一種1,2,4-三嗪并嘧啶二酮類(lèi)化合物作為hCBS酶抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種hCBS酶抑制劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體內(nèi)源性的H2S氣體分子參與并調(diào)控很多生理和病理過(guò)程，為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路的調(diào)控分子。在結(jié)腸癌、神經(jīng)退行性疾病、缺血性中風(fēng)、低血壓、高血壓和胰腺炎等很多 病理?xiàng)l件下，內(nèi)源性H 2S含量都發(fā)現(xiàn)有異常變化。因此，目前需要內(nèi)源性H2S信號(hào)的特異抑 制劑或激活劑作為分子探針工具去進(jìn)一步闡述H 2S的生理功能，和治療與H2S-相關(guān)的疾病 的小分子藥物先導(dǎo)物。
[0003] CBS (cystathionine β-synthase,胱硫醚-β -合成酶）是一種 PLP-依賴(lài)型（ρ yridoxal-5' -phosphate-dependent)酶，即維生素 B6依賴(lài)型酶。在人體內(nèi)，CBS催化底物 L-半胱氨酸（Cysteine)和L-同型半胱氨酸（L-Homocysteine)產(chǎn)生內(nèi)源性H2S氣體。在 循環(huán)休克、中風(fēng)、唐氏綜合癥和癌癥病人或模型動(dòng)物的體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)過(guò)量的H 2S和/或CBS活 性的增強(qiáng)，因此，hCBS (human CBS)已經(jīng)被認(rèn)為是治療循環(huán)休克、中風(fēng)、唐氏綜合癥以及腫 瘤等與H2S相關(guān)的疾病的潛在靶標(biāo)。
[0004] 已知的hCBS小分子抑制劑，不僅與酶的結(jié)合力弱而且選擇性也很低，因?yàn)樗麄儗?duì) 其它維生素 B6-依賴(lài)型酶也有抑制作用。因此，急需篩選出特異性的hCBS抑制劑，可作為 "工具藥"去證實(shí)已發(fā)現(xiàn)的H 2S的生物學(xué)效應(yīng)和信號(hào)通路作用，同時(shí)也可作為藥物研發(fā)的先 導(dǎo)化合物。
[0005] 目前，酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)主要通過(guò)兩種方法，即生物篩選和合理藥物設(shè)計(jì)?；诎悬c(diǎn) 的合理藥物設(shè)計(jì)就是通過(guò)對(duì)藥物作用的靶點(diǎn)進(jìn)行研究，找到新的、合適的藥物來(lái)治療某些 疾病。發(fā)現(xiàn)一個(gè)的靶點(diǎn)往往就能設(shè)計(jì)出一類(lèi)新藥，在新藥研究領(lǐng)域也是極受重視的。
[0006] 深入認(rèn)識(shí)酶結(jié)構(gòu)，特別是當(dāng)它與特異性抑制劑復(fù)合時(shí)的結(jié)構(gòu)，將會(huì)產(chǎn)生一種鑒定 該酶中結(jié)合位點(diǎn)的方法，并獲得酶/抑制劑復(fù)合物以及該酶中敏感殘基的構(gòu)象，這些知識(shí) 對(duì)藥物設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法來(lái)講都是至關(guān)重要的。
[0007] hCBS純酶3D晶體結(jié)構(gòu)已被報(bào)道，這為其靶向抑制劑的設(shè)計(jì)提供了一定的結(jié)構(gòu)基 礎(chǔ)，但是與底物-結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基還不清楚。
[0008] 因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于研究hCBS酶促反應(yīng)的抑制劑以及這種抑制劑作 為研究治療循環(huán)休克、中風(fēng)、唐氏綜合癥和腫瘤等與H 2S相關(guān)的疾病的藥物的先導(dǎo)化合物的 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明中所用縮寫(xiě)如下：
[0010] hCBS 指人源胱硫醚-β -合成酶，即 human cystathionine β -synthase ;
[0011] 0丁咄指5,5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸)，即5,5'-0行111〇1^8-(2-11行1'(*61^〇1。 acid)；
[0012] Tris-HCl 指三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽，即 Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride；
[0013] EDTA 指乙二胺四乙酸，即 Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ;
[0014] L-Cys 指 L-半胱氨酸，即 L-Cysteine ;
[0015] D, L-HCys 指 D, L-同型半胱:氛酸，即 D, L-Homocysteine ;
[0016] SAM 指 S-腺苷甲硫氨酸，即 S-adenosyl methionine ;
[0017] PLP 指憐酸批咳醒，即 pyridoxal-5' -phosphate ;
[0018] HepG2 細(xì)胞指人肝癌細(xì)胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0019] 1，6-二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮，即 I, 6-dimethylpyrimido [5, 4-e] [I, 2, 4] triazine-5, 7 (1H, 6H)-dione ；
[0020] 1,6-二甲基-3-苯基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(1!1，6!1)-嘧啶二酮，即1，6-(1 imethyl-3-phenylpyrimido[5, 4-e][I, 2, 4]triazine-5, 7(1H, 6H)-di one ；
[0021] 6-甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮，即 6_methylpyrimido[5, 4_e] [1，2, 4]triazine_5, 7(1H，6H)_dione〇
[0022] 蝶啶-2,4(3H，8H)-二酮，即 pteridine-2, 4(3H, 8H)-dione。
[0023] HepG2 細(xì)胞指人肝癌細(xì)胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0024] 本發(fā)明中用 Compd.2 指代 1，6-二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-. 啶二酮；
[0025] 用 Compd.5 指代 1，6-二甲基-3-苯基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-. 啶二酮；
[0026] 用 Compd 6 指代 6 -甲基[1，2, 4 [三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)_ 嘧啶二酮；
[0027] 用 Compd. 7 指代蝶啶-2, 4 (3H，8H)-二酮。
[0028] 本發(fā)明中所提到的酶促反應(yīng)容器能夠容納H2S氣體檢測(cè)容器，即氣體檢測(cè)容器能 夠置入酶促反應(yīng)容器中，以使酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H 2S氣體能夠全部擴(kuò)散進(jìn)入檢測(cè)體系。
[0029] 本發(fā)明公開(kāi)了一種1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮類(lèi)化合物作為hCBS酶抑制劑的應(yīng)用， 該化合物是1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮，結(jié)構(gòu)式如（I)所 不，分子量191. 19。
[0030]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮類(lèi)化合物作為hCBS酶抑制劑的應(yīng)用，該化合物是 1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(111，611)-嘧啶二酮，結(jié)構(gòu)如式（1)所示，分子量 193. 16 ：
2. -種抑制離體hCBS酶促反應(yīng)的方法，其步驟如下： 步驟一、配制緩沖溶液：在酶促反應(yīng)容器中配置Tris-HCl濃度為50mM，PLP濃度為 100iiM，hCBS-413濃度為50-500nM，L-Cys濃度為4mM，D,L-HCys濃度為4mM的去離子水溶 液，pH為 7. 6-9. 0 ; 步驟二、配制酶促反應(yīng)混合液：將化合物1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)_嘧啶二酮分別加入到步驟一所配制的緩沖溶液中，配制成不同濃度 的酶促反應(yīng)混合液，形成酶促反應(yīng)體系； 步驟三、配制H2S氣體檢測(cè)體系： 在H2S氣體檢測(cè)容器中，加入50yL的DTNB溶液，所述DTNB溶液為：DTNB濃度為 300iiM，Tris-HCl濃度為262mM，EDTA濃度為13mM，pH=8. 9的去離子水溶液，形成H2S氣體 檢測(cè)體系，將氣體檢測(cè)容器置入酶促反應(yīng)容器中，以使酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2S氣體能夠擴(kuò)散進(jìn) 入氣體檢測(cè)體系； 步驟四、孵育過(guò)程： 用封板膜密封酶促反應(yīng)容器，在37°C下孵育60分鐘； 步驟五、化合物1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(111，611)-嘧啶二酮作為hCBS抑制劑應(yīng)用效果的檢測(cè)： 在酶標(biāo)儀上測(cè)定H2S氣體檢測(cè)體系在413nm下的光吸收。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，步驟一中所述pH=8. 6。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，步驟一中所述hCBS-413濃度為100nM。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，步驟二中所述化合物1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的濃度為 0-400iiM。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，步驟二中所述化合物1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的濃度為 12iiM。
7. -種抑制細(xì)胞內(nèi)hCBS酶抑制劑的方法，其步驟如下： 步驟一、將人源H印G2培養(yǎng)在由氨基酸營(yíng)養(yǎng)液中孵育一天后，將化合物1，6-二甲基 [1，2, 4]三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮加入到所述氨基酸營(yíng)養(yǎng)液中，進(jìn)行共孵育； 然后，用冷的Tris-HCl緩沖液將細(xì)胞洗滌兩次，并用細(xì)胞刮刷收集；收集的細(xì)胞在裂解緩 沖液中，先用液氮冷凍，然后在37°C下解凍2分鐘，此冷凍、解凍操作重復(fù)3次；之后，裂解 液在轉(zhuǎn)離心機(jī)上離心1小時(shí)后，收集上層清液。作為H印G2細(xì)胞溶液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；所述 Tris-HCl緩沖液的濃度為50mM，pH=8. 6 ; 步驟二、在酶促反應(yīng)容器中加入步驟一中得到的H印G2細(xì)胞溶液，然后加入PLP濃度為 100iiM、SAM濃度為200iiM的去離子水溶液20iiL和L-Cys濃度為4mM、D,L-HCys濃度為 4mM的去離子水溶液； 步驟三、配制H2S氣體檢測(cè)體系： 在H2S氣體檢測(cè)容器中，加入50yL的DTNB溶液，所述DTNB溶液為：DTNB濃度為 300iiM，Tris-HCl濃度為262mM，EDTA濃度為13mM，pH=8. 9的去離子水溶液，形成H2S氣體 檢測(cè)體系；將氣體檢測(cè)容器置入酶促反應(yīng)容器中，以使酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2S氣體能夠擴(kuò)散進(jìn) 入氣體檢測(cè)體系； 步驟四、孵育過(guò)程： 用封板膜密封酶促反應(yīng)容器，在37°C下孵育60分鐘； 步驟五、化合物1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮作為細(xì) 胞內(nèi)hCBS酶抑制劑應(yīng)用效果的檢測(cè)： 在酶標(biāo)儀上測(cè)定H2S氣體檢測(cè)體系在413nm下的光吸收。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，步驟一中加入的1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的最終濃度 10iiM、1iiM、0. 1iiM或 0? 05iiM。
9. 一種如權(quán)利要求1所述的1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮類(lèi)化合物在治療循環(huán)休克、中風(fēng)、 唐氏綜合癥和腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種1,2,4-三嗪并嘧啶二酮類(lèi)化合物作為hCBS酶抑制劑的應(yīng)用，具體涉及化合物1,6–二甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(1H，6H)-嘧啶二酮作為hCBS酶抑制劑的應(yīng)用。該小分子化合物對(duì)離體hCBS酶促反應(yīng)的IC50為12μM，可以作為研究H2S信號(hào)通路的工具藥，以及開(kāi)發(fā)治療循環(huán)休克、中風(fēng)、唐氏綜合癥和腫瘤等與H2S相關(guān)的疾病的藥物的先導(dǎo)化合物。
【IPC分類(lèi)】A61K31-53, A61P9-00, C12Q1-527, A61P9-10, A61P35-00, C12Q1-02, A61P25-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104546860
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310466969
【發(fā)明人】吳方, 周越洋, 于晶
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月9日