一種低溫下微生物降解石油污染物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及石油污染技術領域，特別是一種低溫下微生物降解石油污染物的方法。
【背景技術】
[0002]石油是工業(yè)的血液，作為重要的能源和化工原料，都具有難以替代的作用。隨著石油應用范圍的不斷拓展，消耗量日趨增大。在石油的開采、煉制、貯藏和運輸?shù)倪^程中，由于受到工藝和技術水平的限制以及突發(fā)事故的影響，石油以及含油的廢渣廢水正在大量的進入到環(huán)境中，嚴重的影響了生態(tài)環(huán)境的平衡。而隨著石油的海洋運輸規(guī)模的進一步擴大和海上采油業(yè)的發(fā)展，海洋已成為石油污染的重災區(qū)。自1969年美國加州圣巴巴拉油田發(fā)生第一次海上漏油事故以來，世界上已有超過40處大的海洋泄露事故。石油污染的治理引起了人們越來越多的關注。石油成分復雜，降解緩慢，且隨產地不同，其處理方法也不盡相同，而海洋環(huán)境又復雜多變，往往要面對溫度和鹽度上的苛刻條件，生物修復具有高效、經濟的優(yōu)點。
[0003]石油進入水體后主要以形成表面油膜溶解狀態(tài)，乳化狀態(tài)和凝聚態(tài)殘余物四種狀態(tài)存在。石油最初進入海洋環(huán)境時呈現(xiàn)油膜狀態(tài)，然后一邊蒸發(fā)到大氣中，一邊溶解到海水中，溶解狀態(tài)的油分散在水體中，剩余凝聚態(tài)殘余物根據(jù)其密度大小或漂浮或沉于水底。石油中相對分子質量低的烴類通過蒸發(fā)進入大氣，或通光化學作用分解，或經過其他氧化作用而分解。石油對海洋生物有強烈毒性，其毒性強度與芳烴衍生物含量成正比關系。石油對魚鰓等器官的粘附作用會導致毒物聚集，致使魚類窒息死亡。長遠的會導致魚類雌雄比例失調，幼體畸形，成活率降低。海洋哺乳類動物可以在一定時間內清楚體表上粘附的石油，但若攝入體內，則會嚴重損害其健康。鳥類會由于石油粘附喪失飛行功能，并損害器官。據(jù)報道，近50年來因石油污染已有1000多種海洋生物滅絕，海洋生物減少了 40%。
[0004]石油對人體危害同樣非常嚴重，其揮發(fā)制大氣中的組分會迅速污染空氣。人類直接接觸石油會影響到肺、胃、腸、腎、中樞神經系統(tǒng)和造血系統(tǒng)。石油中的苯和多花芳香烴類化合物有強烈的致癌作用。除了直接接觸石油及吸入石油揮發(fā)物外，人類還可能通過使用被污染水域的海產品而使有毒物質進入體內，導致器官病變，甚至死亡。
[0005]目前在石油污染的治理中主要有物理法、化學法、和生物修復法。其中物理法技能進行稀釋、聚集或將污染物迀移到其他環(huán)境不能徹底消除污染，而化學法難以徹底降解石油，且會造成二次污染。相比之下，微生物作為石油天然分解過程中最重要的一環(huán)，本身便是自然降解的一部分，具有安全、高效、經濟、應用范圍廣的特點。尤其對于物理方法無法去除的薄油膜和化學藥品由于二次污染的問題而被限制使用時，生物方法具有無可替代的作用。在1989年美國阿拉斯加石油泄漏第一次應用生物修復方法后，對生物方法的研究日益受到人們關注。目前已發(fā)現(xiàn)的石油降解菌主要為無色桿菌屬(achromobactersp.)、不動桿菌屬(acinetobactersp.)、產喊桿菌屬(alcaligenessp.)、分支桿菌屬(archrobactersp.)芽孢桿菌屬(bacillussp.)、放線菌屬(actinomycetessp.)黃桿菌屬(f lavobacteriumsp.)、棒桿菌屬(coryneformssp.)、諾卡氏菌屬(nocardiasp.)、假單胞菌屬(pseudomonassp.)、微球菌屬(!11；[1'0(30(^118 8。.)、青霉屬(peniciliumsp.)、假絲酵母屬(candidasp.)等。在海洋環(huán)境起作用的主要是細菌，目前也以對細菌的研究最多最充分。
[0006]在微生物降解石油的過程中，有多重原因可能影響微生物的降解效率和降解過程，如微生物本身所屬的種類、所降解石油的性質(粘度、化學組成等)、環(huán)境條件(溫度、PH、溶氧、輔助類的營養(yǎng)物質、鹽度)等。環(huán)境條件中對微生物降解過程影響最大的就是溫度條件。溫度在兩個方面影響生物降解的效率，第一影響石油降解菌的生長速度，影響氧化酶的活性和微生物種群的構成;第二，影響是有的物理狀態(tài)和化學組成在常溫下生物反應速度較快，微生物生長速度很高，但海水水溫較低，如渤海灣海水可低于0°C水溫最高的8月份才能達到28°C，大多數(shù)時候處于10°C左右的相對低溫狀態(tài)。
[0007]微生物生長速度緩慢降解效率較低。而低溫環(huán)境同樣會增大石油的粘度，有毒物質揮發(fā)作用降低導致生物降解啟動緩慢。普通的好氧菌最佳的石油降解溫度在15_30°C之間。鹽度的升高會造成微生物膜結構的不穩(wěn)定而影響微生物對石油污染物的降解能力。本專利正是為了研究環(huán)境中比較接近的鹽度(3%)和溫度(10°C)的條件下進行石油污染物的微生物降解，因而具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明提供了一種研究低溫(10°C)、高鹽(3%)條件下微生物降解石油污染物的方法。
[0009]本發(fā)明的技術方案如下:
[0010]—種研究低溫高鹽條件下石油降解的方法，按照以下的方法步驟進行低溫高鹽條件下的利用微生物對石油污染物進行降解:
[0011](— )首先配置用于石油污染物降解的基礎無機鹽培養(yǎng)基，將10mL的無機鹽培養(yǎng)基分裝在250mL的三角瓶中，密封后在121°C的高溫下滅菌20分鐘，冷卻至室溫待用；
[0012](二)選擇耐低溫和耐高鹽的菌株加入到無機鹽培養(yǎng)基中，初始0D600為0.1 ；
[0013](三)將石油烴過0.22微米的油膜，除去內部的雜菌后，取出0.5mL加入到接種后的無機鹽培養(yǎng)基中；
[0014](四)搖床培養(yǎng)后，每隔24小時取樣并測量培養(yǎng)基中的菌體濃度以及剩余石油烴的濃度。
[0015]步驟(一)中所用到的無機鹽培養(yǎng)基的配方是:硝酸鈉0.5_2g/L、磷酸二氫鉀0.5-1.5g/L、磷酸二氫鉀 0.5-1.5g/L、硫酸銨 2-4g/L、NaC120-50g/L，硫酸鎂 0.5_2g/L，微量元素5-15mL/L，利用2mol/L的NaOH和2mol/L的HCl調節(jié)無機鹽培養(yǎng)基的pH到6.5-7.5。所用到的其中的微量元素的每升培養(yǎng)液中配方是:0.2gNa2Mo04.2H20 , 0.3gCuS04.5H20，0.5gZnS04.7H20,2.0gFeSO4.7H20,1.0gCaCl2,NaS045.0g,ZnSO4.4H200.4g和0.5gH3B03。
[0016]步驟(二)中所用到的耐低溫耐高鹽的菌株是分支桿菌cpl，該菌是從受石油污染的沿海土壤中經過梯度降低培養(yǎng)溫度及梯度增加培養(yǎng)基中的鹽度的條件下進行篩選和馴化得到的，具體的篩選方法是在10mL的無機鹽培養(yǎng)基中加入0.5g的石油烴后，加入5g的受石油污染土壤，在20°C下進行200rpm的搖床培養(yǎng);轉接培養(yǎng)3次后，降低溫度到15°C，轉接3次后，再降低溫度到10攝氏度，轉接培養(yǎng)3次后取出0.1mL培養(yǎng)液，在LB平板培養(yǎng)基中劃線純化。取出單菌落后，經過擴大培養(yǎng)驗證在10°c下的石油降解能力。得到具有低溫耐鹽的石油降解菌株--分支桿菌CPI。
[0017]步驟(四)中所用到降解石油污染物培養(yǎng)條件為轉速為180-250rpm，培養(yǎng)溫度為5°C_15°C，培養(yǎng)時間為10-16天。
[0018]本發(fā)明的效果如圖1和圖2所示。分支桿菌cpl在10°C，pH為7.2，200rpm下降解石油烴的