異葉青蘭活性精細組分的分離方法及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及民族醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及異葉青蘭活性精細組分的分離方法及其 應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 異葉青蘭Benth.)是國家部頒標準藏藥收錄的 品種，藏藥名為吉孜青保，為唇形科青蘭屬草本植物，分布于青海、甘肅、西藏等地，以全草 入藥，主要用于治療黃疽性發(fā)燒、肝熱、熱性病頭痛、口腔潰瘍、支氣管炎、高血壓等多種病 癥，是藏族的傳統(tǒng)用藥。
[0003] 肝炎作為一種傳染性強、傳播途徑復雜的疾病，其發(fā)病率逐年上升。根據(jù)流行病學 調(diào)查，我國是病毒性肝炎的高流行區(qū)，約有1.2億人感染乙肝病毒，7~9億人感染過甲肝病 毒，3800萬人感染丙肝病毒。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全世界原發(fā)性肝癌中大約80%都與HBV 慢性感染相關(guān)。中國是肝癌高發(fā)區(qū)，也是全球乙肝和肝癌負擔最沉重的國家，每年用于乙肝 治療的費用達1000億以上，每年近30萬人死于肝硬化、肝癌等肝臟相關(guān)疾病。
[0004] 現(xiàn)代研宄表明，異葉青蘭含有揮發(fā)油、黃酮、多糖、帖類、木脂素等成分，具有抗腫 瘤、抗氧化、抗病毒、降血壓、抑菌抗炎及免疫抑制等活性。至今尚無有關(guān)異葉青蘭中抗肝炎 及對肝損傷有療效的活性組分的研宄報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種工藝簡單、有效成分質(zhì)量穩(wěn)定、易規(guī)?；?生產(chǎn)的異葉青蘭活性精細組分的分離方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供該活性精細組分的應用。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的異葉青蘭活性精細組分的分離方法，包括以下步 驟： ⑴提取： 將異葉青蘭全草陰干、粉碎后，用其質(zhì)量8~20倍體積濃度為95%的乙醇溶液浸泡10~15 個小時，在80~90°C溫度下加熱回流提取2~4次，每次3小時，經(jīng)減壓干燥得異葉青蘭醇提 物； ⑵硅膠柱層析分離： 將所述異葉青蘭醇提物經(jīng)硅膠柱色譜分離，用1〇~20倍柱體積的石油醚-乙酸乙酯混 合溶劑洗脫，按每份1〇〇~200 mL收集餾分，采用薄層色譜檢測，其中展開劑為石油醚、乙酸 乙酯按1 :1的體積比混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合 并收集Rf值為〇. 1~〇. 6的餾分，該餾分經(jīng)減壓干燥，即得呈黃褐色粉末狀的異葉青蘭粗組 分； ⑶微孔樹脂除雜： 將所述異葉青蘭粗組分用其質(zhì)量5~10倍的體積分數(shù)為90~100%的甲醇溶液溶解，過濾 得到濾液，該濾液上微孔樹脂柱分離，用3~5倍柱體積且體積分數(shù)為90°/『100%的甲醇溶液 洗脫，收集90°/『100%的甲醇溶液洗脫物，該90°/『100%的甲醇溶液洗脫物經(jīng)減壓干燥，即得 呈黃色的異葉青蘭精細組分；所述異葉青蘭粗組分與所述微孔樹脂比例為I g:30 mL。
[0008] 所述減壓干燥條件是指真空度為0. 06~0. 09 MPa，溫度為50~60°C。
[0009] 所述步驟⑵中石油醚-乙酸乙酯的混合溶劑是指石油醚和乙酸乙酯按7 :3~3 :7 的體積比混合而成。
[0010] 所述步驟⑶中微孔樹脂是指HP20SS型樹脂柱、MCI型樹脂柱、HP20型樹脂柱中的 任意一種。
[0011] 如上所述的異葉青蘭活性精細組分的分離方法制得的異葉青蘭精細組分在肝病 治療中的應用，其特征在于：該異葉青蘭活性精細組分作為有效組分按常規(guī)方法與藥學上 可接受的任何載體制成各類抗病毒性肝炎、急性重型肝炎、肝功能衰竭、自身免疫性肝炎、 藥物性肝損傷和肝硬化的藥用制劑。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點： 1、本發(fā)明原材料分布廣泛，資源量豐富，易于批量備料。
[0013] 2、本發(fā)明用95%乙醇作為提取溶劑，能有效提取目標組分，同時保證糖類、鞣質(zhì)等 生物大分子不被提取出來，溶劑價格低廉，操作過程簡單，易于規(guī)模化。
[0014] 3、本發(fā)明采用硅膠柱層析分離，可直接將異葉青蘭中弱極性類組分與揮發(fā)性成分 分開，同時去除部分強極性雜質(zhì)。
[0015] 4、本發(fā)明采用微孔樹脂除雜，可有效去除樣品中的色素，且樹脂柱可以再生循環(huán) 使用，平均價格低廉。
[0016] 5、本發(fā)明工藝簡單、重復性好、質(zhì)量穩(wěn)定可控，所得到的異葉青蘭活性精細組分經(jīng) 測試，具有很好的抗肝炎和肝損傷治療作用。
[0017] ⑴通過使用刀豆蛋白酶引起肝臟免疫系統(tǒng)對肝臟自身過度免疫反應，造成肝臟組 織損傷，來模擬病毒性肝炎中病毒引起的自身免疫失調(diào)造成的肝細胞壞死病理。在該病理 模型中，對異葉青蘭中活性精細組分的藥物功能進行研宄，通過檢測對照組及異葉青蘭中 活性精細組分藥物組balb/ c小鼠轉(zhuǎn)氨酶活性值變化判定該精細組分的藥物效應，體內(nèi)實 驗分組如表1 : 表1
⑵通過聯(lián)合注射多聚胞苷（Poly I :c)與D型半乳糖氨（D-GalN)，誘導小鼠肝組織大面 積壞死，引起嚴重的炎癥，來模擬病毒肝炎引發(fā)的急性肝炎。在該病理模型中，對異葉青蘭 中活性精細組分的藥物功能進行研宄，通過檢測對照組及異葉青蘭中活性精細組分藥物組 balb/c小鼠轉(zhuǎn)氨酶活性值變化判定該精細組分的藥物效應，體內(nèi)實驗分組如表2 : 表2
⑶結(jié)論：異葉青蘭中活性精細組分藥物組對機體自身性免疫反應引起的肝損傷有顯 著的治療作用，對病毒性肝炎引發(fā)的急性肝炎有明顯的抑制作用。具體見附圖1和圖2。
【附圖說明】
[0018] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0019] 圖1為本發(fā)明異葉青蘭活性精細組分的抗病毒性肝炎中病毒引起的自身免疫失 調(diào)造成的肝細胞壞死病理活性篩選結(jié)果。
[0020] 圖2為本發(fā)明異葉青蘭活性精細組分的抗病毒肝炎引發(fā)的急性肝炎的活性篩選 結(jié)果。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1 異葉青蘭活性精細組分的分離方法，包括以下步驟： ⑴提取： 將I. 0 Kg異葉青蘭全草陰干、粉碎后，用其質(zhì)量10倍體積濃度為95%的乙醇溶液浸泡 10個小時，在90°C溫度下加熱回流提取3次，每次3小時，經(jīng)減壓干燥得異葉青蘭醇提物 198. 4 g〇
[0022] 其中：減壓干燥條件是指真空度為0. 06 MPa，溫度為60°C。
[0023] ⑵硅膠柱層析分離： 將異葉青蘭醇提物經(jīng)硅膠柱色譜分離，用10倍柱體積的石油醚-乙酸乙酯混合溶劑 洗脫，按每份100 mL收集餾分，采用薄層色譜檢測，其中展開劑為石油醚、乙酸乙酯按I : 1 的體積比（mL/ mL)混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并 收集Rf值為〇. 1~〇. 6的餾分，該餾分經(jīng)減壓干燥，即得呈黃褐色粉末狀的異葉青蘭粗組分 116. 3 g〇
[0024] 其中：石油醚-乙酸乙酯的混合溶劑是指石油醚和乙酸乙酯按5 :5的體積比（mL/ mL)混合而成。
[0025] 減壓干燥條件是指真空度為0. 06 MPa，溫度為60°C。
[0026] ⑶微孔樹脂除雜： 將異葉青蘭粗組分用其質(zhì)量5倍的體積分數(shù)為100%的甲醇溶液溶解，過濾得到濾液， 該濾液上微孔樹脂柱分離，用3倍柱體積且體積分數(shù)為100%的甲醇溶液洗脫，收集100%的 甲醇溶液洗脫物，該100%的甲醇溶液洗脫物經(jīng)減壓干燥，即得呈黃色的異葉青蘭精細組分 98. 4 g〇
[0027] 其中：微孔樹脂是指HP20SS型樹脂柱。