專利名稱：利用酶催化半合成紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶催化下的紫杉醇半合成方法，特別是一種利用酶催化半合成紫杉醇的方法。屬于分子生物工程與生物化學工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫杉醇(taxol)是經(jīng)FDA認證的目前最好的天然抗癌藥物之一，是治療卵巢癌的首選藥物，并且對白血病、肺癌、腦癌和其他的一些實體瘤等均有很好的療效。其抗癌基因是促進微管蛋白聚合，抑制其解聚，從而抑制癌細胞的快速分裂。紫杉醇最初發(fā)現(xiàn)于短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮，現(xiàn)在已經(jīng)在多種紅豆杉屬植物發(fā)現(xiàn)了紫杉醇。由于天然紅豆杉資源本就非常稀少，其中的紫杉醇含量在干重的萬分之幾以下，且多多數(shù)集中在樹皮中，樹齡為100年的紅豆杉只能提供一個癌癥患者所需的紫杉醇。所以通過砍伐紅豆杉，然后對樹皮進行提取分離的方法獲得紫杉醇，導致天然紅豆杉數(shù)量急劇下降，瀕臨滅絕，并對周圍環(huán)境造成不可挽回的破壞。鑒于以上原因，我過和世界上多數(shù)國家已經(jīng)將紅豆杉列為國家保護植物，嚴禁砍伐。由于提取天然紅豆杉中的紫杉醇已經(jīng)不能滿足臨床上對紫杉醇日益增長的需要(全世界紫杉醇的需求量約為1000公斤/年，而產(chǎn)量卻不到100公斤/年)。紫杉醇的療效和藥源的嚴重短缺使其價格極為昂貴，高達5000-6000美元/克。嚴重阻礙了對其的廣泛應用。目前的植物細胞培養(yǎng)中紫杉醇的含量低，造成其生產(chǎn)成本過高，化學全合成雖然已經(jīng)成功，但由于步驟冗長，產(chǎn)率太低；目前化學半合成法的化學反應空間選擇性差，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，需要先保護其他非目標?；稽c，待反應后再去保護的方法，以降低副產(chǎn)物的出現(xiàn)，但步驟煩瑣，收率低。在進行對本發(fā)明的主題的檢索中，尚未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明相關(guān)的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用酶催化半合成紫杉醇的方法，使其從曼地亞紅豆杉中克隆到紫杉醇生物合成中最后三個?；?DAT，BAPT，DBTNBT)基因，并將上述三個基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌或者酵母中，獲得能夠高效表達有催化活力的重組?；傅鞍椎幕蚬こ叹焕迷摶蚬こ叹蛘咂涮崛∥?，催化10去乙?；涂ㄍとD(zhuǎn)化為紫杉醇。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提出并實現(xiàn)了紫杉醇的酶催化半合成。與化學半合成法一樣，酶催化半合成也以紅豆杉中含量相對豐富的10去乙酰巴卡亭三為底物，差別是在對紫杉醇三環(huán)二萜骨架修飾過程中采用酶催化的方法，而不是化學修飾的方法，紫杉醇酶催化半合成以三個重組?；笧榇呋瘎诜磻髦羞M行三步?；?，從而合成紫杉醇。
由于酶具有高度的空間選擇性，可以在不保護其他酰化位點的條件下直接對10位和13位進行特異性?；?，因此簡化了反應步驟，提高紫杉醇的產(chǎn)率，且整個反映在溫和條件下進行，不采用有機溶劑，對環(huán)境破壞性小。
本發(fā)明中所采用的三個酶為10-DAB 10位乙酰化酶(10DAB10-O-acetyltransferase，DAT)，巴卡亭三13位3’-氨基-3’-苯基丙?；?Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT)，N去苯甲?；仙即急郊柞；?3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxolN-benzoyltransferase，DBTNBT)。
?；甘峭ㄟ^克隆紅豆杉中對應?；富?，在大腸桿菌或者酵母中進行表達而產(chǎn)生的。
在本發(fā)明的一個方面，提供了三種分離出的DNA分子。
DNA分子A具有編碼10-DAB 10位乙酰化酶(10DAB10-O-acetyltransferase，DAT)的核苷酸序列。DNA分子B具有編碼巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙?；?Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyl transferase，BAPT)的核苷酸序列。DNA分子C具有編碼N去苯甲?；仙即急郊柞；?3-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyl transferase，DBTNBT)的核苷酸序列。在本發(fā)明還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。將三個?；富蚓幋a序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成三個?；富虻谋磉_載體。
在本發(fā)明還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化宿主菌，從而獲得含有三個?；富虻幕蚬こ叹Ｔ趯嵗性撍拗骶鸀榇竽c桿菌DH5α和釀酒酵母的缺陷型菌株INVScl。
在本發(fā)明還進一步提供了一種分離純化重組酶蛋白，并在含有C-13側(cè)鏈前體的中性緩沖體系中下催化10去乙?；涂ㄍとD(zhuǎn)化為紫杉醇。
在本發(fā)明中，術(shù)語“DAT，BAPT，DBTNBT”指具有與野生型DAT，BAPT，DBTNBT相同活性的多肽，既包括野生型，也包括其變異型，為小于等于20個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加15個以內(nèi)的氨基酸。
本發(fā)明中DAT，BAPT，DBTNBT的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與其野生型基因DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?，還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽(這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶而完成)，以及具有磷酸化氨基酸殘基，如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸的序列，和被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明所涉及的“可操作地連于”是指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發(fā)明所涉及的“酶法紫杉醇半合成”是指利用基因工程菌產(chǎn)生的具有催化活力的重組?；笧榇呋瘎?，經(jīng)過三步酰化，將10去乙酰基巴卡亭三轉(zhuǎn)化為紫杉醇。
隨所采用的基因工程菌和酶蛋白的分泌特性的不同，有不同的催化形式對于胞內(nèi)酶，首先將基因工程菌破碎，制備無細胞提取物，作為催化劑；也可以進一步分離提純，以純品酶蛋白的形式進行催化，甚至將所獲得的酶固定化，以固定化酶的形式進行催化。
對于胞外酶，由于具有催化能力的酶蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因此可直接在培養(yǎng)體系中加10去乙酰基紫杉醇進行酶催化反應，或者以固定化細胞的形式產(chǎn)生分泌酶蛋白，催化紫杉醇的合成。
對于胞內(nèi)酶，另一種方式是使培養(yǎng)基中的10去乙?；仙即纪ㄟ^基因工程菌的細胞膜，在細胞內(nèi)進行催化反應，產(chǎn)生紫杉醇。
本發(fā)明提供的紫杉醇酶催化半合成方法，相對與目前廣泛采用的化學半合成，具有自己顯著的特點和明顯的優(yōu)勢。該方法采用酶催化方法對紫杉醇骨架進行修飾，而不是化學半合成法中的純化學修飾。由于酶催化修飾所具有的高選擇性，不需要保護紫杉醇骨架上的非目的修飾位點，因此所需步驟更少，操作更簡單；在很大程度上消除了立體異構(gòu)和非必要修飾所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，提高了紫杉醇合成的選擇性和產(chǎn)率。同時該方法在人工反應器中進行紫杉醇生產(chǎn)，而不是采用細胞體系進行紫杉醇生產(chǎn)，可以突破活細胞對其中紫杉醇最大含量的限制(紫杉醇具有細胞毒性，過高將導致細胞死亡)，從而在更大規(guī)模上進行更大強度的紫杉醇生產(chǎn)。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
一、DAT酶基因的克隆的實施例1.基因克隆10-DAB 10位乙?；富蛴杀緦嶒炇覅⒄誘aKaRa RNA PCR Kit說明書從曼地亞紅豆杉的總RNA提取物中克隆。反轉(zhuǎn)錄用多聚T作引物，反應條件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反應用DAT酶基因特異性引物P1和P2，擴增參數(shù)94℃5min；94℃ 30sec；63℃ 30sec；72℃2min 35個循環(huán)；72℃ 10min。反應產(chǎn)物進行脂糖凝膠電泳檢測，獲得約1.32kb的擴增片段。
DAT酶基因P15’-cgaattcatggcaggctcaacagaatttg-3’(SEQ ID NO.1)DAT酶基因P25’-cctcgagtcaaggcttagttacatatttgtttg-3’(SEQ ID NO.2)2.連接按PCR回收Kit說明書回收DAT酶基因目標片段。回收的DAT cDNA片段與pGEM-T Easy載體在T4 DNAligase作用下16℃過夜。
3.轉(zhuǎn)化大腸桿菌用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用藍白斑篩選檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽性克隆；4.基因的檢測利用DAT酶基因特異引物對篩選的大腸桿菌陽性克隆進行PCR檢測，并對PCR檢測所確定的大腸桿菌陽性克隆抽取質(zhì)粒DNA進一步進行測序驗證。
序列分析顯示DAT酶基因的全長為1320bp，根據(jù)推導該酶基因共編碼439個氨基酸。將克隆的DAT酶基因全長序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)它與來自于Taxus cuspidata和Taxusbaccata的10-DAB 10位乙?；富虼嬖诤芨叩耐葱?。在核苷酸水平上，所克隆的DAT酶基因與Taxus cuspidata的10-DAB 10位乙?；富虻木幋a序列(GenBankAccession No.AF193765)有95％的同源性；在氨基酸水平上，它與Taxus cuspidata的10-DAB 10位乙?；富虻陌被嵝蛄杏?7％的同源性(GenPept Accession No.AAF27621)。
二、BAPT酶基因的克隆的實施例1.基因克隆巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙?；富蛴杀緦嶒炇覅⒄誘aKaRa RNA PCRKit說明書從曼地亞紅豆杉的總RNA提取物中克隆。反轉(zhuǎn)錄用多聚T作引物，反應條件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反應用BAPT酶基因特異性引物P1和P2，擴增參數(shù)94℃5min；94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃2min 35個循環(huán)；72℃10min。反應產(chǎn)物進行脂糖凝膠電泳檢測，獲得約1.34kb的擴增片段。
BAPT酶基因P15’-cgaattcatgaagaagacaggttcgtttgc-3’(SEQ ID NO.3)BAPT酶基因P25’-cctcgagtcataactttgacggacacactttag-3’(SEQ ID NO.4)2.連接按PCR回收Kit說明書回收BAPT酶基因目標片段?；厥盏腂APT cDNA片段與pGEM-T Easy載體在T4 DNAligase作用下16℃過夜。
3.轉(zhuǎn)化大腸桿菌用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用藍白斑篩選檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽性克??；4.基因的檢測利用BAPT酶基因特異引物對篩選的大腸桿菌陽性克隆進行PCR檢測，并對PCR檢測所確定的大腸桿菌陽性克隆抽取質(zhì)粒DNA進一步進行測序驗證。
序列分析顯示BAPT酶基因的全長為1338bp。根據(jù)推導，該酶基因共編碼445個氨基酸。將克隆的BAPT酶基因全長序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)它與來自于Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的BAPT酶基因與Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙?；富虻木幋a序列(GenBank Accession No.AY082804)有90％的同源性；在氨基酸水平上，它與Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙?；富虻陌被嵝蛄杏?2％的同源性(GenPept Accession No.AAL92459)。
三、DBTNBT酶基因的克隆的實施例1.基因克隆N去苯甲?；仙即急郊柞；富蛴杀緦嶒炇覅⒄誘aKaRa RNA PCR Kit說明書從曼地亞紅豆杉的總RNA提取物中克隆。反轉(zhuǎn)錄用多聚T作引物，反應條件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反應用DBTNBT酶基因特異性引物P1和P2，擴增參數(shù)94℃ 5min；94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃ 2min 35個循環(huán)；72℃10min。反應產(chǎn)物進行脂糖凝膠電泳檢測，獲得約1.33kb的擴增片段。
DBTNBT酶基因P15’-cgaattcatggagaaggcaggctcaacag-3’(SEQ ID NO.5)DBTNBT酶基因P25’-cctcgagtcacactttacttacatctttctc-3’(SEQ ID NO.6)2.連接按PCR回收Kit說明書回收DBTNBT酶基因目標片段。回收的DBTNBT cDNA片段與pGEM-T Easy載體在T4 DNAligase作用下16℃過夜。
3.轉(zhuǎn)化大腸桿菌用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用藍白斑篩選檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽性克??；4.基因的檢測利用DBTNBT酶基因特異引物對篩選的大腸桿菌陽性克隆進行PCR檢測，并對PCR檢測所確定的大腸桿菌陽性克隆抽取質(zhì)粒DNA進一步進行測序驗證。
序列分析顯示DBTNBT酶基因的全長為1326bp，根據(jù)推導該酶基因共編碼441個氨基酸。將克隆的DBTNBT酶基因全長序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)它與來自于Taxus canadensis的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲?；富虼嬖诤芨叩耐葱浴Ｔ诤塑账崴缴?，所克隆的DBTNBT酶基因與Taxus canadensis的N去苯甲?；仙即急郊柞；富虻木幋a序列(GenBank Accession No.AF466397)有85％的同源性；在氨基酸水平上，它與Taxuscuspidata的N去苯甲?；仙即急郊柞；富虻陌被嵝蛄杏?5％的同源性(GenBank Accession No.AAM75818)。
權(quán)利要求
1.一種利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征在于，紫杉醇的酶催化半合成以紅豆杉中含量相對豐富的10去乙酰巴卡亭三為底物，對紫杉醇三環(huán)二萜骨架修飾過程中采用酶催化的方法，直接對10位和13位進行特異性酰化，且整個反映在溫和條件下進行，紫杉醇酶催化半合成以三個重組?；笧榇呋瘎诜磻髦羞M行三步?；?，從而合成紫杉醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，所采用的三個酶為10-DAB 10位乙?；?，即10DAB10-O-acetyl transferase，DAT；巴卡亭三13位3’-氨基-3’-苯基丙?；福碆accatinIII3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT；N去苯甲?；仙即急郊柞；?，即3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxolN-benzoyltransferase，DBTNBT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，?；甘峭ㄟ^克隆紅豆杉中對應?；富?，在大腸桿菌或者酵母中進行表達而產(chǎn)生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，提供了一種載體，它包含以下三個DNA分子或者其中之一DNA分子A具有編碼10-DAB 10位乙?；?0DAB10-O-acetyltransferase，DAT的核苷酸序列，DNA分子B具有編碼巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙?；窧accatin III3-amino-3-phenylpropanoyl transferase，BAPT的核苷酸序列，DNA分子C具有編碼N去苯甲?；仙即急郊柞；?-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyl transferase，DBTNBT的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是選用的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒，將三個?；富蚓幋a序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成三個?；富虻谋磉_載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化宿主菌，從而獲得含有三個?；富虻幕蚬こ叹?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征在于進一步提供了一種分離純化重組酶蛋白，并在含有C-13側(cè)鏈前體的中性緩沖體系中下催化10去乙?；涂ㄍとD(zhuǎn)化為紫杉醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是DAT，BAPT，DBTNBT指具有與野生型DAT，BAPT，DBTNBT相同活性的多肽，既包括野生型，也包括其變異型，為小于等于20個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加15個以內(nèi)的氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是DAT，BAPT，DBTNBT的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與其野生型基因DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是修飾形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?，還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽，以及具有磷酸化氨基酸殘基，如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸的序列，和被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
全文摘要
一種利用酶催化半合成紫杉醇的方法屬于分子生物工程與生物化學工程領(lǐng)域。紫杉醇的酶催化半合成以紅豆杉中含量相對豐富的10去乙酰巴卡亭三為底物，對紫杉醇三環(huán)二萜骨架修飾過程中采用酶催化的方法，直接對10位和13位進行特異性?；?，且整個反應在溫和條件下進行，紫杉醇酶催化半合成以三個重組?；笧榇呋瘎?，在反應器中進行三步?；瑥亩铣勺仙即?。本發(fā)明提供的紫杉醇酶催化半合成方法，對紫杉醇骨架進行修飾，所需步驟更少，操作更簡單，提高了紫杉醇合成的選擇性和產(chǎn)率，從而在更大規(guī)模上進行更大強度的紫杉醇生產(chǎn)。
文檔編號C07D305/00GK1460720SQ0311616
公開日2003年12月10日 申請日期2003年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月3日
發(fā)明者苗志奇, 唐克軒, 張利達 申請人:上海交通大學