可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑及制備方法
【專利摘要】可高效降解氯氰菊酯和3?苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑及制備方法，原料為：復(fù)合菌液、硅藻土、木質(zhì)素磺酸鈉、吐溫80、份脫脂奶粉和海藻糖，所述復(fù)合菌液由地衣芽孢桿菌B?1菌液和鞘氨醇單胞菌SC?1菌液組成；工藝步驟：(1)將硅藻土加入復(fù)合菌液中得到載體?菌液混合料；將吐溫80、木質(zhì)素磺酸鈉、脫脂乳粉和海藻糖加入與復(fù)合菌液等體積的無菌水得到助劑溶液；將助劑溶液和載體?菌液混合料混合均勻，得到菌劑混合液；(2)將步驟(1)得到的菌劑混合液按照如下工藝參數(shù)依次進行干燥：?46～?48℃保持1.0～3.0h，?36～?40℃保持1.0～3.0h，?26～?30℃保持1.0～3.0h，?15～?20℃保持1.0～3.0h，0～4℃保持10～14h，8～12℃保持1.0～3.0h，30～40℃保持2.0～6.0h，15～25℃保持20～24h，得到可濕性菌粉劑。CCTCC M 201625820160511CCTCC M 201627020160518
【專利說明】
可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑及制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)藥氯氰菊酯降解領(lǐng)域，特別涉及可降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸 的可濕性菌粉劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著有機氯和有機磷殺蟲劑的部分或全部禁用，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的使 用量已經(jīng)占據(jù)世界殺蟲劑市場的30%。氯氰菊酯是一種使用最為廣泛的擬除蟲菊酯類農(nóng) 藥。但是隨著其使用量和使用范圍的不斷增加，茶葉、果蔬和土壤中均有其殘留超標(biāo)的報 道。殘留的氯氰菊酯會通過食物鏈進入人體，對神經(jīng)、免疫和生殖系統(tǒng)造成毒害。由于微生 物降解氯氰菊酯具有環(huán)保、安全和高效的特點，因此其廣泛被用于消除茶葉、果蔬和土壤中 殘留的氯氰菊酯。然而，微生物降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥往往導(dǎo)致3-苯氧基苯甲酸的積累。3-苯氧基苯甲酸在環(huán)境中的毒性和迀移性比擬除蟲菊酯類農(nóng)藥還要強，其會干擾人體性激素 正常分泌、導(dǎo)致男性精子DNA斷裂和精子濃度降低。
[0003] 目前，國內(nèi)對微生物降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的報道較多，已公開的發(fā)明專利主要 包括降解氯氰菊酯菌粉的制備及其應(yīng)用（如ZL 201510016653.3、ZL 200510022548.7)、降 解氯氰菊酯菌液的制備及其應(yīng)用（如ZL 201210013359.3、ZL 201210013350.2、ZL 200810224883 · 9、ZL 200810119983 · 5、ZL 200810010695 · 6)。然而，這些菌粉或菌液難以降 解3-苯氧基苯甲酸，會造成新的安全性問題。此外，菌液普遍存在貯存期短、對環(huán)境不良因 素抵抗力差等問題;菌粉也存在潤濕性差、噴施不方便等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯 甲酸的可濕性菌粉劑及制備方法，所述可濕性菌粉劑不僅能減少農(nóng)作物和土壤中氯氰菊酯 和3-苯氧基苯甲酸的殘留量，而且潤濕時間短，貯藏期較長。
[0005] 本發(fā)明所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑的制備方法， 所用原料及各原料的質(zhì)量份為：35份~55份復(fù)合菌液、33份~42份娃藻土、4份~10份木質(zhì) 素磺酸鈉、2份~7份吐溫80、1.5份~3.0份脫脂奶粉和1.5份~3.0份海藻糖，所述復(fù)合菌液 由地衣芽抱桿菌B_1 (Bacillus licheniformis，CCTCC Μ 2016258)菌液和鞘氨醇單胞菌 SC-l(Sphingomonas sp.，CCTCC Μ 2016270)菌液組成；
[0006] 工藝步驟如下：
[0007] (1)菌劑混合液的制備
[0008] 將硅藻土加入復(fù)合菌液中攪拌均勻，得到載體-菌液混合料;將吐溫80、木質(zhì)素磺 酸鈉、脫脂乳粉和海藻糖加入與復(fù)合菌液等體積的無菌水中并攪拌至它們完全溶解且混合 均勻，得到助劑溶液;將助劑溶液和載體-菌液混合料混合均勻，得到菌劑混合液；
[0009] (2)菌劑混合液的干燥
[0010] 將步驟（1)得到的菌劑混合液按照如下工藝參數(shù)依次進行干燥:-46°C~-48°c保 持 l.Oh ~3.0h，-36°C ~_4(TC 保持 l.Oh ~3.0h，-26°C ~_3(TC 保持 l.Oh ~3.0h，-15°C ~-20 。(:保持 1 · Oh ~3 · Oh，0 °C ~4 °C 保持 1 Oh ~14h，8 °C ~12 °C 保持 1 · Oh ~3 · Oh，30 °C ~40 °C 保持 2. Oh~6. Oh，15 °C~25 °C保持20h~24h，得到可濕性菌粉劑。
[0011] 本發(fā)明所述方法將得到的可濕性菌粉劑在無菌條件下分裝后于2°C~8°C下冷藏。
[0012] 上述方法中，復(fù)合菌液由地衣芽孢桿菌B-1菌液與鞘氨醇單胞菌SC-ι菌液以1: (2 ~2.5)的體積比配料并混合均勻后形成。地衣芽孢桿菌B-1菌液中菌體的濃度為5.0 X 107cfu/mL~5 · 0 X 108cfu/mL，鞘氨醇單胞菌SC-1菌液中菌體的濃度為5 · 0 X 108cfu/mL~ 5.0X109cfu/mL〇
[0013] 所述地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌SC-1分別是由茶園土壤和農(nóng)藥廠污泥中分 離得到。于2016年5月11日和2016年5月18日已分別將地衣芽孢桿菌B-1、鞘氨醇單胞菌SC-1 送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢，珞珈山）保藏；地衣芽孢桿菌B-1的分類:Baci 1 lus licheniformis，保藏號:CCTCC Μ 2016258;鞘氨醇單胞菌SC-1 的分類:Sphingomonas sp·， 保藏號：CCTCC Μ 2016270。
[0014] 本發(fā)明所述高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑由上述方法制 備得到。
[0015] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0016] 1、本發(fā)明所述可濕性菌粉劑特別適合消除茶葉和果蔬中殘留的氯氰菊酯和3-苯 氧基苯甲酸及修復(fù)被氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸污染的土壤，試驗表明，對小白菜和栽培 土壤中的氯氰菊酯殘留的降解率分別達到73.47%和91.47%，與未噴施本發(fā)明所述可濕性 菌粉劑的對照品相比，小白菜和栽培土壤中3-苯氧基苯甲酸殘留量分別降低53.50%和 54.84% (見實施例4)。
[0017] 2、本發(fā)明所述可濕性菌粉劑中的硅藻土能夠吸附和保護微生物免受環(huán)境不良因 素的影響;木質(zhì)素磺酸鈉能夠提高菌粉劑在水中的分散率，有利于噴施;吐溫80能夠縮短菌 粉劑的潤濕時間，有利于菌粉劑與水的快速混合;脫脂奶粉和海藻糖能夠在凍干工藝中保 護微生物菌株免受低溫的影響，有利于保持菌株的降解活性。
[0018] 3、本發(fā)明所述可濕性菌粉劑不僅潤濕時間短（10.84s)、分散性能好(分散率高達 83.99%)和活菌數(shù)高（菌株8-1活菌數(shù)為4.50\10 11，菌株3(：-1活菌數(shù)為4.80\1012)，而且 使用方便，貯藏期長（多180d)。
[0019] 4、本發(fā)明所述方法工藝簡單，原料易于獲取，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0020] 圖1是實施例4中噴施可濕性菌粉劑液、復(fù)合菌液后土壤和小白菜中氯氰菊酯的降 解率與時間的關(guān)系曲線；
[0021 ]圖2是實施例4中噴施可濕性菌粉劑液、復(fù)合菌液后土壤和小白菜中3-苯氧基苯甲 酸含量與時間的關(guān)系曲線。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實施例對本發(fā)明所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性 菌粉劑的制備方法及所制備的可濕性菌粉劑作進一步。
[0023] 下述實施例中，地衣芽孢桿菌B-1菌液和鞘氨醇單胞菌SC-1菌液是將地衣芽孢桿 菌B-1菌、鞘氨醇單胞菌SC-1菌分別接種于氯氰菊酯濃度為100mg/L的LB培養(yǎng)基和3-苯氧基 苯甲酸濃度為l〇〇mg/L的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后于8000rpm下離心10min，收集菌 體后用生理鹽水復(fù)溶，調(diào)節(jié)菌體濃度后得到。所述LB培養(yǎng)基:酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉 l〇g，加蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH為7 · 0~7 · 5，121°C殺菌20min ;MS培養(yǎng)基:硫酸銨1 · 5g，磷酸二氫 鉀0.58，磷酸氫二鉀1.58，氯化鈉0.58，硫酸鎂0.28，加蒸餾水至11^，調(diào)節(jié)口!1為7.0~7.5，121 °C 殺菌 20min。
[0024] 下述實施例中，無菌水是將蒸餾水于121°C殺菌20min，冷卻至室溫后制得。
[0025] 實施例1
[0026]本實施例中，所用原料及各原料的質(zhì)量份為:55kg復(fù)合菌液、33kg娃藻土、4kg木質(zhì) 素磺酸鈉、2kg吐溫80、1.5kg脫脂奶粉和1.5kg海藻糖；
[0027] 所述復(fù)合菌液由菌體濃度為5.0X107cfu/mL的地衣芽孢桿菌B-1菌液與菌體濃度 為5.0 X 108cfu/mL的鞘氨醇單胞菌SC-1菌液以1:2.5的體積比配料并混合均勻后形成； [0028] 工藝步驟如下：
[0029] (1)菌劑混合液的制備
[0030]將硅藻土加入復(fù)合菌液中攪拌均勻，得到載體-菌液混合料;將吐溫80、木質(zhì)素磺 酸鈉、脫脂乳粉和海藻糖加入與混合菌液等體積的無菌水中并攪拌至它們完全溶解且混合 均勻，得到助劑溶液;將助劑溶液和載體-菌液混合料混合均勻，得到菌劑混合液；
[0031] (2)菌劑混合液的干燥
[0032]將步驟（1)中得到的菌劑混合液按照如下工藝參數(shù)依次進行干燥：_46°C保持 3 · Oh，-36 °C 保持 3 · Oh，-26 °C 保持 3 · Oh，-15 °C 保持 3 · Oh，0 °C 保持 14h，8 °C 保持 3 · Oh，30 °C 保 持6h，15 °C保持24h，得到可濕性菌粉劑；
[0033] (3)分裝
[0034] 將步驟(2)中得到的可濕性菌粉劑在無菌條件下分裝后于2°C下冷藏。
[0035] 將本實施例制備的可濕性菌粉劑參照GB/T 19567.3-2004(蘇云金芽胞桿菌可濕 性菌劑）、GB 20287-2006(農(nóng)藥微生物菌劑）、GB/T 19136-2003(農(nóng)藥熱貯藏穩(wěn)定性測定方 法)進行質(zhì)量指標(biāo)和貯藏穩(wěn)定性檢測，檢測結(jié)果見表1和表2。
[0036]表1可濕性菌粉劑的質(zhì)量指標(biāo)
[0038]表2可濕性粉劑的貯藏穩(wěn)定性
[0040]檢測結(jié)果表明，本實施例所制備的可濕性菌粉劑各項質(zhì)量指標(biāo)和貯藏穩(wěn)定性均符 合或優(yōu)于相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)，其品質(zhì)符合可濕性菌粉劑商業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的要求。
[0041 ] 實施例2
[0042]本實施例中，所用原料及各原料的質(zhì)量份為:47kg復(fù)合菌液、38kg娃藻土、7kg木質(zhì) 素磺酸鈉、4kg吐溫80、2.0kg脫脂奶粉和2.0kg海藻糖；
[0043] 所述復(fù)合菌液由菌體濃度為5.0 X 108cfu/mL的地衣芽孢桿菌B-1菌液與菌體濃度 為5.0 X 109cfu/mL的鞘氨醇單胞菌SC-1菌液以1:2.3的體積比配料并混合均勻后形成；
[0044] 工藝步驟如下：
[0045] (1)菌劑混合液的制備
[0046]將硅藻土加入復(fù)合菌液中攪拌均勻，得到載體-菌液混合料;將吐溫80、木質(zhì)素磺 酸鈉、脫脂乳粉和海藻糖加入與混合菌液等體積的無菌水中并攪拌至它們完全溶解且混合 均勻，得到助劑溶液;將助劑溶液和載體-菌液混合料混合均勻，得到菌劑混合液；
[0047] (2)菌劑混合液的干燥
[0048]將步驟（1)中得到的菌劑混合液按照如下工藝參數(shù)依次進行干燥：_47°C保持 2 · Oh，-38 °C 保持 2 · Oh，-28 °C 保持 2 · Oh，-18 °C 保持 2 · Oh，2 °C 保持 12h，10 °C 保持 2 · Oh，35 °C 保 持4h，20°C保持22h，得到可濕性菌粉劑；
[0049] (3)分裝
[0050] 將步驟(2)中得到的可濕性菌粉劑在無菌條件下分裝后于5°C下冷藏。
[0051]參照實施例1中的方法，對本實施例所制備的可濕性菌粉劑依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進行質(zhì) 量指標(biāo)和貯藏穩(wěn)定性檢測，結(jié)果與實施例1 一致。
[0052] 實施例3
[0053]本實施例中，所用原料及各原料的質(zhì)量份為：35kg復(fù)合菌液、42kg娃藻土、10kg木 質(zhì)素磺酸鈉、7kg吐溫80、3.0kg脫脂奶粉和3.0kg海藻糖；
[0054]所述復(fù)合菌液由菌體濃度為5.0 X 107cfu/mL的地衣芽孢桿菌B-1菌液與菌體濃度 為5.0 X 109cfu/mL的鞘氨醇單胞菌SC-1菌液以1:2的體積比配料并混合均勻后形成；
[0055] 工藝步驟如下：
[0056] (1)菌劑混合液的制備
[0057]將硅藻土加入復(fù)合菌液中攪拌均勻，得到載體-菌液混合料;將吐溫80、木質(zhì)素磺 酸鈉、脫脂乳粉和海藻糖加入與混合菌液等體積的無菌水中并攪拌至它們完全溶解且混合 均勻，得到助劑溶液;將助劑溶液和載體-菌液混合料混合均勻，得到菌劑混合液；
[0058] (2)菌劑混合液的干燥
[0059]將步驟（1)中得到的菌劑混合液按照如下工藝參數(shù)依次進行干燥：_48°C保持 1 · Oh，-40 °C 保持 1 · Oh，-30 °C 保持 1 · Oh，-20 °C 保持 1 · Oh，4 °C 保持 1 Oh，12 °C 保持 1 · Oh，40 °C 保 持2. Oh，25°C保持20h，得到可濕性菌粉劑；
[0060] (3)分裝
[0061] 將步驟(2)中得到的可濕性菌粉劑在無菌條件下分裝后于8°C下冷藏。
[0062] 參照實施例1中的方法，對本實施例所制備的可濕性菌粉劑依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進行質(zhì) 量指標(biāo)和貯藏穩(wěn)定性檢測，結(jié)果與實施例1 一致。
[0063] 實施例4
[0064] 本實施例將實施例2制備的可濕性菌粉劑進行氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸降解試 驗。
[0065]從菜園中采集未受氯氰菊酯污染的表層(0~20cm)土壤，過20目篩，過夜風(fēng)干。將 風(fēng)干的土壤分別裝于標(biāo)有A和B的兩個菜盆(45X32 X23cm)中，栽植3葉期的小白菜秧苗。參 照中國國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則GB/T 8321.1-2000，向A菜盆和B菜盆中的土壤和小白菜 按0.045mL/m2的噴施量噴施濃度10% (w/v)的氯氰菊酯乳油（中國天津美邦化工科技有限 公司）。噴施氯氰菊酯乳油24h后取樣，測定A菜盆和B菜盆的土壤和小白菜中的氯氰菊酯和 3-苯氧基苯甲酸含量。取樣后將lg實施例2制備的可濕性菌粉劑復(fù)溶于lkg無菌水中，均勻 噴施于A菜盆中的土壤和小白菜表面，將lkg實施例2所述復(fù)合菌液均勾噴施于B盆中的土壤 和小白菜表面(做為對照）。繼后每天向A菜盆和B菜盆中補充適量的水，以保證小白菜的正 常生長。分別于噴施可濕性菌粉劑溶液和復(fù)合菌液后的1(1、2(1、3(1、4(1、5(1取樣，測定4菜盆和 B菜盆的土壤和小白菜中的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸含量。測定結(jié)果見圖1和圖2所示。
[0066] 從圖1可以看出，本發(fā)明所述可濕性菌粉劑噴施5d后，對小白菜中氯氰菊酯殘留的 降解率達到73.47%，栽培土壤中氯氰菊酯殘留的降解率達到91.47%，與復(fù)合菌液相比，對 小白菜和栽培土壤中氯氰菊酯殘留的降解率大幅度提高。
[0067] 從圖2可以看出，噴施可濕性菌粉劑溶液和復(fù)合菌液5d后，與噴施復(fù)合菌液的對照 品相比，噴施本發(fā)明所述可濕性菌粉劑液的小白菜和栽培土壤中3-苯氧基苯甲酸的殘留量 分別降低53.50%和54.84%，表明本發(fā)明所述可濕性菌粉劑對3-苯氧基苯甲酸的降解效果 優(yōu)于復(fù)合菌液。
[0068] 注:氯氰菊酯的降解率（％) = (1_樣品中氯氰菊酯的殘留量/樣品中氯氰菊酯的初 始含量）Χ1〇〇。
【主權(quán)項】
1. 一種可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑的制備方法，其特征在 于所用原料及各原料的質(zhì)量份為:35份~55份復(fù)合菌液、33份~42份娃藻土、4份~10份木 質(zhì)素磺酸鈉、2份~7份吐溫80、1.5份~3.0份脫脂奶粉和1.5份~3.0份海藻糖，所述復(fù)合菌 液由地衣芽抱桿菌B-1 (Bacillus licheniformis，CCTCC M 2016258)菌液和鞘氨醇單胞菌 SC-l(Sphingomonas sp.，CCTCC M 2016270)菌液組成； 工藝步驟如下： (1) 菌劑混合液的制備 將硅藻土加入復(fù)合菌液中攪拌均勻，得到載體-菌液混合料;將吐溫80、木質(zhì)素磺酸鈉、 脫脂乳粉和海藻糖加入與復(fù)合菌液等體積的無菌水中并攪拌至它們完全溶解且混合均勻， 得到助劑溶液;將助劑溶液和載體-菌液混合料混合均勻，得到菌劑混合液； (2) 菌劑混合液的干燥 將步驟（1)得到的菌劑混合液按照如下工藝參數(shù)依次進行干燥：-46°C~_48°C保持 1 · Oh~3 · Oh，-36 cC ~-40 cC 保持 1 · Oh~3 · Oh，-26 cC ~-30 cC 保持 1 · Oh ~3 · Oh，-15 cC ~-20 cC 保持 1 · Oh~3 · Oh，0 °C ~4 °C保持 IOh~14h，8 °C ~12 °C 保持 1 · Oh~3 · Oh，30 °C ~40 °C 保持 2. Oh~6. Oh，15 °C~25 °C保持20h~24h，得到可濕性菌粉劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑的制備 方法，其特征在于將得到的可濕性菌粉劑在無菌條件下分裝后于2°C~8°C下冷藏。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑的 制備方法，其特征在于復(fù)合菌液由地衣芽孢桿菌B-I菌液與鞘氨醇單胞菌SC-I菌液以1: (2 ~2.5)的體積比配料并混合均勻后形成。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可濕性菌粉劑的制備 方法，其特征在于地衣芽孢桿菌B-I菌液中菌體的濃度為5.0 X 107cfu/mL~5.0 X IO8Cfu/ mL，鞘氨醇單胞菌SC-I菌液中菌體的濃度為5.0 X 108cfu/mL~5.0 X 109cfu/mL。5. 權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述方法制備的可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯 甲酸的可濕性菌粉劑。
【文檔編號】A62D3/02GK105903148SQ201610348400
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】姚開, 趙甲元, 吳雙, 賈冬英, 遲原龍, 李欣蔚, 徐穎超
【申請人】四川大學(xué)