含有vegf特異性表位和/或血管生成素-2特異性表位的dna疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對于癌癥治療或預(yù)防有效的DNA疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 對于腫瘤長大，依賴腫瘤的生長，需要增加將營養(yǎng)素和氧遞送至腫瘤的血管。腫瘤 細(xì)胞被視為通過經(jīng)由自身分泌血管生長因子來誘導(dǎo)腫瘤血管的血管生成，所述血管生長因 子刺激附近血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。因此，已嘗試通過抑制血管生長因子的功能且壓制 腫瘤血管生成來治療或預(yù)防腫瘤。作為此類方法之一，靶向腫瘤血管生成相關(guān)因子的疫苗 療法已受到關(guān)注。在疫苗療法中，癌癥通過下述得到治療或預(yù)防：將腫瘤血管生成相關(guān)因 子、包含在所述因子中的表位或編碼它們的表達(dá)載體施用于癌癥患者或具有發(fā)展癌癥的危 險(xiǎn)的靶標(biāo)，從而在患者體內(nèi)誘導(dǎo)針對腫瘤血管生成相關(guān)因子的抗體，從而中和所述因子的 功能且壓制腫瘤血管生成。作為腫瘤血管生成相關(guān)因子，多種因子例如VEGF、血管生成素、 FGF、I3DGF等是已知的。
[0003] 例如，專利文件1公開了通過施用編碼VEGF受體-UVEGF受體-2或Flk-I的DNA 疫苗，來抑制腫瘤微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、預(yù)防血管生成且抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的 方法。
[0004] 專利文件2描述了通過使用異源VEGF疫苗來壓制血管生成相關(guān)疾病，特別是癌癥 的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
[0005] 然而，對諸如VEGF等因子的免疫耐受性一般已建立，因?yàn)檫@些因子是患者的自身 組分。因此，即使當(dāng)這些因子或其部分肽直接施用于患者時(shí)，也難以在患者體內(nèi)有效誘導(dǎo)針 對這些因子的抗體。因而，需要一些技術(shù)構(gòu)思以使得患者的免疫系統(tǒng)識別這些自身抗原，從 而誘導(dǎo)其抗體的產(chǎn)生。
[0006] 乙型肝炎病毒核心（HBc)抗原蛋白質(zhì)通過自裝配構(gòu)成球形核心顆粒。核心顆粒具 有極高免疫原性。當(dāng)使用通過將所需表位插入在HBc抗原蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)內(nèi)，或?qū)⑺?表位連接至HBc抗原蛋白質(zhì)的末端而獲得的融合多肽時(shí)，表位呈現(xiàn)于通過自裝配形成的顆 粒的表面上。使用融合多肽，插入的表位容易由免疫系統(tǒng)識別，并且可以有效地誘導(dǎo)識別所 述表位的抗體的產(chǎn)生。因此，即使抗原難以由免疫系統(tǒng)識別，已嘗試?yán)肏Bc抗原蛋白質(zhì)作 為疫苗平臺，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生（非專利文件1，非專利文件2)。
[0007] 專利文件3公開了由含有具有表位的外源氨基酸序列的嵌合HBc抗原蛋白質(zhì)組成 的顆粒，其中所述外源氨基酸序列插入在HBc抗原的氨基酸殘基80-81之間。
[0008] 然而，用于腫瘤血管生成相關(guān)因子的疫苗的有效性并非充分令人滿意。
[0009] [文件列表]
[專利文件] 專利文件 I :JP-A-2005-519092 專利文件2 :中國專利公開號1406629 專利文件 3 :JP-B-3228737 [非專利文件] 非專利文件 1:D. C. Whitacre等人，Expert Rev. Vaccines，第8卷，no. 11，1565_1573 頁，2009 非專利文件 2 :Β· E. Clarke 等人，Nature，第 330 卷，381-384 頁，1987。
[0010] 發(fā)明概述 待由本發(fā)明解決的問題 如專利文件1中所述，當(dāng)VEGF受體用作疫苗抗原時(shí)，因?yàn)榇ㄟ^疫苗攻擊的靶標(biāo)變成 表達(dá)VEGF受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞或一部分的癌細(xì)胞，所以通過經(jīng)由增強(qiáng)細(xì)胞毒性免疫壓制 腫瘤中的血管生成而顯示出抗腫瘤效應(yīng)。然而，因?yàn)閂EGF受體不僅在腫瘤組織的新生血管 內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，還在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，所以當(dāng)VEGF受體用作疫苗抗原時(shí)，可以 對正常血管功能發(fā)揮不利影響。
[0011] 相應(yīng)地，本發(fā)明旨在提供用于癌癥治療或預(yù)防的更好的疫苗，其靶向腫瘤血管生 成相關(guān)因子且對正常血管功能具有降低的不利影響的危險(xiǎn)。
[0012] 解決問題的方法 本發(fā)明人已進(jìn)行深入研宄，且發(fā)現(xiàn)嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表達(dá)載體的施用 主要誘導(dǎo)對體液因子的體液免疫，所述嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽通過將體液因子例 如VEGF和血管生成素-2的特異性表位插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸殘基80 和81之間獲得，并且通過有效壓制腫瘤血管生成，同時(shí)避免通過細(xì)胞介導(dǎo)的免疫對正常血 管功能的不利影響，而能夠治療或預(yù)防癌癥?；谶@些發(fā)現(xiàn)，他們已進(jìn)一步研宄且完成本發(fā) 明。
[0013] SP，本發(fā)明涉及下述。
[0014] [1]用于癌癥的治療或預(yù)防試劑，其包含編碼由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝 炎病毒核心抗原多肽的表達(dá)載體，所述氨基酸序列包含VEGF的特異性表位和/或血管生成 素-2的特異性表位，其中包含特異性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗 原多肽的氨基酸殘基80和81之間。
[0015] [2] [1]的治療或預(yù)防試劑，其中所述癌癥是實(shí)體瘤。
[0016] [3] [1]或[2]的治療或預(yù)防試劑，其中所述實(shí)體瘤是選自下述的任一種：非小 細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌和前列腺癌。
[0017] [4] [1] - [3]中任一項(xiàng)的治療或預(yù)防試劑，其中所述插入的氨基酸序列包含 SEQ ID NO :1或2中所示的氨基酸序列。
[0018] [5] [1] - [3]中任一項(xiàng)的治療或預(yù)防試劑，其中所述插入的氨基酸序列包含 SEQ ID NO :31、32或33中所示的氨基酸序列，SEQ ID NO :32中所示的氨基酸序列的部分 序列，其包含SEQ ID NO :1或31中所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO :33中所示的氨基酸序 列的部分序列，其包含SEQ ID NO :2或31中所示的氨基酸序列。
[0019] [6] [1] - [3]中任一項(xiàng)的治療或預(yù)防試劑，其中所述插入的氨基酸序列包含 SEQ ID NO :3或4中所示的氨基酸序列。
[0020] [7] [1] - [6]中任一項(xiàng)的治療或預(yù)防試劑，其中所述插入的氨基酸序列進(jìn)一步 包含一種或多種特異性表位。
[0021] [8] [1] - [7]中任一項(xiàng)的治療或預(yù)防試劑，其多次施用。
[0022] [9] [8]的治療或預(yù)防試劑，其中所述施用次數(shù)為2、3或4次。
[0023] [10] [9]的治療或預(yù)防試劑，其中所述施用次數(shù)為3次。
[0024] [11] [1] - [10]中任一項(xiàng)的治療或預(yù)防試劑，其以半年間隔施用3次。
[0025] [12]編碼由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表達(dá)載體，所 述氨基酸序列包含VEGF的特異性表位和/或血管生成素-2的特異性表位，所述表達(dá)載體 用于癌癥的治療或預(yù)防，其中包含特異性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心 抗原多肽的氨基酸殘基80和81之間。
[0026] [13]編碼由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表達(dá)載體，所 述氨基酸序列包含由SEQ ID NO :1或2顯示的氨基酸序列，所述表達(dá)載體用于非小細(xì)胞肺 癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌或前列腺癌的治療或預(yù)防，其中所述氨基酸 序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸殘基80和81之間。
[0027] [14]編碼由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多肽的表達(dá)載體，所 述氨基酸序列包含由SEQ ID NO :3或4顯示的氨基酸序列，所述表達(dá)載體用于非小細(xì)胞肺 癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宮癌或前列腺癌的治療或改善，其中所述氨基酸 序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸殘基80和81之間。
[0028] [15] [12] - [14]中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中所述插入的氨基酸序列進(jìn)一步包 含一種或多種特異性表位。
[0029] [16]用于治療或預(yù)防哺乳動物中的癌癥的方法，其包括給所述哺乳動物施用有 效量的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體編碼由氨基酸序列插入的嵌合乙型肝炎病毒核心抗原多 肽，所述氨基酸序列包含VEGF的特異性表位和/或血管生成素-2的特異性表位，其中包含 特異性表位的所述氨基酸序列插入在乙型肝炎病毒核心抗原多肽的氨基酸殘基80和81之 間。
[0030] 發(fā)明效果 本發(fā)明提供了用于癌癥治療或預(yù)防的更好的疫苗，其靶向腫瘤血管生成相關(guān)因子且對 正常血管功能具有降低的不利影響的危險(xiǎn)。
[0031] 因?yàn)楸景l(fā)明的疫苗主要誘導(dǎo)對體液因子例如VEGF和血管生成素-2的體液免疫， 而不是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，所以可以降低細(xì)胞介導(dǎo)的免疫對正常血管功能的不利影響的危 險(xiǎn)。
[0032] 此外，因?yàn)閂EGF和血管生成素-2是分泌蛋白質(zhì)，所以不易發(fā)生組織炎癥，因?yàn)橥?過疫苗接種誘導(dǎo)的抗體主要與血液中的分泌蛋白質(zhì)結(jié)合。
[0033] 附圖簡述 圖1顯示了疫苗接種對腫瘤組織生長的影響?？v軸顯示腫瘤組織的體積，并且橫軸顯 示腫瘤注射后的天數(shù)。
[0034] 圖2顯示了疫苗接種對注射有腫瘤的小鼠的存活率的影響?？v軸顯示存活率，并 且橫軸顯示腫瘤注射后的天數(shù)。
[0035] 圖3顯示了在VEGF-貝伐珠單抗界面處的框架殘基。紅色：在與貝伐珠單抗的結(jié) 合表面中的殘基。黃色：紅色中尤其重要的殘基。藍(lán)色：與VEGFR-I的結(jié)合表面中的殘基。 綠色，與VEGFR-2的結(jié)合表面中的殘基。每個殘基由單字母代碼表示。
[0036] 圖4顯示了 DNA疫苗接種的時(shí)間過程。疫苗接種最初使用6周齡小鼠（Ow)執(zhí)行， 并且隨后的疫苗接種在第一次疫苗接種后2、4和8周時(shí)給予。
[0037] 圖5顯示了在16周時(shí)的抗VEGF抗體滴度。VEGF的總IgG滴度在來自分別用 HBc-mVEGF (7 a. a.)、HBc-mVEGF (13 a. a.)、HBc-mVEGF (17 a. a.)或 HBc 免疫接種的小 鼠的小鼠血清（100稀釋度）中進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)為平均值土S.E. Μ。
[0038] 圖6顯示了疫苗的質(zhì)粒DNA構(gòu)建。（a) pcDNA3. I-HBc (對照載體）和 pc