皮氨鈣佐劑及含有皮氨鈣佐劑的疫苗的制作方法
【專利說明】皮氨鈣佐劑及含有皮氨鈣佐劑的疫苗
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及疫苗佐劑及含有該佐劑的疫 苗。本發(fā)明的新佐劑的組成：聚肌胞-氨基化合物-氯化鈣，簡(jiǎn)稱皮氨鈣佐劑以及含有皮氨 鈣佐劑的疫苗。
[0002] 皮氨鈣佐劑屬雙鏈RNA佐劑，目前雙鏈RNA佐劑包括PIC(polyriboinosinic polyribo-cytoidylicacid聚肌苷酸聚胞苷酸）、PICLC(PICwithpoly-L-lysineand carboxymethylcellulose聚肌苷酸聚胞苷酸-羧甲基纖維素-賴氨酸）、PIC12U(PIC withuridylicacidinspecificinterval，PIC12 尿啼啶商品名Ampligen)、 PICKCa(PIC-kanmycin-Cacl2,聚肌苷酸聚胞苷酸-卡那霉素-氯化鈣佐劑）幾種。由于靈 長(zhǎng)目以上動(dòng)物血清核酸酶的水解作用，使PIC人體應(yīng)用效果很差；PICLC人體應(yīng)用有效但副 作用大，PIC12U經(jīng)過大量研究和臨床試驗(yàn)還是在2012年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA) 否決了。我原專利《聚肌胞復(fù)合物免疫佐劑及其疫苗》及《包含基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的 佐劑免疫物質(zhì)》、《含基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐劑粘膜免疫物質(zhì)》專利都含有氨基抗生素 類物質(zhì)，盡管彌補(bǔ)了PIC、PICLC和PIC12U的不足，靈長(zhǎng)類動(dòng)物應(yīng)用安全有效，但其中致命缺 點(diǎn)一一含有抗生素成分是有關(guān)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局不允許的：1.規(guī)定在每劑人用疫苗中允 許抗生素含量為50ng，而皮卡佐劑疫苗每劑可檢測(cè)游離抗生素如卡那霉素達(dá)500ng以上。 2.氨基抗生素副作用的耳毒性包括前庭功能損害和對(duì)聽神經(jīng)的損傷。3.由于氨基抗生素 物質(zhì)如卡那霉素分子含有2個(gè)氨基，與聚肌胞的氫鍵結(jié)合并不穩(wěn)固，因此大部分是游離狀 態(tài)，影響在人體的佐劑效果并可能產(chǎn)生副作用。
[0003] 本發(fā)明主要解決的問題和我的原發(fā)明專利《聚肌胞復(fù)合物免疫佐劑及含有該佐劑 的疫苗》的不同是去掉原佐劑中氨基抗生素物質(zhì)如卡那霉素成分換成非抗生素類氨基化合 物，其它成分不變。非抗生素氨基化合物，如：精胺、亞精胺、甲殼素（己丁糖）、殼聚糖等非 抗生素含有多氨基化合物代替卡那霉素類抗生素物質(zhì)，因含有更多氨基，其中的正離子與 聚肌胞雙鏈核糖核酸中的羧基負(fù)離子結(jié)合更能穩(wěn)定聚肌胞的雙鏈結(jié)構(gòu)并去掉上述氨基類 抗生素的副作用。
[0004] 為此本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：
[0005] 1. -種含氨基化合物（除外氨基類抗生素）和鈣離子的聚肌苷酸聚胞苷酸（聚肌 胞）在制備免疫佐劑中的應(yīng)用。該佐劑簡(jiǎn)稱：皮氨鈣佐劑。成分中文簡(jiǎn)寫為：聚肌胞-氨基 化合物 -Cacl2。
[0006] 2.根據(jù)1所述的一種含有皮氨鈣佐劑的疫苗。包括細(xì)胞內(nèi)感染（病毒和細(xì)胞內(nèi)感 染的細(xì)菌、寄生蟲等）疫苗和腫瘤疫苗用于預(yù)防和治療。其特征在于所述的佐劑在于含有 氨基化合物（除外氨基類抗生素）和鈣離子的聚肌苷酸聚胞苷酸（聚肌胞）。
[0007] 3. -種含氨基化合物（除外氨基類抗生素）和鈣離子的聚肌苷酸聚胞苷酸（聚肌 胞）的免疫佐劑在制備用于哺乳動(dòng)物或人的預(yù)防性和治療性疫苗中的應(yīng)用。
[0008] 4.根據(jù)1所述用含有皮氨鈣佐劑的免疫刺激物體外刺激免疫細(xì)胞，回輸體內(nèi)，已 達(dá)到增強(qiáng)免疫抗腫瘤、抗細(xì)胞內(nèi)感染效果的應(yīng)用。其特征在于所述的佐劑在于含有氨基化 合物（除外氨基類抗生素）和鈣離子的聚肌苷酸聚胞苷酸（聚肌胞）。
[0009] 5.根據(jù)1所述用皮氨鈣佐劑為免疫增強(qiáng)劑，非特異促進(jìn)機(jī)體免疫力的應(yīng)用。其特 征在于所述的佐劑在于含有氨基化合物（除外氨基類抗生素）和鈣離子的聚肌苷酸聚胞苷 酸（聚肌胞）。
[0010] 本發(fā)明的機(jī)制和效果是：PIC(聚肌胞}是大分子的聚陰離子，皮氨鈣佐劑中含有 的氨基化合物是多氨基物質(zhì)，帶正電荷，與PIC聚陰離子結(jié)合，形成了氫鍵形式的結(jié)合，穩(wěn) 定了PIC的雙鏈結(jié)構(gòu)，可以在一定程度上抵抗核酸酶的降解，而使人體應(yīng)用有效。我們選擇 非抗生素氨基化合物，如：精氨、亞精氨、甲殼素（己丁糖）、殼聚糖等穩(wěn)定PIC的雙鏈結(jié)構(gòu) 并去掉氨基抗生素的副作用。因此皮氨鈣佐劑不僅進(jìn)一步增加了佐劑效果并且更加安全， 也符合有關(guān)當(dāng)局在疫苗、菌苗中幾乎不能含有抗生素的規(guī)定。
[0011] 氨基化合物（氨基甙類抗生素除外），包括如：含氧基氨基化合物，無(wú)環(huán)單氨、多氨 及其衍生物和鹽，磺酸類氨基化合物，環(huán)烷氨、芳香單氨、芳香多氨及其衍生物和鹽，酰氨類 化合物。具體如精氨、亞精氨、甲殼素（己丁糖）、殼聚糖、氨基葡萄糖等。
[0012] 下面以甲殼素（己丁糖）、殼聚糖為例，闡述非抗生素類氨基化合物性質(zhì)、作用和 作為新佐劑成分應(yīng)用的可行性，目的是結(jié)合實(shí)例說明本發(fā)明作用機(jī)理、可行性及其人用的 安全性，并非僅限定這兩種非抗生素氨基化合物，而在幫助理解，對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍作出 更清楚的界定。
[0013] 一、非抗生素氨基化合物舉例：
[0014] 1.甲殼素
[0015] 一般通稱：甲殼質(zhì)，甲殼素，（經(jīng)脫乙?；蠓Q為）殼聚糖.
[0016]英文名稱：Chitin.
[0017] 中文學(xué)名：幾丁質(zhì)、甲殼素[2]
[0018]化學(xué)名稱：β-(1，4)_2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖
[0019] 別名：殼多糖、幾丁質(zhì)、甲殼質(zhì)、明角質(zhì)、聚乙酰氨基葡糖
[0020] 分子式：（C8H13N05)η
[0021] 性狀：外觀為類白色無(wú)定形物質(zhì)，無(wú)臭、無(wú)味。
[0022] 甲殼素是地球上存量極為豐富的一種自然資源，也是自然界中迄今為止被發(fā)現(xiàn)的 唯一帶正電荷的動(dòng)物纖維素。由于它的分子結(jié)構(gòu)中帶有不飽和的陽(yáng)離子基團(tuán)，因而對(duì)帶負(fù) 電荷的各類有害物質(zhì)具有強(qiáng)大的吸附作用。同樣它也能清除人體內(nèi)的"垃圾"，達(dá)到預(yù)防疾 病、延年益壽的目的。由于甲殼素具有這種獨(dú)特功能，它被歐美科學(xué)家譽(yù)為和蛋白質(zhì)、脂肪、 糖類、維生素、礦物質(zhì)同等重要的人體第六生命要素。
[0023]分子量甲殼質(zhì)是尚分子量物質(zhì)，其分子量可達(dá)100萬(wàn)以上。分子量越尚吸附能力 越強(qiáng)，適合工業(yè)、環(huán)保領(lǐng)域應(yīng)用。低分子量容易被人體吸收。分子量為7000左右的幾丁聚 糖，大約含30個(gè)左右的葡萄糖胺殘基。
[0024]脫乙酰基純度幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰基成為幾丁聚糖。幾丁質(zhì)因?yàn)椴蝗苡谒釅A也不溶 于水而不能被身體利用。脫乙?；罂稍黾悠淙芙庑砸虼丝杀簧眢w吸收。Ν-乙?；撊?55%以上的則稱為殼聚糖。
[0025] 甲殼素功用：
[0026]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)腦表面比正常細(xì)胞表面具有更多的陰電荷.造成細(xì)胞表面電荷 不平衡，于是使細(xì)胞之間粘附力下降，組織邁破壞。帶陽(yáng)電荷的聚陽(yáng)離子電解質(zhì)能吸附到腫 瘤細(xì)胞的表面并使電荷中和，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
[0027] 附圖1.甲殼素抗癌醫(yī)學(xué)圖
[0028] 這兩種特定性代謝物："己-葡萄氨"和"己-乙醯葡萄氨"均是分子量約 1，〇〇〇的六體，確知是抗癌瘤的關(guān)鍵因素。日本治療癌應(yīng)用"幾丁聚糖"靜脈注射藥物，效 果超過一般抗癌藥物達(dá)5倍之多，即獲取來(lái)自"幾丁聚糖"的水溶性衍生物寡，它們是屬 于分子量約1，〇〇〇的低分子量物質(zhì)，科學(xué)界稱之為"低分子免疫賦活劑"！
[0029] 因此，在上述癌細(xì)胞溶液中加入同樣濃度的甲殼素，24小時(shí)后癌細(xì)胞的存活率達(dá) 94%。這是體外試驗(yàn)的情況，在體內(nèi)試驗(yàn)，就可見到甲殼素發(fā)揮的作用。試驗(yàn)是在鼠的腹腔 內(nèi)移植個(gè)艾氏腹水癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，在移植癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞前的第6、第4和第2的三 天，投喂精制甲殼素或卡介苗.共觀察60天。試驗(yàn)結(jié)果表明，每天按每千克體重投喂50mg 甲殼質(zhì)，病鼠的治愈率都是67%，對(duì)照組卻全都死亡，體內(nèi)試驗(yàn)，甲殼素即能顯示出對(duì)癌細(xì) 胞或腫瘤細(xì)胞的治療效果.在體外試驗(yàn)中卻沒有，這就說明了甲殼素不帶陽(yáng)電荷。對(duì)癌細(xì) 胞或腫瘤細(xì)胞不起聚集粘附作用和電荷中和作用，所以不能直接抑制這些細(xì)胞，但能通過 活性免疫系統(tǒng)達(dá)到抑制癌細(xì)胞的目的.
[0030] 可見，通過對(duì)甲殼素的不斷認(rèn)識(shí)和研究，它會(huì)發(fā)揮重大作用，對(duì)人類的生命延續(xù)起 到積極的作用。
[0031] 甲殼素作為新佐劑成分的可行性：
[0032] 由于甲殼素是地球上唯一帶正電荷的動(dòng)物纖維素。由于它的分子結(jié)構(gòu)中帶有不飽 和的陽(yáng)離子基團(tuán)，因而對(duì)帶負(fù)電荷的各類有害物質(zhì)具有強(qiáng)大的吸附作用。第三代"幾丁聚 糖"（甲殼素）就屬于最新的低分子免疫賦活劑。在使用安全性方面，以老鼠為例，每公斤 體重需服入18公斤"幾丁聚糖"方可致死，可見"幾丁聚糖"（甲殼素）比食用砂糖更安 全。甲殼素不能直接抑制癌細(xì)胞，而是通過活化免疫系統(tǒng)顯示抑制癌細(xì)胞的作用。因此，在 皮氨鈣新佐劑中以甲殼素取代卡那霉素可以：1.甲殼素帶多個(gè)正電荷胺基，與PIC是大分 子的聚陰離子結(jié)合，形成較卡那霉素更穩(wěn)定PIC雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，在靈長(zhǎng)類和人體中更有效。 2.安全性高，又去到了抗生素副作用。3.可口服，可注射。4.與佐劑性質(zhì)相似，具有增強(qiáng)免 疫，抗腫瘤功效。
[0033] 2.殼聚糖
[0034] 外文名：chit〇san又稱：脫乙酰甲殼素化學(xué)名：聚葡萄糖胺（1-4)-2-氨基-B-D
[0035] 化學(xué)名：β-(1-4) -2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖
[0036] 分子式：（C6H11Ν04)Ν
[0037] 單元體的分子量為：161. 2
[0038] 結(jié)構(gòu)式如下式
[0039]
[0040] 應(yīng)用：醫(yī)藥、食品、化工、化妝品
[0041] 殼聚糖是甲殼素脫N-乙?；漠a(chǎn)物，殼聚糖樣品通過比較簡(jiǎn)單的特性粘度測(cè)量， 即可計(jì)算其平均分子量。商品殼聚糖視其用途不同有三種不同的粘度，即高粘度產(chǎn)品為 0· 7~IPa·s、中粘度產(chǎn)品為0· 25~0· 65Pa·s、低粘度產(chǎn)品< 0· 25Pa·s。
[0042] 殼聚糖大分子中有活潑的羥基和氨基，它們具有較強(qiáng)的