間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于產(chǎn)后丟棄物人胎盤組織表面的羊膜層——人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。急性肺損傷是百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷。本發(fā)明采用人羊膜組織分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺損傷動(dòng)物模型，經(jīng)舌下靜脈移植hAD?MSCs制劑對(duì)急性肺損傷有很好的治療效果。本發(fā)明比骨髓和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有取材容易，擴(kuò)增能力強(qiáng)，治療效果佳的優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】
間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在治療百草枯致急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，尤其涉 及人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在治療百草枯致急性肺損傷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 百草枯(ParaqUat，PQ)是一種快速滅生型除草劑，因其具有高效的除草效果曾被 廣泛應(yīng)用，但由于PQ對(duì)人體毒性極大，其吸收后隨血液循環(huán)分布至全身各組織器官，其中絕 大部分被肺組織攝取，引起廣泛的肺泡細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung in jury，ALI)以及其繼發(fā)的纖維化，其中肺組織強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ALI和肺纖維化的中 心環(huán)節(jié)，口服中毒致死率達(dá)90%以上。我國(guó)雖已停止PQ水劑在國(guó)內(nèi)的銷售和使用，但目前因 PQ中毒就診的患者仍屢見不鮮，目前尚無(wú)特效解毒藥。臨床上常規(guī)的治療措施主要包括:1、 抑制毒物吸收，如清洗染毒皮膚、催吐、洗胃及導(dǎo)泄等;2、加速體內(nèi)PQ排泄，如血液灌流、血 液透析等;3、藥物治療，如清除氧自由基、減少肺纖維化，以及對(duì)癥支持等治療。但抑制炎癥 因子、改善氧合及促進(jìn)肺內(nèi)液體吸收等治療措施都未能有效地緩解百草枯中毒所致肺損傷 的病程進(jìn)展，死亡率居高不下。
[0003] 隨著干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)迅速發(fā)展，其所具有的低免疫原性和向多個(gè)胚層分化及旁分 泌等特點(diǎn)為治療肺損傷性疾病開創(chuàng)了新的思路和方法。研究發(fā)現(xiàn)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs)對(duì)PQ誘導(dǎo)的肺損傷具有保護(hù)作用，其可以 減輕肺水腫、脂質(zhì)過(guò)氧化以及抑制炎癥介質(zhì)的釋放。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)百草枯中毒性 急慢性肺損傷有一定的治療作用，這種作用可能是通過(guò)旁分泌機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。這些研究均證 實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)多種原因引起的ALI具有治療作用。
[0004] 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amnion-derived mesenchymal stem cells，hAD-MSCs)是一種比骨髓和臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力。在 特定的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，hAD-MSCs可分化成來(lái)自三個(gè)胚層的所有細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞、 心肌細(xì)胞、成骨和軟骨細(xì)胞及胰腺細(xì)胞等。作為干細(xì)胞其具有向損傷組織迀移的潛能，此 外，研究發(fā)現(xiàn)，hAD-MSCs具有免疫調(diào)節(jié)的特性，能夠抑制損傷組織炎癥反應(yīng)。且hAD-MSCs來(lái) 源豐富，分離周期短，擴(kuò)增能力強(qiáng)，性狀穩(wěn)定，療效顯著。所具有的這些特性使其在PQ中毒所 致的ALI治療中具有更大的臨床應(yīng)用潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明發(fā)明的目的是提供間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在治療百草枯致急性肺損傷制劑中 的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制劑對(duì)百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷具有顯著 的治療療效，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制劑可以在百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷方面實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。該 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于產(chǎn)后丟棄物人胎盤組織表面的羊膜層一一人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明采用人羊膜組織分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞，制備成人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制 劑；以腹膜腔注射百草枯制作急性肺損傷大鼠動(dòng)物模型，經(jīng)舌下靜脈注射hAD-MSCs制劑。其 中，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植所需劑量為約5X 106個(gè)細(xì)胞/kg。
[0008] 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制劑為注射劑，主要由人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和LG-DMEM組成， 細(xì)胞濃度至少為5 X 106個(gè)細(xì)胞/ml。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍保存、復(fù)蘇使用，其冷凍保存 液由20%胎牛血清、10%二甲基亞砜、LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成，復(fù)蘇液由2mM L_谷氨酰胺、10%胎牛血清、LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成。復(fù)蘇液懸浮后繼續(xù)培 養(yǎng)擴(kuò)增或在緊急需要時(shí)用生理鹽水涮洗后，用LG-DMEM重懸制備成注射液使用。百草枯劑量 為30 mg/kg，造模時(shí)含20%百草枯的水溶液一次性腹腔內(nèi)注射。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植時(shí) 機(jī)為造模后4h。
[0009] 本發(fā)明原代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞按5X105/ml接種最多可達(dá)40瓶(25 cm2培養(yǎng)瓶）， 細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1 X 1 〇8個(gè)，細(xì)胞制劑用無(wú)血清的LG-DMEM懸浮，可以使用含20%胎牛血清和10% 二甲基亞砜添加到終體積70%的LG-DMEM中細(xì)胞凍存液中液氮中凍存，并經(jīng)復(fù)蘇后重新懸浮 于無(wú)血清的LG-DMEM使用，也可以在緊急需要時(shí)用生理鹽水涮洗后，用LG-DMEM重懸制備成 注射液直接使用。經(jīng)擴(kuò)增后，3-6代細(xì)胞總數(shù)最多可達(dá)6.4 X 109個(gè)。
[0010] 本發(fā)明采用人羊膜組織分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺損 傷動(dòng)物模型，經(jīng)舌下靜脈移植hAD-MSCs制劑對(duì)急性肺損傷有很好的治療效果。
[0011] 本發(fā)明比骨髓和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有取材容易，擴(kuò)增能力強(qiáng)，治療效果 佳的優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1表示hAD-MSCs生長(zhǎng)形態(tài)； 圖2表示P3代hAD-MSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(一）； 圖3表示P3代hAD-MSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(二）； 圖4表示P3代hAD-MSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(三）； 圖5表示Kaplan-Meier生存分析法； 圖6表示肺組織H.E染色； 圖7表示肺組織Masson染色； 圖8表示肺組織天狼星紅染色； 圖9表示各組大鼠血清中TGF-βΙ、HYP濃度(一）； 圖10表示各組大鼠血清中IL-10、IL-17濃度(二）。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0014] 實(shí)施例1: hAD-MSCs的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增:在無(wú)菌條件下，用鑷子將羊膜從胎盤上剝離，用含雙抗 (終濃度為青霉素：100 IU/ml，鏈霉素:0.1 mg/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用）的D-roS液沖洗一遍后，用不 含有雙抗的D-PBS液反復(fù)沖洗羊膜組織，去除殘留的血漬和粘液。剪碎羊膜，加入0.05%胰蛋 白酶-0.02%EDTA-2Na溶液，37°C恒溫水平搖床(200 rpm/min)消化30 min，200目不銹鋼濾 網(wǎng)過(guò)濾，棄濾液，剩余羊膜組織碎片用D-PBS液沖洗，加入Ο . 75 mg/ml Π 型膠原酶-0.075 mg/ml DNasel消化液，37 °C、200 rpm/min消化2~3 h，至組織消化完全，200目不銹鋼濾網(wǎng) 過(guò)濾，收集細(xì)胞濾液，2400 rpm/min，離心16 min，棄上清，沉淀用含2mM L-谷氨酰胺、10%胎 牛血清和終濃度為10 ng/ml bFGF的LG-DMEM培養(yǎng)基混懸，即hAD-MSCs懸液，2%臺(tái)盼藍(lán)染色 檢測(cè)細(xì)胞活力，根據(jù)細(xì)胞活力接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，細(xì)胞密度按按5 X 105/ml接種，置于37 °C、5% C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后更換新培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞融合約80%~90%時(shí)，D-PBS液沖洗，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液，37 °C孵育1 min，顯微鏡下觀察消 化情況，待細(xì)胞開始收縮時(shí)用含有10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞并行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)， 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0015] hAD-MSCs的純度鑒定：取第3代hAD-MSCs，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，D-PBS 洗滌一次，混懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0X106 cells/ml。取細(xì)胞懸液200 μL按組合方案加10 μ 1 熒光素標(biāo)記的 〇)44、0)73、0)90、0)105、0)34、0)45、0)14、0)19、0)80丄086和!11^-〇財(cái)允體震 蕩混勻，室溫避光孵育30 min，每管加入2ml含有0.1%BSA的D-PBS，混勻，1000 rpm/min離心 5 min，棄上清，震蕩懸浮細(xì)胞。每管加入200 μL 1%多聚甲醛，混勻，2~8 °C避光保存，24小 時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。每份樣品的采集細(xì)胞數(shù)均多2X104個(gè)，Cell Quest軟件分析。 同型對(duì)照抗體為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的小鼠 IgG。
[0016] 急性肺損傷模型制備：SPF級(jí)雄性SD大鼠（200 ± 20g)40只，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，不限飲 水，飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，按30 mg/kg 20%百草枯水溶液一次性腹膜腔內(nèi) 注射，隨機(jī)分為hAD-MSCs移植組（17只）、模型組（15只）和空白對(duì)照組(8只）。
[0017] hAD-MSCs移植:造模后4 h，經(jīng)0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液消化，用LG-DMEM培養(yǎng)基懸浮的hAD-MSCs，制備成200 μL注射劑（含約1 X 106個(gè)細(xì)胞），各組大鼠按0.3 ml/100g腹膜腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液麻醉，固定于自制鼠板，暴露大鼠口腔，用鑷子將大 鼠舌頭拉出，將注射器連接采血針，經(jīng)舌下靜脈穿刺，模型組經(jīng)舌下靜脈緩慢注射等量的 LG-DMEM培養(yǎng)基，無(wú)菌棉球局部壓迫、止血，術(shù)后予以5%葡萄糖灌胃。
[00?8] 大鼠血清和肺組織標(biāo)本米集:hAD-MSCs移植7 d后，將各實(shí)驗(yàn)組未死亡大鼠10%水 合氯醛麻醉，固定于鼠板，剪除大鼠胸腹部鼠毛，碘伏和75%酒精消毒，打開并向兩側(cè)牽拉胸 腔，暴露心臟，采血針從右心室穿刺采集4 ml靜脈血于促凝管中，室溫放置10~20 min，待 血液凝固，2000 rpm/min，離心20 min，收集上層血清分裝于無(wú)菌EP管中，-80°C冰箱儲(chǔ)存， 待測(cè)血清中的TGF-βΙ、HYP、IL-10、IL-17含量。分離肺組織，0.9%生理鹽水沖洗，每只大鼠均 取右下肺，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋后行病理切片，待行H.E、Mass 〇n和天狼星紅染色。
[0019] 肺組織病理學(xué)檢查和移植細(xì)胞示蹤 ① HE染色 A. 將石蠟切片放入60 °C恒溫烘箱中約45 min; B. 待烤干后，二甲苯脫蠟，梯度酒精入水； C. 蘇木素染色5~10 min，自來(lái)水沖洗； D. 1%鹽酸酒精分化1~3 s，自來(lái)水沖洗； E. 飽和碳酸鋰水溶液返藍(lán)后，1%伊紅液染色5~10 min; F. 梯度酒精脫水，二甲苯透明； G. 中性樹脂封片，顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。
[0020] ② Masson染色 A. 將石蠟切片放入60 °C恒溫烘箱中約45 min; B. 待烤干后，二甲苯脫蠟，梯度酒精入水； C. 30~40 °C溫?zé)崴?次，每次60 s; D. 核染液染色60 s，倒丟，沖洗液沖洗30 s; E. 漿染液染色30~60 s，倒丟，沖洗液沖洗30 s; F. 分色液分色6~8 min，棄分色液； G. 復(fù)染液染色5 min，倒丟，無(wú)水乙醇沖洗干凈； Η.待切片干后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。
[0021] ③天狼星紅染色 A. .二甲苯脫蠟，梯度酒精入水； B. 天狼星紅染色液滴染1 h; C. 流水稍沖洗，去除切片表面染液； D. Mayer蘇木素染色液染細(xì)胞核8~10 min; E. 流水沖洗10 min; F. 梯度酒精脫水，二甲苯透明； G. 中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。
[0022] ELISA檢測(cè)大鼠血清細(xì)胞因子含量 ① TGF-m具體檢測(cè)步驟如下： A. 凍存血清4 °C冰箱緩慢解凍，待完全溶解后于室內(nèi)恢復(fù)至室溫； B. TGF-m標(biāo)準(zhǔn)品按180 ng/L、120 ng/L、60 ng/L、30 ng/L、15 ng/L 5個(gè)濃度梯度稀 釋，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； C. 分別于酶標(biāo)包被板孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加入各組血清10 μL，調(diào)零孔加10 μL D-PBS，每組均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，37°C孵育30 min; D. 洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，調(diào)零孔除外； Ε.封板膜封板后37°C孵育30 min; F. 洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入顯色劑，輕輕震蕩混勻，37 °C避光顯色15min; G. 每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)； Η.以調(diào)零孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(0D值）。
[0023] I.用繪圖軟件CurveExpert 1.4繪制TGF-βΙ的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直 線回歸方程式，計(jì)算檢測(cè)樣品的TGF-m含量。
[0024] ②大鼠血清HYP、IL-10、IL-17含量檢測(cè)： A. 凍存血清4 °C冰箱緩慢解凍，待完全溶解后平衡至室溫； B. HYP、IL-10、IL-17標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書推薦的5個(gè)濃度梯度稀釋，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； C. 分別于酶標(biāo)包被板孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加入各組血清10 μL，調(diào)零孔加10 μL D-PBS，每組均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，37°C孵育30 min; D. 洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，調(diào)零孔除外； Ε.封板膜封板后37°C孵育30 min; F.洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入顯色劑，輕輕震蕩混勻，37 °C避光顯色15min; G.每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)； Η.以調(diào)零孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(OD值）。
[0025] I.用繪圖軟件CurveExpert 1.4繪制HYP、IL-10、IL-17的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn) 曲線的直線回歸方程式，計(jì)算檢測(cè)樣品的HYP、IL-10、IL-17含量。
[0026]統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)土 標(biāo)準(zhǔn)差G:土S)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，大鼠生存率采用Kaplan-Meier生存分析 法，α=0·05。
[0027]結(jié)果： hAD-MSCs的生長(zhǎng)形態(tài)和表型特征： hAD-MSCs具有貼壁生長(zhǎng)的特性，原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞貼壁較慢，培養(yǎng)3d左右原代細(xì)胞可融 合80%以上，細(xì)胞形態(tài)具有多樣性，呈多邊形、梭形等（圖1中A部分）。隨著細(xì)胞傳代純化培 養(yǎng)，hAD-MSCs的形態(tài)逐漸呈梭形或纖維樣，呈放射樣或漩渦樣生長(zhǎng)(圖1中B部分）。
[0028] FCM分析表明，第3代hAD-MSCs高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志⑶44,同時(shí)還高表達(dá) 0)73、0)90、0)105，不表達(dá)0)14丄019、0)34丄045、!11^-〇1?(圖2-圖4)等造血干細(xì)胞和腿(：-11 類分子等表面標(biāo)志。
[0029] hAD-MSCs移植對(duì)急性肺損傷大鼠生存率的影響： 各組大鼠均觀察7天，統(tǒng)計(jì)記錄7天內(nèi)（包含第7天)各組大鼠死亡數(shù)量，以Kaplan-Meier 生存分析法比較各組大鼠7天以內(nèi)的生存率。模型組、移植組和空白對(duì)照組大鼠的生存率表 1所示。模型組、移植組和空白對(duì)照組分別對(duì)應(yīng)表1和圖3的1、2和3組，各組大鼠7天內(nèi)（包括7 天）的生存率分別為：1組40.0%、2組76.5%、3組100%(表1)。各組間生存率分別對(duì)比可以發(fā) 現(xiàn)：1組與2組比較，P<0.05,生存率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1組與3組比較，P<0.01，生存 率組間有顯著差異;2組與3組比較，P>0.05,生產(chǎn)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5)。
[0030] hAD-MSCs移植后大鼠肺組織病理學(xué)變化： 模型組大鼠肺組織H.E染色（圖6，A、B)見肺間質(zhì)顯著增厚，各肺泡之間相互融合，結(jié)構(gòu) 明顯破壞，原有肺泡結(jié)構(gòu)消失，可見大量肺間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張，伴有彌漫性肺出血，肺毛細(xì) 血管周圍和肺泡腔可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);Masson染色（圖7，A、B)顯示肺泡腔大量破壞，肺 泡間質(zhì)大量纖維細(xì)胞增生，肺泡壁增厚;天狼星紅染色（圖8，A、B)同樣發(fā)現(xiàn)大量肺泡原有的 結(jié)構(gòu)明顯破壞，大量纖維細(xì)胞增生，肺間質(zhì)彌漫性增厚。
[0031] 移植組大鼠顯微鏡下也可見部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞、融合，少量肺間質(zhì)毛細(xì)血管充血， 周圍見少量紅細(xì)胞滲出，肺毛細(xì)血管周圍和肺泡腔見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞明 顯要少于模型組，Masson染色和天狼星紅染色可見，少量肺泡壁斷裂相互融合，斷裂融合的 肺泡周圍見肺間質(zhì)輕度纖維細(xì)胞增生，肺泡壁增厚，但損傷程度較模型組有顯著減輕。
[0032] 大鼠血清中細(xì)胞因子和氨基酸的含量： ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(表2、圖9和10)，模型組大鼠血清中纖維化標(biāo)志性細(xì)胞因子TGF-βΙ 含量顯著高于hAD-MSCs移植組和空白對(duì)照組(？<〇.〇1，？<〇.〇1)，而后兩組之間了6?-01含 量無(wú)顯著性差異(P>〇.〇5);模型組中膠原纖維中的主要成分HYP含量較hAD-MSCs移植組和 空白對(duì)照組，均升高(P<〇. 05，P<0.05)，而hAD-MSCs移植組仍高于空白對(duì)照組(P<0.05); 血清中IL-10含量，hAD-MSCs移植組和空白對(duì)照組顯著低于模型組（P<0.01，P<0.01)， hAD-MSCs移植組也低于空白對(duì)照組(P<0.01) ;hAD-MSCs移植組和空白對(duì)照組IL-17含量均 高于模型組(？<0.05，？<0.01)，前兩組血清中11^-17含量無(wú)顯著性差異(？>0.05)。
[0033] 當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同 替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于：間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于產(chǎn)后丟棄物人胎盤組織表面的羊膜層一一人羊膜間充質(zhì)干細(xì) 胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:采用人羊膜組織分離出來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞，制備成人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制劑；以腹膜 腔注射百草枯制作急性肺損傷大鼠動(dòng)物模型，經(jīng)舌下靜脈注射hAD-MSCs制劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植所需劑量為約5 X 106個(gè)細(xì)胞/kg。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞制劑為注射劑，由人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和LG-DMEM組成，細(xì)胞濃 度至少為5 X 106個(gè)細(xì)胞/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍保存、復(fù)蘇使用，其冷凍保存液由20%胎牛血清、10%二甲基 亞砜、LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成，復(fù)蘇液由2mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、 LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:復(fù)蘇液懸浮后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增或在緊急需要時(shí)用生理鹽水涮洗后，用LG-DMEM重懸制備 成注射液使用。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:百草枯劑量為30 mg/kg，造模時(shí)含20%百草枯的水溶液一次性腹腔內(nèi)注射。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應(yīng)用，其特征 在于:人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植時(shí)機(jī)為造模后4h。
【文檔編號(hào)】A61K35/28GK106038597SQ201610359976
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】宮黎明, 周滿紅, 徐紹華, 李曉飛, 肖建輝, 楊智敏, 羅克燕
【申請(qǐng)人】遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院