一種蟾皮中抗腫瘤活性組合物、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蟾皮組合物、其制備方法及用途。其中特別 涉及一種水溶性蟾毒配基類成分的蟾皮提取物，該類成分抗癌效果顯著。
【背景技術(shù)】
[0002] 蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮，具有清熱解毒、利水消脹 之功效，臨床用于治療癰疽、腫毒、腫瘤、疳積腹脹、慢性氣管炎等病癥。蟾皮水溶性部位 開發(fā)的藥品已有多個(gè)上市，尤其華蟾素注射液，是從中華大蟾蜍皮經(jīng)加工制成的水溶性制 劑，治療原發(fā)性肝癌和中晚期肺癌分別獲得44%和56%的綜合有效率，瘤體縮小率分別為 10%和16%，且對(duì)化療和放療具有協(xié)同作用。臨床應(yīng)用表明，華蟾素注射液具有解毒、消 月中、止痛之功效，用于治療中、晚期腫瘤、慢性乙型肝炎等癥，文獻(xiàn)報(bào)道其生理活性物質(zhì)主要 是蟾蜍毒素類（bufotoxins)及其水解產(chǎn)物蟾毒配基類（bufageins)等。
[0003] 從蟾蜍（主要是蟾皮）中已經(jīng)確定的化合物來(lái)看，其成分主要可以分為：蟾毒配基 類、蟾蜍毒素類、蟾毒色胺類三大類以及膽留醇、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的藥用 價(jià)值還沒有得到充分的開發(fā)利用。目前為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蟾蜍以及華蟾素的研究焦點(diǎn)主要 集中在其脂溶性蟾毒配基類等成分。該類成分具有明顯的細(xì)胞毒性抗腫瘤活性。然而，眾 所周知華蟾素為水溶性制劑，基本不含有或極少量含有華蟾酥毒基、酯蟾毒配基等脂溶性 蟾毒配基類成分。因此該產(chǎn)品在腫瘤治療方面的良好表現(xiàn)，根據(jù)我們的研究結(jié)果，主要來(lái)源 于水溶性蟾毒配基類成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種具有抗腫瘤作用的蟾皮提取物。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種主要為蟾毒配基類成分的蟾皮提取物，其具有較 好的水溶性，同時(shí)指認(rèn)了其中多種成分。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述蟾皮提取物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述蟾皮提取物的應(yīng)用。
[0008] 以下通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以根據(jù)發(fā)明做出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā) 明所附權(quán)利要求的范圍。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] A -種蟾皮提取物
[0011] -種蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮為原料經(jīng)過(guò)水提或水提醇沉的方法制 成的。
[0012] B -種蟾皮組合物
[0013] -種蟾皮中的組合物，是以干蟾皮為原料經(jīng)過(guò)水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提 取物后，以層析色譜的方法得到的一種或N種蟾毒配基類成分組合而成的組合物。照高效 液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，聯(lián)用 質(zhì)譜（HPLC-MS)，通過(guò)推導(dǎo)質(zhì)譜的碎片信息并與已知標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，指認(rèn)出蟾皮脂溶性組合物 中33個(gè)色譜峰代表的化合物。日蟾毒他靈、沙蟾毒精、嚏根草苷元等。其具有較好的水溶 性。
[0014] C本發(fā)明所得到的組合物具有較好的抗腫瘤活性：
[0015] 1.對(duì)肝癌：
[0016] (1)體外抗癌試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明組合物的體外抗肝癌腫瘤細(xì)胞的效果好，毒性 低；
[0017] (2)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明組合物對(duì)鼠源性肝癌有較好的治療作用，效果優(yōu)于華蟾 素注射液；對(duì)人源肝癌荷瘤裸鼠也具有抗腫瘤作用，且抗腫瘤效果優(yōu)于華蟾素注射液。
[0018] 2.對(duì)胃癌：
[0019] (1)體外抗癌試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明組合物的體外抗胃癌腫瘤細(xì)胞的效果好，毒性 低；
[0020] (2)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明組合物對(duì)鼠源性胃癌有較好的治療作用，效果優(yōu)于華蟾 素注射液；對(duì)人源胃癌荷瘤裸鼠也具有抗腫瘤作用，且抗腫瘤效果優(yōu)于華蟾素注射液。
[0021] 本發(fā)明的意義在于：本發(fā)明對(duì)蟾皮進(jìn)行提取后制備得到水溶性較好的一類蟾毒配 基類成分，該組合物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中顯示，具有比較顯著的抗癌活性，同時(shí)與其他抗腫瘤藥 物相比毒副作用小，具有抗腫瘤類藥物開發(fā)的良好前景。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖 I HPLC(296nm)色譜圖
[0023] 圖2 LC-MS離子流圖
[0024] 圖3藥物對(duì)!fepG2腫瘤體積的影響(之士S)
[0025] 圖4藥物對(duì)荷HepG2腫瘤裸鼠體重的影響（/土S)
[0026] 圖5藥物對(duì)!fepG2相對(duì)腫瘤體積的影響(茫遙）
[0027] 圖6藥物對(duì)HepG2相對(duì)腫瘤增值率的影響
[0028] 圖7藥物對(duì)MKM5腫瘤體積的影響（Z±s)
[0029] 圖8藥物對(duì)荷MKN45腫瘤裸鼠體重的影響（萬(wàn)土S)
[0030] 圖9藥物對(duì)MKN45相對(duì)腫瘤體積的影響(f ±s:>
[0031] 圖10藥物對(duì)MKN45相對(duì)腫瘤增值率的影響
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。
[0033] 實(shí)驗(yàn)例1 :本發(fā)明蟾皮提取物的制備
[0034] 干蟾皮洗凈，用5~15倍的水提取2次，濃縮至小體積后分別用50~70%、75~ 90%的乙醇沉淀，濾過(guò)，回收乙醇得到蟾皮提取物；或者，干蟾皮洗凈，用5~15倍的水提取 2次，濃縮至相對(duì)密度為I. 01~1. 35 (80°C )后，分別用40~70%、75~90%的乙醇沉淀， 濾過(guò)，將濾液回收乙醇得到蟾皮提取物。具體操作方法為：取干蟾皮進(jìn)行修治后，加入8倍 水（V/m)，煎煮2次，每次30min，濾過(guò)，合并濾液，濃縮。濃縮至小體積（相對(duì)密度在1.0 l~ 1. 35,80 °C )，冷卻至40 °C，加入95%乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為40~60 %進(jìn)行一次醇沉，后傾出上 清液；將上清液回收乙醇至無(wú)醇味，加入95%乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為75~90%進(jìn)行二次醇沉， 靜置后常壓濾過(guò)，濾液濃縮至稠膏，冷藏24h，離心，即得蟾皮提取物。
[0035] 實(shí)驗(yàn)例2 :本發(fā)明蟾皮組合物的制備
[0036] 使用葡聚糖凝膠Sephadex G10、G15、G25、G50、G75或LH20對(duì)實(shí)施例1中所述蟾 皮提取物進(jìn)行分離純化，裝柱徑高比1:15,上樣體積比1:40,恒流速3ml/min去離子水洗 脫，或者，使用聚甲基丙燔酸醅凝膠服40、HW50或HW65對(duì)蟾皮提取物行分離純化，裝柱徑 高比1:15~20,上樣體積比1:10~40,恒流速3~lOml/min去離子水洗脫，按照柱體積 1/5進(jìn)行收集，以假蟾毒精、日蟾毒它靈、沙蟾毒精為標(biāo)志物，采用HPLC分析進(jìn)行跟蹤，收集 反應(yīng)陽(yáng)性餾分合并。合并液用十八烷基鍵和硅膠進(jìn)行純化后，冷凍干燥，得到組合物。
[0037] 實(shí)驗(yàn)例3 :本發(fā)明組合物的定性鑒別
[0038] 3. 1儀器與分析條件：
[0039] 分析儀器：Solarix FT-ICR-MS 9· 4T(德國(guó) Bruker 公司）；Agilent 1260 高效液 相色譜儀；
[0040] 色譜條件：Diamonsil C18 色譜柱（4. 6_X 250_，5 μ m);流動(dòng)相：甲醇（A)-水 (B)，梯度洗脫程序：0_5min，5-20 % A ;5-45min，20-42 % A ;45-70min，42 % -100 % A ;流速： 1.0 ml/min ;柱溫：30°C ;進(jìn)樣量：10 μ L ;檢測(cè)波長(zhǎng)：296nm。
[0041] 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源噴霧電壓：+4000V，干燥氣溫度：180°C，干燥氣流速： 4. OL/min，噴霧氣壓力：0. 5bar ;正離子掃描模式采集，質(zhì)譜掃描范圍m/z :70~1500。
[0042] 3. 2對(duì)照品制備
[0043] 分別精確稱量酯蟾毒配基，華蟾酥毒基、日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒 他靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈對(duì)照品，加甲醇溶解，配置成以上給對(duì)照品〇. 2mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn) 溶液，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，即得對(duì)照品溶液。
[0044] 3. 3供試品的制備
[0045] 取本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的蟾皮提取物，按照1:1的比例與硅膠拌勻，分散，加 熱混合物至完全干燥。用二氯甲烷進(jìn)行索氏回流提取，濾過(guò)得到提取液，減壓干燥，得到脂 溶性組合物部分。取該組合物Smg加2ml甲醇溶解，0.22μπι微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品。
[0046] 3. 4結(jié)果與討論
[0047] 通過(guò)推導(dǎo)質(zhì)譜的碎片信息并與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，從組合物供試品色譜峰中推斷出 33個(gè)化合物。分別為日蟾毒他靈，沙蟾毒精，遠(yuǎn)華蟾毒精，蟾毒他靈，華蟾毒他靈，蟾毒靈、酯 蟾毒配基、華蟾酥毒基等。結(jié)果見表1、圖1、2。
[0048] 表1 HPLC-MS解析數(shù)據(jù)
[0049]






[0056] 實(shí)驗(yàn)例4 :本發(fā)明組合物的體內(nèi)外抗肝癌的藥效研究
[0057] 4. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0058] 4. I. 1實(shí)驗(yàn)藥物及陽(yáng)性藥物
[0059] 華蟾素注射液（批號(hào)131101-1，安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司）；華蟾素中間 體、5-氟尿