察到的值，這表明受試化合物在小鼠中的作用是可逆的(圖2)。
實(shí)施例30P2Y12受體拮抗劑處理對(duì)小鼠中由血栓形成誘導(dǎo)的死亡的預(yù)防作用用載體(對(duì)照)或單劑靜脈內(nèi)給予的受試化合物(通常為10-25mg/kg)處理10只麻醉的小鼠。處理后5分鐘，將0.3mg/kg膠原和60μg/kg腎上腺素的混合物注射入動(dòng)物。圖3中以卡普蘭-邁耶曲線顯示了用鹽水或25mg/kg的受試化合物(INS50589)預(yù)處理的動(dòng)物，在給予膠原和腎上腺素后的存活時(shí)間。90％用載體預(yù)處理的動(dòng)物在靜脈注射膠原和腎上腺素后6分鐘內(nèi)死亡。相反，僅觀察到20％用受試化合物預(yù)處理的動(dòng)物因全身性血管內(nèi)血栓栓塞而死亡。這些結(jié)果證明了體內(nèi)給予本發(fā)明所述化合物的顯著抗凝血作用。
實(shí)施例31給予狗P2Y12拮抗劑對(duì)血小板聚集的抑制作用在研究前兩周，將頸靜脈導(dǎo)管和血管通孔植入小獵犬(beagle dog)。給4只狗(每種性別2只)的組穿上護(hù)套(jacket)，連接到用于給藥的可走動(dòng)輸液泵。
在研究當(dāng)天，以3mL/kg/h的速率，用不同濃度(通常為0.1-1.5mg/kg/h)的測(cè)試化合物連續(xù)輸液90分鐘對(duì)狗進(jìn)行處理。在開始輸液前約30分鐘和15分鐘(劑量前樣品)、各輸液階段中的不同時(shí)間(通常為10、30、60和90分鐘)以及輸液終止后(通常為5、10、20、30、40、60、120和240分鐘以及18、20、22和24小時(shí))，從頭部靜脈導(dǎo)管取血用于離體全血血小板聚集分析和/或用于通過(guò)生物檢測(cè)測(cè)定受試化合物的血漿水平。用如實(shí)施例21中所述的CronoLog集合度計(jì)的阻抗模式評(píng)估血小板聚集，在連接有Agilent 1100系列液相色譜儀的API 4000 LC/MS/MS系統(tǒng)上分析受試化合物的血漿水平。
如圖4所示，連續(xù)靜脈給予化合物41(INS50589)對(duì)血小板聚集產(chǎn)生了劑量依賴性抑制作用。在濃度為0.3mg/kg/h時(shí)，觀察到了最大抑制效果。
還研究了由受試化合物引起的對(duì)血小板聚集的抑制的動(dòng)力學(xué)和可逆性。如圖5A所示，受試化合物的藥效學(xué)效果在30分鐘時(shí)達(dá)到穩(wěn)態(tài)，輸液終止后血小板聚集抑制迅速逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明受試化合物可在起始連續(xù)靜脈輸液后數(shù)分鐘內(nèi)迅速抑制血小板聚集，而在終止輸液后一小時(shí)內(nèi)可幾乎完全恢復(fù)血小板聚集。
給予受試化合物的藥理學(xué)作用與所述化合物的血漿水平密切相關(guān)。受試化合物的總血漿濃度在30-60分鐘達(dá)到穩(wěn)態(tài)，而在停止給予所述化合物后迅速降低。如圖5B所示，輸液后的受試化合物單室模型分析顯示所述化合物以約7分鐘的估計(jì)半衰期從血漿中清除。
綜上所述，化合物41(INS50589)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)與使得對(duì)血小板功能進(jìn)行快速控制和容易逆轉(zhuǎn)的快速起始和消除作用是一致的。
雖然已參考目前優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，應(yīng)理解的是可不脫離本發(fā)明的范圍而作出不同的改變。
權(quán)利要求
1.式Ib-2的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物；式Ib-2 其中R18是苯基、芐基或苯乙烯基；R19是C2-C6烷基；C3-C6環(huán)烷基；在烷基部分含有1-2個(gè)碳原子，在環(huán)烷基部分含有3-6個(gè)碳的烷基環(huán)烷基；苯基；它們是取代或未取代的。
2.如如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R19是乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或苯基。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物1，所述化合物為2’3’苯基乙醛縮醛-6-N-苯脲AMP；2’3’苯基乙醛縮醛-6-N-正己脲AMP；2’3’苯基乙醛縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’苯基乙醛縮醛-6-N-環(huán)戊脲AMP；2’3’肉桂基縮醛-6-N-正己脲AMP；2’3’肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’肉桂基縮醛-6-N-苯脲AMP；2’3’肉桂基縮醛-6-N-正丙脲AMP；2’3’肉桂基縮醛-6-N-正丁脲AMP；2’3’苯基炔丙基縮醛-6-N-苯脲AMP；2’3’苯基炔丙基縮醛-6-N-正己脲AMP；2’3’苯基炔丙基縮醛-6-N-正丁脲AMP；2’3’苯基炔丙基縮醛-6-N-正丙脲AMP；2’3’苯基炔丙基縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’苯甲醛縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’苯甲醛縮醛-6-N-正丙脲AMP；2’3’苯甲醛縮醛-6-N-正丁脲AMP；2’3’苯甲醛縮醛-6-N-正己脲AMP；2’3’苯甲醛縮醛-6-N-環(huán)戊脲AMP；2’3’-(反式)肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’-(反式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’-(順式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，所述化合物為2’3’-(反式)肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’-(反式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP；或2’3’-(順式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP。
5.式Ia-2的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物；式Ia-2 其中R18和R18′獨(dú)立地為苯基、芐基或苯乙烯基；和R19和R19′獨(dú)立地為C2-C6烷基；C3-C6環(huán)烷基；在烷基部分包含1-2個(gè)碳原子、在環(huán)烷基部分包含3-6個(gè)碳的烷基環(huán)烷基；苯基；它們可被取代或未被取代。
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，所述R19和R19’獨(dú)立地為乙基、丙基、丁基、環(huán)丙基、環(huán)丙基甲基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或苯基。
7.如權(quán)利要求5或6所述的化合物，其特征在于，R18和R18′、R19和R19′為相同的對(duì)。
8.如權(quán)利要求5所述的化合物，所述化合物為P1，P2-二-(2’，3’-肉桂基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸、P1，P2-二-(2’，3’-苯基炔丙基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸、P1，P2-二-(2’，3’-苯基乙醛縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸或P1，P2-二-(2’，3’-苯基縮醛-6-N-乙脲腺苷5’-)二磷酸。
9.一種藥物制劑，所述藥物制劑包含藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物制劑，其特征在于，所述化合物為2’3’-(反式)肉桂基縮醛-6-N-乙脲AMP；2’3’-(反式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP；或2’3’-(順式)苯基縮醛-6-N-乙脲AMP。
11.一種預(yù)防或治療與血小板聚集和/或血小板活化有關(guān)的疾病或病況的方法，所述方法包括給予對(duì)象權(quán)利要求9或10所述的藥物制劑，其中所述化合物有效地結(jié)合于血小板上的P2Y12受體并抑制ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述化合物可逆地抑制ADP-誘導(dǎo)的血小板聚集。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物是與其它抗血小板和/或抗凝血藥物聯(lián)合給藥的。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述與血小板聚集有關(guān)的疾病或病況是特征如下的病癥或過(guò)程血栓形成、動(dòng)脈硬化疾病的原發(fā)性動(dòng)脈血栓并發(fā)癥、動(dòng)脈粥樣硬化疾病干預(yù)的血栓并發(fā)癥、手術(shù)或機(jī)械損傷的血栓并發(fā)癥、機(jī)械性誘導(dǎo)的血小板活化、分流堵塞、血管損傷和炎癥繼發(fā)性的血栓形成、彌散性血栓/血小板消耗性成分的適應(yīng)癥、靜脈血栓形成、冠狀動(dòng)脈血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化的病理作用、血液和血產(chǎn)品在儲(chǔ)藏過(guò)程中的血小板聚集和凝塊形成、超聚集性的慢性或急性狀態(tài)、動(dòng)脈或靜脈在溶纖維蛋白治療后的重新阻塞、與體外循環(huán)有關(guān)的血小板粘附、與溶栓治療有關(guān)的血栓并發(fā)癥、與冠狀和其它血管成形術(shù)有關(guān)的血栓并發(fā)癥、或與冠狀動(dòng)脈分流術(shù)有關(guān)的血栓并發(fā)癥。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述與血栓形成有關(guān)的病癥或過(guò)程是不穩(wěn)定性心絞痛、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)或心肌梗塞；所述動(dòng)脈硬化的原發(fā)性動(dòng)脈血栓并發(fā)癥是血栓性中風(fēng)、周圍血管疾病或沒(méi)有血栓溶解的心肌梗塞；所述動(dòng)脈粥樣硬化疾病干預(yù)的血栓并發(fā)癥是血管成形術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、支架放置、冠狀或其它血管移植手術(shù)；所述手術(shù)或機(jī)械損傷的血栓并發(fā)癥是手術(shù)或偶然創(chuàng)傷后的組織補(bǔ)救，重建性手術(shù)包括皮瓣或還原性手術(shù)；所述機(jī)械性誘導(dǎo)的血小板活化是由導(dǎo)致微血栓栓塞的心肺分流術(shù)和血制品儲(chǔ)藏引起的；所述分流堵塞是腎透析和血漿置換；所述血管損傷和炎癥繼發(fā)性的血栓形成是血管炎、動(dòng)脈炎、腎小球腎炎或器官移植排斥；所述彌散性血栓/血小板消耗性成分的適應(yīng)癥是播散性血管內(nèi)凝結(jié)、血栓性血小板減少性紫癜、溶血性尿毒癥綜合征、肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥或先兆子癇/子癇；所述靜脈血栓形成是深靜脈血栓、靜脈栓塞疾病、血液學(xué)病況或偏頭痛；和所述冠狀動(dòng)脈血栓形成是與不穩(wěn)定性心絞痛、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)或急性心肌梗塞有關(guān)。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)脈硬化和動(dòng)脈粥樣硬化的所述病理學(xué)作用是動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死、慢性穩(wěn)定性心絞痛、不穩(wěn)定性心絞痛、短暫性局部缺血發(fā)作、中風(fēng)、周圍血管疾病、動(dòng)脈血栓形成、先兆子癇、栓塞、或是血管成形術(shù)或頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)或血管移植吻合術(shù)后的再狹窄或突然閉合；所述超聚集性的慢性或急性狀態(tài)是由于DIC、敗血癥、手術(shù)或感染性休克、手術(shù)后創(chuàng)傷、產(chǎn)后創(chuàng)傷、心肺分流術(shù)、不兼容輸血、胎盤早期脫離、血栓性血小板減少性紫癜、蛇毒或免疫疾病導(dǎo)致的。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述與血小板聚集和/或血小板活化有關(guān)的疾病或病況是因血液與人造裝置的接觸而產(chǎn)生的。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述人造裝置是血液透析儀、體旁人造肺和體外膜產(chǎn)氧裝置、可植入的人造心臟、用于去除或分離血液中特定成分并將其余的血液成分返還給供血者的血液成分部分清除儀器。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述給藥是將所述化合物給予對(duì)象的全身性給藥。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述全身性給藥是口服給藥。
21.一種用于體外抑制血液或血制品中血小板聚集的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的化合物或其鹽、溶劑化物或水合物給予所述血液或血制品的步驟。
22.一種藥物制劑，所述藥物制劑包括0.0005-0.3％w/v的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物、緩沖劑、螯合劑、非離子型張力調(diào)節(jié)劑，其中所述藥物制劑的張力為250-350mOsm/kG，pH為4-9式I 其中X1、X2和X3獨(dú)立地為氧、亞甲基、一氯亞甲基、二氯亞甲基、一氟亞甲基、二氟亞甲基或亞氨基；T1、T2、W和V獨(dú)立地為氧或硫m＝0、1或2；n＝0或1；p＝0、1、或2；其中m+n+p之和是0-5；M＝H或藥物學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)抗衡離子；D1＝O或CH2；B′是通式IV和V的嘌呤或嘧啶殘基，它分別通過(guò)堿基的9-或1-位與呋喃糖或碳環(huán)的1′-位連接；Y′＝H、OH或OR1；Z′＝H、OH或OR2；條件是當(dāng)A＝M時(shí)，Y′和Z′中的至少一個(gè)是OR1或OR2；A＝M，或A是如下定義的核苷殘基 其通過(guò)呋喃糖或碳環(huán)的5′-位與磷酸鏈連接，其中D2＝O或CH2；Z＝H、OH或OR3；Y＝H、OH或OR4；條件是Y′、Z′、Y和Z中的至少一個(gè)分別等于OR1、OR2、OR4或OR3；B是通式IV和V的嘌呤或嘧啶殘基，它分別通過(guò)堿基的9-或1-位與呋喃糖或碳環(huán)的1′位連接；R1、R2、R3和/或R4是如通式II的通過(guò)碳原子直接與呋喃糖或碳環(huán)各自的2′-和/或3′-羥基連接的殘基，或如通式III的通過(guò)共用碳原子與呋喃糖或碳環(huán)各自的兩個(gè)(2′-和3′-)羥基直接連接的殘基，從而存在1-4個(gè)符合式II定義的R1、R2、R3和R4獨(dú)立殘基，或存在1-2個(gè)由R1+R2和/或R3+R4構(gòu)成的獨(dú)立殘基；式II 其中O是各呋喃糖或碳環(huán)相應(yīng)的的2′-和/或3′-氧；C是碳原子；R5、R6和R7是H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，從而使得式II定義的部分是醚；或R5和R6是H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，R7是烷氧基、環(huán)烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基或取代的芳氧基，從而使得式II定義的部分是非環(huán)狀縮醛或縮酮；或R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，R7是烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，從而使得式II定義的部分是酯或硫代酸酯；或R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，R7是氨基或一或二取代的氨基，其中取代基是烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基或取代的芳基，從而使得式II的部分是氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯；或R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，R7是烷氧基、環(huán)烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基或取代的芳氧基，從而使得式II的部分是碳酸酯或硫代碳酸酯；或R7不存在，R5和R6合起來(lái)作為與C雙鍵鍵合的氧或硫，呋喃糖或碳環(huán)各自的兩個(gè)2′-和3′-氧直接與C鍵合，形成環(huán)狀碳酸酯或硫代碳酸酯；式III 其中所述O原子是呋喃糖或碳環(huán)的2′-和3′-氧；呋喃糖或碳環(huán)的2′-和3′-氧與共用碳原子(C)連接，形成環(huán)狀縮醛、環(huán)狀縮酮或環(huán)狀原酸酯；對(duì)于環(huán)狀縮醛和環(huán)狀縮酮，R8和R9獨(dú)立地為氫、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基、取代的芳基，或能合起來(lái)形成由3-8個(gè)原子，優(yōu)選3-6個(gè)原子組成的碳環(huán)或雜環(huán)；對(duì)于環(huán)狀原酸酯，R8是氫、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、取代的芳烷基、或取代的芳基，R9是烷氧基、環(huán)烷氧基、芳烷氧基、芳氧基、取代的芳烷氧基或取代的芳氧基。
23.如權(quán)利要求22所述的藥物制劑，其特征在于，所述非離子型張力調(diào)節(jié)劑是甘露醇或右旋糖。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物制劑，其特征在于，所述非離子型張力調(diào)節(jié)劑的量為3-5％。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)一種預(yù)防或治療與血小板聚集相關(guān)的疾病或病況的方法。該方法還針對(duì)一種治療血栓形成的方法。該方法包括對(duì)個(gè)體施用一種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的P2Y
文檔編號(hào)C07F9/6561GK101018799SQ200580010554
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月30日
發(fā)明者J·博耶, J·G·道格拉斯三世, S·R·謝弗, P·S·沃森, R·克里希納穆斯 申請(qǐng)人:印斯拜爾藥品股份有限公司, 北卡羅來(lái)納州大學(xué)