一種治療病毒性角膜炎的nk細胞分泌的蛋白滴眼液及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術領域，具體涉及一種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的 蛋白滴眼液及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 病毒性角膜炎是受病毒致病原感染角膜而引起的炎癥，當身體抵抗力減退時，如 感冒或高熱等，容易誘發(fā)該病反復發(fā)作，每次發(fā)作視力就下降一點，嚴重的最后會導致失 明。在臨床治療中常用抗病毒眼藥水，配合抗菌素眼藥水，以防繼發(fā)細菌或真菌感染，有虹 膜反應時，則加擴瞳藥，根據患者體質情況，衰落者或易感冒者，常輔以提高免役的藥物。目 前常用于病毒性角膜炎治療預防的眼藥水主要是包含抗生素類藥物的眼藥水，包括:氧佛 沙星、阿昔洛韋、利巴韋林等，現(xiàn)有技術中存在采用金銀花、野菊花等中草藥制成熏眼制劑 以治療病毒性角膜炎的方案，但是，添加的為中藥通過煎煮得到的藥液，會讓很多的有效成 分失活，總體是成分不明確，制備方法過于簡單，高溫易使有效成分失活，治療效果不明顯。
[0003] 病毒性角膜炎:病毒性角膜炎是受病毒致病原感染角膜而引起的炎癥。角膜淺層 有豐富的三叉神經末梢，故該病常有明顯的刺激癥狀，有畏光、流淚、酸痛等。病毒性角膜炎 可由多種病毒引起，其臨床表現(xiàn)輕重不等，對視力的損害程度視病變位置、炎癥輕重、病程 長短、復發(fā)次數和有無混合感染而不同。臨床上常見的病毒性角膜炎有單純皰疹性角膜炎、 牛痘性角膜炎、帶狀皰疹性角膜炎等。
[0004] NK細胞及分泌的蛋白因子:NK細胞即自然殺傷細胞(natural killer cell)，是機 體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)有關，而且在某些情況下參與超 敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細胞的殺傷活性無 MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自 然殺傷活性。NK細胞胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒，顆粒的含量與NK細胞的殺傷活性呈 正相關。NK細胞作用于靶細胞后殺傷作用出現(xiàn)早，在體外1小時、體內4小時即可見到殺傷效 應。NK細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞(包括部分細胞系）、病毒感染細胞、某些自身組織 細胞(如血細胞）、寄生蟲等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第 Π 型超敏反應和移植物抗宿主反應。在體外，NK可溶解皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺 炎病毒、巨細胞病毒和流感病毒感染的靶細胞。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的 蛋白滴眼液，針對病毒性角膜炎治療中通過消炎、抗病毒為主的治療方式進行制備，成分明 確，針對性強，效果明顯。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的蛋白滴眼液的 制備方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供一種的NK細胞分泌的蛋白滴眼液用于治療病毒性角膜 炎的用途。
[0008] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)該目的：
[0009] 一種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的蛋白滴眼液，包括以下組分： NK細胞培養(yǎng)液凍千粉 0,05~0,12g 氯霉素 O..25g 硼酸 lJg
[0010] 硼砂 0,03g 輕苯乙醋 0.03g 夾菌注射用水 100 mL。
[0011] -種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的蛋白滴眼液的制備方法，包括以下步驟：
[0012] NK細胞的擴增培養(yǎng)：
[0013] 1)采集患者自身外周血20~40mL，200~600g離心10min后收集上層血漿備用；
[0014] 2)將下層血細胞用2倍體積的生理鹽水進行稀釋，再將稀釋血液緩慢加入淋巴細 胞分離液上層，使分層清晰，稀釋血液與淋巴細胞分離液的體積比為2:1;
[0015] 3)400~700g離心30min，提取中間白膜層細胞，加生理鹽水清洗兩遍，200-500g離 心5min，計數；
[0016] 4)加入X-VIV015無血清培養(yǎng)基，使得細胞密度為1~10 X 105cel Ι/mL，添加 5 %自 體血漿、100 ~1000U/mL 的 IL-2、100 ~1000U/mL 的 IL-15、100 ~1000U/mL 的 IL-21、50 ~ 500U/mL 的 CD3 單抗；
[0017] 5)培養(yǎng)過程中每3天補液一次，并添加 100~1000U/mL的IL-2、100~1000U/mL的 IL-15,使得細胞密度維持在1~10X105cell/mL;
[0018] 6)培養(yǎng)12~14天，收集NK細胞懸液，200~500g離心10min，收集上清液；
[0019] NK細胞培養(yǎng)液的純化與凍干：
[0020] 7)將收集的上清液采用切向流器，循環(huán)過濾濃縮至少3h，經0.45μπι濾膜過濾除去 大顆粒物質，濾液再經〇. 22μπι濾膜過濾除去3kDa以下小顆粒物質；
[0021 ] 8)將步驟7)收集的濃縮液經凍干機制成NK細胞培養(yǎng)凍干粉；
[0022] 含NK細胞蛋白因子滴眼液的制備：
[0023] 9)取無菌注射用水加熱煮沸，加入硼酸、硼砂溶解后冷卻至40°C;
[0024] 10)加入氯霉素、羥苯乙酯攪拌溶解，再加入NK細胞培養(yǎng)凍干粉，最后添加無菌注 射用水定容，制得治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的蛋白滴眼液。
[0025] 一種NK細胞分泌的蛋白滴眼液用于治療病毒性角膜炎的用途。
[0026]相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的治療病毒性角膜炎的NK細胞分 泌的蛋白滴眼液，針對病毒性角膜炎治療中通過消炎、抗病毒為主的治療方式進行制備，成 分明確，針對性強，效果明顯，制備方法首先對NK細胞進行擴增培養(yǎng)，然后再收集NK細胞分 泌的蛋白，將蛋白進行純化和凍干后與輔助制劑復配制得NK細胞分泌的蛋白滴眼液，制備 方法簡單、成本低，本發(fā)明的NK細胞分泌的蛋白滴眼液在治療病毒性角膜炎的應用中具有 顯著的效果，且不易復發(fā)。
【具體實施方式】
[0027]以下結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
[0028] 實施例1。
[0029] 本實施例提供一種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的蛋白滴眼液的制備方法，包 括以下步驟：
[0030] NK細胞的擴增培養(yǎng)：
[0031] 1)采集患者自身外周血20mL，200g離心10min后收集上層血漿備用；
[0032] 2)將下層血細胞用2倍體積的生理鹽水進行稀釋，再將稀釋血液緩慢加入淋巴細 胞分離液上層，使分層清晰，稀釋血液與淋巴細胞分離液的體積比為2:1;
[0033] 3 )400g離心30min，提取中間白膜層細胞，加生理鹽水清洗兩遍，200g離心5min，計 數；
[0034] 4)加入X-VIV015無血清培養(yǎng)基，使得細胞密度為lX105cell/mL，添加5%自體血 漿、100U/mL 的 IL-2、100U/mL 的 IL-15、100U/mL 的 IL-21、50U/mL 的 CD3 單抗；
[0035] 5)培養(yǎng)過程中每3天補液一次，并添加500U/mL的IL-2、500U/mL的IL-15,使得細胞 密度維持在1~10X105cell/mL;
[0036] 6)培養(yǎng)12~14天，收集NK細胞懸液，200g離心1 Omin，收集上清液；
[0037] NK細胞培養(yǎng)液的純化與凍干：
[0038] 7)將收集的上清液采用切向流器，循環(huán)過濾濃縮至少3h，經0.45μπι濾膜過濾除去 大顆粒物質，濾液再經〇. 22μπι濾膜過濾除去3kDa以下小顆粒物質；
[0039] 8)將步驟7)收集的濃縮液經凍干機制成NK細胞培養(yǎng)凍干粉；
[0040] 含NK細胞蛋白因子滴眼液的制備：
[0041] 9)取無菌注射用水加熱煮沸，按量加入硼酸、硼砂溶解后冷卻至40°C;
[0042] 10)按量加入氯霉素、羥苯乙酯攪拌溶解，再加入NK細胞培養(yǎng)。
[0043] 實施例2。
[0044]本實施例提供一種治療病毒性角膜炎的NK細胞分泌的蛋白滴眼液的制備方法，包 括以下步驟：
[0045] NK細胞的擴增培養(yǎng)：
[0046] 1)采集患者自身外周血30mL，400g離心10min后收集上層血漿備用；
[0047] 2)將下層血細胞用2倍體積的生理鹽水進行稀釋，再將稀釋血液緩慢加入淋巴細 胞分離液上層，