吡非尼酮衍生物在制藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了式Ⅰ所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水合物或溶劑合物在制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用：其中，R1、R2、R3、R4、R5分別或同時(shí)選自H、鹵素、羥基、硝基、羰基或C1～C8烷基；R6、R7分別或同時(shí)選自H或C1～C8烷基，且R6、R7相連構(gòu)成含有3～17個(gè)碳原子的五元環(huán)或六元環(huán)。本發(fā)明提供了一種式Ⅰ所示的新化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水合物或溶劑合物在制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，與吡非尼酮相比，本發(fā)明新化合物具有不同的環(huán)結(jié)構(gòu)，且本發(fā)明新化合物的抗纖維化活性顯著優(yōu)于吡非尼酮，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
【專利說明】
口比非尼酬衍生物在制藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及化非尼酬衍生物在制藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維化是指由各種致病因素引起的患者器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少或壞死，組織內(nèi)細(xì)胞外 基質(zhì)增多和彌漫性過度沉積的病理過程，持續(xù)進(jìn)展可導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)的破壞和功能減退，直 至衰竭。纖維化可發(fā)生于多種器官，臨床上最為常見的纖維化主要有：（1)肺纖維化；（2)肝 纖維化；（3)屯、臟纖維化；（4)腎纖維化和(5)膜腺纖維化;此外，眼，血管，神經(jīng)系統(tǒng)也可能發(fā) 生纖維化。
[0003] 抗纖維化藥物是指治療和/或預(yù)防纖維化疾病的藥物，如：化非尼酬(上市藥物產(chǎn) 品），然而，該化合物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制率僅能達(dá)到8.15%，抗纖維化活性差。
[0004] 目前，未見有將本發(fā)明式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水合物或 溶劑合物用于制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種式I所示的新化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水 合物或溶劑合物在制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水合物或溶劑合物 在制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用：
[0007]
[000引 其中，
[0009] Ri、R2、R3、R4、Rs分別或同時(shí)選自H、面素、徑基、硝基、幾基或Cl~C8烷基；
[0010] R6、R汾別或同時(shí)選卽或Cl~C8烷基，且R6、R浦連構(gòu)成含有3~17個(gè)碳原子的五元 環(huán)或六元環(huán)。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的抗纖維化藥物為抑制成纖維細(xì)胞增殖的藥物。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的抗纖維化藥物為抑制成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白的藥物。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的成纖維細(xì)胞為胚胎成纖維細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、肝成纖維細(xì)胞、 屯、臟成纖維細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞、膜腺成纖維細(xì)胞、眼部成纖維細(xì)胞、血管成纖維細(xì)胞中的 任意一種或兩種w上。
[0014] 進(jìn)一步的，所述的抗腫瘤藥物為抗癌藥物。
[0015] 進(jìn)一步的，所述的抗癌藥物為治療和/或預(yù)防乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌中的任 意一種或兩種W上癌癥的藥物。
[0016] 進(jìn)一步的，Ri、R2、R3、R4、Rs分別或同時(shí)選自Η或Cl~C偏基；優(yōu)選的，Ri、R2、R3、R4、Rs 分別或同時(shí)選自Η或Cl~C4烷基;更優(yōu)選的，Ri選自Η或Cl~C4烷基;化、R3、R4、化同時(shí)為Η。 [0017]進(jìn)一步的，式I所示的化合物為
[001 引
[0019] 其中，1?8、1?9、1?1日、虹1、虹2分另喊同時(shí)選自曬^：1~〔4烷基。
[0020] 進(jìn)一步的，1?8、1?9、1?10、虹1、虹2分別或同時(shí)選自曬^甲基、乙基。
[0021 ]進(jìn)一步的，式I所示的化合物為
[0022]
[0023]
[0024] 本發(fā)明提供了一種式I所示的新化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水合物或溶 劑合物在制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，與化非尼酬相比，本發(fā)明新化合物 具有不同的環(huán)結(jié)構(gòu)，且本發(fā)明新化合物的抗纖維化活性顯著優(yōu)于化非尼酬，特別是，本發(fā)明 新化合物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制率，相對(duì)于化非尼酬提高幅度至少在30% W上，同時(shí)，本 發(fā)明新化合物對(duì)成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白的抑制效果也顯著優(yōu)于化非尼酬，具有良好 的產(chǎn)業(yè)化前景。
[0025] 本發(fā)明中提供的化合物和衍生物可W根據(jù)IUPAC(國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì))或 CAS(化學(xué)文摘服務(wù)社，Columbus，0H)命名系統(tǒng)命名。
[0026] 關(guān)于本發(fā)明的使用術(shù)語的定義：除非另有說明，本文中基團(tuán)或者術(shù)語提供的初始 定義適用于整篇說明書的該基團(tuán)或者術(shù)語;對(duì)于本文沒有具體定義的術(shù)語，應(yīng)該根據(jù)公開 內(nèi)容和上下文，給出本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠給予它們的含義。
[0027] "取代"是指分子中的氨原子被其它不同的原子或分子所替換。
[00%]碳氨基團(tuán)中碳原子含量的最小值和最大值通過前綴表示，例如，前綴Ca~Cb烷基表 明任何含V'至V個(gè)碳原子的烷基。因此，例如，Cl~C4烷基是指包含1~4個(gè)碳原子的烷基； 取代的Cl~C4烷基是指烷基中包含1~4個(gè)碳原子，不將取代基的碳原子數(shù)計(jì)算在內(nèi)。
[0029] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"是指某載體、運(yùn)載物、稀釋劑、輔料，和/或所形成的鹽通常 在化學(xué)上或物理上與構(gòu)成某藥物劑型的其它成分相兼容，并在生理上與受體相兼容。
[0030] 術(shù)語"鹽"和"可藥用的鹽"是指上述化合物或其立體異構(gòu)體，與無機(jī)和/或有機(jī)酸 和堿形成的酸式和/或堿式鹽，也包括兩性離子鹽（內(nèi)鹽），還包括季錠鹽，例如烷基錠鹽。運(yùn) 些鹽可W是在化合物的最后分離和純化中直接得到。也可W是通過將上述化合物，或其立 體異構(gòu)體，與一定數(shù)量的酸或堿適當(dāng)（例如等當(dāng)量)進(jìn)行混合而得到。運(yùn)些鹽可能在溶液中 形成沉淀而W過濾方法收集，或在溶劑蒸發(fā)后回收而得到，或在水介質(zhì)中反應(yīng)后冷凍干燥 制得。本發(fā)明中所述鹽可W是化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽、構(gòu)祿酸鹽、苯橫酸鹽、氨漠酸鹽、氨 氣酸鹽、憐酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、下二酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、班巧酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸 鹽、酒石酸鹽或Ξ氣乙酸鹽。
[0031] 本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括 (但并不限于）：口服、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下）、和局部給藥。
[0032] 用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在運(yùn)些固體劑 型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如巧樣酸鋼或憐酸二巧，或與 下述成分混合：（a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、薦糖、葡萄糖、甘露醇和娃酸；（b)粘合 劑，例如，徑甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙締基化咯燒酬、薦糖和阿拉伯膠；（C)保濕劑，例 如，甘油；（d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸巧、馬鈴馨淀粉或木馨淀粉、藻酸、某些復(fù)合娃酸鹽、 和碳酸鋼；（e)緩溶劑，例如石蠟；（f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；（g)潤濕劑，例如嫁蠟 醇和單硬脂酸甘油醋；化)吸附劑，例如，高嶺±;和（0潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸巧、硬脂 酸儀、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鋼，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含 緩沖劑。
[0033] 固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和 其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，運(yùn)種組合物中活性化合物或化合物的 釋放可W延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放。可采用的包埋組分的實(shí)例是聚合物質(zhì) 和蠟類物質(zhì)。必要時(shí)，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
[0034] 用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或町劑。 除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增 溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙醋、乙酸乙醋、丙二醇、1,3-下二醇、二甲基甲酯 胺W及油，特別是棉巧油、花生油、玉米胚油、橄攬油、藍(lán)麻油和芝麻油或運(yùn)些物質(zhì)的混合物 等。
[0035] 除了運(yùn)些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味 劑、矯味劑和香料。
[0036] 除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八燒醇、聚氧乙締 山梨醇和脫水山梨醇醋、微晶纖維素、甲醇侶和瓊脂或運(yùn)些物質(zhì)的混合物等。
[0037] 用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0038] 用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。 活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時(shí)可能需要 的推進(jìn)劑一起混合。
[0039] 本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的輔料，是指除活性成分W外包含在劑型中的物質(zhì)。
[0040] 本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的輔助性成分，它具有一定生理活性，但該成分的加入 不會(huì)改變上述藥物組合物在疾病治療過程中的主導(dǎo)地位，而僅僅發(fā)揮輔助功效，運(yùn)些輔助 功效僅僅是對(duì)該成分已知活性的利用，是醫(yī)藥領(lǐng)域慣用的輔助治療方式。若將上述輔助性 成分與本發(fā)明藥物組合物配合使用，仍然屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0041] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0042] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。
[0044] 縮寫；
[0045] DMF: N，N-二甲基甲酯胺;TLC:薄層色譜；3T3L1:小鼠胚肺成纖維細(xì)胞;FBS( f etal bovine serum):胎牛血清；DMSO:二甲基亞諷；DMEM(dulbecco's modified eagle medium):DMEM培養(yǎng)基；ElISA:酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法;MTT(3-(4,5-dimethパ-2-thiazolyl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide):嚷挫藍(lán)tk色法；IC已0化alf maximal inhibitory concentration):半數(shù)抑制濃度。
[0046] 實(shí)施例1、本發(fā)明化合物化的合成
[0047] 合成路線：
[004引
[00例 1、化合物3(5-甲基化晚酬)的合成
[0050] 在25mL反應(yīng)瓶中先加入3.40mL 50%硫酸(v/v)，然后加入1. OOg(lOmmol)2-氨基- 5-甲基化晚(化合物1)，冰鹽浴冷卻至10°CW下，攬拌幾分鐘后，反應(yīng)液變?yōu)槿榘咨?然后緩 慢滴加1.72g(化mmol)NaN〇2與3mL出0組成的混合溶液，滴加過程中有棟黃色有刺激性氣味 氣體產(chǎn)生，加畢，反應(yīng)液變?yōu)榈S色，用10%的稀硫酸調(diào)抑至7-8，回流攬拌反應(yīng)20min左右， 旋掉大部分水，向其中加入適量300目硅膠，旋干，倒入玻璃砂忍漏斗，乙酸乙醋沖洗抽濾， 將濾液旋干即得粗產(chǎn)品(化合物3)，未經(jīng)純化，直接用于下一步反應(yīng)。
[0051 ] 2、化合物4(5-甲基-1-(4-甲酯苯基)-2-(lH)化晚酬)的合成
[0052]在25mL圓底燒瓶中加入0.1 0g( 1 mmol，Iquiv.)化合物3，0.1 7g( 1 mmol，Iquiv.)對(duì) 漠苯甲醒，1.4g(lOmmol, lOequiv.化2C〇3，0.05g(0.26mmol，0.26equiv. )QiI，5mL DMF作溶 劑，回流攬拌反應(yīng)化，TLC跟蹤，反應(yīng)畢，冷卻，加入30mL水，3 X 20mL乙酸乙醋萃取，有機(jī)層無 水硫酸鋼干燥，旋干，300目硅膠柱層析分離，洗脫劑石油酸：乙酸乙醋= l:3(v/v)，得淺黃 色固體:化合物4。
[0化3] 3、化合物化的合成
[0054] 在盛有l(wèi)OmL叔下醇的25mL圓底燒瓶中加入0.22g( Immol，lequiv .)化合物4， 0.086g( 1.2mmol，1.2equiv.) 1,2-丙二胺（R,S混旋物），0.32g(2.5mmol ,2.5equiv.)單質(zhì) 艦，0.43g(3mmol, 3. OequiV.)碳酸鐘，70°C下反應(yīng)化，反應(yīng)畢，調(diào)抑至7-8，旋干上柱，先用石 油酸：乙酸乙醋= l:2(v/v)洗脫劑沖洗掉未完全反應(yīng)完的化合物4及1,2-丙二胺，然后直接 用乙醇(溶有3-5滴Ξ乙胺)直接將產(chǎn)物洗脫出，合并洗脫液，旋干，即得黃色化合物化，該步 驟的單步收率為66 %。
[0化5] 化合物化：1-(4-(5-甲基-4,5-二氨-1H-咪挫-2-基）苯基）-5-甲基化晚 酬，黃色固體，m.p.l80-182°C;
[0056] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S7.99(t，J = 7.6Hz，2H)，7.58-7.42(m，4H)，6.44(d，J = 9.3Hz，lH)，3.99-3.88(m，lH)，3.51-3.41(m，2H)，2.05(s，3H)，1.83(s，3H)1.77(m，lH);
[0057] ?3〇 NMR(101MHz，DMS0)Sl73.38，170.41，162.29，160.46，143.61，135.61，128.54, 127.14,120.34,114.77,60.31,46.75,22.33,16.46;
[005引 HRMS(ESI)calcd for。姐 17化0[M+H]+268.1451,found 268.1450。
[0059] 實(shí)施例2、本發(fā)明化合物5c的合成
[0060] 按照實(shí)施例1類似的方法，步驟3中W乙二胺為原料，制備得到化合物5c，第3步的 單步收率為69 %。
[0061]
[0062] 化合物5c: 1-(4-(4，5-二氨-IH-咪挫-2-基)苯基)-5-甲基化晚-2( IH)-酬，黃色固 體，m.p.252-254°C;
[006；3] 1h 醒R(400MHz，DMS0)δ8.01(d，J = 8.5Hz，2H)，7.68(d，J = 8.甜z，2H)，7.55-7.31 (m，2H)，6.45(d J = 9.3Hz，lH)，4.02-3.25(m，4H)，2.05(s，3H)，1.86(dd J=12.6,9.6Hz, IH);
[0064] "C NMR(lOlMHz，DMS0)S164.04，160.29，144.87，143.66，135.37，129.01，127.50， 125.22,123.22,120.32,114.84,69.80,45.61,16.42；
[00化]HRMS(ESI)calcd for。出化化0[M+H]+254.1294，found 254.1289。
[0066] 實(shí)施例3、本發(fā)明化合物5d的合成
[0067] 按照實(shí)施例1類似的方法，步驟3中Wl，3-丙二胺為原料，制備得到化合物5d，第3 步的單步收率為54%。
[006引
[0069] 化合物5d:l-(4-(l，4,5,6-四氨喀晚-2-基)苯基)-5-甲基化晚酬，黃色固 體，m.p. 265-267 °C;
[0070] 1h 醒R(400MHz，DMS0)δ7.83(d，J = 8.5Hz，2H)，7.68(d，J = 8.甜z，2H)，7.51-7.40 (m，2H)，6.45(d，J = 9.3Hz，lH)，3.51(m，6H)，2.93(dd，J=14.7,7.4Hz，lH)，2.05(d，J = 13.甜z，3H);
[0071] "C NMR(101MHz，DMS0)Sl60.21，158.66，144.51，143.61，135.29，128.51，127.95, 127.39,120.27,114.62,45.76,17.60,16.37,11.06；
[0072] HRMS(ESI)calcd for。姐 17化0[M+H]+268.1451，found 268.1449。
[0073] 實(shí)施例4、本發(fā)明化合物7b的合成
[0074]
[0075] 步驟1中W化合物Γ (2-氨基化晚）為原料，按照實(shí)施例2類似的方法，制備得到化 合物化，第3步的單步收率為56 %。
[0076] 化合物7b :1-(4-(4-5-二氨-1Η-咪挫-2-基）苯基）化晚-2(1Η)-酬，黃色固體， m.p.237-239°C；
[0077] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S8.00(d，J = 8.6Hz，2H)，7.69(ddJ=12.3,5.2Hz，3H), 7.57-7.51(m，lH)，6.50(d，J = 9.2Hz，lH)，6.37(td，J = 6.7，l.lHz，lH)，3.56-3.10(m，4H)， l. 87(s，lH);
[007引 ?30 NMR(101MHz，DMS0)Sl70.27，163.97，160.98，144.55，141.07，138.51，128.93, 127.49,120.63,106.14,45.90,45.74;
[0079] HRMS(ESI)calcd for。姐1曲3〇[M+H]+240.1138，found 240.1138。
[0080] 實(shí)施例5、本發(fā)明化合物7c的合成
[0081] 步驟1中W化合物Γ (2-氨基化晚）為原料，步驟3中Wl，3-丙二胺為原料，按照實(shí) 施例4類似的方法，制備得到化合物7c，第3步的單步收率為56%。
[0082]
[0083] 化合物7c: 1-(4-(1，4,5,6-四氨喀晚-2-基）苯基）化晚酬，黃色固體， m. p.146-148°C ；
[0084] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S8.10(d，J = 8.6Hz，2H)，7.83(d，J = 8.4Hz，2H)，7.65(d，J = 8.4Hz，lH)，7.57-7.51(m，lH)，6.48(d，J = 9.3Hz，lH)，6.37(td，J = 6.7，l.lHz，lH), 3.53-3.41 (m，6H)，2.94(dd，J = 14.7，7.4Hz，IH);
[0085] 13c NMR(101MHz，DMS0)Sl70.：M，165.08，162.01，161.64，159.06，141.64，138.91， 129.13,128.63,127.82,120.99,106.76,46.31,37.27,35.33；
[0086] HRMS(ESI)calcd for。出化化0[M+H]+254.1294,found 254.1292。
[0087] 對(duì)比例、化非尼酬的合成
[008引在25mL圓底燒瓶中加入0.10g(lmmol，Iquiv.)化合物3，0.17g( Immol，Iquiv.)漠 苯，1.4g(10mmol, lOequiv.化2C03,0.05g(0.26mmol，0.25equiv. )QiI，5mL DMF作溶齊υ，回流 攬拌反應(yīng)化，TLC跟蹤，反應(yīng)畢，冷卻，加入30mL水，3 X 20mL乙酸乙醋萃取，有機(jī)層無水硫酸 鋼干燥，旋干，300目硅膠柱層析分離，洗脫劑石油酸：乙酸乙醋= l:3(v/v)，得到化非尼酬， 收率為76 %。
[0089] 化非尼酬:黃色晶體，m.p.l21-123°C;
[0090] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S7.49(t，J = 7.4Hz，2H)，7.44-7.32(m，5H)，6.43(d，J = 9.3Hz，lH)，2.03(s，3H);
[0091] ?3〇 NMR(101MHz，DMS0)Sl60.41，142.98，141.01，136.04，128.96，127.92，126.71, 120.21,114.01,16.30。
[0092] 實(shí)施例6、本發(fā)明化合物的抗纖維化活性
[0093] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0094] 將3T化1細(xì)胞接種于含有10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入lOOIU/mL青霉素和鏈霉 素，置于37°C含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合后，W0.25%的膜酶消化 傳代，取3-10代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用DMS0溶解化非尼酬、本發(fā)明化合物，0.22μπι濾膜過濾除 菌，-20°C保存，臨用前解凍。
[0095] 2、細(xì)胞增殖率/抑制率評(píng)價(jià)
[0096] 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液將3T化1細(xì)胞接種于96孔板，濃度調(diào)整為8X10シ孔，于 37°C含有5%的二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)2地，分別加入100、200、40化g/mLS個(gè)濃度的本發(fā)明 化合物，W化非尼酬(pirfenidone，PFD)作為陽性對(duì)照，等量的DMEM培養(yǎng)液作為空白對(duì)照， 每組設(shè)5個(gè)平行孔，放在37°C含有5%的二氧化碳的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，24、48h后加入20μΙ ΜΤΤ(5mg/mL)，繼續(xù)防治在培養(yǎng)箱中解化4h，棄去上清液，每孔加入15化L DMS0，混勻lOmin， 酶標(biāo)儀570nm處讀取各孔吸光度值，根據(jù)吸光度0. D.值計(jì)算出細(xì)胞的增殖率/抑制率，抑制 率用實(shí)驗(yàn)組跟對(duì)照組0. D.值得差值與對(duì)照組的0. D.值得比值表示。
[0097] 24、4化后，MTT法檢測(cè)100、200、4(K)yg/mLS個(gè)濃度的本發(fā)明化合物對(duì)3T化1細(xì)胞增 殖抑制率的評(píng)價(jià)結(jié)果，見表1。
[0098] 表1、本發(fā)明化合物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制率結(jié)果
[0099]
[0100] 說明：抑制率越高，表明其抗纖維化活性越好誼白對(duì)照的抑制活性為0,化非尼酬 作陽性對(duì)照。
[0101] 上述結(jié)果表明，與化非尼酬(PFD)相比，本發(fā)明化合物對(duì)3T化1細(xì)胞增殖的抑制率 有了顯著提高，提高幅度至少在30% W上。
[0102] 3、對(duì)3T化1細(xì)胞分泌化(fibronectin，纖維連接蛋白）抑制活性的評(píng)價(jià)
[0103] E11SA試劑盒測(cè)定化的表達(dá)。含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整調(diào)整細(xì)胞濃度為8 X 10^孔并接種于96孔板上，于37°C含有5%的二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)24h，分別加入100、 200、40化g/mLS個(gè)濃度的本發(fā)明化合物，W化非尼酬作為陽性對(duì)照，等量的DMEM培養(yǎng)液作 為空白對(duì)照，于37°C含有5%的二氧化碳的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)4她后取細(xì)胞上清液加入測(cè)試孔 中，酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定吸光度0. D.值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得出化的數(shù)值。
[0104] 4化后化ISA試劑盒分別檢測(cè)100、200、40化g/mLS個(gè)濃度的本發(fā)明化合物對(duì)3T化！ 細(xì)胞分泌化的結(jié)果，結(jié)果見表2。
[0105] 表2、本發(fā)明化合物對(duì)3T化1細(xì)胞分泌化抑制活性的評(píng)價(jià)結(jié)果
[0106]
[0107] 說明：化值越小，表明抑制化表達(dá)的活性越強(qiáng)，其抗纖維化活性也越強(qiáng)誼白對(duì)照 中化的數(shù)值為1389.1 Ong/mL，R比非尼酬作陽性對(duì)照。
[0108] 上述結(jié)果表明，本發(fā)明化合物對(duì)3T化1細(xì)胞分泌化的抑制效果顯著優(yōu)于化非尼酬 腫D)。
[0109] 實(shí)施例7、本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性
[0110] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0111] MDA-MB-231細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MC巧細(xì)胞用無酪紅的培養(yǎng)基按常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加 入5 %的胎牛血清(FBS)、4mM谷氨酸鹽、ImM丙酬酸鋼、lOOIU/mL青霉素、lOOyg/mL鏈霉素和 0.25yg/mL兩性霉素；LnCAP前列腺癌細(xì)胞在RPIM-1640培養(yǎng)液中按常規(guī)培養(yǎng)，另加入10% FBS、4mM谷氨酸鹽、ImM丙酬酸鋼、lOOIU/mL青霉素、lOOyg/mL鏈霉素和0.25yg/mL兩性霉素； 細(xì)胞培養(yǎng)在37°C含有5%的二氧化碳的環(huán)境中。
[0112] 2、細(xì)胞存活率、增殖率評(píng)價(jià)
[0113] MDA-MB-231細(xì)胞按每孔50000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于含有5%FBS培養(yǎng)基的六孔板 中，再向其中加入10-5Μ、10-6Μ的本發(fā)明化合物，等體積的DMS0作為空白對(duì)照，將細(xì)胞在37 °C 含有5%的二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)5天;流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，存活率 由化合物處理過的細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)表示。
[0114] HeLa、LnCAP及MCF7細(xì)胞按每孔20000個(gè)細(xì)胞的濃度接種于含有10%FBS培養(yǎng)基的 24-孔板中，孔中按6個(gè)不同濃度(0.0ΙμΜ至1 ΟμΜ)加入對(duì)照品化非尼酬、本發(fā)明化合物，等體 積的DMS0作為空白對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活率用藥物處理過的細(xì)胞數(shù)/空白 對(duì)照細(xì)胞數(shù)表示，從劑量反應(yīng)曲線上得到ICso值。
[0115] 3、抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果
[0116] 本發(fā)明化合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制活性初篩結(jié)果，結(jié)果見表3。
[0117] 表3、本發(fā)明化合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制活性效果
[011 引
[0119] 基于化非尼酬、本發(fā)明化合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的初篩結(jié)果，設(shè)置Ο.ΟΙμΜ至ΙΟμΜ 6個(gè)不同濃度，進(jìn)行化合物對(duì)化La、LnCAP及MCF7細(xì)胞的劑量依賴反應(yīng)篩選，從劑量反應(yīng)曲線 上得出IC50值，結(jié)果見表4。
[0120] 表4、本發(fā)明化合物對(duì)化La、LnCAP及MC巧細(xì)胞的抑制活性效果
[0121]
[0122] 上述結(jié)果表明，本發(fā)明化合物與化非尼酬的抗腫瘤活性效果基本相當(dāng)。
[0123] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種式I所示的新化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、 水合物或溶劑合物在制備抗纖維化藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，與化非尼酬相比，本發(fā) 明新化合物具有不同的環(huán)結(jié)構(gòu)，且本發(fā)明新化合物的抗纖維化活性顯著優(yōu)于化非尼酬，特 別是，本發(fā)明新化合物對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制率，相對(duì)于化非尼酬提高幅度至少在30% W上，同時(shí)，本發(fā)明新化合物對(duì)成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白的抑制效果也顯著優(yōu)于化非 尼酬，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、晶型、水合物或溶劑合物在制備抗纖維化 藥物和/或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用： 其中，Ri、R2、R3、R4、R5分別或同時(shí)選自H、鹵素、羥基、硝基、羰基或&~C 8烷基； R6、R7分別或同時(shí)選自H或CpC8烷基，且R6、R7相連構(gòu)成含有3~17個(gè)碳原子的五元環(huán)或 六元環(huán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的抗纖維化藥物為抑制成纖維細(xì)胞增 殖的藥物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的抗纖維化藥物為抑制成纖維細(xì)胞分 泌纖維連接蛋白的藥物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的成纖維細(xì)胞為胚胎成纖維細(xì)胞、 肺成纖維細(xì)胞、肝成纖維細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞、胰腺成纖維細(xì)胞、眼部成纖 維細(xì)胞、血管成纖維細(xì)胞中的任意一種或兩種以上。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的抗腫瘤藥物為抗癌藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的抗癌藥物為治療和/或預(yù)防乳腺癌、 子宮頸癌、前列腺癌中的任意一種或兩種以上癌癥的藥物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:R1、R2、R3、R4、抱分別或同時(shí)選自H或CpC 8烷 基；優(yōu)選的，Ri、R2、R3、R4、R5分別或同時(shí)選自H或Ci~C4烷基；更優(yōu)選的，Ri選自 基;1?2、1?3、1?4、1?5同時(shí)為11。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:式I所示的化合物為其中，1?8、1?9、1?1()、1?11、1?12分別或同時(shí)選自11或&~〇4烷基。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:1?8、1?9、1?1()、1? 11、1?12分別或同時(shí)選自!1或甲基、 乙基。10. 枏據(jù)權(quán)剎要求9所沭的應(yīng)用，其特征在干：式I所示的化合物為
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK105878243SQ201610423743
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】尹述凡, 黎勇, 曹婷婷, 楊子耀
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)