Dlk1蛋白胞外剪切部分的制藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及創(chuàng)面治療領(lǐng)域，更具體的是，本發(fā)明涉及DLK1蛋白胞外剪切部分在制 備促進(jìn)創(chuàng)面愈合的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 外傷性創(chuàng)面、燒傷創(chuàng)面、糖尿病足、靜脈瘀滯性潰瘍、壓力性潰瘍以及感染、腫瘤切 除導(dǎo)致的各種急慢創(chuàng)面在臨床上常見(jiàn)，對(duì)患者生活質(zhì)量和勞動(dòng)能力影響極大，并且給家庭 和社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。近年來(lái)隨著我國(guó)交通、建設(shè)的飛速發(fā)展及人口老齡化的加劇，各類 創(chuàng)面的發(fā)病率也有不斷增高趨勢(shì)。
[0003]瘢痕是各種創(chuàng)傷后所引起的正常皮膚組織的外觀形態(tài)和組織病理學(xué)改變的統(tǒng)稱， 它是人體創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中必然的產(chǎn)物。從廣義上說(shuō)，沒(méi)有瘢痕組織也就沒(méi)有創(chuàng)傷的愈合。但 瘢痕生長(zhǎng)超過(guò)一定的限度，就會(huì)發(fā)生各種并發(fā)癥，諸如外形的破壞及功能活動(dòng)障礙等，給患 者帶來(lái)巨大的肉體痛苦和精神痛苦，尤其是燒傷、燙傷、嚴(yán)重外傷后遺留的瘢痕。
[0004] 目前臨床上應(yīng)用的創(chuàng)面治療方案可分為手術(shù)及非手術(shù)治療。手術(shù)治療主要指清創(chuàng) 換藥、植皮或皮瓣移植，主要適用于外傷性創(chuàng)面及燒傷創(chuàng)面或者壓力性潰瘍。對(duì)于各種不適 用手術(shù)治療的創(chuàng)面，如小創(chuàng)面或者全身情況較差患者的較大創(chuàng)面，或者局部情況不佳的創(chuàng) 面，治療以清創(chuàng)換藥及局部外用藥物為主。但是目前可用的外用促進(jìn)創(chuàng)面愈合藥物非常有 限，主要是生長(zhǎng)因子類藥物。而生長(zhǎng)因子往往半衰期僅數(shù)分鐘，效果不能讓人滿意，而且分 子量極小，容易吸收入血，長(zhǎng)期大量使用對(duì)未成年人發(fā)育可能造成影響。因此，開(kāi)發(fā)新的促 進(jìn)創(chuàng)面愈合藥物仍然非常必要。
[0005] 創(chuàng)面愈合過(guò)程的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，目前仍不完全清楚。但是目前已經(jīng)證明局部微環(huán) 境中的部分非結(jié)構(gòu)蛋白在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起到了非常重要的調(diào)節(jié)作用。這些蛋白可能對(duì)上 皮細(xì)胞增殖、遷移、分化，成纖維細(xì)胞募集、增殖、激活、凋亡，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子分泌 及膠原沉積、細(xì)胞外基質(zhì)重塑起到重要影響。
[0006] Delta_likelhomolog(DLKl，又名 fetal antigenl，F(xiàn)A1 或 preadipocyte factorl， Pref-1)是一種跨膜蛋白，定位于人染色體14q32,為父系表達(dá)的印跡基因，由于其蛋白結(jié) 構(gòu)和氨基酸序列與果蠅Notch配基Delta的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)有著高度同源性，因而得名。人DLK1 基因（GeneBank Access No. BC007741,)全長(zhǎng) 1557bp，CDS 含有 1152 核苷酸，編碼 383 個(gè)氨 基酸殘基。DLK1蛋白是一種跨膜蛋白，包含細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽，中間跨膜區(qū)及細(xì)胞外區(qū)。其胞 外結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)，并且其胞外結(jié)構(gòu)域可以被ADAM metallopeptidase domainl7剪切后形成一個(gè)可溶性的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。目前研究已發(fā)現(xiàn)該剪切蛋白對(duì)多種細(xì) 胞分化和增殖有明顯影響，并且DLK1蛋白在發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。
[0007] DLK1，屬于人類印跡基因的一種，國(guó)家人類基因組南方研究中心研究發(fā)現(xiàn)屬于一 種促肝癌新基因，對(duì)肝癌的形成起到重大促進(jìn)作用。
[0008] 也有通過(guò)對(duì)食管癌組織中Dlk-1蛋白表達(dá)的觀察，探討其臨床意義，對(duì)食管癌及 癌旁正常組織兩組中Dlk-1蛋白的表達(dá)以免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)Dlk-1蛋白表 達(dá)與腫瘤分級(jí)及臨床病理分期之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果Dlk-1蛋白在食管癌組的表 達(dá)與其在癌旁正常組織中的表達(dá)兩者間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈〇. 01)。食管癌組織中 Dlk-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤臨床病理分期呈正相關(guān)（P〈0.01)，與食管癌組織學(xué)分級(jí)負(fù)相關(guān) (P〈0. 01)。結(jié)論Dlk-1蛋白的表達(dá)與食管癌的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)，將為食管癌的臨床 治療及預(yù)后分析等提供新的思路。（參見(jiàn)胡欽勇，黃衛(wèi)彬，"食管癌組織中Dlk-1蛋白的表達(dá) 及其意義"，《中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)》，2012年第8期）
[0009] 目前為止，DLK1在創(chuàng)面愈合中的作用還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)過(guò)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供DLK1的新的制藥用途。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過(guò)下列構(gòu)思來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及DLK1蛋白胞外剪切部分在制備減少瘢痕形成的藥物中的 用途。
[0013] 本發(fā)明的另一方面涉及DLK1蛋白胞外剪切部分在制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合的藥物中的 用途。
[0014] DLK1蛋白是一種跨膜蛋白，包含細(xì)胞內(nèi)信號(hào)肽，中間跨膜區(qū)及細(xì)胞外區(qū)。其胞 外結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)，并且其胞外結(jié)構(gòu)域可以被ADAMmetallopeptidase domainl7剪切后形成一個(gè)可溶性的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，據(jù)此得到了本發(fā)明中使用的DLK1蛋 白胞外剪切部分。本發(fā)明中使用的DLK1蛋白胞外剪切部分具有如下的重組蛋白序列（280 個(gè)氨基酸）：AECFPACNPQNGFCEDDNVCRCQPGWQGPLCDQCVTSPGCLHGLCGEPGQCICTDGWDGELCDRDVR ACSS APCANNGTCVSLDDGLYECSCAPGYSGKDCQKKDGPCVINGSPCQHGGTCVDDEGRASHASCLCPPGFSGN F CEIVANSCTPNPCENDGVCTDIGGDFRCRCPAGFIDKTCSRPVTNCASSPCQNGGTCLQHTQVSYECLCK PEFTGLT CVKKRALSPQQVTRLPSGYGLAYRLTPGVHELPVQQPEHRILKVSMKELNKKTPLLTEGQ〇
[0015] 本文中所述的創(chuàng)面包括，但不限于，外傷性創(chuàng)面、燒傷創(chuàng)面、糖尿病足、靜脈瘀滯性 潰瘍、壓力性潰瘍以及感染、腫瘤切除導(dǎo)致的各種急慢創(chuàng)面。
[0016] 下文中使用的術(shù)語(yǔ)"DLK1"特指本發(fā)明使用的DLK1蛋白胞外剪切部分
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1A為正常人皮膚、人增生期瘢痕及人成熟期瘢痕DLK1免疫組織化學(xué)染色代表 性圖片。
[0018] 圖1B為DLK1在正常人皮膚、人增生期瘢痕及人成熟期瘢痕表皮及真皮中表達(dá)水 平的免疫組化結(jié)果定量。
[0019] 圖1C為小鼠創(chuàng)面組織DLK1表達(dá)的免疫組化代表性圖片。
[0020] 圖1D為小鼠創(chuàng)面組織DLK1免疫組化表達(dá)情況的定量結(jié)果。
[0021] 圖2A為DLK1蛋白的結(jié)構(gòu)圖。
[0022] 圖2B為構(gòu)建之蛋白表達(dá)載體不意圖。
[0023] 圖2C為表達(dá)并純化的蛋白通過(guò)Western blot抗DLK1及抗strip- II抗體鑒定的 圖譜。
[0024]圖3A是顯示實(shí)施例5中的Balb/c小鼠創(chuàng)面愈合的模型圖。
[0025] 圖3B是顯示實(shí)施例5中的小鼠創(chuàng)面面積對(duì)時(shí)間的柱形圖。
[0026] 圖4A和4C是Masson三色染色圖。
[0027] 圖4B是給予或不給予DLK1所形成的瘢痕厚度的柱形圖。
[0028] 圖5A是顯示角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的示意圖。
[0029] 圖5B是時(shí)間對(duì)遷移面積的柱形圖。
[0030] 圖5C是時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的柱形圖
[0031] 圖是時(shí)間對(duì)HDF細(xì)胞增殖的柱形圖。
[0032] 圖6是本發(fā)明所使用的DLKlmRNA的序列圖。
[0033] 圖7是V152質(zhì)粒圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面基于下列具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述。
[0035] 實(shí)施例1 :免疫組化步驟
[0036] 人正常皮膚及增殖期瘢痕組織、成熟瘢痕組織及小鼠創(chuàng)面組織多聚甲醛固定，石 蠟包埋，切片，脫蠟至水；檸檬酸鈉緩沖液水浴抗原修復(fù)；〇. 3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化 物酶活性；10%BSA室溫封閉1小時(shí)；兔抗小鼠DLK1-抗（Abcam(ab21682)，Cambridge，MA)4 度搖床孵育過(guò)夜，PBS清洗3次；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫?fù)u床孵育1小時(shí)， PBS清洗3次；DAB發(fā)色，自來(lái)水洗10分鐘；蘇木素復(fù)染5分鐘，自來(lái)水洗10分鐘后鹽酸乙 醇分化5秒，自來(lái)水洗10分鐘；脫水透明后封片。
[0037] 實(shí)施例2 :人源性DLK1蛋白胞外剪切部分表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)、純 化：
[0038] 1)DLK1蛋白胞外剪切部分過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建
[0039] ①工具載體及目的基因
[0040] 載體名稱：V152
[0041]質(zhì)粒大小：9752bp
[0042]克隆位點(diǎn)：Nhe I/BamH I
[0043] 載體構(gòu)建示意圖：見(jiàn)圖2B
[0044] 目的基因：DLK1，0RF全長(zhǎng)840bp (基因序列詳見(jiàn)圖6)
[0045] ②DLK1基因的克隆
[0046] a.PCR引物的設(shè)計(jì)
[0047] 依據(jù)DLK1基因的cDNA片段序列（NM_003836. 5)設(shè)計(jì)引物，引物包含兩段與模板 兩端互補(bǔ)的寡核苷酸序列，引物由上海生工公司合成。
[0048]上游引物：5 'CTA GCT AGC AGC TGA ATG CTT CCC GGC CTG3'
[0049]下游引