卟啉修飾末端樹枝狀聚合物的制作方法
【專利說明】口M林修飾末端樹枝狀聚合物
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請是2013年3月14日提交的美國申請?zhí)?3/803,878的部分繼續(xù)申請，美國 申請?zhí)?3/803, 878要求2012年12月12日提交的美國臨時申請?zhí)?1/736, 067的優(yōu)先權(quán)， 各申請W全部內(nèi)容并入本文用于所有目的。
[0003] 關(guān)于對在聯(lián)邦政府資助的研發(fā)下作出的發(fā)明的權(quán)利的聲明
[0004] 本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院和國家癌癥研究所授予的撥款號為 2R01CA115483-06的政府支持W及VA職業(yè)發(fā)展獎-2下作出。政府對本發(fā)明具有一定的權(quán) 利。
[000引發(fā)明背景
[0006]用于治療多種癌癥類型的多種有效化療劑非常不溶于水，需要使用會誘發(fā)不利副 作用的制劑。最近，納米治療制劑如Abraxane? (載紫杉醇的白蛋白納米粒），Doxil? (載 阿霉素的脂質(zhì)體）和其他制劑已經(jīng)被證明可W改善藥物的臨床毒性特征，但它們的抗腫瘤 作用僅比原來的藥物制劑略好。運已部分歸因于納米治療制劑相對大的尺寸（通常> 100 納米），運限制了藥物滲透到腫瘤塊的程度。在某些情況下，運種大尺寸還會導(dǎo)致納米治療 劑被截留在肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RE巧內(nèi)。因此，為在體內(nèi)有效遞送抗癌藥，有必要開發(fā)更 小（20-80nm)的隱形和生物相容性納米載體。
[0007] 最近我們已經(jīng)開發(fā)了紫杉醇（PT訝或其他疏水性藥物的一些新納米載體。運些新 納米載體，其包括聚（乙二醇）（PEG)和寡聚膽酸，可W在水性下自組裝從而形成核-殼（膽 燒-陽G)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可W在疏水性內(nèi)部攜帶PTX。運些兩親載藥納米粒本身是有治療效果 的，具有改善的臨床毒性特征。更重要的是，當(dāng)被祀向癌細(xì)胞表面的配體和/或腫瘤血管配 體修飾時，運些納米載體將能夠遞送毒性治療劑到腫瘤部位。通過使用各種不同膽燒-PEG 制劑或其組合，可調(diào)節(jié)納米載體的最終尺寸（10至lOOnm)。納米載體組分，PEG和膽酸，均 是生物相容和基本上無毒的。事實上，在小鼠模型和陪伴犬體內(nèi)施用用于抗癌治療中，紫杉 醇納米療法的表現(xiàn)是安全的。但是納米載體對某些藥物已經(jīng)表現(xiàn)出體外和體內(nèi)某種溶血活 性W及下降的負(fù)載能力。因此有需要開發(fā)具有改善的生物相容性和多功能性的納米載體。
[0008] 本發(fā)明是基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即構(gòu)成嵌段的親水和疏水片段的某些變化，能改 善治療性能而不破壞納米載體裝配，解決了上述需要。 發(fā)明概要
[0009] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供式I所示的化合物：
[0010]度)k-(PEG)m-A燈i)p-L1-D-[y2-l2-時n(I)
[0011] 其中B可W是結(jié)合配體；各陽G可W是分子量為I-IOOkDa的聚乙二醇（陽G)聚合 物；A包括至少一支化的單體單元X，且可W連接到至少一個陽G基團(tuán)；D可W是樹枝狀聚合 物，該樹枝狀聚合物具有單一中屯、基團(tuán)（focalpointgroup),多個分支單體單元X和多個 端基；各和Y2可W為無或可交聯(lián)的基團(tuán)，該可交聯(lián)的基團(tuán)可W是棚酸、苯二酪或硫醇；各 Li和L2可W獨立地為鍵或連接物（接頭），其中L1可W連接到樹枝狀聚合物的中屯、基團(tuán)； 各R可W獨立地為樹枝狀聚合物的端基、化嘟、疏水基團(tuán)、親水基團(tuán)，兩親化合物或藥物，其 中至少一R基團(tuán)可W是化嘟；下標(biāo)k可W是O或1;下標(biāo)m可W是0-20的整數(shù)；下標(biāo)n可W 是2-20的整數(shù)，其中下標(biāo)n可W與樹枝狀聚合物上的端基數(shù)相等；和下標(biāo)P可W是0-8。
[0012] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供具有內(nèi)部和外部的納米載體，所述納米載體包括 多個本發(fā)明的樹枝狀聚合物綴合物，其中各化合物在水性溶劑中自組裝從而形成納米載 體，W致在納米載體的內(nèi)部形成疏水囊，且其中各化合物的PEG自組裝在納米載體的外部。
[0013] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供通過光動力或光熱療法治療疾病的方法，包 括將治療有效量的本發(fā)明的納米載體給予有需要的對象，并將所述對象暴露于福照 (radiation)，從而通過光動力或光熱療法治療疾病。
【附圖說明】
[0014]圖1示出本發(fā)明的末端樹枝狀聚合物的支化性質(zhì)的幾個實施方式。
[0015] 圖2示出4小時解育后，非祀向NP相對化Z4-NP被5637人膀脫癌細(xì)胞的細(xì)胞攝 取情況?；┯糜坞x化Z4膚預(yù)解育KOTCC-Pu-In細(xì)胞一小時，隨后用2. 2yM的化Z4-NP再 解育一小時。未經(jīng)游離化Z4膚處理的細(xì)胞用作100%對照。細(xì)胞用福爾馬林固定并用流式 細(xì)胞術(shù)分析。
[0016] 圖3示出KOTCC-Pu-In膀脫癌細(xì)胞的對化Z4-NP的細(xì)胞攝取與（a)PLZ4-NP濃度 (4虹解育）和化）時間（2. 2iiM的化Z4-NP)的關(guān)系。（C)在玻璃底平皿中用2. 2iiM的 化Z4-NP解育人膀脫癌細(xì)胞系5637二十分鐘。加入包含用于核染的介質(zhì)的DAPI后，采用 高分辨形貌成像系統(tǒng)值eltavision公司）獲取活細(xì)胞影像。箭頭表示膜分布。（d)采用 2. 2yM的化Z4-NP處理5637兩小時。洗涂后，在新鮮的完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)細(xì)胞0、24、48 和72小時。然后膜酶消化細(xì)胞并用10%福爾馬林固定，之后用于測試，且通過流式細(xì)胞術(shù) 分析細(xì)胞。
[0017] 圖4示出膀脫癌細(xì)胞特異性攝取化Z4-NP，但正常尿路上皮細(xì)胞不攝取。（a)采 用化Z4-NP處理共培養(yǎng)的正常犬尿路上皮細(xì)胞OJro)和已用DiO預(yù)標(biāo)記的人膀脫癌細(xì)胞系 5637 度C)兩小時（化嘟：紅；DiO:綠；Hochest:藍(lán)）（IOOX)。
[0018] 圖5示出5637膀脫癌細(xì)胞在（a)暴露于2. 2yM的化Z4-NP兩小時，之后用各種 水平的光（紅光，650皿波長）照射后，W及化）用化Z4-NP或5-ALA解育兩小時之后暴露 于4. 2J/cm2紅光后的細(xì)胞毒性。
[0019] 圖6示出PZL4-NP和PDT處理5637人膀脫癌細(xì)胞后ROS介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。（a)用 或不用2. 2iiM的PZL4-NP處理細(xì)胞兩小時，并用氨基苯基巧光素（APF;R0S指示劑）負(fù)載處 理S十分鐘。之后在4. 2J/cm2用PDT處理細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)分析；化）采用不同濃度的 PZL4-NP處理細(xì)胞2小時，之后用PDT處理。24小時后，通過SensoLyte?試劑盒（Anaspec， 化emont，CA)檢測含半脫氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase)3/7活性（PTX紫杉醇處理 作為細(xì)胞調(diào)亡的陽性對照）。
[0020] 圖7示出在96孔黑壁板中用2. 2yMPZL4-NP解育5637細(xì)胞2小時，在解育結(jié)束 后用40nM的Di0Ce(3)(綠，A)染色20min從而評價線粒體膜電勢（AWm)，隨后通 過照射各孔的部分從而引起PDT效應(yīng)。24小時后，用艦化丙晚對細(xì)胞進(jìn)行染色鑒別細(xì)胞死 亡。
[0021] 圖8示出PDT處理后細(xì)胞形態(tài)。5637細(xì)胞培養(yǎng)于8孔腔室玻片，無處理、僅光 (4. 2J/cm2)處理、僅化Z4-NP處理或化Z4-NP和光結(jié)合處理（PDT) 2小時，或T-PN處理2小 時后用PDT處理。然后固定細(xì)胞并用化ma3?染色。
[0022] 圖9示出化Z4-NP的選擇性攝入膀脫內(nèi)給藥入裸鼠后，原位人膀脫癌異種移植模 型對化Z4-NP的選擇性攝入。（a)在NSG鼠內(nèi)建立人類患者源異體移植（PD訝BL269f。通 過將懸浮化269f細(xì)胞直接注入膀脫壁生成化269f的鼠原位模型。4周后，注意到實體腫瘤 生長，膀脫內(nèi)腔容量降低。在全麻下，我們注射30微升化Z4-NP進(jìn)入膀脫2小時。采用PBS 清洗膀脫并與體外隔離用于體內(nèi)成像。之后，立即處死鼠，解剖大部分器官W體外成像。用 正常NSG鼠做相似的實驗，不進(jìn)行膀脫腫瘤移植?；┯谢驘o化269f異種移植的膀脫固定 于0.C.T，獲得10微米厚的冰凍切片。采用DAPI(藍(lán)）逆染細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)化Z4-NP紅色巧 光。巧光成像研究后，用Hema3@再染組織（黃色箭頭：暴露的膀脫癌組織；紅色箭頭：完整 正常上皮細(xì)胞）（40x)。
[0023] 圖10示出靜脈注射非交聯(lián)化Z4-NP24小時后腫瘤/膀脫和器官的體外近紅外成 像。
[0024] 圖11示出阿霉素和化Z4-NP結(jié)合介導(dǎo)PDT的細(xì)胞毒性作用。（a)W1yg/ml阿 霉素和/或2. 2yM化嘟的濃度采用化Z4-NP、PLZ4-NP-Dox或化Z4-NM-DOX處理5637細(xì)胞 2小時。洗涂后，細(xì)胞不暴露或暴露于2. 1和4. 2J/cm2的光下。48小時后檢測細(xì)胞生存能 力（活力）。*P< 0. 〇5 化）采用化Z4-NP、化Z4-NP-DOX、無Dox、Doxil、化Z4-NM-DOXW及 化Z4-NP和化Z4-NM-DOX的組合處理5637細(xì)胞5分鐘和兩小時。采用流式細(xì)胞術(shù)評價胞內(nèi) 阿霉素濃度。該結(jié)果WS個獨立實驗的均值+/-SD呈現(xiàn)。*p< 0. 05;**p< 0.Ol(C)采用 化Z4-NP(PNP)、化Z4-NM-D0X(PN-DOX)、PNP和PN-DOX的組合、W及化Z4-NP-D0X(PNP-DOX) 處理5637細(xì)胞兩小時。通過巧光顯微鏡（100訝檢測化嘟（紅）和阿霉素（綠）。（d)通 過共聚焦顯微鏡（600X油鏡）在5分鐘、1小時和3小時檢測化Z4-NP-D0X(PNP-D0訝的亞 細(xì)胞分布。洗涂細(xì)胞但不固定。PNP(化嘟：紅），阿霉素（綠）。
[002引圖12示出了本發(fā)明的各不同方面，包括：(a)多功能、自組裝化嘟-末端樹枝狀聚 合物，PEG5k-P0r4-CA4,具有4焦脫儀葉綠酸-a分子和4膽酸連接于線性PEG鏈末端的示意 圖；化）納米化嘟作為用于癌癥治療的巧妙的"8合1 (eight-in-one)"納米醫(yī)學(xué)平臺的示意 圖；（C)納米化嘟的TEM影響（憐鶴酸染色，PTA) ;(d)空納米化嘟和馨合不同金屬離子的納 米化嘟的吸收光譜；負(fù)載化(II)的納米化嘟（e)和Gd(III) (f)通過TEM觀察（PTA染色）； (g)在PBS和SDS中的納米化嘟的巧光發(fā)射光譜，405nm激發(fā)；化）存在或不存在SDS的情 況下納米化嘟溶液（10yL)的近紅外巧光影像，使用625/20nm激發(fā)帶通濾波器和700/35nm 濾波器；（i)通過使用2' ,7'-二氯巧光素乙酷乙酸鹽值C巧作為ROS指示劑檢測PBS和 SDS中納米化嘟（0. 125mg/mL)單線態(tài)氧的產(chǎn)生；納米化嘟的濃度依賴的光-熱傳導(dǎo)，包括 (j)熱成像和化）定量溫度變化曲線（n= 2)，其中，在用1. 25w/cm2NIR激光化90nm)照射 20秒后使用熱感攝像機監(jiān)測在有或沒有SDS時納米化嘟溶液（IOyL)的溫度；和（I)使用 1. 25w/cm2NIR激光照射溶液（4.Omg/mL) 120秒后的具有高溫度的納米化嘟的代表性圖像。 [002引 圖13示出陽G5k-P0r4-CA4末端樹枝狀聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0027] 圖14示出了陽G5k-P〇r4-CA4末端樹枝狀聚合物的MLDI-TOF質(zhì)譜。
[0028] 圖15示出了陽G5k-P〇r4-CA4末端樹枝狀聚合物的電NMR譜，分別記錄于 DMS0-d6 (a)和 〇2〇 中化）。PEG鏈（3. 5-3. 7ppm)，膽酸（0. 5-2. 4ppm)和焦脫儀葉綠 酸-a(0. 9-2. 2ppm)的化學(xué)位移能夠在末端樹枝狀聚合物于DMS0-d6中的電NMR譜（a)中 觀察到。膽酸中甲基質(zhì)子18、19、和21的特征峰能夠分別在0. 58,0. 80和0. 95ppm看到。 焦脫儀葉綠酸-a中甲基質(zhì)子8和18的特征峰能夠分別在1. 8和1. 9ppm看到。當(dāng)在〇2〇中 記NMR譜，PEG5k-P〇r4-CA4中膽酸質(zhì)子和焦脫儀葉綠酸-a質(zhì)子被高度抑制化），顯示水相環(huán) 境中形成的核-殼膠束結(jié)構(gòu)高度限制了膽燒和焦脫儀葉綠酸-a中質(zhì)子的運動。
[0029] 圖16示出：(a)典型的交聯(lián)化嘟-末端樹枝狀聚合物（PEGSk-切s4-Por4-CA4)示 意圖，具有連接于線性PEG末端的4個半脫氨酸、4個焦脫儀葉綠酸-a分子和4個膽酸，把 化es用作間隔物（spacer);化）二硫鍵交聯(lián)納米化嘟的TEM影像（PTA染色）；（C)在PBS 和SDS存在下的交聯(lián)納米化嘟的巧光發(fā)射光譜，與未交聯(lián)納米化嘟的對比，其中使用谷脫 甘膚（GSH)作為還原劑來打破二硫鍵的交聯(lián)（激發(fā)于405nm) ; (d)相對于在初始負(fù)載時添 加的藥物水平，二硫鍵交聯(lián)NPs的阿霉素負(fù)載和體積變化，其中最終NP溶液的體積保持在 ImL并且最終末端樹枝狀聚合物的濃度為20mg/mL;(e)在人血漿中納米化嘟實時釋放阿霉 素的研究，基于FRET方法的示意圖；在人血漿中照射（1. 25w/cm2 5min)24h和2化負(fù)載阿霉 素交聯(lián)納米化嘟（CNP-D0訝的FRET信號（f)和FRET比率變化（g);和化）使用GSH(IOmM) 處理24h的人血漿中NP-DOX的FRET比率變化。
[0030] 圖17示出了有或沒有SDS時NPs(IOyU的熱成像，用NIR激光化90nm)0.Iw/ cm2照射120秒后，使用熱成像攝影機拍攝。對于NM-P0R，焦脫儀葉綠酸-a的濃度保持在 0. 2mg/mL，與NPs的1.Omg/mL的焦脫儀葉綠酸-a的濃度相當(dāng)。
[0031] 圖18示出了PEG5L切s4-Por4-CA4末端樹枝狀聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0032] 圖19示出了沒有染色的負(fù)載于納米化嘟的化(II)的TEM影像。
[003引圖20示出了有（a)和沒有化)2. 5g/LSDS時NPs的粒徑。使用動態(tài)光散射值LS) 檢測粒徑。加入SDS后NPs被完全降解。
[0034] 圖21示出了有和沒有SDS時納米化晰溶液液滴的明場像。
[0035] 圖22示出了有（a)和沒有化)2. 5g/LSDS時游離焦脫儀葉綠酸-a負(fù)載于標(biāo)準(zhǔn)的 陽GSk-CAs膠束（NM-POR)的粒徑。使用動態(tài)光散射值L巧檢測粒徑。加入SDS后NM-POR被 完全降解。
[0036] 圖23示出了有和沒有SDS時游離焦脫儀葉綠酸-a負(fù)載于標(biāo)準(zhǔn)的PEGSk-CAs膠束 (NM-POR) 7溶液（10yL)(上圖）的近紅外巧光影像，都使用625/20nm的激發(fā)帶通濾波器 (excitationbandpassfilter)和 700/35nm的濾波器（emissionfilter),并與納米化 嘟溶液（下圖）對比。對于NM-P0R，焦脫儀葉綠酸-a的濃度保持在0. 2mg/mU與NPs的 1. Omg/mL的焦脫儀葉綠酸-a的濃度相當(dāng)。通過計算在SDS中和在PBS中平均巧光強度的 比值，發(fā)現(xiàn)NPs具有比在相同的Por濃度下的NM-POR多10倍的自澤滅（self-quenching)。
[0037] 圖24示出了有和沒有SDS時NM-POR溶液（10yL)的熱成像，用NIR激光 化90nm) 1. 25w/cm2照射20秒后，使用熱成像攝影機拍攝。對于NM-P0R，焦脫儀葉綠酸-a的 濃度保持在0. 2mg/mU與NPs的1.Omg/mL的焦脫儀葉綠酸-a的濃度相當(dāng)。
[003引圖25示出了非交聯(lián)納米化嘟（20mg/mL)的粒徑分別負(fù)載（a)阿霉素（2. 5mg/mL)，化）紫杉醇（l.Omg/mL)，（C)長春新堿（1.5mg/mL)，（d)棚替佐米（2. Omg/mL)，（e)索拉非 尼（2. Omg/mL)，和訊17-締丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素（17AAG) (1. Omg/mL)。使 用動態(tài)光散射值L巧檢測粒徑。
[0039] 圖26示出了在50% (v/v)的人血漿存在下負(fù)載DOX的交聯(lián)NPs (NP-DOX)的連續(xù) 粒徑檢測。
[0040] 圖27示出了陽GSk-切Sa-Ls-CAs末端樹枝狀聚合物的MLDI-TOF質(zhì)譜。
[0041]圖 28 示出了二硫鍵交聯(lián)的NPs在沒有（a)和有 2. 5g/LSDS(b)，2. 5g/LSDS+20mM NAC(c)，2. 5g/LSDS+20mMGSH(d)時的粒徑。使用動態(tài)光散射值L巧檢測粒徑。加入SDS 后，非交聯(lián)的NPs完全降解。作為對比，在相同條件下，交聯(lián)的NPs的大小維持20-30nm。形 成交聯(lián)NPs的二硫鍵在存在SDS時，在加入內(nèi)源性還原劑谷脫甘膚（GSHJOmM)和外源性的 還原劑N-乙酷半脫氨酸（NACJOmM)約40min后，解開了。
[004引圖29示出了在SK0V-3卵巢癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，在細(xì)胞暴露于NPs、負(fù)載Por的 陽GSk-CAs膠束（NM-POR)和游離焦脫儀葉綠酸-a(Por)化后，然后在黑暗條件下解育22h。 [004引圖30示出了在SK0V-3卵巢癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，（a)在細(xì)胞暴露于4. 4yMNPs 化后，然后使用不同水平的NIR光照射，和化）使用NPs或5-ALA解育2地，然后暴露于 0. 07Wcm2NIR光下 60s;
[0044]圖30 (C)示出了在NPs和光處理SK0V-3卵巢癌細(xì)胞后，ROS介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。不 用或用2. 2yMNPs處理細(xì)胞2地并加載DCF30min。在使用0. 07Wcm2NIR光照60s后，使 用巧光顯微鏡檢測ROS的產(chǎn)生圖片。
[004引 圖30(d)示出了在96孔黑壁板中使用2. 2yMNPs處理24h的SK0V-3卵巢癌細(xì)胞， 在解育末期使用40nM的DiOCe(3)(綠，A)染色20min，來評價線粒體膜電位（AWm)， 隨后照射各孔的一部分來引起PDT效應(yīng)。照射區(qū)域標(biāo)記為"L. "24h后，用艦化丙晚（PI)對 細(xì)胞進(jìn)行染色鑒別細(xì)胞死亡。
[0046] 圖30(e)示出了使用不同濃度的NPs處理24h后隨PDT的細(xì)胞中半脫氨酸天冬氨 酸蛋白酶（caspase)3/7 的活性。24h后，使用.S畑soLyt魄3'試劑盒（Anaspec，Rremont,CA) 檢測caspase3/7活性。
[0047] 圖30(f)示出了PDT后細(xì)胞形態(tài)。SK0V-3卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)于8孔腔室玻片，僅PBS、 僅^3和聯(lián)合^3和光照（0.07胖畑12,60秒）處理2地。然后固定細(xì)胞化后，用掃胤化3衝 染色。用NPs+光照處理的細(xì)胞表現(xiàn)出了明顯的細(xì)胞核膨脹、細(xì)胞變圓、細(xì)胞膜破壞、和細(xì)胞 質(zhì)聚集。
[004引圖30(g)示出了阿霉素聯(lián)合NP介導(dǎo)的光療法的細(xì)胞毒性。使用不同濃度的DOX和/或NPs,僅使用NPs、負(fù)載阿霉素納米化嘟（NP-D0訝、負(fù)載阿霉素標(biāo)準(zhǔn)膠束（NM-D0訝處 理SK0V-3卵巢癌細(xì)胞2地。洗涂后，將細(xì)胞暴露于光照24h后檢測細(xì)胞活力*p< 0. 05。
[0049] 圖30化）示出了NP-AAG對PC3前列腺癌細(xì)胞系的生長抑制效果，相比于僅使用NP 和游離藥物17AAG。在NP-AAG和NP組中保持NP濃度一致。移除并使用新鮮的培養(yǎng)基替換 藥物，然后將細(xì)胞暴露于NIR光照射2min。7化后使用MT測試檢測生長抑制。左欄，未光 照；框內(nèi)右欄，光照。n= 3。
[0050] 圖30(i)示出了 24h后使用膜聯(lián)蛋白V和PI染色（n= ^分析細(xì)胞調(diào)亡。
[0051]圖30 (j)示出了 1化后使用相關(guān)抗體的Westernblotting分析HIFla、生存素 (survivin)、AKT、STAT3 和Src水平。
[0052] 圖31示出了NP-AAG對LNCAP前列腺癌細(xì)胞系和RP肥1正常前列腺細(xì)胞系的生長 抑制效果，相比于僅使用NP和游離藥物17AAG。NP-AAG和NP組中的NP濃度保持一致。移 除并使用新鮮的培養(yǎng)基替換藥物，然后將細(xì)胞暴露于NIR光照射2min。7化后使用MT測 試檢測生長抑制。左欄，未光照；右欄框內(nèi)，光照。n= 3。
[0053] 圖32 (a)示出了交聯(lián)的NPs和NM-POR(均包含0.5mg/mL的化r)在IOxDMSO中 的吸光度。圖32(b)示出了NIR的巧光信號和圖32 (C)示出了注射交聯(lián)NPs和NM-POR(Por 劑量：5mg/kg)5min后的從異種移植腫瘤的小鼠中獲取的血液的定量巧光。圖像作為感興 趣區(qū)域（ROI)的平均信號進(jìn)行分析。***p< 0.001。
[0054] 圖33顯示了注射NPs和NM-POR(Por劑量：5mg/kg) 5min之后暴露于光照后從異種 移植腫瘤的裸鼠中獲取的血液的ROS產(chǎn)生量。光劑量：0. 1W，60s和300s。使用2' ,7'-二 氯代巧光素乙酷乙酸鹽（2' ,7'-dichlorofluorescindiacetate，DCF)作為ROS指示劑 進(jìn)行檢測。林口 < 0. 002,***p< 0. 001。
[00巧]圖34顯示了異種移植腫瘤的裸鼠體外的溶血活性。使用交聯(lián)NP(a，b)和NM-POR(C，d)注射Imin后收集2yL小鼠血液，使用PBS稀釋至100yL隨后暴露于光照 0、60、和300秒。光照后（Por劑量：5mg/kg)。光劑量：0.IWcm2,4小時后，離屯、沉降血細(xì) 胞，在NM-POR處理的小鼠的樣本中觀察到了溶血（a,C)。進(jìn)一步制備了經(jīng)過300秒細(xì)胞離 屯、的的樣本，用來評估細(xì)胞形態(tài)化，d) (Hem忽愈染色，IOOX油鏡）。相對于在交聯(lián)的NP樣 本中發(fā)現(xiàn)的正常的血細(xì)胞形態(tài)化），在NM-POR樣本（d)中RBCs和WBCs經(jīng)過光照后，被大量 的破壞，運極有可能是因為ROS引起的對血細(xì)胞的氧化性損傷。
[0056] 圖35示出了異種移植腫瘤的裸鼠的血液溫度，注射二硫鍵交聯(lián)的NPs和 NM-P0R(P