表面多孔的plga微球制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高分子多孔微球材料技術(shù)領(lǐng)域，更為具體地，涉及一種利用W/0/W雙重乳化溶劑揮發(fā)法結(jié)合定向水解技術(shù)制備表面具有大孔結(jié)構(gòu)可注射的細(xì)胞微球載體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)是一種可降解生物高分子聚合物，其生物力學(xué)性和降解性可通過其聚合的單體乳酸(LA)和羥基乙酸的比例及分子量調(diào)控。由于良好的生物相容性，已被美國Π)Α批準(zhǔn)可用于臨床，在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域內(nèi)具有廣泛的應(yīng)用，目前已被制作成為各類生物可吸收的骨螺釘、手術(shù)縫合線、藥物載體及組織工程支架材料。將其制成形態(tài)、表面多孔結(jié)構(gòu)可控的微球，將是一種良好的可注射組織工程細(xì)胞載體，具有廣泛的潛在應(yīng)用。
[0003]微球是近年來發(fā)展起來的新型細(xì)胞載體，它是以蛋白、明膠、聚乳酸等生物材料制成的球狀載體。微球材料是目前生物材料領(lǐng)域發(fā)展較快而且應(yīng)用前景非常好的的材料之一，與常規(guī)的生物材料相比，微球具有如下特點和性能:I)在微球內(nèi)制作較大直徑的孔道，使之可容納細(xì)胞生存，微球即為一種組織工程支架，作為可注射支架材料應(yīng)用于微創(chuàng)治療；
2)通過微球表面修飾，微球可以對環(huán)境溫度、pH、磁場、超聲、輻射等因素產(chǎn)生快速的反應(yīng)；
3)微球可以作為致孔劑，提高傳統(tǒng)塊體支架材料的孔隙率，有利于生物組織的長入，生成代謝的進(jìn)行和改善材料的力學(xué)性能;4)微球作為微反應(yīng)器，誘導(dǎo)磷灰石在其表面礦化，有利于骨組織再生，是良好的骨修復(fù)材料;5)微球本身固有的球形屬性使其具有良好的可注射性，可用于微創(chuàng)治療，并在修復(fù)復(fù)雜部位的骨缺損時容易成型;6)具有微/納米尺寸。由于具有較小的尺寸和較大的比表面積，已被廣泛用作藥物控釋載體;7)微球能夠掩蓋藥物不良?xì)馕都翱谖?，提高藥物的穩(wěn)定性，防止藥物在胃內(nèi)失活或降低藥物對胃的刺激，緩釋或控釋及靶向作用。
[0004]目前用于制備微球的物理化學(xué)方法通過有3大類:相分離法，微流道法和溶劑蒸發(fā)法。相分離的方法要使用大量的有機溶劑作為凝聚劑，這些有機溶劑的去除較為困難，會帶來環(huán)境污染和細(xì)胞毒性，對作為生物相容性要求較高的細(xì)胞載體而言并不太適合。微流道法需要較為復(fù)雜的流體系統(tǒng)，對制備條件要求較高。而溶劑蒸發(fā)法是一種較為常規(guī)的微球制備方法，目前應(yīng)用較為普遍，該方法是從乳狀液中去除有機溶劑而使高分子固化成球，可以較好地控制微球粒徑，通過乳化過程中加入具有滲透作用的物質(zhì)作為致孔劑可控制其表面多孔結(jié)構(gòu)。該方法不需要特殊的高壓裝置也不會引有毒的相分離凝聚劑。但是該方法制備的微球，表面多孔孔徑大多是微米級，較難生成孔徑可控的可供細(xì)胞進(jìn)入的約20μπι大孔結(jié)構(gòu)。其于上述分析，發(fā)展了一種新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種表面多孔的PLGA微球制備方法，工藝簡單，周期短，適合用工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明提供一種表面多孔的PLGA微球制備方法，包括:將PLGA加入到有機溶劑中，攪拌溶解后，滴加入致孔溶液，并超聲乳化，形成乳化液;其中，所述PLGA的LA與GA的摩爾比例范圍為:50:50?90:10;
[0007]將所述乳化液逐滴加入到攪拌的外水相中，并加入預(yù)設(shè)體積的去離子水，改變速率持續(xù)攪拌，直至所述有機溶劑完全揮發(fā)，其中，所述外水相為水溶性表面活性劑加入去離子水中；
[0008]將所述有機溶劑完全揮發(fā)后的溶液進(jìn)行離心，并用去離子水清洗，除去上清液，獲得PLGA微球；
[0009]將NaOH溶液加入到所述PLGA微球中，混合均勻，并放到搖床繼續(xù)反應(yīng)；
[0010]將反應(yīng)后的PLGA微球用去離子水反復(fù)離心洗滌，冷凍干燥，獲得表面多孔的PLGA微球。
[0011 ] 此外，優(yōu)選的方案是，所述PLGA的分子量為10000至100000。
[0012]此外，優(yōu)選的方案是，所述致孔溶液為牛血清白蛋白或PVA水溶液，所述致孔溶液的濃度為0.1_4%。
[0013]此外，優(yōu)選的方案是，所述有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯，所述有機溶劑的濃度為0.25-10%。
[0014]此外，優(yōu)選的方案是，所述水溶性表面活性劑為PVA、羧甲基纖維素或PEG;所述水溶性表面活性劑的濃度為0.1-2%。
[0015]此外，優(yōu)選的方案是，在形成復(fù)乳時，油水比為1:3?1:5，并經(jīng)過10-50min快速攪拌形成初乳后，再加入10倍的去離子水改變速率繼續(xù)攪拌約4h，至所述有機溶劑揮發(fā)完全。
[0016]此外，優(yōu)選的方案是，在將NaOH溶液加入到所述PLGA微球中，混合均勻，并放到搖床繼續(xù)反應(yīng)的過程中，
[0017]將濃度為0.1?IMol/L的NaOH溶液加入到所述PLGA微球中，在5?40 °C下使所述PLGA微球表面小孔發(fā)生水解反應(yīng)，形成大孔。
[0018]從上面的技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供的表面多孔的PLGA微球制備方法，形成的表面多孔的PLGA微球為表面具有可供細(xì)胞進(jìn)入的大孔結(jié)構(gòu)，孔徑約20μπι的PLGA多孔微球，粒徑均勻，內(nèi)部孔隙貫通，形貌結(jié)構(gòu)統(tǒng)一;在乳化時采用超聲乳化的方法縮短了乳化時間，采用生物相容性良好的白蛋白和PVA水溶液作為致孔劑，無細(xì)胞毒副作用；后期結(jié)合NaOH堿性溶液定向水解，控制表面的孔徑大小為20μπι，能夠改進(jìn)只通過乳化法制備的微球孔徑偏小的缺點，所制備的微球大孔孔徑符合細(xì)胞進(jìn)入的要求，微球球形度好，粒徑約ΙΟΟμπι，具有較好的可注射性。
[0019]為了實現(xiàn)上述以及相關(guān)目的，本發(fā)明的一個或多個方面包括后面將詳細(xì)說明并在權(quán)利要求中特別指出的特征。下面的說明以及附圖詳細(xì)說明了本發(fā)明的某些示例性方面。然而，這些方面指示的僅僅是可使用本發(fā)明的原理的各種方式中的一些方式。此外，本發(fā)明旨在包括所有這些方面以及它們的等同物。
【附圖說明】
[0020]通過參考以下結(jié)合附圖的說明及權(quán)利要求書的內(nèi)容，并且隨著對本發(fā)明的更全面理解，本發(fā)明的其它目的及結(jié)果將更加明白及易于理解。在附圖中:[0021 ]圖1為根據(jù)本發(fā)明實施例的表面多孔的PLGA微球制備方法流程示意圖；
[0022 ]圖2為根據(jù)本發(fā)明實施例的表面多孔的PLGA微球的掃描電鏡圖片。
[0023 ]在所有附圖中相同的標(biāo)號指示相似或相應(yīng)的特征或功能。
【具體實施方式】
[0024]在下面的描述中，出于說明的目的，為了提供對一個或多個實施例的全面理解，闡述了許多具體細(xì)節(jié)。然而，很明顯，也可以在沒有這些具體細(xì)節(jié)的情況下實現(xiàn)這些實施例。
[0025]以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0026]為了說明本發(fā)明提供的表面多孔的PLGA微球制備方法，圖1示出了根據(jù)本發(fā)明實施例的表面多孔的PLGA微球制備方法流程。
[0027]如圖1所示，本發(fā)明提供的表面多孔的PLGA微球制備方法包括:
[0028]S110:將PLGA加入到有機溶劑中，攪拌溶解后，滴加入致孔溶液，并超聲乳化，形成乳化液;其中，所述PLGA的LA與GA的摩爾比例范圍為:50:50?90:10；
[0029]S120:將乳化液逐滴加入到攪拌的外水相中，并加入預(yù)設(shè)體積的去離子水，改變速率持續(xù)攪拌，直至有機溶劑完全揮發(fā)，其中，外水相為水溶性表面活性劑加入去離子水中；
[0030]S130:將有機溶劑完全揮發(fā)后的溶液進(jìn)行離心，并用去離子水清洗，除去上清液，獲得PLGA微球；
[0031 ] S140:將NaOH溶液加入到所述PLGA微球中，混合均勻，并放到搖床繼續(xù)反應(yīng)；
[0032]S150:將反應(yīng)后的PLGA微球用去離子水反復(fù)離心洗滌，冷凍干燥，獲得表面多孔的PLGA微球。
[0033]上述方法為表面多孔的PLGA微球制備的詳細(xì)方法，其中，PLGA的分子量為10000至100000。致孔劑為牛血清白蛋白或PVA水溶液，優(yōu)選PVA，致孔劑濃度為0.1-4% (w/v);有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯，優(yōu)選二氯甲烷;PLGA有機溶劑的濃度為0.25-10%(w/v)ο
[0034]另外，水相表面合性劑為PVA，羧甲基纖維素或PEG，優(yōu)選PVA，PVA分子量為40000-100000，其濃度控制在0.1-2% (w/v)。
[0035]在步驟SllO中，將所得到的致孔劑水溶液作為內(nèi)水相，在超聲條件下加入到油相中，形成油包水乳化液(油包水乳化液時，采用了超聲波乳化以快速形成乳化液)，超聲功率為8-40W，時間控制在30s-5min。致孔劑內(nèi)水相溶液:油相溶液=1:10?20(v/v)。
[0036]在步驟S120中，在形成復(fù)乳時，油水比為1: 3?1: 5，并經(jīng)過10_50min快速以800-1600rpm速率攪拌形成初乳后，再加入10倍的去離子水繼續(xù)以200-500rpm速率攪拌約2-4h，至所述有機溶劑揮發(fā)完全。
[0037]在步驟S140中，將濃度為0.1?IMol/L的NaOH溶液加入到所述PLGA微球中，在5?40°C下使所述PLGA微球表面小孔發(fā)生水解反應(yīng)，形成大孔;處理微球的堿溶液與微球的比例控制在濃度1-5% (w/v)，反應(yīng)時間為2min_30min。
[0038]圖2示出了根據(jù)本發(fā)明實施例的表面多孔的PLGA微球的掃描電鏡圖片，此圖片為根據(jù)上述圖1的流程制備出的表面多孔的PLGA微球的電鏡圖片。
[0039]下面的示例將采用圖1的方法流程制備表面多孔的PLGA微球，其中，實施例所采用的原料來源說明，PLGA購自山東濟南岱罡生物科技有限公司;PVA購自Sigma-Aldrich;二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙腈，羧甲基纖維素，聚乙二醇購自成都科龍化工試劑廠;所用的超聲波乳化機購自上海生析。
[0040]示例一
[0041 ]本實施例采取以下步驟:
[0042]I)將10mgPLGA(50:5