重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物免疫領(lǐng)域，涉及重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 雖然人、畜、禽在免疫學(xué)結(jié)構(gòu)方面存在差異，但針對(duì)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的生物模式 方面存在很多共同點(diǎn)，在人類(lèi)疾病防控領(lǐng)域普遍應(yīng)用的免疫佐劑，在禽、畜體內(nèi)同樣發(fā)揮作 用。作為人類(lèi)整體，其健康質(zhì)量的提升、平均壽命的延長(zhǎng)，很大部分得益于對(duì)各種可致流行 病的病原體的抵抗；而后者則依賴(lài)于針對(duì)各種病原體的疫苗的研發(fā)和免疫方法的建立。目 前在某些地區(qū)，病原體感染仍是威脅人類(lèi)健康的重大殺手，如引起愛(ài)滋病的HIV感染、人畜 共患的SARS、禽流感、埃博拉病毒感染等，以及并非致命的感染如瘧疾等。同時(shí)，對(duì)于一些非 感染性疾病，若其發(fā)病機(jī)制與免疫失功相關(guān)，如腫瘤，則也可應(yīng)用疫苗接種途徑，誘導(dǎo)機(jī)體 產(chǎn)生針對(duì)特定抗原(如腫瘤相關(guān)抗原）的免疫力，從而達(dá)到預(yù)防或治療疾病的目的。
[0003] 除增強(qiáng)人類(lèi)自身健康狀況外，為人類(lèi)提供足夠并健康的畜、禽制品，也是提升人 類(lèi)整體生活質(zhì)量的保障手段之一。因此，研發(fā)適用于畜、禽生產(chǎn)的疫苗以促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康 發(fā)展，同樣具有重大意義。
[0004] 決定疫苗成敗的三個(gè)主要因素包括特異性抗原、佐劑和免疫途徑，其中后兩者常 為領(lǐng)域內(nèi)公共待解決的問(wèn)題，因此具有更重大的研宄意義。即便針對(duì)同一種抗原，采用不同 的佐劑或應(yīng)用不同的免疫途徑，都可能引起不同的免疫防治效果。目前公共衛(wèi)生防治領(lǐng)域 常用的免疫途徑仍為皮下粘膜或肌肉注射。隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近二十年在經(jīng)粘膜 免疫途徑方面開(kāi)展了大量工作，被認(rèn)為最終將取代傳統(tǒng)免疫途徑。與其對(duì)應(yīng)的則是尋找新 型的免疫佐劑。目前被公認(rèn)較有前景的粘膜免疫佐劑(也適合傳統(tǒng)免疫途徑)主要包括霍亂 毒素、大腸桿菌熱敏感腸毒素和人工合成的非甲基化的CpG類(lèi)寡核苷酸。
[0005] 在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里，鋁劑（以氫氧化鋁為主，還有硫酸鋁、氧化鋁凝膠等）是唯一被 批準(zhǔn)在美國(guó)使用的免疫佐劑。隨后，在歐洲和加拿大上市的MF59,為角鯊烯squalene納米 油劑，用于流感；在防治16/18型乳頭狀瘤病毒引起的宮頸癌疫苗Cervarix中，使用的是氫 氧化鋁與單磷酸脂質(zhì)A (MPL)的混合物（AS04)。2013年，為應(yīng)對(duì)嚴(yán)重的禽流感威脅，美國(guó)FDA 緊急批準(zhǔn)在H5N1疫苗中使用的佐劑AS03,是維生素 E、角鯊烯和polysorbate (聚山梨醇 酯，又稱(chēng)吐溫80)的混合物；只是該疫苗未公開(kāi)售用，但在衛(wèi)生官員認(rèn)為需要時(shí)可以使用。 目前世界上有上百種基于各種機(jī)制、具有各種結(jié)構(gòu)、針對(duì)不同使用目的的佐劑候選制品，處 于研發(fā)的不同階段。在我國(guó)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于二〇〇五年十月十四日發(fā)布的"多 肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則"中也明確闡明："傳統(tǒng)佐劑是在礦物膠基礎(chǔ)上制成-氫氧 化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣，到目前為止批準(zhǔn)使用的佐劑鮮為他類(lèi)"。為此，研發(fā)基于我國(guó)自主創(chuàng) 新發(fā)現(xiàn)的新型免疫佐劑，具有重要的意義。
[0006] -種良好的佐劑能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)特異性抗原的免疫應(yīng)答，但本身不引起不需要的作 用。目前使用或在研的多數(shù)佐劑，作用機(jī)制主要包括兩種方式：通過(guò)物理方法延長(zhǎng)疫苗抗原 的作用時(shí)間，或通過(guò)刺激先天性免疫系統(tǒng)而放大機(jī)體針對(duì)抗原產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)。比 如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的不完全弗氏佐劑即通過(guò)其內(nèi)油脂類(lèi)物質(zhì)保護(hù)抗原不被迅速稀釋 降解，而完全弗氏佐劑中的菌體則刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。雖然完全弗氏佐劑也可引起針對(duì) 其內(nèi)菌體抗原的特異性免疫反應(yīng)，但因?yàn)樵撟魟﹥?nèi)的細(xì)菌實(shí)為致病菌，所以針對(duì)其產(chǎn)生的 特異性抗體或細(xì)胞免疫效應(yīng)細(xì)胞并不對(duì)宿主產(chǎn)生不良效果?，F(xiàn)在已知弗氏佐劑中的菌體發(fā) 揮作用的主要機(jī)制是其各種結(jié)構(gòu)成分如脂多糖、蛋白多糖、胞內(nèi)DNA等病原體相關(guān)模式分 子（Pathogen-Associated Molec μ Lar Pattern)對(duì)宿主細(xì)胞上Toll樣受體的激活，引起 后續(xù)免疫刺激效應(yīng)。近些年研宄較多的基于CpG免疫刺激現(xiàn)象的佐劑，通過(guò)激活Toll樣受 體9而活化抗原提呈細(xì)胞和B細(xì)胞，從而增強(qiáng)對(duì)抗原的反應(yīng)。毒素類(lèi)佐劑則通過(guò)刺激粘膜 局部的炎性反應(yīng)，放大對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。目前基于CpG免疫刺激現(xiàn)象的佐劑研發(fā)比較引 人注目，主要由于以下原因：CpG免疫刺激現(xiàn)象較為明顯；CpG類(lèi)寡核苷酸容易制備；當(dāng)CpG 寡核苷酸長(zhǎng)度控制在一定范圍內(nèi)時(shí)，其免疫原性十分微弱；除了其核心部位的CpG序列不 能變更外，其側(cè)翼序列可有很多的變通方法，因此較易以新的序列研發(fā)自己的產(chǎn)品。
[0007] 在來(lái)源于細(xì)菌的佐劑候選制劑中，基于鞭毛成分者也值得關(guān)注。首先，曾有文 獻(xiàn)表明完整鞭毛具有佐劑效應(yīng)（Ruiz AM, et al. Immunoprotection of mice against Trypanosoma cruzi with a lyophilized flagellar fraction of the parasite plus adjuvant. Immunol Lett 1986; 12:1-4)。至 1997 年 Toll 樣受體系列被發(fā)現(xiàn)（Medzhitov R, et al. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997; 388:394-397)后，于 2001 年證實(shí)鞭毛的佐劑效應(yīng) 是通過(guò)鞭毛體的主要部分（即鞭毛纖維）所含鞭毛蛋白FliC作用于Toll樣受體5 (TLR5) 而實(shí)現(xiàn)的（Hayashi F, et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 2001; 410:1099-1103)。目前國(guó)內(nèi)外均 有部分專(zhuān)利對(duì)FliC相關(guān)制劑的佐劑性應(yīng)用進(jìn)行保護(hù)。以"鞭毛蛋白and佐劑"搜索國(guó)家 專(zhuān)利局的專(zhuān)利公布公告數(shù)據(jù)庫(kù)，返回四條記錄（圖2)，申請(qǐng)人分別來(lái)自中國(guó)和法國(guó)，專(zhuān)利對(duì) 鞭毛蛋白在人或禽疫苗中的應(yīng)用進(jìn)行保護(hù)。必須指出的是，目前已有的國(guó)內(nèi)外所有應(yīng)用鞭 毛蛋白作為佐劑或者其他方面應(yīng)用的專(zhuān)利（比如腫瘤治療等）中所指的"鞭毛蛋白"，無(wú)一例 外均指由基因FliC編碼的flagellin type B，因其對(duì)應(yīng)于鞭毛體纖維部分，因此傳統(tǒng)被稱(chēng) 為filament C (FliC)，與本專(zhuān)利所保護(hù)的FlgE是由不同基因編碼的不同蛋白（表1)。采 用Pubmed的BLAST程序和SimGene的CLUSTALW2程序分別對(duì)二者進(jìn)行同源比較，顯示FliC 和FlgE在蛋白序列方面同源性極低。
[0008] 表1.綠膿桿菌PAOl菌株中，"鞭毛蛋白"與"鞭毛鉤蛋白"的對(duì)比
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的用途為重組綠膿桿菌鞭 毛鉤蛋白FlgE在制備免疫佐劑或疫苗中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 免疫佐劑為用于預(yù)防或治療腫瘤、感染性疾病的免疫佐劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 疫苗為用于預(yù)防腫瘤或感染性疾病的疫苗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 疫苗為禽類(lèi)或畜類(lèi)疫苗。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的感染性疾病包括病毒感染性疾病、細(xì)菌感染性疾病或寄生蟲(chóng)感染性疾病。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的感染性疾病包括肺炎、腦膜炎、腸炎、禽流感或艾滋病。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的腫瘤包括基底細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、惡性血管外皮瘤、惡性血管外皮 瘤、B細(xì)胞性惡性淋巴瘤、T細(xì)胞性惡性淋巴瘤或造釉細(xì)胞癌。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物免疫領(lǐng)域，本發(fā)明公開(kāi)了重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE的用途，所述的用途為重組綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE在制備免疫佐劑或疫苗中的用途；尤其是免疫佐劑用于預(yù)防或治療腫瘤或感染性疾病的用途。本發(fā)明提供了以綠膿桿菌PAO1株為模型菌株，證明重組表達(dá)的FlgE單體，可以刺激人角膜上皮細(xì)胞或小鼠肺組織發(fā)生炎性反應(yīng)，并能表現(xiàn)出顯著的佐劑效應(yīng)，為其應(yīng)用于免疫佐劑奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】A61P35-00, A61K39-39, A61K39-00, A61P31-00, A61P33-00, A61P31-04, A61P37-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104784687
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510201954
【發(fā)明人】王宜強(qiáng), 沈瑩, 唐華, 邵聯(lián)波
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 泰山醫(yī)學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月27日