淫羊藿素在制備抗nk/t細胞淋巴瘤藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥有效成分淫羊藿素新的藥用用途，具體涉及淫羊藿 素在制備抗NK/T細胞淋巴瘤藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] NK/T細胞淋巴瘤是一種高度侵襲性非霍奇金淋巴瘤，主要發(fā)生于淋巴結(jié)外的組 織。該疾患早期臨床表現(xiàn)不典型，病程進展迅速，預(yù)后較差，目前臨床無特效化療藥物。研 究顯示，NK/T細胞淋巴瘤其發(fā)病與EB病毒（EBV)感染關(guān)系密切，EBV在腫瘤細胞中是潛伏 感染，因此，為抗病毒治療帶來困難。有研究將EBV誘導(dǎo)進入裂解感染（活化）再聯(lián)合抗病 毒藥物更昔洛韋（GCV)靶向抗病毒治療EBV相關(guān)腫瘤。為相關(guān)領(lǐng)域提供從天然藥物中篩選 活性成分誘導(dǎo)EBV激活NK/T細胞淋巴瘤靶向治療的新方向。
[0003] 淫羊藿素是淫羊藿屬植物提取物淫羊藿苷的水解衍生產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]
[0005]淫羊藿素（Icaritin)
[0006]目前關(guān)于淫羊藿素在制備抗NK/T細胞淋巴瘤藥物方面的用途尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供淫羊藿素的新的藥用用途，具體涉及淫羊藿素在制備抗 NK/T細胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的又一目的在于提供淫羊藿素在制備治療NK/T細胞淋巴瘤曾敏藥物中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的淫羊藿素是淫羊藿屬植物提取物淫羊藿苷的水解衍生產(chǎn)物，其化學(xué) 結(jié)構(gòu)式如下：
[0010]
[0011] 淫羊藿素（Icaritin)
[0012] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)，
[0013]采用淫羊藿素干預(yù)人NK/T細胞淋巴瘤細胞株（SNK-10、SNT-8)，結(jié)果顯示：1.淫羊 藿素體外可顯著抑制SNK-10和SNT-8細胞的增殖，明顯促進其凋亡，增加內(nèi)源性Caspase 蛋白和促凋亡蛋白Bax表達，抑制Bcl-2、pBad表達；2.淫羊藿素可誘導(dǎo)SNK-10細胞內(nèi)EB 病毒（EBV)活化，進而增加腫瘤細胞對抗病毒藥物更昔洛韋（GCV)的敏感性。
[0014] 本發(fā)明經(jīng)實驗證實單獨應(yīng)用淫羊藿素可抑制NK/T細胞淋巴瘤，而作為病毒激活 劑的淫羊藿素聯(lián)合抗病毒藥物更昔洛韋（GCV)對NK/T細胞淋巴瘤具有更強的抗腫瘤作用。
[0015] 本發(fā)明的淫羊藿素可作為藥物有效成分制備抗NK/T細胞淋巴瘤藥物；或，所述的 的淫羊藿素可作為藥物有效成分與藥物學(xué)上可接受的載體制備抗NK/T細胞淋巴瘤的藥物 組合物；
[0016] 更進一步的，本發(fā)明淫羊藿素與抗病毒藥物制備抗NK/T細胞淋巴瘤增敏藥物，本 發(fā)明的實施例中，優(yōu)選淫羊藿素作為藥物有效成分與抗病毒藥物更昔洛韋（GCV)制備抗 NK/T細胞淋巴瘤增敏藥物；所述的淫羊藿素可通過激活NK/T細胞淋巴瘤內(nèi)潛伏感染的EB 病毒，增加NK/T細胞淋巴瘤對抗病毒藥物的敏感性。
【附圖說明】
[0017] 圖1:淫羊藿素對兩種NK/T細胞淋巴瘤細胞株細胞增殖的影響，
[0018] 其中：MFI為平均熒光強度；圖IA為CCK-8法檢測各濃度淫羊藿素對SNK-10和 SNT-8細胞活力的影響；圖IB為CFDASE染色法檢測淫羊藿素處理兩株細胞48h對細胞增 殖的影響，細胞MFI值越高細胞增殖速度越慢；與對照組相比，*P〈0. 05, #P〈0. 01;各組實驗 重復(fù)3遍以上。
[0019] 圖2:淫羊藿素對SNK-10和SNT-8細胞凋亡的影響，
[0020] 其中：圖2A為AnnexinV/PI雙染法流式檢測細胞凋亡率，淫羊藿素干預(yù)時間為 48h，與對照組相比，*P〈0. 05/P〈0. 01;圖2B為Hoechst33258染色法示細胞凋亡形態(tài)改變， 藥物處理組細胞核出現(xiàn)核固縮、核斷裂和濃染白色熒光等典型凋亡形態(tài)改變，淫羊藿素干 預(yù)時間為48h。
[0021] 圖3 :淫羊藿素對NK/T細胞淋巴瘤細胞株CaspaSe、Bcl-2家族蛋白表達的影響，
[0022] 其中：檢測方法為Westernblot，淫羊藿素干預(yù)時間為48h。
[0023] 圖4:淫羊藿素對SNK-10細胞內(nèi)EBV相關(guān)基因表達的影響，
[0024] 其中：檢測方法為Real-timePCR，淫羊藿素干預(yù)時間為48h，與對照組相比， *P〈0. 05, #P〈0. 01;實驗重復(fù)3遍以上。
[0025] 圖5:淫羊藿素對Zta蛋白表達的影響，
[0026] 其中：檢測方法為Westernblot，淫羊藿素干預(yù)時間為48h。
[0027] 圖6 :淫羊藿素增加SNK-10細胞對GCV的敏感性，
[0028] 其中：AnnexinV/PI雙染法流式檢測細胞凋亡率，淫羊藿素干預(yù)時間為48h，與對 照組相比，*P〈0.05，#P〈0.01。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1:淫羊藿素抑制NK/T細胞淋巴瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡試驗
[0030] 一、材料與方法
[0031] 1.細胞株，采用研究NK/T細胞淋巴瘤常用的細胞系：本實施例的人NK/T細胞淋 巴瘤細胞株SNK-10和SNT-8購自日本東京醫(yī)科齒科大學(xué)，均為EB病毒陽性，所述細胞株用 含有10%滅活人血清及7001]/1111幾-2的？1?頂-1640培養(yǎng)基在371：、體積分數(shù)為5%〇) 2、完 全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，2~3天傳代1次，實驗選用對數(shù)生長期細胞；
[0032] 2?細胞活力的檢測
[0033]分別調(diào)整SNK-10和SNT-8細胞株細胞懸液濃度為IXIO5Ail，加入96孔培養(yǎng)板 內(nèi)，每孔100ill，分別加入等體積不同濃度淫羊藿素（SNK-10細胞所用藥物濃度為50ilM， 30iiM，20iiM，10iiM;SNT-8 細胞所用藥物濃度為 3211]?、1611]\1、811]\1、411]\1)，設(shè)空白對照組 和調(diào)零組，每組均設(shè)3復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h。每孔加入10iiLCCK-8溶液，置37°C、 5 %CO2孵箱培養(yǎng)4h，在490nm處檢測各孔的吸光值；細胞活力=(加藥組OD平均值-調(diào) 零孔OD平均值）八空白對照組00平均值-調(diào)零孔00平均值）乂100%。實驗重復(fù)3遍以 上；
[0034] 2.細胞增殖的檢測
[0035] 取SNK-10細胞4XIO6個（或SNT-8細胞5XIO6個），用ImlCFDASE細胞標(biāo)記液 重懸細胞，置于15ml離心管內(nèi)。加入ImlCFDASE儲存液（2X)，輕輕混勻，37°C孵育10分鐘， 加入約IOml完全細胞培養(yǎng)基洗滌2次，再加入8ml完全細胞培養(yǎng)液，37°C孵育5分鐘，以促 進CFDASE在細胞內(nèi)的駐留及未反應(yīng)的CFDASE進入完全細胞培養(yǎng)液；1000 rpmX5min離心 去上清，完成最后一次洗滌，用IOml完全培養(yǎng)基重懸細胞，混勻，將細胞接種于6孔板，每孔 2ml，SNK-10細胞密度為4XIO5Ail，SNT-8細胞密度為5XIO5Ail;細胞培養(yǎng)孔中分別加入等 體積不同濃度淫羊藿素，SNK-10細胞培養(yǎng)孔中淫羊藿素終濃度分別為0iiM、10iiM、20iiM、 30iiM、50iiM，SNT-8細胞培養(yǎng)孔內(nèi)淫羊藿素終濃度分別為0iiM、4iiM、8iiM、16iiM、32iiM， 置于CO2孵育箱培養(yǎng)48h，PBS洗滌一次后用流式細胞儀檢測CFSE熒光，每組實驗重復(fù)3次， 計算均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差；
[0036] 3.細胞凋亡檢測
[0037] 調(diào)整SNK-10細胞懸液濃度為4XIO5Ail(SNT-8細胞濃度為5XIO5Ail)，將細胞 接種于6孔板，每孔2ml，分別加入等體積不同濃度淫羊藿素（藥物濃度同上），置于37°C、 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48h后，收集細胞300gX5min、4°C離心去上清，用冷PBS洗滌細胞兩 次（300gX5min、4°C離心收集細胞沉淀），用400iiLIXAnnexinV結(jié)合液懸浮細胞，調(diào)整細 胞濃度約為IXIOfVml，在細胞懸液中加入2. 5iiLAnnexinV染色液，輕輕混勻后4°C避光孵 育15min，再加入5iiLPI染色液，輕輕混勻后于4°C避光孵育5min，立即用流式細胞儀檢測 細胞凋亡率；
[0038] 4?細胞凋亡形態(tài)檢測
[0039]調(diào)整SNK-10細胞懸液濃度為4XIO5Ail(SNT-8細胞濃度為5XIO5Ail)，將細胞 接種于6孔板，每孔2ml，分別加入等體積不同濃度淫羊藿素（藥物濃度同前），置于37°C、 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48h后，收集細胞1000 rpmX5min離心去上清，加入0. 5ml固定液，置 于4°C冰箱固定lOmin，1000 rpmX5min離心去固定液,用PBS洗兩遍，1000 rpmX5min離心 后吸去大部分液體保留約50iiL液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，盡量使細胞分布 均勻，稍晾干后均勻滴上〇. 5mlHoechst33258染色液,染色5分鐘,微晾干后去染色液,用 PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋 玻片，用熒光顯微鏡檢測細胞核形態(tài)；
[0040] 4.Caspase、Bc