專利名稱：平衡檢測共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)及其三維影像重建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域?qū)儆诹Ⅲw影像重建，尤其是有關(guān)于ー種平衡檢測共聚焦顯微鏡(confocal microscope)成像系統(tǒng)及其三維影像重建方法。
背景技術(shù)：
共聚焦顯微鏡早在1957年即為Marvin Minskey所提出，并于1961年獲得專利。早先由于沒有高功率的空間相干光源(spatial coherent light source),所以共聚焦顯微鏡并無法善加應(yīng)用。只是在激光技術(shù)產(chǎn)生后，此ー現(xiàn)像才被改迸。
共聚焦顯微鏡的信號光源主要為激光器或熒光(fluorescence)。由一高數(shù)值孔徑(numerical aperture)的聚焦裝置搜集信號光且應(yīng)用一光檢測器進(jìn)行檢測。在聚焦深度外部的光將被光檢測器之前的ー針孔(pinhole)阻擋住。因為聚焦深度外部的光無法被光檢測器所檢測到，所以共聚焦顯微鏡具有深度辨識的能力。共聚焦顯微鏡的反射強(qiáng)度相對于軸向深度為ー sine square的曲線，且深度的分辨率為此曲線該最大值之半的全寬(fullwidth at half maximum of this curve)。在可見光的范為內(nèi)，其約為300納米,而側(cè)向的分辨率為入射的激光束的散射能力所限制，其最高值約為200納米。應(yīng)用共聚焦顯微鏡在不同的軸向深度處作ニ維的掃瞄可以重建ー掃瞄物件的三維影像。因為傳統(tǒng)上使用的共聚焦顯微鏡無法對高速變動的物件進(jìn)行實時的掃瞄，所以也無法進(jìn)行實時進(jìn)行三維成像。共聚焦顯微鏡使用高NA物鏡以使得照明的點(diǎn)距相當(dāng)?shù)木o密，而且在光檢測器前方的光共軛平面中的針孔(pinhole)可以消除焦點(diǎn)外的信號。當(dāng)來自聚焦深度外的光將被在該光檢測器前方的針孔(pinhole)所阻檔。共聚焦顯微鏡具有深度辨識的能力，所以可以是ー項理想的表面輪廓量測計.
傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡中，將ー樣本對位于該焦點(diǎn)上，且在軸方向進(jìn)行平面掃描，再堆棧這些平面影像，可以得到三維影像。但是此過程必需精密的控制不同位的圖像(sectioningimage)的軸向位置，及影像重建的時間。因此傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡不適于檢測高速三維變動的形態(tài)及對為微觀處理的實時檢測。美國專利USP5，804，813(J._P.Wang and C. -H Lee, “Differential 共聚焦顯微鏡”)中提出ー種可實時檢測變動物體的三維影像的方法，該專利應(yīng)用differential共聚焦顯微鏡，其中使用共聚焦顯微鏡的軸響應(yīng)曲線(axial response curve)中的線性區(qū)段以使得深度方向的分辨率可以達(dá)到最大。已證明此一方式可以克服傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡的限制。差動共聚焦顯微鏡(differential confocal microscope)可以使得在深度方向的分辨率高于20納米,且可以操作在ー開回路的組態(tài)(open loop configuration)下,而大大增加成像速度。因此可以達(dá)到實時的三維surface成像。但是此一方法的動態(tài)范圍(dynamic range)不夠大,所以當(dāng)物件瞬時的變化較大時，所得到的三維影像相當(dāng)?shù)哪：?。其次，此ー方法并未考慮表面反射或熒光效應(yīng)的差異所造成重建影樣上的錯誤。此外，目前此技術(shù)的軸向分辨率主要受限于光源功率的變動。
本發(fā)明的目的即在解決此ー現(xiàn)有技術(shù)的困難點(diǎn)，利用三階(three order)非線性擬合來増加其動態(tài)范圍，利用平衡檢測來消除光源功率變動的影響進(jìn)而提高軸向分辨率和解決表面反射或熒光效應(yīng)的差異所造成重建影樣上的錯誤，以得到更佳的影像效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提出ー種平衡檢測的共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)及其三維影像重建方法，其中本發(fā)明使用非線性擬合(fitting)，可以增加可應(yīng)用的動態(tài)范圍。本發(fā)明中消除光源中的功率的變動。應(yīng)用平衡檢測可以改進(jìn)軸向的分辨率。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的ー種平衡偵測的共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)包含一光源；一光束放大器接收來自該光源的光束并經(jīng)散射后放大該光束的截面；ー聚焦機(jī)構(gòu)，用于聚焦通過該光束放大器的光，以將在光束聚焦到一待測樣品上；ー掃瞄機(jī)構(gòu)，可以調(diào)整該聚焦機(jī)構(gòu)相對于該樣品的軸向深度，并在不同深度處的樣品平面上的移動，以使得該光束在不同的樣品點(diǎn)上聚焦后并產(chǎn)生反射光束；一等量分束器，將反射光束分成兩等量光束；一大面積光檢測器接收來自該等量分束器的一道光束，并測得使光束的信號強(qiáng)度；一針孔接收來自該等量分束器的另一道光束；一光束倍増管接收來自該針孔的信號，并測得此信號的強(qiáng)度；ー處理器，接收來自該光束倍増管及該大面積光檢測器所檢測的信號的信號強(qiáng)度，并經(jīng)過校準(zhǔn)的程序以得到校準(zhǔn)后的反射信號強(qiáng)度；并應(yīng)用在不同的軸向深度處的不同截面上所得到信號強(qiáng)度，重建該樣品的影像。進(jìn)ー步的，其尚包含
ー控制器用于控制該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的位置以使得該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡可以沿著軸向進(jìn)行不同軸向點(diǎn)處的ニ維掃瞄；一存儲器用于記錄相關(guān)資料，其中包含來自該大面積光檢測器及該光束倍増管的信號值，該ニ維掃描光學(xué)裝置及該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡的相對位置及坐標(biāo)。進(jìn)ー步的，其尚包含ー導(dǎo)光裝置用于導(dǎo)引該截面放大的光束進(jìn)入該掃瞄機(jī)構(gòu)，且導(dǎo)引該反射光束進(jìn)入該分束器，其中的導(dǎo)光機(jī)構(gòu)包含一極化分束器(polarizationbeamsplitter)位于該光束放大器的后方，主要是由兩介電系數(shù)不同的棱鏡所構(gòu)成；利用介電系數(shù)的不同，使得當(dāng)光束從第一面射入時可以直接穿過該分束器，反之當(dāng)光從第二面射入時，碰到第一面的邊界處將使得入射在該邊界處產(chǎn)生全反射；一四分之一波長光板(quarter wave plate)為在該極化分束器該后方,該四分之一波長光板包含反向的第一端及第ニ端，使得進(jìn)入第一端的入射光及從第二端通過的反射光之間的極性相差90度，所以反射光束再如第二端進(jìn)入該極化分束器之兩棱鏡的界面時會被反射，而不會穿過該界面。進(jìn)ー步的，該掃貓機(jī)構(gòu)為一二維掃描光學(xué)裝置，其包含ー鏡面，且可以由一驅(qū)動裝置驅(qū)動，應(yīng)用該ニ維掃描光學(xué)裝置的移動可以改變?nèi)肷涔夥瓷浜蟮穆窂?，所以該反射后的光束可以掃瞄過一照射物體。該聚焦機(jī)構(gòu)為ー PZT驅(qū)動的物鏡，可以隨者該ニ維掃描光學(xué)裝置的位置改變而改變此PZT驅(qū)動的物鏡使得該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡對準(zhǔn)由該ニ維掃描光學(xué)裝置反射的光線。該光源為線性極化光源。 本發(fā)明另提供一種應(yīng)用成像系統(tǒng)進(jìn)行三維影像重建的方法，其包含步驟為
由該光源發(fā)射一光束，該光束經(jīng)過ー光束放大器將該光束的截面放大；經(jīng)該極化分束器后的光束入射一二維掃描光學(xué)裝置，必經(jīng)由該ニ維掃描光學(xué)裝置的鏡面反射，改變的光束的行進(jìn)方向；
由ー驅(qū)動裝置驅(qū)動該ニ維掃描光學(xué)裝置以改變?nèi)肷涔馐蟮穆窂剑?br> 將經(jīng)過該ニ維掃描光學(xué)裝置的光束投射向一物鏡；其中，該物鏡可以隨著該ニ維掃描光學(xué)裝置的位置改變而改變其軸向深度，及在垂直于此軸向深度之平面上的位置，使得該物鏡對準(zhǔn)由該ニ維掃描光學(xué)裝置所傳送過來的光束；
反射光束經(jīng)過該等量分束器后分成兩等量的光束；
其中之一等量光束入射到一大面積光檢測器，以檢測到一信號功率；此信號功率的平均值表示在不同的軸向深度處的功率的平均值，其中已避免由于光源的不穩(wěn)定所產(chǎn)生的功率不穩(wěn)定； 其中另一等量光束入射到該針孔后在入射到該光束倍增管以檢測并放大該信號；
將上述結(jié)果相關(guān)的資料儲存起來，儲存的資料包含來自該大面積光檢測器及該光束倍增管的信號值，該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的相對位置及坐標(biāo)等等；并對該光束倍増管所得到的信號值進(jìn)行校準(zhǔn)；
調(diào)整該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的相對位置后在同一軸向深度對方該樣品進(jìn)行ニ維掃描，并執(zhí)行相同的作業(yè)以得到對應(yīng)的數(shù)據(jù)；
然后改變該ニ維掃描光學(xué)裝置及該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡的軸向深度，并重覆上述的步驟，對方該樣品進(jìn)行ニ維掃描，并執(zhí)行相同的作業(yè)以得到對應(yīng)的數(shù)據(jù)；以及應(yīng)用上述所得到的校準(zhǔn)后的數(shù)據(jù)產(chǎn)生該樣品的三維影像。其中
將該放大截面的光束通過ー極化分束器及一四分之一波長光板；且由樣品反射該光束經(jīng)該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡后照射到一祥品后，此光束經(jīng)該樣品反射，并經(jīng)該ニ維掃描光學(xué)裝置反射后以反方向入射該四分之一波長光板，并在該極化方束器上的兩棱鏡的界面處反射向該等量分束器。該校準(zhǔn)的步驟包含在量測前，選定一基準(zhǔn)點(diǎn)，在幾U m的行程中，在樣品及物鏡之間的軸方向上不同的位置處將光束入射該樣品；擷取自該光束倍増管所得到的信號，以得到不同軸向點(diǎn)的反射功率分布函數(shù)，其為近似sinc2的曲線；由此曲線可以找到一工作點(diǎn)，即為sinc2曲線之微分值為最大的一點(diǎn)；使用三階非線性的fitting，在該工作點(diǎn)的附近得到一三階(three order)的匹配曲線，其可匹配該軸向點(diǎn)功率分布函數(shù)；因此可以得到ー較大的動態(tài)范圍；以及記錄該大面積光檢測器所得到的光信號強(qiáng)度。該ニ維掃瞄的步驟尚包含步驟為微調(diào)樣品與物鏡之間的距離到該工作點(diǎn)；在原先進(jìn)行校準(zhǔn)之點(diǎn)的附近進(jìn)行ニ維掃瞄；每ー掃瞄點(diǎn)所得到的反射光束經(jīng)不同的鏡面作用后由大面積光檢測器及該光束倍增管擷取對應(yīng)的信號；其中因為由該光束倍増管所得到的信號先經(jīng)過該針孔的過濾，所以唯有在該工作點(diǎn)附近之深度處的信號才會被擷??；而由該大面積光檢測器所得到的信號強(qiáng)度代表在該掃瞄點(diǎn)的反射信號的總強(qiáng)度；依據(jù)在掃瞄點(diǎn)及基準(zhǔn)點(diǎn)所量測的反射信號總強(qiáng)度的差異，將由掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度)進(jìn)行調(diào)整；修正軸向高度所產(chǎn)生的誤差，先將掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度)除以在工作點(diǎn)的斜率即可得到軸向高度差(即掃瞄點(diǎn)與基準(zhǔn)點(diǎn))之間的高度差；應(yīng)用此高度差找到在該3D擬合曲線上對應(yīng)的點(diǎn)；應(yīng)用此對應(yīng)點(diǎn)與該工作點(diǎn)在該3D擬合曲線上對應(yīng)的功率的比值修正由該工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度)，即將該工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度乘上該比值，如此得到在該掃瞄點(diǎn)的反射功率，并記憶到一存儲器中；對其它的掃瞄點(diǎn)進(jìn)行同樣的運(yùn)算；如果發(fā)現(xiàn)某一掃瞄點(diǎn)的反射信號“總”強(qiáng)度(即來自大面積光檢測器的信號強(qiáng)度)與其它點(diǎn)的偏差過大時，有可能是樣品的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很大的變異，則必須重新進(jìn)行較準(zhǔn)的工作?？蓪⒂蓲呙辄c(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度)進(jìn)行調(diào)整的方式將掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度X掃瞄點(diǎn)B的反射信號總強(qiáng)度/基準(zhǔn)點(diǎn)的反射信號總強(qiáng)度?？蓱?yīng)用壓電轉(zhuǎn)換器(PZT)驅(qū)動該物鏡。由下文的說明可更進(jìn)一歩了解本發(fā)明的特征及其優(yōu)點(diǎn)，閱讀時并請參考附圖。



圖I為應(yīng)用共聚焦顯微鏡在不同的軸向點(diǎn)位置處，所得到的功率分布。圖2為在本發(fā)明的元件方塊圖。圖3-1為現(xiàn)有技術(shù)的ー階擬合的模擬結(jié)果。圖3-2示本發(fā)明的三階擬合的模擬結(jié)果。圖4顯示本發(fā)明的模擬結(jié)果。其中圖4-1表示樣品的縱剖面；圖4-2表示由光束倍増管9所得到的ニ維影像。為符合實際操作情形，我們在影像中加入了光源功率變動(噪聲)以及表面反射的差異(上下半部影像強(qiáng)度不同)；圖4-3表示由差動共聚焦顯微鏡對該樣品的重建之影像的剖面圖；圖4-4表示由本發(fā)明之平衡共聚焦顯微鏡對該樣品的重建之影像的剖面圖；4-4表示應(yīng)用本發(fā)明的結(jié)果所得到的影像。
具體實施例方式茲謹(jǐn)就本發(fā)明的結(jié)構(gòu)組成，及所能產(chǎn)生的功效與優(yōu)點(diǎn)，配合附圖，舉本發(fā)明之ー較佳實施例詳細(xì)說明如下。本發(fā)明運(yùn)作的原理
圖I中顯示的是應(yīng)用共聚焦顯微鏡，在不同的軸向點(diǎn)位置處，所得到的功率分布，其中顯示的功率相對于軸向點(diǎn)呈Sinc2曲線的分布，其最大點(diǎn)處對應(yīng)到物鏡的焦點(diǎn)。雖然在焦點(diǎn)處可以得到最大的信號值。但對于該sinc2曲線取微分后得到其微分曲線，可以發(fā)現(xiàn)功率最大點(diǎn)處的微分值為零。亦即在此位置，共聚焦信號對于樣品的位移并不敏感。反之，差動共聚焦顯微鏡的概念即在于將工作點(diǎn)置于sinc2曲線中微分值最大的一點(diǎn)，而不是在焦點(diǎn)。此工作點(diǎn)的意義為當(dāng)我們在此點(diǎn)進(jìn)行量測時，即使樣品位置僅有微小的偏移，也能造成極大的信號變化。本發(fā)明是對于此現(xiàn)有技術(shù)提出更進(jìn)一歩的改進(jìn)，其中本發(fā)明應(yīng)用三階的非線性擬合増加量測的動態(tài)范圍，使得本發(fā)明中的差動共聚焦顯微鏡可以用于量測較厚的樣品。另夕卜，本發(fā)明應(yīng)用平衡檢測來消除光源功率變動的影響進(jìn)而提高軸向分辨率和解決表面反射或熒光效應(yīng)的差異所造成重建影樣上的錯誤，以得到更佳的影像效果。
圖2顯示在本文中所提出的“平衡檢測差動共聚焦顯微鏡(balanced detectiondifferential confocal microscope)共聚焦顯微鏡”的較佳實施例。與現(xiàn)有的技術(shù)比較下，本發(fā)明有兩項顯著的改進(jìn)，第一項為本發(fā)明應(yīng)用非線性的擬合(nonlinear fitting),所以使得動態(tài)范圍增加；另外，本發(fā)明中使用平衡檢測(balance detection)經(jīng)由消除光源的不穩(wěn)定而改進(jìn)軸向分辨率。已知差動共聚焦顯微鏡在深度方向的分辨率為系統(tǒng)的噪聲所限制，其中噪聲主要是來自光源中光能的不穩(wěn)定(fluctuation)所致。因此，由本發(fā)明中所提出的平衡檢測以去除噪聲將有效的改進(jìn)軸向分辨率。此外，也可以消除(表面形態(tài))中的分岐，其主要是源自于表面反射或熒光效應(yīng)中的差異。圖2中顯示本發(fā)明的組件的安裝結(jié)構(gòu)。其中本發(fā)明包含下列元件
一線性極化光源1，可放出線性的極化光。 —光束放大器(beam expander) 2接收來自該線性極化光源I的光束并將該光束發(fā)散以増加散射截面。本例中該光束放大器由一凹透鏡及ー凸透鏡所形成。其中該凹透鏡的作用在于將入射的光束發(fā)散，以增加光束面積，該凸透鏡的作用是接收來自該凹透鏡的散射光后聚焦后成為平行光束，以便于后段的光信號處理。一極化分束器(polarization beamsplitter) 3主要是由兩介電系數(shù)不同的棱鏡所構(gòu)成。利用介電系數(shù)的不同，使得當(dāng)平行極化的光束入射時可以直接穿過該分束器，反之當(dāng)垂直極化的光束入射吋，碰到該第二面與該第一面的邊界處將使得入射光在的邊界處產(chǎn)生全反射。此裝置在現(xiàn)有技術(shù)中已熟知，所以不再贅述其細(xì)節(jié)?！姆种徊ㄩL光板(quarter wave plate) 4,其目的在于使得進(jìn)入第一端的入射光及從反向的第二端通過的反射光之間的極性相差90度，所以反射光束再由該極化方束器3的第二端進(jìn)入該極化分束器3的兩棱鏡的界面時會被反射，而不會穿過該界面?！司S掃描光學(xué)裝置5,基本上此ニ維掃描光學(xué)裝置5為一鏡面,且可以由一驅(qū)動裝置(圖中沒有顯示，此為現(xiàn)有技術(shù)中所熟知的)驅(qū)動，應(yīng)用該ニ維掃描光學(xué)裝置5的移動可以改變?nèi)肷涔庠谠撶R面反射后的路徑，所以該反射后的光束可以掃瞄過一照射物體。一PZT(壓電轉(zhuǎn)移,piezoelectric transfer)驅(qū)動的物鏡6,可以隨者該ニ維掃描光學(xué)裝置5的位置改變而改變此PZT驅(qū)動的物鏡6使得該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6對準(zhǔn)由該ニ維掃描光學(xué)裝置5反射的光線。此動作是有ー計算機(jī)進(jìn)行精密的控制，以在一二維的平面上對該樣品進(jìn)行精細(xì)的掃描。并可以沿著該物鏡6的軸向(垂直物鏡的鏡面)改變深度。經(jīng)由在不同的軸向深度處進(jìn)行ニ維平面掃描可以建立三維的掃描結(jié)果。當(dāng)由該ニ維掃描光學(xué)裝置5反射的光線入射該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6吋，將為該物鏡6所聚焦，然后入射到樣本20。此入射光束在該樣本不同深度處將產(chǎn)生不同的反射光，這些反射光形成反射光束并沿著入射光路徑的反方向入射該ニ維掃描光學(xué)裝置5。隨后由該ニ維掃描光學(xué)裝置5反射后穿過該四分之一波長光板4入射該極化分束器(polarizationbeamsplitter) 3,并在兩棱鏡的交界處產(chǎn)生反射。一等量分束器7 (50/50 beamsplitter)，反射光束在此等量的分束器7后分成兩束等量的光束并沿著不同的方向行迸。一大面積光檢測器(large area photo detector) 10接收來自該等量分束器7的一道光束并檢測其能量。ー針孔8接收來自該等量分束器7的另一道光束。
一光束倍増管9接收來自該針孔8的光束的信號?！幚砥?1，接收來自該光束倍増管9及該大面積光檢測器10的信號，并進(jìn)行與本發(fā)明相關(guān)的運(yùn)算。一控制器12用于控制該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該P(yáng)ZT驅(qū)動物鏡6的位置以使得該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該P(yáng)ZT驅(qū)動物鏡6可以沿著軸向進(jìn)行不同軸向點(diǎn)處的ニ維掃瞄?！鎯ζ?3用于記錄與本發(fā)明相關(guān)的資料，如儲存的資料包含來自該大面積光檢測器10及該光束倍増管9的信號值，該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6的相對位置及坐標(biāo)等等。一顯示器14用于顯示與本發(fā)明相關(guān)的資料及處理結(jié)果。下文中說明本發(fā)明之裝置的操作如下 由線性極化光源I發(fā)射一光束，該光束經(jīng)過光束放大器一將該光束的截面放大；將該放大截面的光束經(jīng)極化分束器3 ;由于此處該光束尚未經(jīng)過四分之一波長光板，其極化仍然為平行方向，因此得完全通過極化分束器3 ；
經(jīng)極化分束器后的光束入射一二維掃描光學(xué)裝置5,必經(jīng)由該ニ維掃描光學(xué)裝置5的鏡面反射，改變的光束的行進(jìn)方向；
由ー驅(qū)動裝置(圖中沒有顯示，此為現(xiàn)有技術(shù)中所熟知的)驅(qū)動，應(yīng)用該ニ維掃描光學(xué)裝置5的移動可以改變?nèi)肷涔獾穆窂剑允沟迷撊肷涔馐鴴呙檫^一祥品。將經(jīng)過該ニ維掃描光學(xué)裝置5投射向該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6，
其中該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6可以隨者該ニ維掃描光學(xué)裝置5的位置改變而改變此PZT驅(qū)動的物鏡6使得該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6對準(zhǔn)由該ニ維掃描光學(xué)裝置5反射的光線；
經(jīng)該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6后照射到一祥品后，此光束經(jīng)該樣品反射，并經(jīng)該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該四分之一波長光板4，其極化改變?yōu)榇怪狈较?，由反向入射該極化分束器3在該極化分束器3的兩棱鏡的界面處反射向一等量光束器7，反射光束經(jīng)此等量方束器7后分成兩束等量的光束；
其中之一等量光束入射到一大面積光檢測器10 ;以檢測到一信號功率，此信號并沒有經(jīng)過空間濾波，此信號再經(jīng)ー類比數(shù)字轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號；
所以當(dāng)在同一時點(diǎn)下，此信號功率的平均值表示在不同的軸向深度處的功率的平均值，其可以避免由于光源的不穩(wěn)定所產(chǎn)生的功率震蕩，所以由此大面積光檢測器10所得到平均功率將用于作校準(zhǔn)之用。其中另一光束入射到ー針孔8后再入射到一光束倍増管9以檢測其光能并放大該信號；該放大的信號在經(jīng)ー類比數(shù)字轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號；
將上述結(jié)果相關(guān)的資料儲存起來，儲存的資料包含來自該大面積光檢測器10及該光束倍増管9的信號值，該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6的相對位置及坐標(biāo)等等;
調(diào)整該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6的相對位置后在同一軸向深度對方該樣品進(jìn)行ニ維掃描，并執(zhí)行相同的作業(yè)以得到對應(yīng)的數(shù)據(jù)；
然后改變該ニ維掃描光學(xué)裝置5及該P(yáng)ZT驅(qū)動的物鏡6的軸向深度，并重覆上述的步驟，對方該樣品進(jìn)行ニ維掃描，并執(zhí)行相同的作業(yè)以得到對應(yīng)的數(shù)據(jù)；
應(yīng)用上述所得到的數(shù)據(jù)產(chǎn)生該樣品的三維影像。
本發(fā)明的校準(zhǔn)方式說明如下
在量測前，先選定一基準(zhǔn)點(diǎn)A，在幾微米的行程中，在樣品及PZT-驅(qū)動的物鏡6之間的軸方向上不同的位置處對該樣品進(jìn)行量測，并擷取自該光束倍増管9所得到的信號，以得到不同軸向點(diǎn)的反射功率分布函數(shù)，其為近似sinc2的曲線(請參考圖I)。由此曲線可以找到ー工作點(diǎn)，即為sinc2曲線之微分值為最大的一點(diǎn)。然后使用三階非線性的擬合，在該工作點(diǎn)的附近，找到一三階(three order)的匹配曲線，其可匹配該軸向點(diǎn)功率分布函數(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)中的線性擬合比較下，本發(fā)明中使用三階非線性的擬合，因此可以得到ー較大的動態(tài)范圍(如圖3所示)。圖3中顯示應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)的ー階線性擬合其可應(yīng)用的動態(tài)范為約為400納米，但本發(fā)明中使用三階的非線性擬合其動態(tài)范圍增加為1000納米。同時由該大面積光檢測器10所得到的光信號強(qiáng)度也被記錄下來。微調(diào)樣品與PZT驅(qū)動的物鏡6之間的距離到該工作點(diǎn)(圖I中所標(biāo)示的)，然后在原先之基準(zhǔn)點(diǎn)的附近進(jìn)行ニ維掃瞄。每ー掃瞄點(diǎn)B所得到的反射光束經(jīng)不同的鏡面作用后由大面積光檢測器10及該光束倍増管9擷取對應(yīng)的信號。其中由該光束倍増管9所得到的信號先經(jīng)過該針孔8的過濾，所以唯有在該工作點(diǎn)附近之深度處的信號才會被擷取，而其余的信號會被過濾棹。而由該大面積光檢測器10所得到的信號強(qiáng)度代表在該掃瞄點(diǎn)B的反射信號的總強(qiáng)度。由于樣品在軸向的密度分布不均勻的緣故，所以在掃瞄點(diǎn)B的反射信號總強(qiáng)度(即由大面積光檢測器10所接收信號的強(qiáng)度)與在基準(zhǔn)點(diǎn)A的反射信號總強(qiáng)度會產(chǎn)生差異。此差異適可用來校正由該光束倍増管9所得到的信號的強(qiáng)度。首先，依據(jù)在掃瞄點(diǎn)B及基準(zhǔn)點(diǎn)A所量測的反射信號總強(qiáng)度的差異，將由掃瞄點(diǎn)B所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管9所接收信號的強(qiáng)度)進(jìn)行調(diào)整(如將掃瞄點(diǎn)B所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度X掃瞄點(diǎn)B的反射信號總強(qiáng)度/基準(zhǔn)點(diǎn)A的反射信號總強(qiáng)度)，以消除因為樣品在軸向的密度分布不均勻所產(chǎn)生的誤差。然后修正軸向高度所產(chǎn)生的誤差，先將掃瞄點(diǎn)B所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管9所接收信號的強(qiáng)度)除以在工作點(diǎn)的斜率即可得到軸向高度差(即掃瞄點(diǎn)B與基準(zhǔn)點(diǎn)A)之間的高度差。應(yīng)用此高度差可以找到在該3D擬合曲線(fittingcurve)上對應(yīng)的點(diǎn)。應(yīng)用此對應(yīng)點(diǎn)與該工作點(diǎn)在該3D擬合曲線上對應(yīng)的功率的比值修正由該工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度(即由光束倍増管9所接收信號的強(qiáng)度)，即將該工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度乘上該比值，如此得到在該掃瞄點(diǎn)B的反射功率，并記憶到該存儲器中，然后對其它的掃瞄點(diǎn)進(jìn)行同樣的運(yùn)算。如果發(fā)現(xiàn)某一掃瞄點(diǎn)的反射信號”總”強(qiáng)度(即來自大面積光檢測器10的信號強(qiáng)度)與其它點(diǎn)的偏差過大時，有可能是樣品的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很大的變異，則必須重新進(jìn)行較準(zhǔn)的工作。如此反覆此一作業(yè)，直到整個平面均掃瞄完成為止，并將這些結(jié)果儲存在該存儲器中。然后改變樣品與PZT驅(qū)動的物鏡6之間的距離(軸向深度)，對另一平面重覆相同的操作，直到整個樣品所涵蓋的空間(或所欲埽瞄的空間)均被掃瞄過后，停止該項操作。最后，將所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行影像重建以得到樣品的三維影像。與現(xiàn)有技術(shù)中相比較，可以得知本發(fā)明提供兩項的改進(jìn)。第一點(diǎn)，本發(fā)明使用非線性擬合曲線，而非僅使用線性區(qū)域，所以可以增加可應(yīng)用的動態(tài)范圍。第二點(diǎn)，經(jīng)由消除光源中的功率的變動，平衡的檢測可以改進(jìn)軸向的分辨率。其中顯示差動共聚焦顯微鏡在深度方向的分辨率受到系統(tǒng)噪聲的限制，其中噪聲主要是由于光源本身即存在的功率不穩(wěn)定(power fluctuation)所致。因此噪聲主要來自光源中的功率不穩(wěn)定。本發(fā)明中提出應(yīng)用平衡移除此ー噪聲將有效的改進(jìn)軸向分辨率。此外，由于表面反射或熒光效應(yīng)的差異所產(chǎn)的分歧可以消除棹。大面積光檢測器10不具深度辨識的能力，只是其表示光源的功率不穩(wěn)定，及表面反射的映射或突光效應(yīng)(fluorescence efficiency)的結(jié)果。另言之，由該光束倍增管9所得到的信號的強(qiáng)度表示光源中所有的功率震動，表面反射及的熒光效應(yīng)及表面形態(tài)的總合結(jié)果。由光束倍増管9及大面積光檢測器10的平衡檢測，不只允許可以得到表面形態(tài)，而不受表面反射或熒光效應(yīng)變動的影響，而且可以移除由于光源的功率振動所產(chǎn)生的噪聲。此噪聲將限制軸向的分辨率。圖4顯示本發(fā)明的模擬結(jié)果。其中圖4-1表示樣品的剖面影像；圖4-4表示應(yīng)用本發(fā)明的結(jié)果所得到的影像。綜上所述，本發(fā)明人性化之體貼設(shè)計，相當(dāng)符合實際需求。其具體改進(jìn)現(xiàn)有缺失，相較于現(xiàn)有技術(shù)明顯具有突破性之進(jìn)步優(yōu)點(diǎn)，確實具有功效之增進(jìn)，且非易于達(dá)成。
上列詳細(xì)說明是針對本發(fā)明之一可行實施例的具體說明，只是該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
權(quán)利要求
1.ー種平衡檢測共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)，其特征在于，包含 一光源; 一光束放大器接收來自該光源的光束并經(jīng)散射后放大該光束的截面； ー聚焦機(jī)構(gòu)，用于聚焦通過該光束放大器的光，以將在光束聚焦到一待測樣品上； ー掃瞄機(jī)構(gòu)，能調(diào)整該聚焦機(jī)構(gòu)相對于該樣品的軸向深度，并在不同深度處的樣品平面上的移動，以使得該光束在不同的樣品點(diǎn)上聚焦后并產(chǎn)生反射光束； 一等量分束器，將該反射光束分成兩等量光束； 一大面積光檢測器接收來自該等量分束器的一道光束，并測得該光束的信號強(qiáng)度； ー針孔接收來自該等量分束器的另一道光束； 一光束倍増管接收來自該針孔的光束的信號，并測得此光束的信號的強(qiáng)度； ー處理器，接收來自該光束倍増管及該大面積光檢測器所檢測的信號的信號強(qiáng)度，并經(jīng)過校準(zhǔn)的程序以得到校準(zhǔn)后的反射信號強(qiáng)度；并應(yīng)用在不同的軸向深度處的不同截面上所得到信號強(qiáng)度重建該樣品的影像。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其特征在干，尚包含 ー控制器，用于控制該掃瞄機(jī)構(gòu)中的ニ維掃描光學(xué)裝置及物鏡的位置以使得該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡可以沿著軸向進(jìn)行不同軸向點(diǎn)處的ニ維掃瞄； 一存儲器，用于記錄相關(guān)資料，其中包含來自該大面積光檢測器及該光束倍増管的信號值、該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的相對位置及坐標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其特征在干，尚包含ー導(dǎo)光裝置用于導(dǎo)引該截面放大的光束進(jìn)入該掃貓機(jī)構(gòu)，且導(dǎo)引該反射光束進(jìn)入該分束器，其中的導(dǎo)光機(jī)構(gòu)包含 一極化分束器位于該光束放大器的后方，主要是由兩介電系數(shù)不同的棱鏡所構(gòu)成；利用介電系數(shù)的不同，使得當(dāng)光束從第一面射入時可以直接穿過該分束器，反之當(dāng)光從第二面射入時，碰到第一面的邊界處將使得入射在該邊界處產(chǎn)生全反射； 一四分之一波長光板位于該極化分束器該后方，該四分之一波長光板包含反向的第一端及第ニ端，使得進(jìn)入第一端的入射光及從第二端通過的反射光之間的極性相差90度，所以反射光束再如第二端進(jìn)入該極化分束器之兩棱鏡的界面時會被反射，而不會穿過該界面。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，該掃貓機(jī)構(gòu)為一二維掃描光學(xué)裝置，其包含ー鏡面，且可以由ー驅(qū)動裝置驅(qū)動，應(yīng)用該ニ維掃描光學(xué)裝置的移動可以改變?nèi)肷涔夥瓷浜蟮穆窂剑栽摲瓷浜蟮墓馐梢話呙檫^一照射物體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，該聚焦機(jī)構(gòu)為ー應(yīng)用壓電轉(zhuǎn)換器驅(qū)動的物鏡，能隨著該ニ維掃描光學(xué)裝置的位置改變而改變此應(yīng)用壓電轉(zhuǎn)換器驅(qū)動的物鏡使得該應(yīng)用壓電轉(zhuǎn)換器驅(qū)動的物鏡對準(zhǔn)由該ニ維掃描光學(xué)裝置反射的光線。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，該光源為線性極化光源。
7.一種成像系統(tǒng)進(jìn)行三維影像重建的方法，其特征在于，包含步驟為 由該光源發(fā)射一光束，該光束經(jīng)過ー光束放大器將該光束的截面放大； 經(jīng)該極化分束器后的光束入射一二維掃描光學(xué)裝置，并通過該ニ維掃描光學(xué)裝置的鏡面反射，改變的光束的行進(jìn)方向； 由ー驅(qū)動裝置驅(qū)動該ニ維掃描光學(xué)裝置以改變?nèi)肷涔馐蟮穆窂剑粚⒔?jīng)過該ニ維掃描光學(xué)裝置的光束投射向一物鏡；其中，該物鏡能隨著該ニ維掃描光學(xué)裝置的位置改變而改變其軸向深度，及在垂直于此軸向深度之平面上的位置，使得該物鏡對準(zhǔn)由該ニ維掃描光學(xué)裝置所傳送過來的光束； 反射光束經(jīng)過該等量分束器后分成兩等量的光束； 其中之一的等量光束入射到一大面積光檢測器，以檢測到一信號功率；此信號功率的平均值表示在不同的軸向深度處的功率的平均值以避免由于光源的不穩(wěn)定所產(chǎn)生的功率不穩(wěn)定； 其中另一等量光束入射到該針孔后在入射到該光束倍增管以檢測并放大該信號； 將上述結(jié)果相關(guān)的資料儲存起來，儲存的資料包含來自該大面積光檢測器及該光束倍增管的信號值、該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的相對位置及坐標(biāo)等等；并對該光束倍増管所得到的信號值進(jìn)行校準(zhǔn)； 調(diào)整該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的相對位置后在同一軸向深度對方該樣品進(jìn)行ニ維掃描，并執(zhí)行相同的作業(yè)以得到對應(yīng)的數(shù)據(jù)； 然后改變該ニ維掃描光學(xué)裝置及該物鏡的軸向深度，并重覆上述的步驟，對方該樣品進(jìn)行ニ維掃描，并執(zhí)行相同的作業(yè)以得到對應(yīng)的數(shù)據(jù)；以及應(yīng)用上述所得到的校準(zhǔn)后的數(shù)據(jù)產(chǎn)生該樣品的三維影像。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將該放大截面的光束通過ー極化分束器及一四分之一波長光板；且由樣品反射該光束經(jīng)應(yīng)用壓電轉(zhuǎn)換器驅(qū)動的該物鏡后照射到一樣品后，此光束經(jīng)該樣品反射，并經(jīng)該ニ維掃描光學(xué)裝置反射后以反方向入射該四分之一波長光板，并在該極化方束器上的兩棱鏡的界面處反射向該等量分束器。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該校準(zhǔn)的步驟包含 在量測前，選定一基準(zhǔn)點(diǎn)，在幾個Pm的行程中，在樣品及物鏡之間的軸方向上不同的位置處將光束入射該樣品； 擷取自該光束倍増管所得到的信號，以得到不同軸向點(diǎn)的反射功率分布函數(shù)，其為近似sinc2的曲線；由此曲線可以找到一工作點(diǎn)，即為sinc2曲線之微分值為最大的一點(diǎn)；使用三階非線性的fitting，在該工作點(diǎn)的附近得到一三階的匹配曲線，其可匹配該軸向點(diǎn)功率分布函數(shù)；因此可以得到ー較大的動態(tài)范圍；以及記錄該大面積光檢測器所得到的光信號強(qiáng)度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該ニ維掃瞄的步驟尚包含步驟 微調(diào)樣品與物鏡之間的距離到該工作點(diǎn)； 在原先進(jìn)行校準(zhǔn)之點(diǎn)的附近進(jìn)行ニ維掃瞄；每ー掃瞄點(diǎn)所得到的反射光束經(jīng)不同的鏡面作用后由大面積光檢測器及該光束倍增管擷取對應(yīng)的信號；其中因為由該光束倍増管所得到的信號先經(jīng)過該針孔的過濾，所以唯有在該工作點(diǎn)附近之深度處的信號才會被擷?。欢稍摯竺娣e光檢測器所得到的信號強(qiáng)度代表在該掃瞄點(diǎn)的反射信號的總強(qiáng)度； 依據(jù)在掃瞄點(diǎn)及基準(zhǔn)點(diǎn)所量測的反射信號總強(qiáng)度的差異，將由掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)整； 修正軸向高度所產(chǎn)生的誤差，先將掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度即由光束倍增管所接收信號的強(qiáng)度除以在工作點(diǎn)的斜率即可得到軸向高度差即掃瞄點(diǎn)與基準(zhǔn)點(diǎn)之間的高度差；應(yīng)用此高度差找到在該3D擬合曲線上對應(yīng)的點(diǎn)；應(yīng)用此對應(yīng)點(diǎn)與該工作點(diǎn)在該3D擬合曲線上對應(yīng)的功率的比值修正由該工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度，即將該工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度乘上該比值，如此得到在該掃瞄點(diǎn)的反射功率，并記憶到一存儲器中； 對其它的掃瞄點(diǎn)進(jìn)行同樣的運(yùn)算；當(dāng)發(fā)現(xiàn)某一掃瞄點(diǎn)的反射信號“總”強(qiáng)度即來自大面積光檢測器的信號強(qiáng)度與其它點(diǎn)的偏差過大時，則必須重新進(jìn)行較準(zhǔn)的工作。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將由掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度即由光束倍増管所接收信號的強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)整的方式將掃瞄點(diǎn)所得到的工作點(diǎn)的反射信號強(qiáng)度X掃瞄點(diǎn)B的反射信號總強(qiáng)度/基準(zhǔn)點(diǎn)的反射信號總強(qiáng)度。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在干，應(yīng)用壓電轉(zhuǎn)換器驅(qū)動該物鏡。
全文摘要
一種平衡檢測共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)其三維影像重建方法，包含:光源；光束放大器；聚焦機(jī)構(gòu)；掃瞄機(jī)構(gòu)；等量分束器，將反射光束分成兩等量光束；大面積光檢測器接收來自該等量分束器的一道光束，并測得使光束的信號強(qiáng)度；針孔接收來自該等量分束器的另一道光束；光束倍增管接收來自該針孔的信號，并測得此信號的強(qiáng)度；處理器，接收來自該光束倍增管及該大面積光檢測器所檢測的信號的信號強(qiáng)度，并經(jīng)過校準(zhǔn)的程序以得到校準(zhǔn)后的反射信號強(qiáng)度；并應(yīng)用在不同的軸向深度處的不同截面上所得到信號強(qiáng)度，重建該樣品的影像。使用三階非線性擬合，可增加可應(yīng)用的動態(tài)范圍。且經(jīng)由消除光源中的功率的變動，平衡的檢測可以改進(jìn)軸向的分辨率。
文檔編號G02B21/06GK102866492SQ20111018789
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者黃書偉, 李選德 申請人:黃書偉, 李選德