專利名稱：新旋素:抗微生物肽的制作方法
關(guān)于聯(lián)邦資助的研究的聲明本發(fā)明在政府支持下進行，有國立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health)資助，授權(quán)號為A143934。政府在本發(fā)明中擁有一定的權(quán)益。
前言背景有效的抗微生物劑的發(fā)展一度是治療細菌疾病的決定性因素。但是，即使在開發(fā)出第一種抗生素之前，就已證明細菌具有適應(yīng)環(huán)境壓力、從而發(fā)展抗性的能力。近年來，隨著已產(chǎn)生抗性的致病微生物的增加，各種抗微生物劑也大量增加?，F(xiàn)在認識到，抗性是針對所有臨床上使用的抗微生物劑而產(chǎn)生的。醫(yī)學(xué)界對抗生物素抗性的反應(yīng)是，使用先前未使用的新的或者別的抗生素來抵抗已產(chǎn)生抗性的細菌。這些方法需要不斷地開發(fā)出新的抗生素，而不管這種新的抗生素是對目前存在的化合物的修飾而得到，還是這些新抗生素是那些可抑制或者回避細菌抗性機制的化合物的組合。
已在許多不同的動物和昆蟲種類中發(fā)現(xiàn)天然的多陽離子抗生素肽，并且這些肽已顯示出廣譜抗微生物活性。在哺乳動物中，這些抗微生物肽主要由兩類代表，一類是防衛(wèi)素，另一類是卡瑟利次定(cathelicidins)。幾乎所有的這些肽都具有膜親和力，并可滲透細菌膜，使其產(chǎn)生滲透性，結(jié)果導(dǎo)致該微生物損傷、裂解和/或死亡。例如，人的稱為α-防衛(wèi)素的肽由嗜中性白細胞和腸帕內(nèi)特細胞產(chǎn)生。在其三維結(jié)構(gòu)中，防衛(wèi)素是兩性分子，大部分是β-折疊結(jié)構(gòu)，具有一個極性表面，該表面主要由它的精氨酸形成，其N末端和C末端殘基在防御抗微生物能力和領(lǐng)域中起重要的作用〔參見Gudmundsson等(1999)，《免疫方法雜志》(J ImmunolMethods)，232(1-)45-54〕。Hancock和Lehrer在《生物技術(shù)發(fā)展趨勢》(Trends inBiotechnology，1998，1682)中綜合闡述了抗微生物肽。
囊性纖維化(Cystic fibrosis，CF)是一種遺傳病，美國每3,300個新生兒中就有1個患有這種疾病?，F(xiàn)在它使大約30,000人受到影響。CF患者的平均壽命僅為31.3歲，因而是美國最常見的使壽命縮短的遺傳病。大多數(shù)CF患者死于呼吸衰竭，這種肺衰竭產(chǎn)生于長期的、漸進性的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染；綠膿桿菌是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布在環(huán)境之中。綠膿桿菌感染正常個體的能力有限，但是它可在免疫妥協(xié)的、嚴重?zé)齻幕蛘呓?jīng)抗生素處理的人中成為摧毀性的次級入侵者。由于綠膿桿菌染色對于常規(guī)的抗生素常常是耐藥的，或者常常產(chǎn)生耐藥性，所有由它們引起的感染一般都難以消除。
已測試了許多抗微生物肽抗綠膿桿菌的臨床分離物的體外活性，這些抗微生物肽包括天蠶抗菌肽P1(cecropin P1)、吲哚里茨啶(indolicidin)、馬加寧II、乳鏈菌肽和蘭那雷辛(ranalexin)。已發(fā)現(xiàn)，這些肽的抑制值的范圍不同，當(dāng)它們與常規(guī)抗生素組合時，顯示出一定的協(xié)同效果〔Giacometti等(1999)，《抗微生物化學(xué)治療劑雜志》(J Antimicrob Chemother.)，44(5)641-5〕。
臨床上仍需要新穎的抗生素制劑，這些制劑對具有藥物抗性的革蘭氏陰性菌有效，并對哺乳動物細胞的毒性低。本發(fā)明滿足這些要求。
相關(guān)文獻Saiman等在《小兒科肺科學(xué)》(Pediatr Pulmonol，1999，17320)的增刊中報道，CF患者的耐藥性微生物被卡瑟利次定肽抑制；Brogden等在《小兒科肺科學(xué)》(Pediatr Pulmonol，1999，17320)的增刊中報道了SMAP29在肺感染的綿羊模型中的效果，以及SMAP29在治療囊性纖維化(CF)患者的綠膿桿菌感染中的潛力。
發(fā)明概要提供使用新旋素(novispirin)肽的方法和組合物。新旋素肽是小的抗微生物劑，它們具有抵抗包括沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、綠膿桿菌、大腸桿菌(Escherichia coli)和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)在內(nèi)的革蘭氏陰性菌的潛在活性。這些肽是非溶血性的，與其它抗微生物肽相比，其體外的細胞毒性減少，并且在體內(nèi)在靜脈注射后具有很好的耐受性。新旋素對生長期和穩(wěn)定期的綠膿桿菌非常有效，它們在高鹽濃度或者人的血清中保留著活性。新旋素還與脂多糖(LPS)結(jié)合，這是一種可減緩革蘭氏陰性菌感染相關(guān)的癥狀的特性。
將含有作為活性劑的新旋素的藥物組合物給予受微生物感染(尤其是細菌感染)的患者。該蛋白質(zhì)在體外也有效地殺死各種微生物體?？蓡为毥o予新旋素，或者使其與其它殺菌劑(如抗生素)組合，作為有效肽的混合物給予，等等。也可將新旋素介導(dǎo)的微生物的殺傷用于建模和篩選新穎抗生素。
附圖的簡短說明

圖1A和1B顯示卵旋素(ovispirin)和代表性的新旋素抗兩種革蘭氏陰性菌的相對活性。
圖2顯示抗微生物肽抗綠膿桿菌的動力學(xué)。
圖3顯示抗微生物肽抗人紅細胞的溶血活性。
圖4A、4B和4C顯示抗微生物肽抗人細胞的相對細胞毒性。
圖5顯示新旋素對LPS的結(jié)合。
圖6A和6B顯示新旋素對細菌膜的滲透性。
特殊實施例的描述提供將新旋素用作抗微生物劑的方法。這些肽在體外和體內(nèi)通過直接的殺菌活性而有效地殺死各種微生物體。將新旋素單獨給予受到感染或易受感染的患者，或者使其與其它活性劑聯(lián)合給予，在一定的劑量和持續(xù)時間，應(yīng)足以減少這類微生物病原體的患者人數(shù)。
對新的抗微生物劑的需求不斷增長，尤其是有效殺死對常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性的病原體(如綠膿桿菌)的抗微生物劑。感興趣的特殊治療包括但不限于以氣溶膠方式向囊性纖維化患者的肺給藥，以治療由例如綠膿桿菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌引起的感染，同時防止針對吸入的其它抗生素產(chǎn)生耐藥性；用留置插管滴注患者的膀胱，以預(yù)防感染；施涂于嚴重?zé)齻幕颊叩钠つw；直接滴到眼睛中，或者成滴眼液形式滴到眼睛中，以治療或預(yù)防感染；陰道內(nèi)給藥，以治療細菌性陰道病和/或預(yù)防性傳播疾病，如通過預(yù)防沙眼衣原體的感染。新旋素還可用于治療使植物致病的假單胞菌類，以及設(shè)計預(yù)防食用谷物中的疾病和谷物腐爛的農(nóng)業(yè)應(yīng)用中。
新旋素的肽形式為進一步的治療開發(fā)提供了基礎(chǔ)，通過修飾其多肽結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生修飾形式，該修飾形式具有改變的生物學(xué)和化學(xué)特性。在生理學(xué)上可接受的載體中其天然形式或修飾形式，以用于治療用途，或者用作抗微生物劑。
新旋素組合物對于本方法，可使用所提供的任何新旋素、其修飾形式或者一種或多種形式的組合。新旋素包括具有如下式子的肽SEQ ID NO1 KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG其中，X1、X2、X3和X4獨立選自D或L型的甘氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸，較佳是甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、D-丙氨酸和D-異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸。對于非異亮氨酸殘基，優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。優(yōu)選的肽是X1、X2、X3和X4中僅有1個選自甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的肽。
進行這些取代時不想被任何理論所限制，可以認為抗微生物肽卵旋素(SEQ IDNO2)的細胞毒性與其高度的剛性和兩性分子性(amphipathicity)有關(guān)。用甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、D-丙氨酸或D-異亮氨酸取代卵旋素第6、7、10或11位之中的一個異亮氨酸殘基，會增加該卵旋素的柔韌性(甘氨酸)、破壞α-螺旋〔D丙氨酸(D)或D-異亮氨酸(DI)〕或者增加一個極性殘基而破壞了極度疏水的區(qū)域。
表I顯示卵旋素和示范性新旋素肽的基本序列。黑體字母表示新旋素中與卵旋素不同的殘基。
可采用本領(lǐng)域已知的各種方法改變新旋素多肽的序列，以在序列中產(chǎn)生目標(biāo)變化。該多肽通常與本文提供的序列基本上類似，即它們將有1個氨基酸的差異，可能有兩個氨基酸的差異。所述的序列變化可以是取代、插入或刪除。
出于各種目的，該蛋白質(zhì)可連接于各種各樣的其它寡肽或蛋白質(zhì)。通過使本發(fā)明肽表達，可獲得各種翻譯后的修飾。例如，使用適當(dāng)?shù)木幋a序列可產(chǎn)生法呢基化作用或異戊二烯化作用。在這種情況下，肽將結(jié)合于末端的脂基，以便能結(jié)合于脂質(zhì)膜，如脂質(zhì)體。在另一例子中，肽的羧基末端被酰胺化，從而增加該肽的正電荷。
可采用重組方法從真核細胞或原核細胞生產(chǎn)用于本發(fā)明的新旋素，或者如本領(lǐng)域已知的在體外合成。
在本發(fā)明的一個實施例中，抗微生物肽主要由選自SEQ ID NO1或SEQ IDNO3到SEQ ID NO30的多肽序列組成。在本文中，“主要由……組成”是指多肽由序列表中給出的序列構(gòu)成，該序列可以側(cè)接一個或多個氨基酸，或?qū)嵸|(zhì)上不影響該多肽的基本特性的其它殘基。
使用方法將新旋素的制劑給予受到微生物感染或易受微生物感染的宿主。給藥可以是表面的(topical)、局部的(localized)或全身的，這要視具體的而定，優(yōu)選局部給藥。通常，新旋素的劑量足以將微生物數(shù)量減少至少約50％，其殺傷一般至少1個對數(shù)，還可以是2個或多個對數(shù)。以減少微生物數(shù)量同時使任何副作用減到最少的劑量給予本發(fā)明的化合物。考慮可以獲得該組合物，并在醫(yī)生的指導(dǎo)下在體內(nèi)使用。新旋素特別可用于殺死革蘭氏陰性菌，包括綠膿桿菌和沙眼衣原體。
新旋素還可用于配制體外殺死微生物的制劑，尤其是對于不想采用大量的常規(guī)抗生素的人。例如，可將新旋素加到動物和/或人的食品中。新旋素可以作為細胞的體外培養(yǎng)物的添加劑，以防止組織培養(yǎng)物中微生物過量生長。
如試驗部分所述，可通過體外測試確定具體的微生物被新旋素殺死的易感性。通常，將微生物的培養(yǎng)物與各種濃度的新旋素培育一段足以使該蛋白質(zhì)起作用的時間，這段時間通常約為1個小時到1天。然后計算活微生物的數(shù)量，測定殺死水平。
感興趣的微生物包括但不限于革蘭氏陰性菌，例如檸檬酸桿菌屬(Citrobactersp.)；腸桿菌屬(Enterobacter sp.)；大腸桿菌屬(Escherichia sp.)，如大腸桿菌；克雷伯桿菌屬(Klebsiella sp.)；摩氏變形桿菌屬(Morganella sp.)；變形桿菌屬(Proteussp.)；普羅威登斯菌屬(Providencia sp.)；沙門氏菌屬(Salmonella sp.)，如傷寒沙門氏菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌屬(Serratia sp.)；志賀菌屬(Shigella sp.)；假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；耶爾森氏菌屬(Yersinia sp.)，如鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)；弗朗西絲氏菌屬(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌屬(Pasturella sp.)；弧菌屬(Vibriosp.)，如霍亂弧菌(V.cholearae)。副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；彎曲桿菌屬(Campylobacter sp.)，如空腸彎曲桿菌(C.jejuni)；嗜血桿菌屬(Haemophilus sp.)，如流感嗜血桿菌(H.influenzae)、杜氏嗜血桿菌(H.ducreyo)；博德特氏菌屬(Bordetella sp.)，如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布魯氏菌屬(Brucellasp.)；奈瑟氏菌屬(Neisseria sp.)，如淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)；等等。其它感興趣的細菌包括軍團菌屬(Legionella sp.)，如侵肺軍團菌(L.pneumophila)；李斯特菌屬(Listeria sp.)，如單核細胞增生李斯特菌屬(L.monocytogenes)；枝原體屬(Mycoplasma sp.)，如人型枝原體(M.hominis)、肺炎枝原體(M.pneumoniae)；分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.)，如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberulosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)；密螺旋體屬(Treponemasp.)，如蒼白密螺旋體屬(T.pallidum)；疏螺旋體屬(Borrelia sp.)，如布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)；鉤端螺旋體(Leptospirae sp.)；立克次氏體屬(Rickettsia sp.)，如立氏立克次氏體(R.rickettsii)、斑疹傷寒立克次氏體(R.typhi)；衣原體屬(Chlamydia sp.)、如砂眼衣原體(C.trachomatis)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)、鸚鵡衣原體(C.psittaci)；螺桿菌屬(Helicobacter sp.)，如幽門螺桿菌(H.pylori)；等等。
感興趣的非細菌病原體包括真菌和寄生蟲病原體，如瘧原蟲屬(Plasmodiasp.)，如惡性瘧原蟲(P.falciparum)；錐體蟲屬(Trypanosoma sp.)，如布氏錐體蟲(T.brucei)；血吸蟲(shistosomes)；內(nèi)阿爾巴蟲屬(Entaemoeba sp.)；酵母屬(Cryptococcus sp.)；假絲酵母屬(Candida sp.)，如白假絲酵母(C.albicans)；等等。
可采用各種給藥方法?？煽诜嚯闹苿?，或者可靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腹膜注射，可以氣溶膠方式、眼內(nèi)、膀胱內(nèi)、局部等方式給予。例如，吸入給藥的方法在本領(lǐng)域中已知的。治療劑的劑量可以根據(jù)所給的具體的新旋素、疾病的性質(zhì)、給藥的頻率、給藥的方式、該藥劑從宿主中的清除等等而改變。最初的劑量可以較大，接著給予較小的維持劑量。可每周或每兩周給予該劑量，或者分成多份較小的劑量，每天、每半周等給予一次或幾次，以維持有效的劑量水平。在許多例子中，口服所需的劑量比靜脈注射的要大。對于口服給藥，可修飾酰胺鍵以及氨基和羧基末端，以獲得更大的穩(wěn)定性。例如，可將羧基末端酰胺化。
制劑可將本發(fā)明的化合物摻入各種制劑中，用于治療給藥。更具體而言，通過將本發(fā)明的化合物與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或賦形劑組合，而將它們配制成藥物組合物，并可將它們配制成固體、半固體、液體或氣體形式，如片劑、膠囊、粉末、軟膏、霜、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體、洗劑和氣溶膠。這樣，可以各種方式給予這些化合物，包括口服、口腔、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮下、氣管內(nèi)等給藥。新旋素在給藥后可以遍布全身，或者通過使用植入管或?qū)⒒钚运巹┍Ａ粼谥踩朦c的其它制劑使新旋素局部化。
在一個實施例中，用于局部的制劑包含螯合劑，該螯合劑使二價陽離子(尤其是鈣和鎂)的濃度下降。例如，可包括制劑如檸檬酸、EGTA或EDTA，其中優(yōu)選檸檬酸。檸檬酸的濃度通常約為1-10μM。
可單獨給予本發(fā)明的化合物，或者將本發(fā)明的各種化合物相互組合給予，或者使它們與其它已知的化合物〔如培服林(perforin)、抗炎劑、抗生素等〕組合給予。關(guān)于藥物的劑型，這些化合物可以以它們的藥學(xué)上可接受的鹽的形式給予。下面的方法和賦形劑僅僅是示范性的，而非限制性。
對于口服制劑，這些化合物可單獨使用，或者與適當(dāng)?shù)奶砑觿┙M合，配制成片劑、粉末、粒劑或者膠囊；例如，與常規(guī)的添加劑組合，如乳糖、甘露糖、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與結(jié)合劑組合，如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或者明膠；與崩解劑組合，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或者羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑組合，如滑石粉或硬脂酸鎂；如果需要，還可以與稀釋劑組合，如緩沖劑、增濕劑、防腐劑和增香劑。
可將這些化合物配制成注射用的制劑，通過在水性或非水性溶劑中溶解、懸浮或者乳化而給予，所述溶劑如植物油或者其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或者丙二醇；如果需要，可與常規(guī)的添加劑配制，如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑以及防腐劑。
這些化合物可以用于吸入給藥的氣溶膠形式使用?？蓪⒈景l(fā)明的化合物配制到增壓的、可接受的推進劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。
這些化合物可與常規(guī)的添加劑(如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)配制，用作洗劑，如用于防止燒傷的感染。
此外，可將這些化合物與各種堿(如乳化用的堿或水溶性堿)混合而配制成栓劑。本發(fā)明的化合物可以栓劑形式而從直腸給予。栓劑可包含載體，如可可油、聚乙二醇(carbowax)和聚乙二醇(polyethylene glycol)，這些載體在體溫下熔化，而在室溫則固化。
可提供口服或直腸給藥的各種劑型，如糖漿、酏劑和懸浮劑，其中，各劑量單位如一茶匙、一湯匙的片劑或栓劑含有預(yù)定量的組合物，該組合物含有本發(fā)明一種或多種化合物。類似地，注射或靜脈內(nèi)給藥的單位劑型可包括成組合物形式的本發(fā)明的化合物，如在無菌水、生理鹽水或其它藥學(xué)上可接受的載體中的溶液。
用于緩釋制劑的植入物在本領(lǐng)域是熟知的。可將植入物與生物可降解的或非生物和降解的聚合物配制成微球體、片狀等形式。例如，乳酸和/或乙醛酸的聚合物形成可腐蝕的聚合物，宿主對該聚合物具有很好的耐受性。將含有新旋素的植入物放在感染位點的附近，這樣活性劑的局部濃度相對于身體的其它部位而增加。
術(shù)語“單位劑型”在本文中指物理上分散的、適合于人和動物用的單一劑型；含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物的各單位，是以與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或媒介一起足以產(chǎn)生所需的效果的量計。本發(fā)明單位劑型的規(guī)格根據(jù)所使用的具體化合物、要達到的效果以及該化合物在宿主中的藥物動力學(xué)而定。
公眾易于獲得藥學(xué)上可接受的賦形劑，如媒介、佐劑、載體或稀釋劑。此外，公眾也易于獲得藥學(xué)上可接受的佐劑，如pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、增濕劑等等。
全身性給藥的典型劑量范圍是每次給藥0.1微克到100毫克/千克對象體重。典型的劑量可以是每天給予2-6次的一片藥劑；或者是每天給予一次的隨時間而釋放的膠囊或片劑，它們含有其含量相對較高的的活性成分。隨時間釋放效果可由在不同的pH值溶解的膠囊材料獲得、由根據(jù)滲透壓而緩慢釋放的膠囊獲得、或者由任何已知的控制釋放方法獲得。
熟練的技術(shù)人員將很容易理解，劑量水平可作為具體的化合物、癥狀的嚴重性以及對象對副作用的易感性的函數(shù)而改變。一些特殊的化合物以另外一些更有效。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員采用各種方法，可容易地確定給定化合物的優(yōu)選劑量。優(yōu)選的方法是測量給定化合物的生理效力。
將脂質(zhì)體用作傳送載體是一種感興趣的方法。脂質(zhì)體與細胞的靶位點融合，然后細胞內(nèi)傳送其內(nèi)腔的內(nèi)容物。使脂質(zhì)體維持與細胞接觸足夠長的時間，以使它們?nèi)诤?；采用各種方法維持接觸，如隔離、結(jié)合劑等等。在本發(fā)明的一個方面，將脂質(zhì)體設(shè)計成氣溶膠的形式，以用于肺給藥?？蓪⒅|(zhì)體與介導(dǎo)膜融合的純化蛋白質(zhì)或肽一起制備，如仙臺病毒或流感病毒等。脂質(zhì)可以是已知的脂質(zhì)體形成脂質(zhì)的任何有用的組合，包括陽離子或兩性離子脂質(zhì)，如磷脂酰膽堿。余下的脂質(zhì)通常是中性的或酸性的脂質(zhì)，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。
可采用Kato等所述的方法〔1991，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，2663361〕制備脂質(zhì)體。簡言之，在適當(dāng)水性介質(zhì)中將脂質(zhì)和含有肽的內(nèi)腔混合，該水性介質(zhì)通常是鹽水介質(zhì)，總的固體的范圍約為1-10重量％。在短時間(約5-60秒)的劇烈攪拌后，將試管放到約25-40℃的溫水浴中，重復(fù)這種循環(huán)約5-10次。然后用超聲波處理該組合物一段合適的時間，通常約為1-10秒，并可通過渦流進行攪拌。然后加入水性介質(zhì)增大體積，通常將體積增加約1-2倍，接著搖動和冷卻。這種方法使高分子量的分子摻入內(nèi)腔中。
與其它活性劑配制在本方法的使用中，可將新旋素與其它藥學(xué)上活躍的制劑一起配制，尤其是其它抗微生物劑。感興趣的其它制劑包括各種各樣的抗生素，如本領(lǐng)域已知的?？股氐念悇e包括，例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑青霉素、羧芐青霉素、乙氧萘青霉素、氨芐青霉素等；青霉素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑頭孢菌素的組合，如頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢呋辛、拉氧頭孢等；卡巴苯寧(carbapenem)；單菌霉素；氨基糖苷；四環(huán)素；大環(huán)內(nèi)酯物；林可霉素；多粘菌素；磺胺；可洛蘭芬尼卡爾(cloramphenical)；甲硝唑；大觀霉素；甲氧芐啶；萬古霉素；等等。
也可使用抗真菌劑，包括多烯類，如兩性霉素B、制霉素；5-氟魯構(gòu)辛(5-flucosyn)；和吡咯類，如咪康唑、酮康唑、衣康唑(itraconazol)和氟康唑?？菇Y(jié)核病藥物包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和利福平。在新旋素制劑中還可包含細胞因子，如γ干擾素、腫瘤壞死因子α、白介素12等等。
新旋素的合成本發(fā)明的肽可采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法在體外合成而制得?？色@得各種市售的合成裝置，如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA，Beckman)的自動合成儀等等。使用合成儀，可用天然的氨基酸取代非天然的氨基酸，具體是D異構(gòu)體，如D-丙氨酸和D-異亮氨酸；非對映異構(gòu)體、長度不同的側(cè)鏈或官能度；等等。具體的序列和制備的方法將依方便、節(jié)約、所需的純度等而確定。
可向各種肽或蛋白質(zhì)提供化學(xué)連接，這些肽或蛋白質(zhì)包含用于結(jié)合的方便的官能度，例如提供氨基用于酰胺或取代的胺的形成，如還原性的胺化；提供巰基用于硫酯或二硫鍵的形成；提供羧基用于酰胺的形成；等等。
如果需要，在合成期間或在表達期間，可將各種基團引入肽中，這些基團使得該肽得以與其它分子或表面連接。因此，可使用半胱氨酸來制備硫酯，用組氨酸來連接于金屬離子復(fù)合物，用羧基來形成酰胺或酯，用氨基來形成酰胺，等等。
可根據(jù)重組合成的方法還可分離和純化多肽。由表達宿主制得裂解物，采用HPLC、排阻色譜法、凝膠電泳、親和層析或者其它純化技術(shù)純化該裂解物。最重要的是，與該產(chǎn)物的制備和純化方法有關(guān)的污染物相比，所使用的組合物將含有至少20重量％的所需產(chǎn)物，更一般是至少約75重量％，較佳至少約95重量％；對于治療目的，通常至少約99.5重量％。通常，該百分比是以總蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。
實施例給出下述實施例，以給本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員提供關(guān)于怎樣制備和使用本發(fā)明的一個完整的公開和描述，這些實施例并不限制本發(fā)明的范圍。已作出努力以確保所使用的數(shù)據(jù)(如數(shù)量、溫度、濃度等)的準(zhǔn)確，但是，實驗誤差和偏差總歸存在。除非另有說明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是℃，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實施例1方法抗微生物活性采用幾種不同的方法檢測新旋素的抗微生物活性，包括a)兩階段徑向擴散試驗(two-stage radial diffusion assay)；b)集落計數(shù)試驗(colonycounting assay)；c)標(biāo)準(zhǔn)少量肉湯稀釋試驗(standard microbroth dilution assay)。
在低鹽度、正常鹽度或高鹽度的培養(yǎng)基中檢測抗微生物活性。在徑向擴散試驗中，使用低鹽“基本培養(yǎng)基”進行檢測，該基本培養(yǎng)基含有0.3毫克胰胨豆胨粉末/毫升10mM磷酸鈉緩沖液，pH為7.4。在該基本培養(yǎng)基中補充100mM NaCl獲得正常培養(yǎng)基，或者補充175-200mM NaCl獲得高鹽培養(yǎng)基。高鹽培養(yǎng)基對于綠膿桿菌活性的保持是重要的，因為據(jù)報道，從囊性纖維化患者得到的氣道液體顯示出高鹽性，而其它位點，包括皮膚表面和膀胱，也可能在局部具有高鹽濃度。
用于此研究的微生物包括13種不同的綠膿桿菌菌株。AML-654和LZ-1株是UCLA微生物實驗室最近得到的臨床分離物。9種菌株是最近的CF分離物，由LisaSaiman博士提供。除了PAO-1株外，所有的綠膿桿菌菌株都對多種常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性，所有9種(5種類粘蛋白，4種非類粘蛋白)CF分離物都對250μg/ml的托普霉素具有耐藥性。我們還已測試了從CF患者得到的嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia capacia)各自的5種菌株(也由Lisa Saiman提供)、大腸桿菌的兩種菌株(ML-35p和DH-5a)、金黃色葡糖球菌(Staphylococcusaureus)〔MRSA(具有甲氧苯青霉素抗性的金黃色葡萄糖菌)〕和白假絲酵母。
細胞毒性采用四唑還原試驗(Boehringer-Mannheim，Indianapolis IN)研究細胞毒性。使ME-180人頸上皮細胞(ATCC HTB-33)和A549人肺上皮細胞(ATCCCCL-185)在RPMI培養(yǎng)基(Me-180)或含有2mM L-谷氨酰胺的Ham F12K培養(yǎng)基(A-549)中生長至鋪滿，該Ham F12K培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和50μg/ml慶大霉素(“培養(yǎng)基”)。用胰蛋白酶-EDTA收集細胞，用“培養(yǎng)基”沖洗，測定(錐蟲藍排染法)它們的濃度和存活力后，將細胞稀釋成5×104細胞/毫升。將100微升的等分分散在96孔組織培養(yǎng)平板(Costar)上，37℃在含有5％CO2的室內(nèi)空氣中培育5小時。然后，加入系列稀釋的肽，加入肽20小時后，加入10微升MTT溶液。4小時后，加入100微升增溶緩沖液，放置過夜。第二天，使用Spectramax 250 Spectrophotometer〔分子設(shè)備(Molecular Devices)，Sunnyvale，CA〕在600nm和650nm測量光密度，測定MTT還原。
溶血活性通過將各種濃度的肽與洗滌的人、鼠、綿羊或牛紅細胞的PBS溶液的懸浮液(2.8％v/v)一起培育，從而測試溶血活性。37℃培育30分鐘后，將試管離心，測量釋放到上清液中的總血紅蛋白的百分比。
結(jié)果抗微生物特性卵旋素和新旋素證明對革蘭氏陰性菌具有有效的抗微生物活性，包括綠膿桿菌的全部13種菌株。這些菌株中的11種，包括從CF患者得到的9種(5種類粘蛋白，4種非類粘蛋白)都是最近的臨床分離物。所有的CF菌株都對250μg/ml的托普霉素具有耐藥性，大多數(shù)對多種其它的抗生素具有高度耐藥性。新旋素對嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌的所有5種菌株也有活性，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌是囊性纖維化中出現(xiàn)的病原體，它們對常規(guī)的抗生素通常具有耐藥性。與其它許多抗生素和抗微生物肽一樣，新旋素對洋蔥伯克霍爾德氏菌無活性。
新旋素介導(dǎo)的殺菌活性在5-15分鐘內(nèi)產(chǎn)生，最有可能是對細菌的內(nèi)膜和外膜產(chǎn)生滲透化作用?？刮⑸锘钚栽诟啕}(175-200mM NaCl)條件下維持，在20％血清的存在下受到的影響最小。新旋素對生長期或休眠期的綠膿桿菌相當(dāng)有效。
圖1顯示卵旋素和新旋素對兩種微生物——大腸桿菌和綠膿桿菌的多抗性菌株的相對活性。在低鹽、正常鹽濃度和高鹽條件下(在X軸上分別表示為0、100和100mM NaCl)進行徑向擴散試驗，獲得MIC。柱顯示平均的MIC值±SEM(n＝3)?？梢钥闯觯诘望}和正常鹽濃度下測量時，新旋素比卵旋素更有活性，而高鹽條件下它們的活性大致相等。
表1對新旋素針對這些革蘭氏陰性菌的活性與它針對單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡糖球菌和白假絲酵母的活性進行了比較。表中的數(shù)據(jù)由徑向擴散試驗獲得，這些數(shù)據(jù)由平均MIC±SEM顯示，n＝3。注意到當(dāng)在生理鹽濃度(100mMNaCl)測試時，新旋素顯示出抗這些革蘭氏陰性菌的活性，并且新旋素G10對白假絲酵母也具有相當(dāng)?shù)幕钚浴ｋm然在非常高的鹽濃度條件下(200mM NaCl)，卵旋素和新旋素都沒有維持著針對白假絲酵母或革蘭氏陽性菌的活性，但是它們在這些條件下維持了針對革蘭氏陰性菌的活性。結(jié)果，即使CF患者中氣管的NaCl濃度特別地高，這種因素也不會削弱卵旋素或新旋素殺死綠膿桿菌的能力。
表1.針對5種不同微生物的MIC(μg/ml)，〔平均值±SEM，n＝3〕
肽 大腸桿菌 綠膿桿菌 單核細胞增生 金黃色葡糖球白假絲酵母ML 35P MR 3007 李斯特菌EGD 菌930918-3 820低鹽(+0mM NaCl)卵旋素 0.7±0.02.7±1.1 2.0±0.5 2.1±0.3 2.2±0.2G7新旋素 0.2±0.00.6±0.2 0.4±0.1 0.6±0.2 0.5±0.1G10新旋素 0.1±0.00.3±0.0 0.2±0.0 0.3±0.0 0.2±0.1T7新旋素 0.3±0.11.3±0.6 0.5±0.2 0.7±0.3 0.5±0.2T10新旋素 0.5±0.21.5±0.9 0.6±0.3 1.0±0.6 0.8±0.4正常鹽濃度 (+100mM NaCl)卵旋素 0.7±0.11.7±0.6 1.5±0.3 1.0±0.1 29.9±15.4G7新旋素 0.2±0.00.4±0.1 2.3±0.5 5.1±1.1 9.3±4.9G10新旋素 0.1±0.00.2±0.0 1.4±0.4 4.6±1.7 4.6±1.9T7新旋素 0.2±0.10.5±0.3 2.4±1.5 3.3±1.5 18.6±5.9T10新旋素 0.3±0.20.9±0.5 5.5±4.0 9.7±4.6 23.0±3.9非常高的鹽濃度 (+200mM NaCl)卵旋素 1.5±0.62.7±0.1 3.3±0.1 2.9±0.7 ＞250G7新旋素 1.5±0.44.5±1.9 28.2±0.739.6±9.2 ＞250G10新旋素 1.8±0.82.5±0.5 9.3±1.3 75.0±51.5 205±22.6T7新旋素 1.4±0.52.7±1.3 21.5±2.014.9±2.9 ＞250T10新旋素 2.7±1.13.9±2.1 26.8±1.675.3±56.2 ＞250表2.綠膿桿菌PAO1的少量肉湯稀釋試驗(μg/ml，平均值，n＝3)肽MIC MBCmM NaCl 0 1001750 100175卵旋素 3.1 3.14.74.7 7.19.4G7新旋素 1.6 6.84.42.6 14.1 8.3G10新旋素 2.6 16.1 11.3 6.8 16.7 29.2T7新旋素 2.1 3.95.77.3 6.312.5T10新旋素 2.8 5.72.86.8 9.49.4Protegrin PG1 2.1 2.62.63.2 2.73.5囊性纖維化患者氣管中的綠膿桿菌可能在許多方面與活動無拘束的漂浮種類生物不同。這些不同點是它們在富含藻酸鹽的生物膜中被捕獲；選擇營養(yǎng)缺陷型和抗生素耐藥性；對它們的脂質(zhì)和LPS結(jié)構(gòu)進行各種修飾；高密度的代謝特征；營養(yǎng)限制性的培養(yǎng)物。許多常規(guī)的抗生素(如細胞壁或蛋白質(zhì)合成的抑制劑)和許多抗微生物肽優(yōu)先針對快速生長著的微生物，因而可能對量大/更新慢的細菌種群相對無活性。因此，我們測試了卵旋素和新旋素針對綠膿桿菌的3種菌株P(guān)AO-1、Liz-1和AML654的活性，以觀察這些肽是否能殺死穩(wěn)定期或缺乏營養(yǎng)的微生物以及快速生長的微生物。所有這三類菌株都獲得相等的結(jié)果。表3顯示PAO-1和Liz-1的數(shù)據(jù)。注意到不論是生長期還是營養(yǎng)的存在或缺乏都沒有影響到綠膿桿菌對新旋素的易感性。
表3.肽針對生長期和穩(wěn)定期的綠膿桿菌(2類菌株)的活性，在鋪墊的凝膠下存在或缺乏營養(yǎng)(TSB)的情況下測試MIC(μg/mL)綠膿桿菌PAO1/綠膿桿菌Liz-1肽對數(shù)生長期中期 對數(shù)生長期中期穩(wěn)定期 穩(wěn)定期1％TSB 無TSB 1％TSB 無TSB低鹽卵旋素 0.6/1.8 1.3/1.1 1.8/1.9 0.9/2.0G7新旋素0.4/0.4 0.3/0.6 0.4/0.3 0.3/0.6G10新旋素 0.3/0.3 0.1/0.4 0.3/0.1 0.2/0.4T7新旋素0.4/0.6 0.5/0.6 0.6/0.4 0.5/0.7T10新旋素 0.6/0.7 0.6/1.0 0.9/0.9 0.6/0.9100mM NaCl卵旋素 0.9/1.6 0.9/1.4 1.5/1.5 0.9/2.1G7新旋素0.2/0.2 0.5/0.6 0.1/0.2 0.5/1.2G10新旋素 0.1 /0.2 0.8/1.3 0.1/0.1 0.5/2.0T7新旋素0.3/0.3 0.6/0.4 0.4/0.4 0.5/0.7T10新旋素 0.3/0.5 0.9/0.6 0.5/0.5 0.8/1.4175mM NaCl卵旋素 1.2/0.9 0.9/0.7 1.1/1.2 0.8/0.8G7新旋素1.2/2.1 0.2/0.1 1.0/2.9 0.1/0.1G10新旋素 3.6/5.9 0.1/0.1 4.7/5.9 0.1/2.3T7新旋素0.8/2.0 0.3/0.1 0.8/2.0 0.2/0.6T10新旋素 2.3/3.4 0.3/0.2 1.9/3.0 0.4/0.8血清的作用人防衛(wèi)素和LL-37(一種α-螺旋的人卡瑟利次定肽)可大量地結(jié)合血清分子。結(jié)果，如果血清存在的話，它們的抗微生物活性被極大地減少。因為血清可以存在于炎癥部分或者流出物，所以在血清的存在下還能發(fā)揮作用的能力是需要的特性。我們最近發(fā)現(xiàn)，SMAP-29(在綿羊中發(fā)現(xiàn)的一種α-螺旋的卡瑟利次定)在血清的存在下保持著其抗微生物活性，這證明了血清的抑制作用不是不可避免的，而是一個設(shè)計上的問題。表4顯示血清對新旋素、LL-37、SMAP-29和其它抗綠膿桿菌MR3007(一種具有血清耐藥性的菌株)和大腸桿菌ML-35P(對＞5％的血清敏感)的肽的作用。在血清的存在下，卵旋素和新旋素喪失了一部分抗綠膿桿菌的活性，但LL-37受到的影響要小得多。
表4.正常人的血清對抗微生物活性的作用MIC(μg/mL)肽 大腸桿菌ML35P 綠膿桿菌MR30070％NHS 2.5％NHS 0％NHS 2.5％NHS20％NHS卵旋素 1.7 1.7 5.6 20.1 17.6G7新旋素0.5 0.4 7.5 21.5 17.7G10新旋素 0.9 0.7 7.6 22.1 21.7T7新旋素1.0 0.7 7.5 25.2 22.0T10新旋素 1.0 0.7 8.6 28.6 17.6PG-1(protegrin) 0.5 0.3 1.6 0.91 1.6PGG 1.8 0.9 5.8 7.41 8.6SMAP-29 0.6 0.3 1.4 1.51.2LL-37 5.8 21.0 12.723.7 141在這些試驗中，鋪墊的凝膠含有60％RPMI-1640、±2.5-20％正常人血清(NHS)。剩余的溶液是磷酸緩沖鹽溶液。
殺微生物活性的動力學(xué)在綠膿桿菌MR3007暴露于5μg/ml的卵旋素或新旋素中后，我們在一定的時間間隔內(nèi)對存活的綠膿桿菌MR3007進行了測定，該卵旋素或新旋素存在于含有1％v/v的胰胨豆胨培養(yǎng)液的PBS培養(yǎng)基中。圖2顯示快速的2至3的對數(shù)的落差，到30分鐘時以及之后再也沒發(fā)現(xiàn)存活的細菌。
圖3顯示裂解的紅細胞中的卵旋素或新旋素的作用。雖然卵旋素對人紅細胞的溶血作用與protegrin PG-1的大致相同，但是新旋素是非溶血性的。使用鼠紅細胞也獲得類似的結(jié)果。相反，這些肽中沒有一條對綿羊或牛紅細胞具有明顯的溶血性。
細胞毒性特性新旋素，尤其是新旋素G10，對人上皮細胞或成纖維細胞的毒性明顯少于卵旋素和先前研究的其它抗微生物肽(如protegrin PG-1、爪蟾抗菌肽MSI-78或者PGG)對這兩種細胞的毒性。針對ME-180人頸上皮細胞和A-549肺上皮細胞的毒性的代表性檢測顯示在圖4中。
圖5比較了這些肽對MRC-5人肺成纖維細胞的細胞毒性。G10和T10新旋素實際上沒有細胞毒性，這證明它們不可能延遲組織的修復(fù)或傷口的愈合。
體內(nèi)毒性在小鼠中進行急性毒性研究。給3只小鼠靜脈使用10毫克新旋素G10/千克體重的量，3只都存活，1只在20毫克/千克的劑量時仍活著。如果小鼠的血液體積占其質(zhì)量的5％，那么10毫克/千克的劑量將產(chǎn)生大約200微克/毫升的峰值水平——高于其MIC濃度的20-50倍。
LPS結(jié)合我們在兩個試驗中測量了卵旋素和新旋素結(jié)合LPS的能力。一個試驗是分光光度計測量，使用到定量的Limulus生色試驗。另一個試驗是物理的，它測量表面等離子體共振變化。
卵旋素對LPS的表觀結(jié)合常數(shù)大約為6.7×10-6M。當(dāng)結(jié)合試驗在低鹽(0mMNaCl)條件下進行時新旋素的親和力下降了4-5倍，即在2.5-3.3×10-5M。當(dāng)我們測試生理NaCL濃度下的結(jié)合時，新旋素對LPS的親和力增加。
新旋素對細菌膜的作用所有的新旋素，當(dāng)以5μl/mg的量進行測試時，它們都能快速地滲透大腸桿菌M-35p的外膜和內(nèi)膜。膜滲透性的起始是快速的，在2分鐘之內(nèi)發(fā)生，并在5分鐘之內(nèi)達到最大程度。這個試驗使用懸浮在PBS(100mMNaCl)中的穩(wěn)定期的大腸桿菌進行。通過監(jiān)控PADAC(一種頭孢菌素)的水解而測量外膜的滲透性，通過監(jiān)控ONPG(這種大腸桿菌株沒有l(wèi)ac通透酶)的水解而測量內(nèi)膜的滲透性。
表5顯示新旋素抗嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌的活性。
表5新旋素嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌
Protegrin PG-1、多粘菌素B和PGG為對照。PGG是α-螺旋肽，其序列是GLLRRLRKKIGEIFKKYG。它由Tossi，A.、Tarantino，C.和Romeo，D.(1997)設(shè)計和報道的。合成的抗微生物肽的設(shè)計是以序列模擬和兩性分子性為基礎(chǔ)的，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)，250549-58。
實施例2砂眼衣原體血清型L2、D和E對G-10新旋素的易感性本研究檢測砂眼衣原體的三種血清型(L2、D和E)對新旋素(G-10)(一種新穎的18殘基α-螺旋肽)的易感性。G-10是非溶血性的，并且當(dāng)在體外針對上皮細胞進行測試時，G-10具有最小的細胞毒性。它對革蘭氏陰性微生物具有相對選擇性。
砂眼衣原體血清型L2引起侵入性LGV，而血清型D和E代表典型的生殖菌株。使用標(biāo)準(zhǔn)的和改良的McCoy細胞殼形小瓶試驗(standard and modified McCoycell shell vial assay)和各濃度的肽，測定G-10對砂眼衣原體血清型(L2、D和E)的作用。在標(biāo)準(zhǔn)試驗中，先將砂眼衣原體/肽混合物預(yù)先培育2小時，然后在進行48小時的培育之前將它們從宿主單層中移出。在改良的試驗中，將預(yù)先培育的混合物放在單層細胞上進行48小時的培育。在第三試驗中，混合G10和砂眼衣原體，然后在沒有預(yù)先培育的情況下，用它們感染細胞單層，在48小時測量。記錄下包涵體形成單位(IFU)，以測量肽的抑制作用。
在預(yù)先培育試驗中，100μg/ml的G-10完全抑制了砂眼衣原體血清型E。在100mg/ml，血清型L2的IFU減少了92.7-99.1％，血清型D的IFU減少了99.4-100％。通常，不進行預(yù)培育步驟會減少砂眼衣原體對新旋素的易感性。沒有移走砂眼衣原體/肽混合物并沒有顯著增加或減少對G-10的易感性。G-10比protegrin更有效，protegrin是在豬淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的抗微生物肽，它們具有優(yōu)異的抗砂眼衣原體活性。此外，所有3種測試的血清型都對G-10有易感性。因此，新旋素具有作為化學(xué)預(yù)防劑的用途，可用于預(yù)防砂眼的傳染。
實施例3二價陽離子對新旋素活性的作用G10新旋素抗某些細菌的活性被1mM濃度的鈣和鎂所抑制。加入含有檸檬酸的緩沖液可緩解這種抑制。在這種發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，用于局部的新旋素制劑應(yīng)含有檸檬酸或者另一種二價陽離子結(jié)合劑，如EDTA(乙二胺四乙酸)。含有檸檬酸的制劑對G10新旋素的有益效果顯示在表6中。
導(dǎo)致這種發(fā)現(xiàn)的試驗涉及徑向擴散試驗。所有鋪墊的凝膠都含有100mM NaCl和5mM HEPES緩沖液(pH7.4)。此外，一些鋪墊的凝膠補充了5mM檸檬酸鈉緩沖液(pH7.4)，而其它的含有1mM CaCl2或1mM MgCl2。數(shù)據(jù)以MIC值表示(μg/ml)。注意到與對金黃色葡糖球菌的增強作用相比，檸檬酸對革蘭氏陰性微生物的增強作用更占優(yōu)。EDTA是一種更有效的鈣和鎂的螯合劑，被認為具有與檸檬酸一樣的作用。
表6
實施例4制備新旋素G10的三種新的變體，并對它們進行測試，以確定增加肽的凈正電荷是否會使該肽在二價陽離子的存在下更有效。將一些新旋素G10變體的羧基末端酰胺化(-NH2)，以增加總的正電荷。這些肽的序列和它們的凈電荷顯示在表7中。在這個計算中忽略組氨酸12上的分散電荷(和pH依賴性電荷)。
表7
結(jié)果MIC，平均值±SEM，n＝3，陰影框表示p＜0.01，與G-10相比，采用t-試驗。
表8
在表8中，MIC表示最小抑制濃度，采用兩階段徑向擴散試驗測得。這些試驗在標(biāo)準(zhǔn)條件下進行，但使用10mM HEPES緩沖液代替10mM磷酸鹽，以避免存在鈣時產(chǎn)生的溶解問題。黑體字顯示的結(jié)果表示與新旋素G10相比，活性有明顯地提高(p＜0.01，采用t-試驗)。注意到G10、R10新旋素酰胺顯示，在鈣和鎂的存在下，針對所有四種測試微生物的活性增加，G10、R10新旋素針對三種革蘭氏陰性微生物〔綠膿桿菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)〕具有更大的活性，但并不對金黃色葡糖球菌更有效。上述G10新旋素衍生物中沒有一種引起人紅細胞的任何溶血，即使當(dāng)以80μg/ml的濃度進行測試。其它陽離子氨基酸(如賴氨酸、鳥氨酸等)有可能也可以用于位置12上，以在鈣和鎂離子存在的情況下獲得更好的活性。
實施例5分析G10新旋素的4種變體，以觀察增加N末端的正電荷是否也會增加對鈣和鎂的抗性。這些G10變體的氨基酸序列以及它們各自的凈電荷顯示在表9中。
表9
本說明書中所引用的所有出版物和專利申請都被納入本文作為參考，就像各單獨的出版物或?qū)＠暾埍幻鞔_且單獨地指出給納入作為參考那樣。任何出版物的引用都是它們在本申請日前的公開內(nèi)容，不應(yīng)認為本發(fā)明者承認本發(fā)明由于這些出版物的緣故而不能在它們之前授權(quán)。
雖然為了清除地理解的目的，已采用闡述和實施例的方式描述了前述發(fā)明，但是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員在參考本發(fā)明的內(nèi)容后將易于理解，在不偏離附帶的權(quán)利要求的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明作出某些改變和修改。
序列表<110>R.I.萊雷爾(Lehrer，Robert，I.)A.J.韋林(Waring，Alan，J.)B.F.塔克(Tack，Brian，F(xiàn).)<120>新旋素抗微生物劑<130>06510-195WO<140>未授權(quán)<141>
<150>US 09/606,858<151>2000-06-28<160>37<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<221>變體<222>(1)…(18)<223>Xaa＝甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、D-丙氨酸、D-異亮氨酸<400>1Lys Asn Leu Arg Arg Xaa Xaa Arg Lys Xaa Xaa His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>2<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>2Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>3<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽
<400>3Lys Asn Leu Arg Arg Gly Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>4<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>4Lys Asn Leu Arg Arg Thr Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>5<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>5Lys Asn Leu Arg Arg Ser Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>6<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>6Lys Asn Leu Arg Arg Glu Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>7<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>7Lys Asn Leu Arg Arg Asp Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>8<211>18
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-丙氨酸<400>8Lys Asn Leu Arg Arg Ala Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>9<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-異亮氨酸<400>9Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>10Lys Asn Leu Arg Arg Ile Gly Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>11<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>11Lys Asn Leu Arg Arg Ile Thr Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>12<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>12Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ser Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>13<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>13Lys Asn Leu Arg Arg Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>14<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>14Lys Asn Leu Arg Arg Ile Asp Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>15<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-丙氨酸<400>15Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ala Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>16<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-異亮氨酸<400>16
Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>17<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>17Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>18<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>18Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Thr Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>19<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>19Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ser Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>20<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>20Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Glu Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>21<211>18<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>21Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Asp Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>22<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-丙氨酸<400>22Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ala Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>23<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-異亮氨酸<400>23Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>24<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>24Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Gly His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>25<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽
<400>25Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Thr His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>26<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>26Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ser His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>27<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>27Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Glu His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>28<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>28Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Asp His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>29<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-丙氨酸<400>29Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ala His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly
<210>30<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<223>D-異亮氨酸<400>30Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Ile Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>31<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<221>酰胺化<222>(18)…(18)<223>G-CONH2<400>31Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>32<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<400>32Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile Arg Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>33<211>18<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<223>合成的抗微生物肽<221>酰胺化<222>(18)…(18)<223>G-CONH2<400>33Lys Asn Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile Arg Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly
<210>34<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>G10新旋素肽的合成變體<400>34Lys Arg Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>35<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>G10新旋素的合成變體<221>酰胺化<222>(18)…(18)<223>G-CONH2<400>35Lys Arg Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile His Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>36<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>G10新旋素的合成變體<400>36Arg Arg Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile Arg Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly<210>37<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的抗微生物肽<221>酰胺化<222>(18)…(18)<223>G-CONH2<400>37Arg Arg Leu Arg Arg Ile Ile Arg Lys Gly Ile Arg Ile Ile Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly
權(quán)利要求
1.一種抗微生物多肽，其特征在于，它包含SEQ ID NO1的序列KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG，其中，X1、X2、X3和X4獨立選自D或L型的甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4獨立選自甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸。
3.如權(quán)利要求2所述的抗微生物肽，其特征在于，X1、X2、X3和X4中僅有一個選自甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。
4.如權(quán)利要求3所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO3到SEQ ID NO37中任一條的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽主要由SEQ ID NO3到SEQ ID NO37中任一條的氨基酸序列組成。
6.如權(quán)利要求1所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽的羧基末端被酰胺化。
7.一種抗微生物制劑，其特征在于，它含有一種抗微生物肽，該肽包含SEQ ID NO1的序列KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG；其中，X1、X2、X3和X4獨立選自甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、D-丙氨酸和D-異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸；一種藥學(xué)上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求7所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4獨立選自甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸。
9.如權(quán)利要求8所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4中僅有一個選自甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。
10.如權(quán)利要求9所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO3到SEQ ID NO37中任一條的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求10所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽主要由SEQ IDNO3到SEQ ID NO37中任一條的氨基酸序列組成。
12.如權(quán)利要求7所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽的羧基末端被酰胺化。
13.如權(quán)利要求7所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體包含螯合劑。
14.如權(quán)利要求13所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述螯合劑是檸檬酸。
15.如權(quán)利要求7所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述制劑還含有第二抗微生物劑。
16.如權(quán)利要求15所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述第二抗微生物劑是抗生素。
17.如權(quán)利要求7所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述制劑適合用于以氣溶膠方式傳送所述抗微生物肽。
18.一種治療微生物傳染的方法，其特征在于，該方法包括使微生物種群與包含序列SEQ ID NO1的抗微生物多肽結(jié)合，SEQ ID NO1的序列為KNLRRX1X2RKX3X4HIIKKYG；其中，X1、X2、X3和X4獨立選自甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、D-丙氨酸和D-異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸。
19.如權(quán)利要求18所述的抗微生物肽，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4獨立選自甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，條件是不超過3個X殘基是異亮氨酸。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述X1、X2、X3和X4中僅有一個選自甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。
21.如權(quán)利要求20所述的抗微生物制劑，其特征在于，所述肽包含SEQ IDNO3到SEQ ID NO37中任一條的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的抗微生物肽，其特征在于，所述肽主要由SEQ IDNO3到SEQ ID NO37中任一條的氨基酸序列組成。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述微生物種群包含革蘭氏陰性菌。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌選自綠膿桿菌、砂眼衣原體、大腸桿菌和金黃色葡糖球菌。
25.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述肽的羧基末端被酰胺化。
26.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述肽在含有螯合劑的藥學(xué)上可接受的載體中配制。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述螯合劑是檸檬酸。
全文摘要
新旋素肽是一類抗微生物劑，它們具有有效的抗革蘭氏陰性菌活性。這些肽是非溶血性的，與其它抗微生物肽相比，在體外具有減少的細胞毒性，并且在體內(nèi)在靜脈注射后具有很好的耐受性。新旋素還結(jié)合脂多糖(LPS)，這是個可減輕與革蘭氏陰性菌感染相關(guān)的癥狀的特征。將含有作為活性劑的新旋素的藥物組合物給予受到或者易受微生物感染(尤其是革蘭氏陰性菌感染)的患者。
文檔編號C07K16/00GK1735422SQ01811862
公開日2006年2月15日 申請日期2001年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月28日
發(fā)明者R·I·萊雷爾, A·J·韋林, B·F·塔克 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會, 衣阿華州立大學(xué)研究基金會