迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷在制備預(yù)治流感藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及迷迭香酸?4?O?β?D?葡萄糖苷在制備預(yù)治流感藥物的應(yīng)用；其中，所述的流感為H1N1亞型或H9N2亞型流感病毒感染引起的流感。本應(yīng)用中所述的藥物由迷迭香酸?4?O?β?D?葡萄糖苷和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中所述的迷迭香酸?4?O?β?D?葡萄糖苷在藥物中的質(zhì)量百分含量為5％～10％。本發(fā)明所述的迷迭香酸?4?O?β?D?葡萄糖苷在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)均有顯著的抑制H1N1亞型或H9N2亞型流感病毒增殖的作用，對(duì)流感病毒感染小鼠具有顯著保護(hù)作用，可用于制備預(yù)防和防治人和動(dòng)物流感的藥物，而且安全無毒，療效穩(wěn)定。
【專利說明】
迷迭香酸-4-0-e-D-葡萄糖昔在制備預(yù)治流感藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及多酪類化合物，具體設(shè)及迷迭香酸巧，特別是設(shè)及迷迭香酸巧抗流感 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的呼吸道疾病，具有流行性廣、傳染性 強(qiáng)、發(fā)病率高等特點(diǎn)，在兒童、老人和高危人群中的死亡率較高。流感病毒是人類健康的一 大威脅。應(yīng)對(duì)流感病毒的主要方式是疫苗和藥物治療。對(duì)可能大規(guī)模爆發(fā)的流感疫情來講， 藥物治療是最好的控制流感病毒傳播的手段。目前，抗流感病毒藥物包括已在俄羅斯上市 的鹽酸阿比朵爾和美國抑A批準(zhǔn)的4個(gè)抗流感病毒藥物，后者根據(jù)作用機(jī)制的不同分為M2離 子通道蛋白抑制劑和神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑。近年來，對(duì)抗流感病毒藥物的研究取得了較 大進(jìn)展。M2離子通道蛋白抑制劑是最早上市的流感臨床治療藥物，但存在神經(jīng)毒性，長期服 用易產(chǎn)生耐藥毒株和對(duì)B型流感無效等缺陷。目前抗病毒西藥雖然品種較多，但多數(shù)選擇性 低和不良反應(yīng)較大，中藥在抗病毒方面有其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，不良反應(yīng)相對(duì)較低，不易形成耐藥 性。根據(jù)抗流感病毒途徑可將中藥分為兩大類:一類具有直接抑制病毒作用，其中大多數(shù)為 清熱解毒類中藥，如金銀花，魚腥草，板藍(lán)根，大青葉，黃琴，黃連等;而另一類通過增強(qiáng)免疫 細(xì)胞能力發(fā)揮間接抗流感病毒作用，如黃巧、丹參等都能誘生干擾素和免疫球蛋白。研究比 較清楚的抗流感成分主要有兩類：一是多酪類物質(zhì)，不僅可抑制流感病毒蛋白質(zhì)和RNA合 成，同時(shí)也可抑制流感病毒的吸附作用；另一類是黃酬類物質(zhì)，能抑制流感病毒唾液酸酶的 活性和抑制膜融合作用。中藥具有很好的抗病毒作用，既可直接殺死病毒而不傷及機(jī)體組 織，又可調(diào)動(dòng)免疫防御系統(tǒng)的積極性，激發(fā)機(jī)體的主動(dòng)免疫機(jī)制，增強(qiáng)免疫力，通過主動(dòng)防 御間接發(fā)揮抗病毒作用。因而，中藥在西藥產(chǎn)生耐藥性、病毒發(fā)生變異的情況下，仍具有潛 在治療作用，具有更廣泛的適應(yīng)性和優(yōu)越性;并且中草藥在我國資源豐富，價(jià)格低廉，展現(xiàn) 了廣闊的研究與開發(fā)前景。因此，研制療效確切、安全高效的治療流感病毒感染的藥物十分 必要。
[0003] 中國藥物化學(xué)雜志報(bào)導(dǎo)了一種迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧(李先霞，黃明菊，李 妍試，等.腫節(jié)風(fēng)中抗氧化活性成分研究[J].中國藥物化學(xué)雜志，2010,20(1) :57-60.)，該 化合物的結(jié)構(gòu)如下式（I)所示。李先霞的文章中還公開了該化合物的鑒定數(shù)據(jù)和抗氧化活 性，但無公開它的其它生活性和用途。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供化合物迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧的新用途， 即在制藥中的新應(yīng)用。
[0006] 上述在制藥中的新應(yīng)用即為，迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧在制備預(yù)治流感藥物 的應(yīng)用;其中，所述的流感為化Ν1亞型或Η9Ν2亞型流感病毒感染引起的流感。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述的藥物由迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料 組成，其中所述的迷迭香酸-4-0-β-0-葡萄糖巧在藥物中的質(zhì)量百分含量為5%~10%。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述的藥物為注射液、顆粒劑、膠囊或片劑。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述的迷迭香酸-4-0-β-0-葡萄糖巧由W下方法制得：
[0010] (1)取腫節(jié)風(fēng)藥材的干燥粉，用蒸饋水浸提2次，合并提取液，用乙醇沉淀，收集上 清液；
[0011] (2)將所收集的上清液W水稀釋至生藥濃度為0.5-lg/ml溶液，上清洗至中性的大 孔樹脂，然后用乙醇梯度洗脫，收集2倍樹脂床體積的30%乙醇洗脫液，加入乙醇使乙醇濃 度達(dá)80 %，靜置過夜，取上清濃縮干燥，W60 %甲醇復(fù)溶，上樣于0DS柱，甲醇梯度洗脫，收集 40 %甲醇洗脫液并濃縮得總迷迭香酸巧；
[0012] (3)將總迷迭香酸巧經(jīng)硅膠柱層析分離，分別W甲醇體積濃度為20 %、30 %和40 % 的乙酸-水洗脫，每個(gè)比例2個(gè)柱體積;合并甲醇體積濃度為30%的乙酸-水的層析組分，60 °C減壓濃縮至干，得到迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧；其中所述的乙酸-水中乙酸的體積含 量為0.05%。
[0013] 本發(fā)明所述的迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧下簡稱迷迭香酸巧)在細(xì)胞和動(dòng)物 體內(nèi)均有顯著的抑制Η1Ν1亞型或Η9Ν2亞型流感病毒增殖的作用，對(duì)流感病毒感染小鼠具有 顯著保護(hù)作用，可用于制備預(yù)防和防治人和動(dòng)物流感的藥物，而且安全無毒，療效穩(wěn)定。
【附圖說明】
[0014] 圖1為迷迭香酸巧對(duì)Α549細(xì)胞毒性作用的細(xì)胞存活率曲線圖。
[001引圖2為迷迭香酸巧對(duì)MDCK細(xì)胞毒性作用的細(xì)胞存活率曲線圖。
[0016] 圖3為各試驗(yàn)組對(duì)Α549細(xì)胞保護(hù)作用的細(xì)胞存活率條形圖。
[0017] 圖4為各試驗(yàn)組對(duì)Α549細(xì)胞內(nèi)化Ν1亞型流感病毒增值的抑制作用的病毒抑制率條 形圖。
[0018] 圖5為各試驗(yàn)組對(duì)Α549細(xì)胞保護(hù)作用的細(xì)胞存活率條形圖。
[0019]圖6為各試驗(yàn)組對(duì)Α549細(xì)胞內(nèi)Η9Ν2亞型流感病毒增值的抑制作用的病毒抑制率條 形圖。
[0020] 圖7為各試驗(yàn)組對(duì)MDCK細(xì)胞保護(hù)作用的細(xì)胞存活率條形圖。
[0021] 圖8為各試驗(yàn)組對(duì)MDCK細(xì)胞內(nèi)化Ν1亞型流感病毒增值的抑制作用的病毒抑制率條 形圖。
[0022] 圖9為未感染對(duì)照組小鼠感染6天后肺組織切片放大200倍顯微照片。
[0023] 圖10為病毒感染對(duì)照組小鼠感染6天后肺組織切片放大200倍顯微照片。
[0024] 圖11為陽性藥對(duì)照組小鼠感染6天后肺組織切片放大200倍顯微照片。
[0025] 圖12為50mg/kg/d迷迭香酸巧混懸液口服組小鼠感染6天后肺組織切片放大200倍 顯微照片。
[0026] 圖13為20mg/kg/d迷迭香酸巧混懸液口服組小鼠感染6天后肺組織切片放大200倍 顯微照片。
[0027] 圖14為迷迭香酸巧的質(zhì)譜圖。
[002引圖15為迷迭香酸巧的Η譜圖。
[0029] 圖16為迷迭香酸巧的幻普?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1(迷迭香酸巧化合物制備及結(jié)構(gòu)鑒定）
[0031 ] 1、制備迷迭香酸巧化合物
[0032] (1)取腫節(jié)風(fēng)藥材的干燥粉l〇kg(4〇-60目），用蒸饋水提取2次，合并提取液，棄藥 渣，加入乙醇沉淀，收集上清液；
[0033] (2)將所收集的上清液W水稀釋至生藥濃度為0.5-lg/ml溶液，上清洗至中性的大 孔樹脂D101，分別用1.5倍樹脂床體積的20%乙醇，2倍樹脂床體積的30 %乙醇洗脫，收集2 倍樹脂床體積的30%乙醇洗脫液，加入乙醇使乙醇濃度達(dá)80%，靜置過夜，取上清濃縮干 燥，W60 %甲醇復(fù)溶，上樣于0DS柱，用甲醇梯度洗脫，收集40 %甲醇洗脫液并濃縮得總迷迭 香酸巧;其中，將大孔樹脂D101清洗至中性的方法為：乙醇浸泡24小時(shí)后，用乙醇清洗樹脂， 洗至流出液與水1:5不渾濁為止，然后用去離子水洗至沒有明顯醇味。之后用5%HC1清洗樹 脂并浸泡地，用去離子水洗至洗脫液為中性，后用2 %化0H洗脫樹脂柱，并浸泡地，最后水洗 至中性；
[0034] (3)將總迷迭香酸巧經(jīng)硅膠柱（100-200目）層析分離，分別W甲醇體積濃度為 20 %、30 %和40 %的乙酸-水洗脫，每個(gè)比例2個(gè)柱體積;合并甲醇體積濃度為30 %的乙酸- 水的層析組分，6(TC減壓濃縮至干，得到棟黃色針狀晶體;其中所述的乙酸-水中乙酸的體 積含量為0.05 %。
[0035] 2、化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
[0036] 用質(zhì)譜儀檢測上述方法得到的棟黃色針狀晶體，得到如下數(shù)據(jù)和圖譜：
[0037] HR-ESI-MS m/z 521.12885[Μ-ΗΓ(理論值為C24H250i3,521.13006).1h-NMR (500MHz，DMS0-d6)S:7.06(lH，s，H-2'），6.76(lH，d，J = 7.5Hz，H-5'），6.98(lH，d，J = 8.0， H-6'），7.42(lH，d，J= 16.0Hz，H-7'），6.22(lH，d，J = 16.0Hz，H-8'），6.51(lH，d，J = 7.甜z, H-6)，6.68(lH，br s，H-2),6.62(lH，d，J=8.0，H-5),2.77(lH，m，H-7a),3.00(lH，m，H-7b), 4.87( lH，d，J = 7.甜z，H-8).i3c-NMR( 125MHz，DMS0-d6)S :125.9(C-1), 115.4(02)，144.3 (C-3),145.4(C-4),115.9(C-5),120.4(C-6),37.0(C-7),74.6(C-8),172.2(C-9),128.9 (C-1'),114.4(C-2'),145.7(C-3'),146.2(C-4'),116.3(C-5'),121.8(C-6'),149.1(C- 7'），117.1(C-8'），166.5(C-9'）。
[0038] 其中，質(zhì)譜、助普和C依次見圖14~16。
[0039] 將上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)與李先霞等報(bào)導(dǎo)的化合物迷迭香酸-4-Ο-β-Ο-葡萄糖巧(李先霞， 黃明菊，李妍試，等.腫節(jié)風(fēng)中抗氧化活性成分研究[J].中國藥物化學(xué)雜志，2010,20(1): 57-60.)的數(shù)據(jù)基本一致，因此確定上述分離方法得到的棟黃色針狀晶體為化合物迷迭香 酸-4-0-β-0-葡萄糖巧(簡稱:迷迭香酸巧），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如【背景技術(shù)】中的（I)式所示。
[0040] 實(shí)施例2(藥效實(shí)驗(yàn)）
[0041 ] 1、迷迭香酸巧對(duì)A549細(xì)胞毒性
[0042] 常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，待細(xì)胞生長夠?qū)嶒?yàn)數(shù)目用化ypsin常規(guī)消化，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 濃度為1.0 X 1〇5個(gè)/mL，W0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞生長至緊密單層后， 棄上清液加入用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的各濃度藥物O.lmL。取實(shí)施例1所制備的化合物按照 3倍梯度稀釋，6個(gè)梯度，每個(gè)梯度接種3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置正常對(duì)照組和憐酸奧司他韋組，繼續(xù)培 養(yǎng)48h。終止實(shí)驗(yàn)后，WCPE觀察法判斷待測樣品對(duì)細(xì)胞的毒性作用，WCCK8試劑盒檢測細(xì)胞 存活率，結(jié)果分別見表1，表2及圖1。
[0043] 表1迷迭香酸巧對(duì)A549細(xì)胞毒性作用(CPE觀察法）
[0044]
[0045]
[0046] 細(xì)胞出現(xiàn)病變按照W下5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄："一"為細(xì)胞生長正常，無病變出現(xiàn)；"±"為 細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10% ; V'為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25% ;"++"為細(xì)胞 病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50 % ;"+++"為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75 % ;"++++"為細(xì)胞 病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75 % W上。
[0047] 表2迷迭香酸巧對(duì)A549細(xì)胞毒性作用(CCK騎去）
[004引
[0049] 2、迷迭香酸巧對(duì)MDCK細(xì)胞毒性
[0050] 常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，待細(xì)胞生長夠?qū)嶒?yàn)數(shù)目用化ypsin常規(guī)消化，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 濃度為1.0 X 1〇5個(gè)/mL，W0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞生長至緊密單層后， 棄上清液加入用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的各濃度藥物O.lmL。取實(shí)施例1所制備的化合物按照 3倍梯度稀釋，6個(gè)梯度，每個(gè)梯度接種3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置正常對(duì)照組和憐酸奧司他韋組，繼續(xù)培 養(yǎng)4甜。終止實(shí)驗(yàn)后，WCPE觀察法判斷待測樣品對(duì)細(xì)胞的毒性作用，WCCK8試劑盒檢測細(xì)胞 存活率，結(jié)果分別見表3，表4及圖2。
[0051 ] 表3迷迭香酸巧對(duì)MDCK細(xì)胞毒性作用(C陽觀察法）
[0化2]
[0053] 細(xì)胞出現(xiàn)病變按照W下5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄："一"為細(xì)胞生長正常，無病變出現(xiàn)；"±"為 細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10% ; V'為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25% ;"++"為細(xì)胞 病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50 % ;"+++"為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75 % ;"++++"為細(xì)胞 病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75% W上。
[0054] 表4迷迭香酸巧對(duì)MDCK細(xì)胞毒性作用(CCK騎去）
[0化5]
[0056] 3、迷迭香酸巧在A549細(xì)胞中對(duì)化N1亞型流感病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用
[0057] 常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，待細(xì)胞生長夠?qū)嶒?yàn)數(shù)目用化ypsin常規(guī)消化，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 濃度為1.0 X 1〇5個(gè)/mL，W0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞生長至緊密單層后， 同時(shí)攻擊50TCID50病毒懸液0.1 mL，于35°C吸附化后，棄上清。加入用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的 各濃度藥物O.lmL。取實(shí)施例1所制備的化合物按照2倍梯度稀釋，10個(gè)梯度，每個(gè)梯度接種3 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置正常對(duì)照組和憐酸奧司他韋（75mg/粒，羅氏公司，生產(chǎn)批號(hào):B3017)組，重新加 入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。終止實(shí)驗(yàn)后，WCCK8試劑盒檢測細(xì)胞存活率，W流 感病毒表面蛋白檢測試劑(NA)檢測病毒含量，計(jì)算待測樣品對(duì)病毒的抑制作用。結(jié)果分邊 見表5,表6及圖3,圖4。
[005引表5迷迭香酸巧在A549細(xì)胞中對(duì)化N1亞型流感病毒抑制作用(NA試劑盒法）
[0化9]
[0060] 表6迷迭香酸巧在A549細(xì)胞中對(duì)化N1亞型流感病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用（CCK8試 劑盒法）
[0061]
[0062]
[0063] 4、迷迭香酸巧在A549細(xì)胞中對(duì)H9N2亞型流感病毒增殖的抑制作用
[0064] 常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，待細(xì)胞生長夠?qū)嶒?yàn)數(shù)目用化ypsin常規(guī)消化，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 濃度為1.0 X 1〇5個(gè)/mL，W0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞生長至緊密單層后， 同時(shí)攻擊50TCID50病毒懸液0.1 mL，于35°C吸附化后，棄上清。加入用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的 各濃度藥物O.lmL。取實(shí)施例1所制備的化合物按照2倍梯度稀釋，10個(gè)梯度，每個(gè)梯度接種3 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置正常對(duì)照組和憐酸奧司他韋（75mg/粒，羅氏公司，生產(chǎn)批號(hào):B3017)組，重新加 入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。終止實(shí)驗(yàn)后，WCCK8試劑盒檢測細(xì)胞存活率，W流 感病毒表面蛋白檢測試劑(NA)檢測病毒含量，計(jì)算待測樣品對(duì)病毒的抑制作用。結(jié)果分邊 見表7,表8及圖5,圖6。
[0065] 表7迷迭香酸巧在A549細(xì)胞中對(duì)H9N2亞型流感病毒抑制作用(NA試劑盒法）
[0066]
[0067] 表8迷迭香酸巧在A549細(xì)胞中對(duì)朋N2亞型流感病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用（CCK8試 劑盒法）
[006引
[0069] 5、迷迭香酸巧在MDCK細(xì)胞中對(duì)化N1亞型流感病毒增殖的抑制作用
[0070] 常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞后，待細(xì)胞生長夠?qū)嶒?yàn)數(shù)目用化ypsin常規(guī)消化，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞 濃度為1.0 X 1〇5個(gè)/mL，W0.1 mL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞生長至緊密單層后， 同時(shí)攻擊50TCID50病毒懸液0.1 mL，于35°C吸附化后，棄上清。加入用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的 各濃度藥物O.lmL。取實(shí)施例1所制備的化合物按照2倍梯度稀釋，10個(gè)梯度，每個(gè)梯度接種3 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置正常對(duì)照組和憐酸奧司他韋（75mg/粒，羅氏公司，生產(chǎn)批號(hào):B3017)組，重新加 入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。終止實(shí)驗(yàn)后，WCCK8試劑盒檢測細(xì)胞存活率，W流 感病毒表面蛋白檢測試劑(NA)檢測病毒含量，計(jì)算待測樣品對(duì)病毒的抑制作用。結(jié)果分邊 見表9,表10及圖7,圖8。
[0071] 表9迷迭香酸巧在MDCK細(xì)胞中對(duì)化N1亞型流感病毒抑制作用(NA試劑盒法）
[0072]
[0073] 表10迷迭香酸巧在MDCK細(xì)胞中對(duì)化N1亞型流感病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用(CCK8試 劑盒法）
[0074]
[0075] 研究結(jié)果表明迷迭香酸巧對(duì)化N1亞型及朋N2亞型流感病毒均具有抑制作用，且在 不同細(xì)胞對(duì)流感病毒具有抑制作用，抑制作用隨迷迭香酸巧濃度的增加而增強(qiáng)。
[0076] 6、迷迭香酸巧對(duì)雞胚毒性作用
[0077] 取實(shí)施例1所制備的化合物加入無菌生理鹽水配制成濃度為lOmg/ml的藥液，再用 無菌生理鹽水作1〇倍梯度稀釋（1〇*^~1〇^)，分別接種于1〇日齡5?曰雞胚，每個(gè)濃度接種4枚 雞胚，0.1ml/胚，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。蠟封后置恒溫解化箱中37°C繼續(xù)解育96h，每 24h檢胚1次，記錄雞胚死亡情況W及雞胚生長發(fā)育情況。24h內(nèi)死亡雞胚棄除不計(jì)于藥物毒 性作用的致死數(shù)。W雞胚可正常發(fā)育9加且無病變產(chǎn)生的最大濃度確定為抗病毒口服液的 最大給藥劑量(Cmax)，用于抗病毒藥效實(shí)驗(yàn)。
[007引表11迷迭香酸巧對(duì)雞胚毒性試驗(yàn)
[0079]
[0080] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無雞胚出現(xiàn)死亡，說明該濃度藥物對(duì)雞胚無毒性作用，可作為本實(shí) 驗(yàn)用最高無毒濃度。
[0081 ] 7、迷迭香酸巧對(duì)感染化N1亞型流感病毒雞胚保護(hù)作用
[0082] 取100EID50的病毒液0.1ml與倍比稀釋的迷迭香酸巧溶液0.1ml在微量離屯、管中 混合均勻，取混合液0.2ml于尿囊腔接種10日齡SPF級(jí)雞胚，每個(gè)濃度接種4枚雞胚。同時(shí)用 生理鹽水0.1ml與流感病毒液0.1ml混合，作為病毒對(duì)照組。雞胚接種完后，置37°C恒溫解育 箱中解育4她。每日照蛋，棄去2地內(nèi)死亡雞胚，24h W后死胚及4她后存活雞胚均置4 °C冰箱 保存，測定尿囊液血凝效價(jià)，并觀察胚體病理變化。記錄雞胚死死數(shù)及尿囊液血凝滴度，結(jié) 果見表12，13。
[0083] 表12迷迭香酸巧在雞胚水平對(duì)化N1亞型流感病毒抑制作用
[0087] 表13中"一"表示無血凝現(xiàn)象
[0088] 收集各藥物組雞胚尿囊液，進(jìn)行凝血試驗(yàn)，結(jié)果顯示，病毒對(duì)照組血凝效價(jià)為1: 2 迷迭香酸巧各劑量組及利己韋林對(duì)照組雞胚尿囊液與正常對(duì)照孔現(xiàn)象現(xiàn)象一致，均未出 現(xiàn)血凝現(xiàn)象，說明迷迭香酸巧可有效抑制化N1亞型流感病毒在雞胚擴(kuò)增。
[0089] 8、迷迭香酸巧對(duì)感染化N1亞型流感病毒小鼠肺組織炎癥的抑制作用
[0090] 稱取取實(shí)施例1所制備的化合物，用生理鹽水溶解，制成注射制劑；陽性藥利己韋 林注射液（lOOmg/mL，辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：1502246441 )，給藥體積均為 0.1 ml/lOg。13-15g KM小鼠50只，雌雄各半，分成5組，每組10只，分別為溶劑對(duì)照組(不含藥 物，含相同劑量的生理鹽水），病毒感染對(duì)照組，利己韋林對(duì)照組，50mg/kg迷迭香酸巧腹腔 注射組及20mg/kg迷迭香酸巧腹腔注射組。除溶劑對(duì)照組外，其他四組滴鼻感染2倍半數(shù)致 死量化D50)的H1N1亞型流感病毒。每天給藥一次，感染后化開始給藥，連續(xù)給藥6天，至第6 天處死小鼠，解剖，取肺組織，稱體重，肺重，顯微觀察肺組織切片。肺指數(shù)結(jié)果見表14，肺組 織切片見圖9-13,從表14和圖9-13可W看出，迷迭香酸巧對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的肺部炎癥具有 顯著抑制作用。
[0091 ]表14迷迭香酸巧對(duì)病毒感染小鼠肺指數(shù)影響
[0092]
[0093] 表14中肺指數(shù)（％ )=小鼠全肺重(g)/小鼠體重(g)X !00%;"#"表示和正常組相 比，有顯著性差異，P<〇.05; "#r表示與正常組相比有極顯著性差異，p<0.01;"*"表示和模 型組相比，有顯著性差異，P<〇. 05;"林"表示和模型組相比，有極顯著性差異，p<0.01。
[0094] 9、迷迭香酸巧對(duì)感染化N1亞型流感病毒小鼠肺組織病毒增殖的抑制作用
[00M]稱取取實(shí)施例1所制備的化合物，用生理鹽水溶解，制成注射制劑；陽性藥利己韋 林注射液（lOOmg/mL，辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：1502246441 )，給藥體積均為 0.1ml/10g"13-15g KM小鼠50只，雌雄各半，分成5組，每組10只，分別為溶劑對(duì)照組(不含藥 物，含相同劑量的生理鹽水），病毒感染對(duì)照組，利己韋林對(duì)照組，50mg/kg迷迭香酸巧腹腔 注射組及20mg/kg迷迭香酸巧腹腔注射組。除溶劑對(duì)照組外，其他四組滴鼻感染2倍半數(shù)致 死量化D50)的化N1亞型流感病毒。每天給藥一次，感染后化開始給藥，連續(xù)給藥6天，末次給 藥后30min，處死小鼠，解剖，取出肺組織。取小鼠左肺肺組織樣本(25mg)，用RT-PCR測定肺 組織中病毒含量。計(jì)算病毒拷貝數(shù)見表15,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，迷迭香酸巧能抑制病毒在小鼠肺 中的擴(kuò)增，有抑制病毒復(fù)制的功效。
[0096]表15肺組織中病毒拷貝數(shù)對(duì)數(shù)
[0097]
[009引表15中V'表示和模型組相比，有顯著性差異，p<0.05;"林"表示和模型組相比，有 極顯著性差異，P<0. 01。
[0099] 實(shí)施例3(注射劑）
[0100] 1、處方：
[0101] 迷迭香酸巧lOOOg，注射用水20L。
[0102] 2、制備方法：
[0103] 取迷迭香酸巧，加注射用水，攬拌使全溶，用G4垂烙漏斗抽濾至澄明。灌封、滅菌、 燈檢、包裝，即成1 〇〇mg/2ml的迷迭香酸巧注射液。
[0104] 3、用法和用量：
[0105] 每次2.0ml肌肉注射、靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴，每天1-2次，5天一療程。
[0106] 實(shí)施例4(顆粒劑）
[0107] 1、處方：
[0108] 迷迭香酸巧lOOg，lOOg薦糖，lOOg糊精，淀粉適量。
[0109] 2、制備方法：
[0110] 取迷迭香酸巧超微粉碎后加入薦糖、糊精W及適量淀粉，制成顆粒，干燥、制粒，審U 成lOOOg，分裝成Ig每包。
[01川 3、用法和用量：
[0112] 每次1-2包，口服，每天1-2次，7天為一療程。
[0113] 實(shí)施例5(膠囊劑）
[0114] 1、處方：
[0115] 迷迭香酸巧lOOg，淀粉888g，硬脂酸儀12邑。
[0116] 2、制備方法：
[0117] 取迷迭香酸巧超微粉碎后用遞加稀釋法逐次加入已混勻的淀粉(過120目篩)及硬 脂酸儀（過60目篩），再經(jīng)過100目篩充分混勻。調(diào)整裝入量（使每粒膠囊含迷迭香酸巧 lOOmg)裝入空屯、膠囊，套合，封口，包裝。
[011引 3、用法和用量：
[0119] 每次2-4粒，口服，每天2-3次，7天為一療程。
[0120] 實(shí)施例6 (片劑）
[0121] 1、處方：
[0122] 迷迭香酸巧lOOg，淀粉lOOg，滑石粉適量。
[0123] 2、制備方法：
[0124] 取迷迭香酸巧超微粉碎后加入淀粉，混合均勻，加滑石粉適量，壓制成1000片。
[0125] 3、用法和用量：
[01 %] 每次2-4片，口服，每天2-3次，7天為一療程。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 迷迭香酸-4-〇-i3-D-葡萄糖苷在制備預(yù)治流感藥物的應(yīng)用；其中，所述的流感為H1N1 亞型或H9N2亞型流感病毒感染引起的流感。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的迷迭香酸-4-〇-i3-D-葡萄糖苷由以 下方法制得： (1) 取腫節(jié)風(fēng)藥材的干燥粉，用蒸餾水浸提2次，合并提取液，用乙醇沉淀，收集上清液； (2) 將所收集的上清液以水稀釋至生藥濃度為0.5-lg/ml溶液，上清洗至中性的大孔樹 月旨，然后用乙醇梯度洗脫，收集2倍樹脂床體積的30%乙醇洗脫液，加入乙醇使乙醇濃度達(dá) 80 %，靜置過夜，取上清濃縮干燥，以60 %甲醇復(fù)溶，上樣于ODS柱，甲醇梯度洗脫，收集40 % 甲醇洗脫液并濃縮得總迷迭香酸苷； (3) 將總迷迭香酸苷經(jīng)硅膠柱層析分離，分別以甲醇體積濃度為20 %、30 %和40 %的乙 酸-水洗脫，每個(gè)比例2個(gè)柱體積;合并甲醇體積濃度為30%的乙酸-水的層析組分，60°C減 壓濃縮至干，得到迷迭香酸-4-〇-i3-D-葡萄糖苷;其中所述的乙酸-水中乙酸的體積含量為 0.05%〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的藥物由迷迭香酸-4-〇-i3-D-葡萄 糖苷和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中所述的迷迭香酸-4-〇-i3-D-葡萄糖苷在藥物中的質(zhì) 量百分含量為5 %~10 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的藥物為注射液、片劑、膠囊或顆粒 劑。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK105998041SQ201610345135
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月21日
【發(fā)明人】李耿, 黎雄, 賴小平
【申請(qǐng)人】廣州中醫(yī)藥大學(xué)