專利名稱：：逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種傳遞系統(tǒng)，尤其是，本發(fā)明涉及到一種能傳遞目的核苷酸序列(下文縮寫成NOI)或者甚至是大量的NOI到目的位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。更具體而言，本發(fā)明涉及一種用于基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?；蛑委煱ㄒ韵氯我环N或多種在一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)如靶細(xì)胞中添加、取代、缺失、補(bǔ)充、操作一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。假如靶位點(diǎn)是靶細(xì)胞，那么這種細(xì)胞也許是組織或器官的一部分。關(guān)于基因治療的一般教導(dǎo)可參見《分子生物學(xué)》(EdRobertMeyersPubVCH，如556-558頁)。作為更進(jìn)一步的例子，基因治療也提供一種手段來實(shí)現(xiàn)以下的任一種或多種效果一段核苷酸序列如一個(gè)基因能被應(yīng)用到取代或補(bǔ)充一個(gè)缺陷基因；一個(gè)致病基因或基因產(chǎn)物能被除去；一個(gè)新的基因可以被添加以創(chuàng)造一個(gè)有利的表型；細(xì)胞能被在分子水平上操作以治療癌癥(Schmidt-WolfandSchmidt-Wolf,1994AnnalsofHematology69:273-279)或其它情況疾病--如免疫病，心血管病，神經(jīng)性疾病，炎癥或感染疾患；抗原能被操作和/或?qū)胍砸鹈庖邞?yīng)答反應(yīng)--如遺傳接種。近年來，逆轉(zhuǎn)錄病毒已被建議用于基因治療。本質(zhì)上逆轉(zhuǎn)錄病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。關(guān)于這一點(diǎn)，當(dāng)一種逆轉(zhuǎn)錄病毒感染一種細(xì)胞時(shí)，它的基因組被轉(zhuǎn)變成DNA形式。換言之，逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種感染實(shí)體，該感染實(shí)體通過DNA中間進(jìn)行復(fù)制。有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的更詳細(xì)描述見后。有許多逆轉(zhuǎn)錄病毒，其實(shí)例包括鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺損病毒(HIV)，馬感染性貧血病毒(EIAV)，鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)，Rous氏肉瘤病毒(RSV)，藤浪氏肉瘤病毒(FUSV)，Moloney氏鼠白血病病毒(Mo-MSV),FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV),Moloney氏鼠肉瘤病毒(Mo-MSV),Abelson氏鼠白血病病毒(A-MLV)，禽髓細(xì)胞組織增生病毒-29(MC-29)和禽成紅細(xì)胞增多癥病毒(AEV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)列表可以在Colfin等中找到(“逆轉(zhuǎn)錄病毒”1997冷泉港實(shí)驗(yàn)室編輯出版JMColfin,SMHaghes,HEVarmus頁758-763)關(guān)于一些逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述可以在現(xiàn)有技術(shù)中找到，例如，關(guān)于HIV的詳細(xì)描述可以從NCBI基因庫中找到(即基因組入藏號(hào)Afo33819)。所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒含有g(shù)ag、pol、env三個(gè)主要的編碼域，它們編碼必需的病毒粒子蛋白。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒可被廣義地劃分為兩大類即“簡單的”和“復(fù)雜的”。通過它們的基因組結(jié)構(gòu)可顯著地區(qū)分這些類別。簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒常常只攜帶這些基本的信息。相反，復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒也編碼來源于多樣化剪接信息的額外調(diào)節(jié)蛋白。逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)一步可以細(xì)分為七個(gè)群。這些群中的5個(gè)是有致癌潛力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。剩下的兩群是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的綜述發(fā)表于“逆轉(zhuǎn)錄病毒”(1997冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，編輯JMCoffinSMHughes,HEVarmus頁1-25)。除人類T細(xì)胞白血病病毒-牛白血病病毒(HIV-BLV)外，所有的致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒都是簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒。HTLV,BLV和慢病毒及泡沫病毒是復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒。一些研究最充分的逆轉(zhuǎn)錄病毒是Rous氏肉瘤病毒(RSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)和鼠白血病病毒(MLV)及人類T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)。慢病毒群甚至可被細(xì)分為“靈長動(dòng)物類”和“非靈長動(dòng)物類”慢病毒。靈長動(dòng)物類慢病毒的實(shí)例包括人類免疫缺損病毒(HIV)及猿免疫缺損病毒(SIV)，其中HIV為人類自身免疫缺損綜合征(AIDS)的病原因子。非靈長類動(dòng)物慢病毒群包括原型“慢病毒”綿羊髓鞘脫落病毒(VMV)，以及相關(guān)的山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)，馬感染性貧血病毒(EIAV)和最近被描述的貓免疫缺損病毒(FIV)及牛免疫缺損病毒(BIV)。慢病毒家族與其它類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒的關(guān)鍵區(qū)別在于慢病毒有能力感染分裂和非分裂細(xì)胞(Lewis等1992EMBOJ.11:3053-3058，LewisandEmerman1994“病毒學(xué)雜志”68:510-516)。相反，其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒如MLV不能感染非分裂細(xì)胞如組成肌肉、大腦、肺和肝組織的細(xì)胞。在感染的過程中，逆轉(zhuǎn)錄病毒首先吸咐到特定細(xì)胞表面受體上。一旦進(jìn)入可感病的宿主細(xì)胞，然后逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA基因組通過親本病毒攜帶進(jìn)的病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制成DNA。這種DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞核，隨即整合進(jìn)宿主基因組。在這一時(shí)期，其一般被稱為前病毒。前病毒在細(xì)胞分裂期間在宿主染色體組中是穩(wěn)定的并象其它細(xì)胞蛋白一樣被轉(zhuǎn)錄。前病毒編碼形成更多病毒所需要的蛋白和包裝機(jī)構(gòu)，所形成的病毒能以有時(shí)稱為“出芽”的過程離開細(xì)胞。象已說明的一樣，每一種逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括gag、pol、env基因，它們編碼病毒粒子蛋白和酶。這些基因位于長末端重復(fù)序列(LTR)的兩側(cè)。長末端重復(fù)序列(LTR)負(fù)責(zé)前病毒的整合和轉(zhuǎn)錄。它們也作為增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列。換言之，長末端重復(fù)序列能控制病毒基因的表達(dá)。通過位于病毒基因組5’端的psi序列的效能使逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA被包囊。長末端重復(fù)序列本身是能被劃分成三個(gè)元件的相同序列，它們分別叫做U3、R和U5。U3來自于RNA3’末端的獨(dú)特序列。R來自于RNA兩端的重復(fù)序列，U5來自于RNA5’末端的獨(dú)特序列。不同逆轉(zhuǎn)錄病毒之間的三個(gè)元件的大小可顯著不同。為了容易理解，一個(gè)簡單的顯示長末端重復(fù)序列、gag、pol和env的基本特征的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的通用圖譜(不按比例)被顯示于圖6。對(duì)于病毒的基因組，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在長末端重復(fù)序列左邊的U3與R之間的范圍(如圖6所示)，且Poly(A)添加的位點(diǎn)(終端)是在長末端重復(fù)序列右邊的R與U5之間的邊界(如圖6所示)。U3含有大多數(shù)前病毒轉(zhuǎn)錄控制元件，包括啟應(yīng)答于細(xì)胞和在某些情況下應(yīng)答于病毒轉(zhuǎn)錄激活代表的啟動(dòng)子和多個(gè)增強(qiáng)子序列。一些逆轉(zhuǎn)錄病毒含tat,rev,tax和rex中的一種或多種基因，這些基因編碼涉及到基因表達(dá)的調(diào)控的蛋白。關(guān)于結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env、gag編碼病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白。Gag蛋白水解成成熟的蛋白MA(基質(zhì))，CA(衣殼)，NC(核衣殼)。基因pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)，該酶包括兩種DNA聚合酶，和伴隨的RnaseH活性及整合酶(IN)，介導(dǎo)基因組的復(fù)制?；騟nv編碼病毒粒子的表面糖蛋白及跨膜蛋白，它們形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物專一性地與細(xì)胞受體蛋白相互作用。這種作用最后導(dǎo)致病毒膜與細(xì)胞膜融合。逆轉(zhuǎn)錄病毒的被膜糖蛋白復(fù)合物包括兩種多肽一種外部的糖基化的親水多肽(SU)和一種跨膜蛋白(TM)。在病毒粒子的表面上它們一起形成一種寡聚物的“隆起”或“隆起的刺突”。這兩種多肽由env基因編碼并以多聚蛋白的前體形式合成，這種前體在轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的過程中被水解切斷成兩部分。盡管末切斷的Env蛋白能結(jié)合到受體上，但這種自身的切斷事件對(duì)于激活蛋白的潛在的融合是必需的，這種融合對(duì)于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是必需的。典型的SU和TM蛋白都在多個(gè)位點(diǎn)被糖基化。但是在一些病毒中，以MLV為例，TM不被糖基化。盡管SU和TM蛋白對(duì)于被膜病毒粒子的裝配不一定是必需的，但它們在進(jìn)入過程中起著重要作用。因而SU域結(jié)合至在靶細(xì)胞表面的受體分子--常是一種專一受體分子。這種結(jié)合事件被相信是激活了TM蛋白誘導(dǎo)膜融合的潛力，此后病毒和細(xì)胞膜融合。在一些病毒特別是MLV中，一種導(dǎo)致TM的胞質(zhì)尾的較短部分的除去的斷裂事件被認(rèn)為在揭示蛋白的完全融合活性中起著關(guān)鍵作用(Brody等1994，“病毒學(xué)雜志”68:4620-4627Rein等1994“病毒學(xué)雜志”68:1773-1781)。這種遠(yuǎn)離TM跨膜部分的胞質(zhì)“尾”保留在病毒膜內(nèi)側(cè)，并且在不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒中它的長度顯著不同。SU/受體相互作用的專一性能限定逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍和組織趨性。在某些情況下，這種專一性可限制重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)潛力。由于這種原因，許多基因治療試驗(yàn)已用MLV進(jìn)行。已知一種含有叫做4070A的被膜蛋白的特定MLV是一種兼嗜性病毒，并且由于它的被膜蛋白“?？俊比撕褪笾g保守的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使得它也能感染人類細(xì)胞。由于這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是廣泛存在的，所以這些病毒能感染許多細(xì)胞類型。但在某種情況下，尤其是從安全的角度出發(fā)，專一性地靶向限制細(xì)胞也許是有益的。為此，幾個(gè)研究組已構(gòu)建了一種小鼠親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒以專一性地感染特定人細(xì)胞，該病毒不象它的兼嗜性近親，通常僅感染小鼠細(xì)胞。用促紅細(xì)胞生成素區(qū)段取代被膜蛋白的一個(gè)片段產(chǎn)生一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，其能專一性地結(jié)合表面表達(dá)有促紅細(xì)胞生成素受體的人細(xì)胞，如紅細(xì)胞前體(MaulikandPatel1997MolecularBiotechnoloy:TherapeuficApplicationsandStrategies1997Wiley--LissInc頁45).除了gag、pol和env基因之外，復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒也含有編碼附屬或輔助蛋白的“附屬”基因。附屬或輔助蛋白被定義為除通常的復(fù)制或結(jié)構(gòu)基因gagpol和env編碼的蛋白外由附屬基因編碼的那些蛋白。這些附屬蛋白不同于那些涉及到基因表達(dá)調(diào)控的蛋白，如那些由tat、rev、tax和rex編碼的蛋白。附屬基因的實(shí)例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一個(gè)或多個(gè)，這些附屬基因能在例如HIV中找到(參見例如，頁802和803，RetrovirusesEdCoffinetalPubCSHL1997)。非必需附屬蛋白可在特殊的細(xì)胞類型中發(fā)揮功能，提供至少部分重復(fù)地由細(xì)胞蛋白提供的功能。一般，附屬基因位于pol和env之間，剛好位于env的下游，包括LTR的U3區(qū)或env的重疊部分或兩者。復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒已自然演進(jìn)了調(diào)控機(jī)制，其利用病毒編碼的轉(zhuǎn)錄激活物以及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。這些反式作用的病毒蛋白可用作由LTR指導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄的激活物。慢病毒的轉(zhuǎn)錄反式激活物由病毒的tat基因編碼。Tat蛋白結(jié)合至一個(gè)穩(wěn)定的RNA莖-環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)稱之TAR，它的一個(gè)功能是表觀上優(yōu)化Tat蛋白定位于反式激活轉(zhuǎn)錄。如前所述，逆轉(zhuǎn)錄病毒已被建議作為一種傳遞系統(tǒng)(其它表達(dá)方式如傳遞工具或傳遞載體)用于轉(zhuǎn)移NOI或大量的NOI至一個(gè)或多個(gè)目的位點(diǎn)。這種轉(zhuǎn)移可發(fā)生在體外，來自體內(nèi)或在體內(nèi)或其組合。當(dāng)用于這種方式時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄病毒一般稱作逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被利用來研究逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的不同方面，包括受體使用，逆轉(zhuǎn)錄及RNA包裝(有關(guān)綜述見Miller1992CurrTopMicrobielImmunol158:1-24)。在用于基因治療的一個(gè)典型的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，至少部分的一個(gè)或多個(gè)gag、pol和env蛋白編碼區(qū)可以從病毒中除去。這使得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體復(fù)制缺餡。為了使生成的病毒能整合它的基因組到宿主細(xì)胞的基因組去，除去的部分甚至可以用NOI取代，但是，其中這種修改過的病毒基因組由于結(jié)構(gòu)蛋白的缺乏而不能自我復(fù)制。當(dāng)整合進(jìn)宿主基因組時(shí)，NOI的表達(dá)導(dǎo)致例如治療效應(yīng)的產(chǎn)生。因此，轉(zhuǎn)移NOI至目標(biāo)部位一般通過以下方式完成使NOI整合進(jìn)重組病毒載體；將修飾過的病毒載體包裝進(jìn)病毒粒子外殼；并且使其轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)部位如靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群。通過用包裝或輔助細(xì)胞系和重組載體的結(jié)合，可以繁殖和分離大量的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如制備適合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的效價(jià))，以用于隨后的目標(biāo)部位轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些情況下，繁殖和分離可能需要逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env基因的分離并使它們分別引入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生一種“包裝細(xì)胞系”。這種包裝細(xì)胞系產(chǎn)生包裝逆轉(zhuǎn)錄DNA所需要的蛋白，但由于psi區(qū)域的缺乏導(dǎo)致它不能引起衣殼化。但是，當(dāng)攜帶NOI的重組載體和psi區(qū)域被引進(jìn)包裝細(xì)胞系時(shí)，助蛋白能包裝psi-陽性重組載體以產(chǎn)重組病毒原種。這種重組病毒原種能被用于感染細(xì)胞以導(dǎo)入NOI進(jìn)細(xì)胞的基因組。這種基因組缺乏所有形成病毒蛋白的必需基因的重組病毒只能感染而不能繁殖。因此NOI被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組而沒有生成有潛在危害的逆轉(zhuǎn)錄病毒?？捎玫陌b系的摘要發(fā)表于“逆轉(zhuǎn)錄病毒”(1997冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，編輯JMCoffin,SMHughes,HEVarmus499頁)。但是這種技術(shù)在某種意義上說是有問題的，即效價(jià)水平不總是在滿意水平。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的設(shè)計(jì)已發(fā)展到解決了輔助病毒的早期設(shè)計(jì)中經(jīng)常遇到的輔助病毒的自發(fā)產(chǎn)生的問題。由于同源重組極容易進(jìn)行，所以減少或消除載體和輔助者基因組之間的同源性已減少了輔助病毒產(chǎn)生的問題。最近，包裝細(xì)胞已經(jīng)得到發(fā)展，其中的gag,pol和env病毒基因的編碼區(qū)攜帶于單獨(dú)的表達(dá)質(zhì)粒上被獨(dú)立轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞系中，使得野生型病毒的產(chǎn)生需要三次重組。這個(gè)策略有時(shí)被稱為三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法(Soneokaetal1995Nucl.AcidsRes.23-628)。當(dāng)載體正在被改進(jìn)時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染也可用來測量載體的產(chǎn)量。關(guān)于這一點(diǎn)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染避免了生成穩(wěn)定生產(chǎn)載體的細(xì)胞系所需的較長時(shí)間，并且若載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝成分對(duì)細(xì)胞有毒可以利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用于生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的典型組成部分包括編碼Gag/Pol蛋白的質(zhì)粒，編碼Env蛋白的質(zhì)粒及含有一個(gè)NOI的質(zhì)粒。載體的生產(chǎn)涉及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一個(gè)或更多的這些組成部分到含有其它所需成分的細(xì)胞中去。如果載體編碼毒素基因或者干擾宿主細(xì)胞復(fù)制的基因，如細(xì)胞周期的抑制劑或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，產(chǎn)生能穩(wěn)定生產(chǎn)載體的細(xì)胞系可能會(huì)比較困難。但在細(xì)胞死亡之前，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可用于生產(chǎn)這種載體。同時(shí)，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，已經(jīng)發(fā)展了一些細(xì)胞系，其所產(chǎn)生的載體的效價(jià)與從穩(wěn)定的載體生產(chǎn)細(xì)胞系獲得的水平相當(dāng)(Pearetal,1993PNAS90:8392-8396)。鑒于一些HIV蛋白的毒性使得產(chǎn)生穩(wěn)定的基于HIV的包裝細(xì)胞相對(duì)困難，通常HIV載體通過載體和輔助病毒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來制得。有些研究者甚至已經(jīng)用水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白置換了HIV的Env蛋白。水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白的插入提高了載體的濃度，如具有5×105效價(jià)(濃縮后為108)的HIV/VSV-G載體已通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染得以生產(chǎn)(Naldinietal1996Science272:263-267)。因此HIV載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可能為高效價(jià)載體的生產(chǎn)提供了一個(gè)有用的策略(Yeee,etal1994,PNAS91:9564-9568)。然而，這種方法的一個(gè)缺陷就是VSV-G蛋白對(duì)細(xì)胞是相當(dāng)有毒的。用異源的env基因取代env基因是一種叫作假型化(Psendotyping)技術(shù)或策略的實(shí)例。假型化不是一種新現(xiàn)象，在WO-A-98/05759,WO-A-98/05754,WO-A-97/17457,WO-A-96/09400,WO-A-91/00047及Mebatsionetal1997Cell90,841-847中均可找到許多實(shí)例。假型化具有一個(gè)或更多的優(yōu)點(diǎn)。例如，就慢病毒載體來說，基于HIV的載體，其env基因產(chǎn)物會(huì)限制這些載體僅侵染表達(dá)CD4蛋白的細(xì)胞。但是如果這些載體中的env基因被其它RNA病毒的env序列取代，那么它們就有一個(gè)更廣的侵染譜(Verma和Somia1997Nature389:239-242)。如剛才所述并作為一個(gè)實(shí)例，研究者們已經(jīng)用水泡性口炎病毒的糖蛋白假型化了一種基于HIV的載體(Verma和Somia1997同上)。同樣，作為一個(gè)例子，逆轉(zhuǎn)錄病毒Env蛋白的相對(duì)易破壞性可能限制了濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的潛力，并且濃縮病毒可能會(huì)導(dǎo)致較低的病毒回收率。在某種程度上通過用更加穩(wěn)定的VSV-G蛋白取代逆轉(zhuǎn)錄病毒Env蛋白可以克服這一問題，這種VSV-G蛋白允許更加有效的濃縮而得到更好的產(chǎn)率(Naldinietal1996,Science272:263-267)。然而，利用VSV-G蛋白的假型化并不總是理想的。這是因?yàn)閂SV-G蛋白是細(xì)胞毒性的(Chenetal1996,Proc.Natl.Acad.Sci.1005及此文中的引用文獻(xiàn))。因此，需要找到?jīng)]有毒性且能用于逆轉(zhuǎn)錄病毒假型化的其它蛋白。因此，本發(fā)明試圖提供一種改進(jìn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靶位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中此逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)包括一段至少編碼部分被膜蛋白的第一核苷酸序列，及一個(gè)或更多其它從逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生而來的核苷酸序列以確保通過逆轉(zhuǎn)病毒傳遞系統(tǒng)的靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)；其中，第一核苷酸序列至少與其它核苷酸序列中的一個(gè)是異源的，并且第一核苷酸序列至少編碼部分的可以識(shí)別靶位點(diǎn)的狂犬病毒G蛋白或其突變體，變體，衍生物或片段。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)能包含一實(shí)體，或者說，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)包含很多實(shí)體，它們共同組合提供了本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)。這些病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于在Savardetal1997，“病毒學(xué)雜志”71(5):4111-4117；Fengetal1997,NatBiotechnol15(9):866-870；及英國專利申請(qǐng)9720465.5中描述的皰疹病毒和腺病毒的實(shí)例?！翱裳苌摹币辉~用其通常的意義，意思為此序列無需非得從逆轉(zhuǎn)錄病毒得來，而可從它衍生而來。作為一個(gè)例子，此序列可以通過合成或者重組DNA技術(shù)制備。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子，此病毒粒子可從本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄傳遞系統(tǒng)獲得。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是根據(jù)本發(fā)明第一方面的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或可由它而得到。根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種用根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或者根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子或者根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供一種用于藥物的根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或者根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子或者根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或者根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子或者根據(jù)本發(fā)明的病毒載體在制備傳遞NOI至所需靶位點(diǎn)的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的第七個(gè)方面，提供一種方法，包括讓一種細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或者根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子或者根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體接觸。根據(jù)本發(fā)明的第八個(gè)方面，提供一種載體以制備根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或者根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子或者根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中此載體包含一段核苷酸序列，該序列至少編碼狂犬病毒G蛋白或者其突變體，變體，衍生物或片段的部分。根據(jù)本發(fā)明的第九個(gè)方面，提供一種質(zhì)粒以制備根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或者根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子，或者根據(jù)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中此質(zhì)粒包含一段核苷酸序列，至少編碼狂犬病毒G蛋白或者其突變體，變體，衍生物或片段的部分。根據(jù)本發(fā)明的第十個(gè)方面，提供許多種質(zhì)粒，其中至少有一個(gè)質(zhì)粒是根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒，并且其中至少有一個(gè)另外的質(zhì)粒包含一個(gè)或更多的從一種逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生而來的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的第十一個(gè)方面，提供狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的用途，從而影響此逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的感染譜。根據(jù)本發(fā)明的第十二個(gè)方面，提供狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子的用途，從而影響該逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒粒子的宿主范圍和/或細(xì)胞嗜性。根據(jù)本發(fā)明的第十三個(gè)方面，提供一種用狂犬病毒G蛋白假型化的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子。根據(jù)本發(fā)明的第十四個(gè)方面，提供一種包括有異源env區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中此異源的env區(qū)域至少包含部分編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的第十五個(gè)方面，提供一種包括有異源env區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中此異源的env區(qū)域包含編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選，第一核苷酸序列編碼全部的狂犬病毒G蛋白或其突變體，變體，衍生物或片段。優(yōu)選，至少其它核苷酸序列之一是從一種慢病毒或一種致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生而來。優(yōu)選，其它核苷酸序列是從一種慢病毒或一種致癌逆轉(zhuǎn)錄衍生而來。優(yōu)選，其它核苷酸序列從MLV、HIV或EIAV衍生而來。優(yōu)選，此逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)至少包括一個(gè)NOI。優(yōu)選，此NOI有一種治療效應(yīng)或者編碼一種有治療效應(yīng)的蛋白。優(yōu)選，靶位點(diǎn)是一個(gè)細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供一種有異源被膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中是有用的。本發(fā)明的一個(gè)重要方面就是用一種編碼狂犬病毒蛋白，尤其是狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列來假型化一種逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或者一種基于此病毒或由此病毒衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。此處，“假型化”一詞的意思是將來源于其它病毒的一種蛋白整合進(jìn)一部分env基因，或者取代一部分env基因，或者取代病毒基因組中或者病毒載體中全部的env基因。有關(guān)狂犬病毒G蛋白及它的突變體的教導(dǎo)可從以下文獻(xiàn)獲得Roseetal.,1982“病毒學(xué)雜志”43:361-364,Hanhametal.,1993“病毒學(xué)雜志”67,530-542,Tuffereauetal.,1998“病毒學(xué)雜志”72,1085-1091,Kuceraetal.,1985J.Virol55,158-162,Dietzscholdetal.,1983PNAS80,70-74,Seifetal.,1985“病毒學(xué)雜志”53,926-934,Coulonetal.,1998“病毒學(xué)雜志”72,273-278,Tuffereauetal.,1998“病毒學(xué)雜志”72,1085-10910,Burgeretal.,1991“普通病毒學(xué)雜志”72.359-367,Gaudinetal1995“病毒學(xué)雜志”69,5528-5534,Benmansouretal1991“病毒學(xué)雜志”65,4198-4203,Luoetal1998“微生物免疫學(xué)”42,187-193,Coll1997“病毒學(xué)紀(jì)事”142,2089-2097,Luoetal1997“病毒研究”51,35-41,Luoetal1998“微生物免疫學(xué)”42,187-193,Coll1995“病毒學(xué)紀(jì)事”140,827-851,Tuchiyaetal1992“病毒研究”25,1-13,Morimotoetal1992“病毒學(xué)”189,203-216,Gaudinetal1992“病毒學(xué)”187,627-632,Whittetal1991“病毒學(xué)”185,681-688,Dietzscholdetal1978“普通病毒學(xué)雜志”40,131-139,Dietzscholdetal1978DevBiolStand40,45-55,Dietzscholdetal1977“病毒學(xué)雜志”23,286-293,andOtvosetal1994“生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)”1224,68-76。一種狂犬病毒G蛋白也可參見EP-A-0445625.使用本發(fā)明的狂犬病毒G蛋白提供了載體，這些載體可在體內(nèi)優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)狂犬病毒優(yōu)先感染的靶細(xì)胞。這特別包括體內(nèi)的神經(jīng)元靶細(xì)胞。作為一種以神經(jīng)元為靶的載體，從一種狂犬病病原毒株如ERA來的狂犬病毒G蛋白可能特別有效。另一方面，狂犬病毒G蛋白在體外具有很廣的靶細(xì)胞范圍，包括幾乎所有的已試驗(yàn)過的哺乳動(dòng)物及鳥的細(xì)胞類型(Segantietal.,1990“病毒學(xué)紀(jì)事”34,155-163；Fieldsetal.,1996FieldsVirology,ThirdEdition,Vol.2,Lippincott-RavenPublishersPhiladelphia,NewYork)。很可能將會(huì)發(fā)現(xiàn)其具有傳遞感染其它目的細(xì)胞類型的能力。因此，使用本發(fā)明的狂犬病毒G蛋白可以提供在體外及體內(nèi)能轉(zhuǎn)導(dǎo)廣泛的不同細(xì)胞類型的載體。狂犬病毒在體內(nèi)及體外的不同嗜性，被認(rèn)為是緣于狂犬病毒結(jié)合一系列受體的能力，這些受體中的一些僅在體外有活性。另外，根據(jù)本發(fā)明的假型化載體粒子的嗜性可以通過一種胞外域修飾的突變狂犬病毒G蛋白來改變?？袢《綠蛋白具有可被突變以限制其靶細(xì)胞范圍的優(yōu)點(diǎn)。在體內(nèi)，靶細(xì)胞對(duì)狂犬病毒的吸收被認(rèn)為是由乙酰膽堿受體(AchR)介導(dǎo)的，但也可能是其體內(nèi)結(jié)合的其它受體所介導(dǎo)的(Hanhametal..,1993“病毒學(xué)雜志”67,530-542；Tuffereauetal.,1998“病毒學(xué)雜志”72,1085-1091)?？袢《綠蛋白抗原位點(diǎn)Ⅲ處的突變對(duì)病毒嗜性的影響已作了研究。這個(gè)區(qū)域被認(rèn)為與病毒和乙酰膽堿受體的結(jié)合無關(guān)(Kuceraetal.,1985“病毒學(xué)雜志”55,158-162；Dietzscholdetal.,1983ProcNatlAcadSci80,70-74；Seifetal.,1985“病毒學(xué)雜志”53,926-934；Coulonetal.,1998“病毒學(xué)雜志”,72,273-278；Tuffereauetal.,1998“病毒學(xué)雜志”72,1085-10910)。例如成熟蛋白中第333位精氨酸(Arg)轉(zhuǎn)換為谷氨酰胺的突變可用來在體內(nèi)將病毒的進(jìn)入限制在嗅覺和外周神經(jīng)元中，而減少了其向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳播。那些病毒原來是能夠象野生病毒那樣侵入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元的，然而跨神經(jīng)元的傳遞沒有發(fā)生(Coclloinetal.,1989，“病毒學(xué)雜志”63,3550-3554)。第330位氨基酸突變的病毒能被進(jìn)一步減毒，并且在肌內(nèi)注射接種后，不能感染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或感覺神經(jīng)元(Coulonetal.,1998“病毒學(xué)雜志”72,273-228)。另外，可以使用來源于實(shí)驗(yàn)室傳代的狂犬病毒毒株的狂犬病毒G蛋白。這些能用于篩選嗜性的改變。這些毒株包括以下作為例子，ERA毒株是一種狂犬病的病原毒株并且來源于此毒株的狂犬病毒G蛋白能被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞。來源于ERA毒株的狂犬病毒G蛋白的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中(進(jìn)入號(hào)J02293)。此蛋白具有一種19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，并且成熟蛋白是從以翻譯起始點(diǎn)甲硫氨酸計(jì)第20位的賴氨酸殘基開始的。HEP-Flury毒株含有成熟蛋白第333位精氨酸轉(zhuǎn)換為谷氨酰胺的突變，此突變與其致病性的降低相關(guān)，并且可以用于限制其病毒被膜的嗜性。一種狂犬病毒G蛋白的實(shí)例如SEQIDNO.2所示，其編碼序列如SEQIDNO.1所提供。本發(fā)明包含這些序列的變體，同源體或衍生物。論及本發(fā)明優(yōu)選酶的氨基酸序列時(shí)，“變體”、“同源體”或“片段”包括自序列或向序列取代、變異、修飾、置換、缺失或添加一個(gè)(或更多)氨基酸，使產(chǎn)生的蛋白具有G蛋白的活性和/或G蛋白的特征或輪廓，優(yōu)選至少有如SEQIDNo.2所示G蛋白的相同生物活性。特別是“同源物”一詞包括結(jié)構(gòu)和/或功能的同源性。至于序列的同源性，優(yōu)選地至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源于SEQIDNo.2所示序列。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％同源于SEQIDNo.2所示序列。論及本發(fā)明優(yōu)選酶的核苷酸序列時(shí)，“變體”、“同源體”或“片段”包括自序列或向序列取代、變異、修飾、置換、缺失或添加一個(gè)(或更多)核苷酸，使產(chǎn)生的核苷酸序列編碼或能夠編碼具有G蛋白活性和/或G蛋白特征或輪廓的蛋白，優(yōu)選至少是與SEQIDNo.1所編碼的G蛋白有相同生物學(xué)活性的蛋白。尤其是，“同源體”一詞，包括結(jié)構(gòu)和/或功能的同源性，使產(chǎn)生的核苷酸序列編碼或能夠編碼具有G蛋白活性和/或G蛋白特性或輪廓的蛋白。至于序列的同源性，優(yōu)選地至少75％，更優(yōu)選至少為85％，更優(yōu)選至少90％同源于SEQIDNo.1所示的序列。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％同源于SEQIDNo.1所示的序列。尤其是在此所用的“同源性”一詞可能等同于“同一性”。相對(duì)的序列同源性(也就是序列同一性)能通過可商購的計(jì)算機(jī)程序來確定，這些程序能計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)序列的百分同源性。這種計(jì)算機(jī)程序的一個(gè)典型的實(shí)例就是CLUSTAL?！白凅w”、“同源體”或“片段”與序列的等位變異是同義的。“變體”也包括與能與此處提供的核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。優(yōu)選“變體”包括與以下序列互補(bǔ)的序列，這些序列能在嚴(yán)緊條件(例如，65℃和0.1SSC(1×SCC=0.15MNaCl,0.015檸檬酸鈉pH7.0)下與此處所提供的核苷酸序列雜交。本發(fā)明也包括能與此處所提供的核苷酸序列雜交的序列(包括此處所提供核苷酸序列的互補(bǔ)序列)。優(yōu)選，本發(fā)明包括能在嚴(yán)緊條件下(例如，65℃和0.1SSC)與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，與此處所提供核苷酸序列雜交的核苷酸序列(包括此處所提供序列的互補(bǔ)序列)。與VSV糖蛋白相比較，應(yīng)用狂犬病毒糖蛋白的一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)就是，由于狂犬病疫苗的廣泛應(yīng)用，對(duì)狂犬病毒對(duì)人和其它動(dòng)物的毒性有詳細(xì)的了解。尤其是有關(guān)應(yīng)用從作為人類疫苗的金絲雀痘病毒重組體表達(dá)的糖蛋白的1期臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有報(bào)道(Frieseta1.,1996Vaccine14,428-434)。這些研究得出結(jié)論是此疫苗用于人類是安全的。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)于在體內(nèi)或體外傳遞一個(gè)或更多NOI進(jìn)入細(xì)胞是有用的，尤其是有治療性活性的NOI的傳遞。一個(gè)或更多所選的NOI可以整合到載體基因組中而在靶細(xì)胞中表達(dá)。此NOI可以有一個(gè)或更多的它們自己的表達(dá)控制序列，或者它們的表達(dá)可以被載體的LTR所控制。為了此NOI的合適表達(dá)，這些LTR中或之間可能包括一個(gè)啟動(dòng)子，它在一定條件或一定細(xì)胞型中優(yōu)先激活。此NOI可能是有義序列或反義序列。而且，如果有很多NOI，那么那些NOI可能是有義序列或反應(yīng)序列或者是它們的組合體。本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因組可能通常包含有5’末端和3’末端LTR，一個(gè)或更多NOI，此NOI含有治療活性的基因和/或標(biāo)記基因，或一個(gè)或多個(gè)NOI的適合的插入位點(diǎn)，以及能使基因組在生產(chǎn)細(xì)胞中包裝成載體粒子的包裝信號(hào)。其中甚至含有合適的引物結(jié)合位點(diǎn)和整合位點(diǎn)，以允許載體RNA到DNA的反轉(zhuǎn)錄，及原病毒DNA整合進(jìn)入靶細(xì)胞基因組。在優(yōu)選方案中，此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子具有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(相容性逆轉(zhuǎn)錄和引物結(jié)合位點(diǎn))和一個(gè)整合系統(tǒng)(相容性整合酶和整合位點(diǎn))。因此，根據(jù)本發(fā)明，使控制病毒基因組或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的核苷酸序列成為可能，從而使病毒的基因由一個(gè)或更多的NOI來取代或補(bǔ)充。這些NOI也可以是任何一個(gè)或更多的選擇基因，標(biāo)記基因及治療基因。許多不同的選擇性標(biāo)記已經(jīng)成功地應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些不同的標(biāo)記在《逆轉(zhuǎn)錄病毒》(1997,ColdSpringHarbourLaboratoryPressEds:JMCoffinSMHughes,HE,Varmas頁444)一書中有綜述，包括以下(但不局限于這些)細(xì)菌的新霉素和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，它們分別提供對(duì)G418和潮霉素的抗性；一種突變的小鼠二氫葉酸還原酶基因，其提供對(duì)氨甲蝶呤的抗性；細(xì)菌的gpt基因，此基因能使細(xì)胞在含有霉酚酸、黃嘌呤、氨基蝶呤的培養(yǎng)基上生長；細(xì)菌的hisD基因，此基因能使細(xì)胞在沒有組氨酸而含有組氨醇的培養(yǎng)基上生長；多藥物抗性基因(mdz)，此基因提供對(duì)許多藥物的抗性；以及嘌呤霉素或腐草霉素抗性的細(xì)菌基因。所有的這些標(biāo)記都是顯性選擇標(biāo)記，并允許對(duì)表達(dá)這些基因的細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)選擇。根據(jù)本發(fā)明，此NOI可以是一個(gè)治療基因--從這個(gè)意義上講此基因本身可能產(chǎn)生一種治療效應(yīng)或者它編碼一個(gè)能產(chǎn)生治療效應(yīng)的產(chǎn)物。治療性NOI的非限制性的實(shí)例包括編碼以下因子的基因腫瘤抑制子蛋白，細(xì)胞因子，抗病毒蛋白，免疫調(diào)節(jié)分子，抗體，工程免疫球蛋白類似分子，融合蛋白，激素，膜蛋白，血管活性蛋白或多肽，生長因子，核酶，反義RNA，酶類，前體藥物，例如前體藥物激活酶類，細(xì)胞毒性物質(zhì)及酶抑制劑。前體藥物的實(shí)例包括但不限于這些表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(與堿性磷酸酶共用)，5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶共用)；阿霉素-N-對(duì)羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素V酰胺酶共用)，對(duì)-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸(與羧肽酶G2共用)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸鹽(與β-內(nèi)酰胺酶共用)，SR4233(與p450還原酶共用)；9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(與HSV胸苷激酶共用)，芥子前體藥物和硝基還原酶及環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺(與細(xì)胞色素P450)?？梢灾委煹募膊“ǖ粌H限于這些癌癥，心臟病，中風(fēng)，神經(jīng)退行性疾病，關(guān)節(jié)炎，病毒感染，細(xì)菌感染，寄生蟲的感染，免疫系統(tǒng)疾病，病毒感染，腫瘤、血凝病，及遺傳性疾病--如慢性肉芽腫，自毀容貌綜合癥，帕金森氏癥，肺氣腫，苯丙酮尿癥，鐮刀狀細(xì)胞貧血，α-地中海貧血，β-地中海貧血，戈謝病。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療的靶細(xì)胞包括但不僅限于這些造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，粒細(xì)胞，或任何這些細(xì)胞的祖細(xì)胞)，內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，星形細(xì)胞，或膠質(zhì)細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，上皮細(xì)胞，神經(jīng)元，成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞，星形細(xì)胞和肺細(xì)胞。在本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，一個(gè)或更多的NOI能在病毒LTR的轉(zhuǎn)錄控制之下?；蛘撸鰪?qiáng)子-啟動(dòng)子元件的組合能夠存在以實(shí)現(xiàn)表達(dá)的更高水平。這些啟動(dòng)子-增強(qiáng)子元件優(yōu)選是有很強(qiáng)的活性或能夠在靶細(xì)胞中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)的。一種強(qiáng)活性啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合的實(shí)例就是，人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的主要中早期(MIE)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。此啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合在活性上可能是組織或時(shí)序限制的。合適的組織限制性啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合的實(shí)例就是那些在腫瘤細(xì)胞中有高度活性的組合，象來自于MUCl基因或CEA基因的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合。組織缺氧或局部缺血可調(diào)節(jié)性表達(dá)可能在某些條件下也特別有用。在很大范圍的不同細(xì)胞類型中，組織缺氧是基因表達(dá)的一個(gè)強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因素，并且通過低氧可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子活性的誘導(dǎo)來起作用，例如低氧可誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)(Wang和Semenza1993PNAS(USA)90:430)，其結(jié)合到同源DNA識(shí)別位點(diǎn)上，也就是不同基因啟動(dòng)子的低氧應(yīng)答元件(HRES)上。來自小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)基因HRE的多聚體形式已被用來控制人纖維肉瘤細(xì)胞應(yīng)答于體外或?qū)嶓w瘤內(nèi)的低氧的標(biāo)記基因和治療基因的表達(dá)(Firthetal1994，PNAS91(14):6496-6500；Dachsetal1997NatureMed5:515)?；蛘撸咸烟侨狈υ谀[瘤的局部缺血區(qū)域也存在，這種現(xiàn)象能被用來激活特別是在腫瘤細(xì)胞中異源基因的表達(dá)。一個(gè)已知被葡萄糖缺乏特異性激活的grp78基因啟動(dòng)子截短的632堿基對(duì)的序列，已被研究表明在鼠體內(nèi)腫瘤中能驅(qū)動(dòng)一種報(bào)告基因的高水平表達(dá)(Gazitetal1995CancerRes.55:1660)。接下來用于基因治療的本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因組優(yōu)選含有作為載體起到有效功能所必需的最小的逆轉(zhuǎn)錄病毒材料。這樣的目的是為NOI的整合提供空間，及為了安全的原因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因組優(yōu)選復(fù)制缺陷的，這種缺陷緣于編碼一個(gè)或更多結(jié)構(gòu)(或包裝)成分的功能基因的缺失，這些成分由gag-pol和env基因編碼。這些病毒粒子生產(chǎn)所需的成分的缺乏，在生產(chǎn)細(xì)胞中通過反式方式來提供?；蚪M中病毒結(jié)構(gòu)成分的缺乏同樣意味著針對(duì)在靶細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白的不良免疫反應(yīng)被降低或消除。而且，在渴望體內(nèi)應(yīng)用的條件下，可能的感染病毒粒子的重建優(yōu)選被避免了。因此，病毒的結(jié)構(gòu)成分優(yōu)選盡最大可能地從基因中去除掉，以降低任何成功重組的可能。本發(fā)明中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子一般在一種合適的生產(chǎn)細(xì)胞中產(chǎn)生。生產(chǎn)細(xì)胞通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞但也可能是其它細(xì)胞如昆蟲細(xì)胞。一種生產(chǎn)細(xì)胞可能是含有一個(gè)通常整合于其基因組的病毒結(jié)構(gòu)基因的包裝細(xì)胞。為了生產(chǎn)具感染性的，復(fù)制缺陷性的載體粒子，此包裝細(xì)胞然后被編碼載體基因組的核酸轉(zhuǎn)染。或者，生產(chǎn)細(xì)胞可用編碼載體基因組的核酸序列和結(jié)構(gòu)成分共轉(zhuǎn)染，和/或用存在于一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體如質(zhì)粒、腺病毒載體、皰疹病毒載體上的核酸序列共轉(zhuǎn)染，或使用任何其它已知的將功能DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的高度優(yōu)選的方案，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)來自狂犬病毒的被膜蛋白，即狂犬病毒G蛋白，能有效地假型化很多不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體不僅包括構(gòu)建自鼠致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒的，例如MLV的載體，還包括構(gòu)建自靈長類動(dòng)物慢病毒例如HIV病毒的載體，及構(gòu)建自非靈長類動(dòng)物慢病毒例如馬傳染性貧血病毒(EIAV)的載體。在一個(gè)方案中，本發(fā)明的載體是從一個(gè)慢病毒構(gòu)建或是衍生而來。這就有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是此載體可能能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。因此，本發(fā)明優(yōu)選的假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體，如HIV或EIAV載體，這些載體有上面所提及的優(yōu)點(diǎn)。特別是假型化的狂犬病毒G蛋白慢病毒載體具有狂犬病毒靶細(xì)胞范圍，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非分裂細(xì)胞如神經(jīng)元。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的。在這個(gè)方面，盡管狂犬病和VSV都屬于桿狀病毒科(這是一個(gè)包含5個(gè)不同種類亞群的科)，但它們(也就是VSV和狂犬病毒)是在不同的亞群。而且，狂犬病毒G蛋白與VSV-G只有很小的同源性(Roseetal.,1982“病毒學(xué)雜志”43:361-364)?？袢《綠蛋白的胞質(zhì)區(qū)為大約44氨基酸，較VSV-G的胞質(zhì)區(qū)長得多，VSV-G的胞質(zhì)區(qū)為28至31個(gè)氨基酸。因此，發(fā)現(xiàn)狂犬病毒G蛋白能假型化MLV是出乎意料的。而且還表明切短HIV-1144個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾是MLV粒子有效假型化所必需的(Mammanoetal.,1997“病毒學(xué)雜志”71:3341-3345)。狂犬病毒G蛋白另外還能假型化其它逆轉(zhuǎn)錄病毒如慢病毒群中的病毒也同樣使人驚訝。因此，一方面本發(fā)明提供了用狂犬病毒G蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子。另一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)包含編碼狂犬病毒G蛋白的核酸序列，編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組的核酸序列，和可選的一個(gè)或更多編碼產(chǎn)生含有有此基因組的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子所需包裝成分的核酸序列。第三方面，本發(fā)明提供了狂犬病毒G蛋白改變逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶細(xì)胞范圍的用途。另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒的方法，此載體粒子的被膜含有狂犬病毒G蛋白，此方法包括提供如此處所述，存在于一種生產(chǎn)細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，置生產(chǎn)細(xì)胞于適合載體粒子成分表達(dá)及載體粒子生產(chǎn)的條件下，以及從上清液中收獲載體粒子。又一方面，本發(fā)明提供一種用NOI轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的方法，此方法包含按其中所述將細(xì)胞與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子接觸，在允許載體吸附并進(jìn)入到細(xì)胞的條件下，用NOI轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞使得NOI進(jìn)入靶細(xì)胞的基因組。根據(jù)本發(fā)明，在載體的被膜中除了狂犬病毒的G蛋白外，還可能有一種或更多的其它被膜蛋白。例如這可能包括一種逆轉(zhuǎn)錄病毒本身的被膜蛋白。除了假型化蛋白外，還利用一個(gè)本病本身的被膜蛋白能夠有利于被膜的穩(wěn)定和/或功能，甚至還可以擴(kuò)大此載體的感染范圍。本發(fā)明還為個(gè)體的基因治療提供了藥物組合物，其中此組合物包含治療有效量的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。此藥物組合物可以作為人用或獸用。一般，醫(yī)生將確定最適合某一個(gè)體的實(shí)際劑量，并且此實(shí)際劑量將隨年齡、體重及具體病人的反應(yīng)來確定。這種組合物可以可選地包括一種可藥用的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑。藥物載體、賦形劑或稀釋劑可以根據(jù)希望的用藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的制藥實(shí)踐來選擇。此藥物組合物除了含有載體、賦形劑或稀釋劑之外，也可以含有任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑及輔助或增加病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)的其它載體物質(zhì)(如脂質(zhì)傳遞系統(tǒng))。合適時(shí)，此藥物組合物能通過以下任何一種或更多的方式來給藥吸入，以栓劑或陰道藥栓的形式，以洗劑、溶液、乳劑、藥膏或撒粉的形式局部用藥，使用皮膚用貼片，以含如淀粉或乳糖等賦形劑的片劑形式，或以含香味劑或生色劑的酏劑、溶液或懸浮液的形式口服，或者可用不經(jīng)腸道的注射，如海綿竇內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射或皮下注射。不經(jīng)腸道給藥時(shí)，此組合物最好以無菌水溶液的形式使用，此水溶液可以含有其它的物質(zhì)，如足夠的鹽類或單糖類，以便此水溶液與血液等滲。用經(jīng)口或舌下的給藥方式，此藥物組合物可以以片劑或錠劑來給藥，這些片劑或錠劑可以按常規(guī)方式配制。因此，總言之，本發(fā)明涉及的是具有異源被膜蛋白的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其是一種狂犬病毒G蛋白。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)其被膜含有狂犬病毒G蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，以及載體和系統(tǒng)的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)載體和系統(tǒng)使用的方法。現(xiàn)在僅用實(shí)例的方式并參照附圖敘述本發(fā)明，其中圖1顯示一個(gè)質(zhì)粒圖譜；圖2顯示一個(gè)凝膠照片；圖3顯示一組圖解示意圖；圖4顯示一個(gè)圖5顯示兩個(gè)圖；及圖6顯示一個(gè)圖解示意圖。實(shí)施例1表達(dá)狂犬病毒G蛋白載體的生產(chǎn)和使用的其它載體的詳細(xì)說明。通過將來源于pSG5rabgp(Burgeretal1991“普通病毒學(xué)雜志”72:359-367)的1.7kbBglⅡ狂犬病毒G片段克隆至pSA91(圖1)來構(gòu)建狂犬病毒G的表達(dá)載體，pSA91是pGW1HG(Soneokaetal1995NuelAcidsRes23:628-633)的衍生質(zhì)粒，通過BamHⅠ消化除去gpt基因并重新連接而獲得。這種構(gòu)建體pSA91RbG允許狂犬病毒G從人巨細(xì)胞病毒(HCMV)即時(shí)早期基因啟動(dòng)子-增強(qiáng)子表達(dá)。該質(zhì)粒與pONY3(詳細(xì)構(gòu)建見后)和pONY2.1nlsLacZ(詳細(xì)構(gòu)建見后)一起轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，使用Soneokaetal1995(ibid)描述的方法，用Western印跡證實(shí)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中狂犬病毒G的表達(dá)。一個(gè)VSV-G表達(dá)質(zhì)粒被用作負(fù)對(duì)照，該質(zhì)粒中用VSV-G基因代替pSA91中的狂犬病毒G基因在HCMV的控制下表達(dá)。用PBS洗轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在含1mM新配制的PMSF的RIPA緩沖液中裂解，并用BCA蛋白測定試劑盒，按其詳細(xì)操作說明測定總蛋白濃度。50ug的細(xì)胞裂解物在10％的SDS/PAGE上電泳。凝膠被電轉(zhuǎn)印到immobilon膜上(Millipore公司)。用1∶3000稀釋的抗狂犬病毒G蛋白的小鼠單克隆抗體17D2和1∶1000稀釋的連接有抗小鼠IgG的兔過氧化物酶(VectorLaboratories,PeterborougUK)進(jìn)行Western印跡分析。用ECL試劑盒(AmershamInternational,UK)通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行測定。在用pSA91RbG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中明顯存在一個(gè)與報(bào)道的狂犬病毒G蛋白大小相當(dāng)?shù)?4KD帶(圖2)。在所有的以下的實(shí)例中，如前描述的(Soneokeetal1995,ibid)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法被用作生成假型化載體。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒如下pHITⅢ和pHIT60分別表示含有大腸大菌LacZ標(biāo)記基因和MLVgag-pol基因的MLV載體(Soneokaetal,1995)。pH32和pGP-RRE3是相應(yīng)的HIV載體成分(Kimetal1998“病毒學(xué)雜志”72:811-816)。pONY2.1nlsLacZ和pONY3是相應(yīng)的EIAV載體成分(英國專利申請(qǐng)9727135.7)。這些載體的重要特征，包括EIAV載體的特征顯示于圖3。在圖3中使用的縮寫和標(biāo)記描述如下<tablesid="table2"num="002"><table>CMVSV40LTRRU3ΔU3U5ψtatrevRREenvΔenvgagΔgagpolvifpAlacZneo人類巨細(xì)胞病毒即時(shí)-早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域猿病毒40增強(qiáng)子和早期啟動(dòng)子區(qū)域長末端重復(fù)LTR的重復(fù)區(qū)域LTR的3’主要獨(dú)有序列一種不完全的U3序列LTR的5’主要獨(dú)有序列基因組包裝信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白rev應(yīng)答元件編碼被膜蛋白的基因含有缺失的env基因，使得一種平截蛋白被產(chǎn)生衣殼蛋白的編碼區(qū)域含有缺失的gag區(qū)域，使得一系列不完全的衣殼蛋白被產(chǎn)生編碼酶蛋白的區(qū)域病毒感染因子聚腺苷化信號(hào)編碼β-半乳糖苷酶的基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因</table></tables>EIAV載體的構(gòu)建如下。由如Payneetal(1994,J.Gen.Virol.75:425-9)描述的一個(gè)感染性前病毒克隆pSPEIAV19被用作開始點(diǎn)。通過從編碼被膜蛋白的質(zhì)粒區(qū)域的5835-6571HindⅢ片段的缺失構(gòu)建質(zhì)粒pSPEIAVΔH。通過插入EIAVLTR至pBluescriptⅡKS+(Stratagene)構(gòu)建一個(gè)基因組質(zhì)粒載體，EIAVLTR是用PCR從pSPEIAV19擴(kuò)增的。然后將pSPEIAVΔH的MluⅠ/MluⅠ(216/814)片段插入LTR/Bluescript質(zhì)粒中形成pONY2。此外，缺失掉pol(1901/4949)內(nèi)的BglⅡ/NcoⅠ片段，并在該位置插入由HCMVIE增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的核內(nèi)定位的β-半乳糖苷酶基因。該質(zhì)粒稱為pONY2.1nlsLacZ.。通過插入來源于pONY2ΔH的MluⅠ/MluⅠ片段到哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo(Promego)中形成一個(gè)編碼gagpol基因的EIAV質(zhì)粒(pONY3)，使gag-pol蛋白從HCMVIE增強(qiáng)子/啟動(dòng)子表達(dá)。實(shí)施例2用狂犬病毒G蛋白假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如前描述的(Soneokaetal1995)三種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法被用作生成假型化載體。在開始的實(shí)驗(yàn)中，在6孔的組織培養(yǎng)皿的孔中，10μgpSA91RbG與10μggag-pol表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)大腸桿菌lacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用VSV-G假型化的實(shí)驗(yàn)被用作這些實(shí)驗(yàn)的正對(duì)照，其中10μg的pRY67代替pSA91中的狂犬病毒G,pRY67是一種VSV-G表達(dá)質(zhì)粒，其中VSV-G在人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制下表達(dá)。在人腎細(xì)胞系293T中(如在Soneokaetal1995中描述的)中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以生產(chǎn)載體病毒粒子。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)收獲培養(yǎng)上清液，并用0.45mm孔徑的過濾器(Millipore)過濾。與狂犬病在體內(nèi)的神經(jīng)元專一性相比，狂犬病毒的實(shí)驗(yàn)室毒株在體外能與廣泛的細(xì)胞系相互作用(ReaganandWunner1985“病毒學(xué)紀(jì)事”84:277-282)。因此對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系作為以狂犬病毒G假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的靶細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)價(jià)，它們分別是幼倉鼠腎細(xì)胞系BHK21細(xì)胞和狗黑素瘤細(xì)胞系D17細(xì)胞。細(xì)胞在感染前一天接種至6孔組織培養(yǎng)皿中，接種量為3×105Cells/孔。通過用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備病毒上清液，即將上述的假型化EIAV,HIV-1和MLV載體加入到這些細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，Polybrene(8ug/ml)被加入到每孔1ml的培養(yǎng)上清液中。感染12小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基置換培養(yǎng)上清液。為了測定病毒效價(jià)，在感染后48小時(shí)，洗滌、固定和染色細(xì)胞。用pSA91RbG和pRV67與所有三種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染時(shí)，我們能觀察到D17細(xì)胞的β-半乳糖苷酶陽性克隆。不用pSA91RbG或pRV67轉(zhuǎn)染則沒有β-半乳糖苷酶陽性克隆，說明被膜對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生是必需的。若用BHK21細(xì)胞感染，僅能在MLV假型體中觀察到β-半乳糖苷酶陽性克隆，而在EIAV和HIV假型體中觀察不到。這種不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶陽性克隆的原因可能是因?yàn)樵谶@種細(xì)胞類型中結(jié)合后封閉EIAV和HIV-1。這些結(jié)果證實(shí)狂犬病毒G能假型化EIAV,HIV和MLV載體。通過比較這些假型化載體的病毒效價(jià)研究了假型化的效率。從β-半乳糖苷酶陽性克隆的數(shù)目來估計(jì)病毒的效價(jià)(表1)。表1含有狂犬病毒G蛋白的假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的相對(duì)效率<tablesid="table4"num="004"><table>病毒成分基于以下細(xì)胞估計(jì)每ml中轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子的數(shù)目D17BHK-21逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相應(yīng)的質(zhì)粒構(gòu)建體Gag-pol表達(dá)質(zhì)粒被膜表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生的假型化載體1EIAVpONY2.1nlsLacZpONY3pRV67EIAV-VSVG8.4×104＜1012EIAVpONY2.1nlsLacZpONY3pSA91RbGEIAV-RbG3.2×104＜1013HIVpH4ZpGP-RRE1pRV67HIV-VSVG3.0×104＜1014HIVpH4ZPGP-RRE1pSA91RbGHIV-RbG6.4×103＜1015MLVpHIT111pHIT60pRV67MLV-VSVG6.3×1064.8×1066MLVpHIT111pHIT60pSA91RbGMLV-RbG1.6×1067.8×106</table></tables><tablesid="table5"num="005"><table>7Mock＜101＜101</table></tables>在兩個(gè)試驗(yàn)細(xì)胞系中用狂犬病毒G假型化的MLV的病毒效價(jià)與觀察到的VSV-G假型體相當(dāng)(在BHK21中，VSV-G與狂犬病毒G各自為4.8×106和7.8×106；在D17細(xì)胞中VSV-G和狂犬病毒G各自為6.3×106和1.6×106)。在D17細(xì)胞中，用VSV-G和狂犬病毒G假型化EIAV和HIV-1得到相似結(jié)果。用VSV-G和狂犬病毒G假型化的載體的EIAV病毒效價(jià)分別為8.4×104和3.2×104。在HIV-1中，用VSV-G和狂犬病毒G假型化的病毒效價(jià)分別為3.4×104和6.4×103。這些結(jié)果說明狂犬病毒G在用三種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體假型化中如VSV-G一樣有效。我們的結(jié)果說明狂犬病毒G能假型化逆轉(zhuǎn)錄載體EIAV,HIV-1和MLV，產(chǎn)生與用VSV-G假型化相當(dāng)?shù)母咝r(jià)。實(shí)施例3-含有改變氨基酸333的狂犬病毒G蛋白的生產(chǎn)和表征在pSA91RbG中，狂犬病毒糖蛋白基因的編碼序列被用重疊PCR改造，使得所產(chǎn)生的蛋白在333位具有谷氨酰胺而不是精氨酸。這一改變被報(bào)導(dǎo)在狂犬病毒中引起減毒作用和改變細(xì)胞嗜性。用作誘變的引物如下正向引物5’GATGCTCACTACAAGTCAGTCCAGACTTGGAATGAGA3TCCTCCC反向引物5’GGGAGGATCTCATTCCAAGTCTGGACTGACTTGTAGT3GAGCATC這一改造片段作為SphⅠBglⅡ片段被重新引入pSA91Rg中，產(chǎn)生的質(zhì)粒是pSA91RM。從這種載體產(chǎn)生的改造的狂犬病毒G蛋白假型化MLV粒子的能力被測試。如Soneokaetal1995描述的將該質(zhì)粒與pHIT60和pHI111一起轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，pSA91Rg被用作正對(duì)照。如前所述收集這些轉(zhuǎn)染的上清液，且通過其轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21或鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系C-1300克隆NA的能力來評(píng)估兩種被膜假型化MLV粒子的能力(表2)。表2含有改變的氨基酸333的狂犬病毒G蛋白假型化MLV粒子的能力的表正盡管用改造的狂犬病毒G蛋白在一般用于生產(chǎn)狂犬病毒疫苗的BHK-21細(xì)胞上獲得的效價(jià)低于野生型的，但是在C-1300細(xì)胞上兩種被膜蛋白獲得的效價(jià)相當(dāng)。這些結(jié)果說明改造的蛋白能有效地假型化MLV粒子。實(shí)施例4-狂犬病毒G假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的效價(jià)優(yōu)化對(duì)其他兩種成分滴定了添加到3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的pSA91RbGDNA的量以便測定最佳病毒效價(jià)。在該實(shí)驗(yàn)中，使用CaPO4沉淀法用質(zhì)粒pSA91RbG,pHIT111和pHIT60轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。后兩種質(zhì)粒等量(8ug/轉(zhuǎn)染/35mm皿)，而pSA91RbG的量依次減少。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后收獲轉(zhuǎn)染上清液，且在HT1080細(xì)胞上測定存在的轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子數(shù)目。結(jié)果顯示于圖4。與其它質(zhì)粒相比pSA91RbGDNA的量減少8倍產(chǎn)生了最高效價(jià)?？傂r(jià)比在例1中從293T細(xì)胞獲得的低。對(duì)產(chǎn)生基于EIAV的載體需要的兩種成分也進(jìn)行了pSA91RbG的滴定。在這種情況中，用含有8ug編碼gag/pol(pONY3)質(zhì)粒和8ug表達(dá)編碼β-半乳糖苷酶(pONY2.1inLacZ)的EIAV載體的質(zhì)粒通過CaPO4沉淀轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。如上添加不同量的pSA91RbG或pRY67以分別提供用狂犬病毒G或VSV-G假型化的載體。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后收獲轉(zhuǎn)染上清液，并在D17細(xì)胞上測定存在的轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子數(shù)目。結(jié)果顯示于圖5。與其他質(zhì)粒相比pSA91RbGDNA的量減少2-4倍產(chǎn)生了最高效價(jià)。當(dāng)用和其他兩種質(zhì)粒等量的pRV67時(shí)，沒有觀察到效價(jià)的明顯減少。這些結(jié)果表明，通過調(diào)整狂犬病毒G和在生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)的載體成分的相對(duì)量來獲得狂犬病毒G假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的較高效價(jià)是可能的。實(shí)施例5-狂犬病毒G假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的濃縮我們更進(jìn)一步研究了用超速離心的方法(Burnsetal1993PNAS90:8033-8037)濃縮病毒上清液是否能增加病毒的效價(jià)，超速離心時(shí)，用VSV-G假型化的基于MLV的載體得到了每ml含有109轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子的病毒效價(jià)。如前所述(Soneokaetal.,1995)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法被用來生成用狂犬病毒G或VSV-G假型化的粒子。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后收獲轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子，超速離心濃縮并在D17細(xì)胞上滴定。48小時(shí)后，這些細(xì)胞進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色。取三次獨(dú)立試驗(yàn)的效價(jià)的平均值并計(jì)算作為每ml半乳糖苷酶的生產(chǎn)單位。試驗(yàn)間的變異不超過10％。已經(jīng)證明可以降低收獲體積至130倍，而用兩種被膜之一假型化的EIAV和MLV粒子的轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子沒有明顯降低。表3濃縮對(duì)狂犬病毒G假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的影響這些結(jié)果表明用狂犬病毒G假型化的載體能用超速離心濃縮，使載體效價(jià)增加到與用VSV-G假型化的載體相當(dāng)?shù)男r(jià)。這些特性和狂犬病毒G在體內(nèi)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的專一性使得用狂犬病毒G假型化非常有吸引力，因?yàn)閿y帶任何治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容易靶向神經(jīng)系統(tǒng)。實(shí)施例6-狂犬病毒G假型體轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的人類靶細(xì)胞的能力的選擇性用人類神經(jīng)和非神經(jīng)源細(xì)胞系測定了用狂犬病毒G假型化的載體的細(xì)胞專一性。用VSV-G假型化的實(shí)驗(yàn)被用作陽性對(duì)照。由三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染制備的病毒上清液用來感染人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和人類T細(xì)胞系CEM-A。從β-半乳糖苷酶陽性克隆估計(jì)病毒效價(jià)(表4)。表4狂犬病假型化轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的人類靶細(xì)胞能力的選擇性用狂犬病毒G和VSV-G假型化的MLV載體能感染IMR-32細(xì)胞。但用狂犬病毒G假型化的MLV載體產(chǎn)生的效價(jià)(3.1×105)是用VSV-G假型化的MLV載體(4.9×103)的100倍。在CEM-A細(xì)胞中，用狂犬病毒G假型化的MLV載體產(chǎn)生了1.7×101的低效價(jià)。這種低效率不是由于MLV沒有能力轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。證明這點(diǎn)的證據(jù)是當(dāng)用VSV-G假型化的同樣載體有比較高的效價(jià)(7.3×102)。我們的結(jié)果說明不象VSV-G，狂犬病毒G假型體顯示了它們轉(zhuǎn)導(dǎo)人類靶細(xì)胞能力的選擇性，在神經(jīng)細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于在T細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。實(shí)施例7-狂犬病毒G假型體在體外(原代培養(yǎng))和體內(nèi)(大鼠/小鼠模式系統(tǒng))轉(zhuǎn)導(dǎo)腦細(xì)胞的能力。有證據(jù)認(rèn)為在體內(nèi)狂犬病毒至少使用了兩種不同的受體(Hanhametal,1993“病毒學(xué)雜志”67:530-542；Tuffereauetal，“病毒學(xué)雜志”72:1085-1091)，這些受體中的一種可能是煙堿乙酰膽堿受體。在小鼠模式系統(tǒng)中，用野生型狂犬病毒(CVS毒株)和這種毒株的雙突變(氨基酸330和333改變)詳細(xì)地研究了它們感染的神經(jīng)細(xì)胞的類型和在整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)中病毒的傳播(Coulouetal；1989“病毒學(xué)雜志”63:3550-3554；Lafayetal,1991“病毒學(xué)”183:320-330)。這些研究結(jié)果表明突變病毒的傳播和范圍與野生型相比較受到重大限制。為了測定用狂犬病毒G蛋白假型化的EIAV載體的趨性，采用了以下分析。成年雌性AO大鼠被麻醉并在紋狀體或其它大腦區(qū)域趨觸性地注射2×1μl的病毒原種。注射7或30天后，麻醉大鼠，并用4％的多聚甲醛灌流心臟。取出大腦，固定24小時(shí)，用30％的蔗糖飽和，并在冷凍切片機(jī)上切片(50μm)。切片用X-gal溶液染色3小時(shí)至過夜，固定標(biāo)本在載玻片上并用光學(xué)顯微鏡分析。用三重標(biāo)記免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體細(xì)胞類型，使用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞元(NeuN或其它的)、星形細(xì)胞(GFAP)或少突細(xì)胞(Galc)特異性的抗體和β-半乳糖苷酶以及種特異性的第二抗體。用共聚焦顯微鏡分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腦區(qū)域的成像。用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)的原代神經(jīng)元被置于大鼠胚胎培養(yǎng)物中，生長至完全分化為止。用4μg/ml的polybrene添加病毒載體5小時(shí)。兩天后更換培養(yǎng)基并用X-gal染色或抗體進(jìn)行表達(dá)的分析。實(shí)施例8-狂犬病毒G假型化HIV-1載體的濃縮和用VSV-G和狂犬病毒被膜生產(chǎn)這種載體的比較。實(shí)施例5說明，狂犬病毒G假型化EIAV載體能用如已報(bào)導(dǎo)的VSV-G假型化載體相同的方式通過超速離心進(jìn)行有效濃縮。我們已經(jīng)延長了這些觀察，表明狂犬病毒G能被用于假型化HIV-1載體，這些粒子能通過超速離心進(jìn)行有效濃縮，在D17細(xì)胞上獲得的效價(jià)與用VSV-G假型化載體獲得的效價(jià)相當(dāng)。如前所述(Soneokaetal.,1995)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法被用于生成用狂犬病毒G或VSV-G假型化的粒子。用于該試驗(yàn)的HIV-1質(zhì)粒pH4Z和pGP-RRE3已被Kim等描述(1998“病毒學(xué)雜志”72:811-816)。用于這種試驗(yàn)的成分比率，對(duì)于狂犬病毒G是gag/pol基因組被膜為1∶1∶1，對(duì)于VSV-G是gag/pol基因組被膜為1∶1∶0.5；這是用于COS1細(xì)胞的變化比率，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞比COS細(xì)胞更抗狂犬病毒G蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子，通過超速離心濃縮并在D17細(xì)胞上滴定。48小時(shí)后，這些細(xì)胞進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色。這證實(shí)用兩種被膜中的任一種假型化的HIV-1粒子收獲物的效價(jià)可以增加大約100倍(表5)。用任一種被膜假型化的載體獲得的效價(jià)并無明顯差別。這些結(jié)果說明用狂犬病毒G假型化的載體能通過超速離心濃縮，使載體效價(jià)增加到與VSV-G假型化載體相當(dāng)，并且在D17細(xì)胞上這兩種被膜同樣有效。表5討論及概述如前所述，逆轉(zhuǎn)錄病毒和來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體需要一種特殊的被膜蛋白，以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。被膜蛋白在生產(chǎn)病毒或載體的細(xì)胞中表達(dá)并整合進(jìn)病毒或載體粒子。逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子由來源于gag基因的蛋白核心組成，該蛋白核心中包圍有病毒RNA。然后該核心被包圍在一種細(xì)胞膜部分中，其中含有來源于病毒env基因的一種被膜蛋白。被膜蛋白以前體的方式被生產(chǎn)，該前體能被加工成2個(gè)或3個(gè)單位。這些單位分別是表面蛋白(SU)，跨膜蛋白(TM)和胞質(zhì)尾(Coffin1992inTheRetroviridae,PleumPress,edLevy)，表面蛋白完全在被膜的外部，跨膜蛋白與表面蛋白相互作用，包含有膜跨區(qū)域。在一些逆轉(zhuǎn)錄病毒中，一個(gè)小肽從跨膜蛋白中被除去。為了充當(dāng)一種有效的被膜蛋白，有能力與靶細(xì)胞表面結(jié)合并介導(dǎo)病毒的進(jìn)入，被膜蛋白不得不用精確的方式與靶細(xì)胞表面適當(dāng)?shù)氖荏w作用，使得病毒粒子以適當(dāng)?shù)姆绞絻?nèi)化，以傳遞基因組至細(xì)胞的正確區(qū)域，在該區(qū)域進(jìn)行生產(chǎn)性感染。已經(jīng)多次嘗試用來源于一種病毒的被膜去包裝不同的病毒，這一過程被稱之為假型化。假型化的效率是高度可變的，似乎被被膜的胞質(zhì)尾和病毒粒子的核心蛋白間的相互作用強(qiáng)烈地影響。被膜蛋白被吸收進(jìn)出芽病毒粒子的過程現(xiàn)在所知甚少，但已知道這一過程是選擇性的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的細(xì)胞蛋白被逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子排除(Hunter1994SeminVirol5:71-83)，并且在一些逆轉(zhuǎn)錄病毒中，已經(jīng)記錄到在缺乏被膜蛋白的情況下發(fā)生的出芽(Einfeld1996CurrTopMicrobiolImmunel214:133-176；KrausslichandWelker1996CurrTopMicrobiolImmunel214:25-63)。在一些逆轉(zhuǎn)錄病毒中，有證據(jù)表明被膜蛋白的胞質(zhì)域與病毒核心間進(jìn)行精確的分子間相互作用。Januszesk；等(1997“病毒學(xué)雜志”71:3613-3619)已表明，鼠白細(xì)胞瘤病毒(MLV)的胞質(zhì)尾少量的缺失或取代就強(qiáng)烈地抑制被膜蛋白進(jìn)入病毒粒子。對(duì)HIV-1,Casson(1996EMBOJ15:5783-5788)表明，HIV-1的基質(zhì)蛋白與它的被膜蛋白的胞質(zhì)域間直接相互作用。這種基質(zhì)與被膜蛋白間的相互作用在被膜蛋白進(jìn)入出芽的HIV病毒粒子中起著關(guān)鍵作用。這是由以下事實(shí)證實(shí)的，即如果綿羊髓鞘脫落病毒的gag多聚蛋白的基質(zhì)域的氨基酸末端被等量的HIV-1基質(zhì)域代替，綿羊髓鞘脫落病毒只能用HIV-1的被膜蛋白有效地假型化(Dorfmanetal.,1994“病毒學(xué)雜志”68:1689-1696)。然而這種情況是復(fù)雜的，因?yàn)镠IV-1Env的截?cái)鄬?duì)于Molony氏白血病病毒的有效假型化是必需的(Mammanoetal1997“病毒學(xué)雜志”71:334-3345)，而人類泡沫病毒被膜蛋白的截?cái)鄷?huì)降低它假型化鼠白血病毒的能力(Lindemametal.,1997“病毒學(xué)雜志”71:4815-4820)。也有環(huán)境因素作用于逆轉(zhuǎn)錄病毒核心和它的被膜蛋白的胞質(zhì)尾部間的相互作用。在一些細(xì)胞系中，EIAV的傳代延長導(dǎo)致糖蛋白的截?cái)?，表明宿主?xì)胞因素可根據(jù)被膜蛋白的C-末端域?qū)Σ《具M(jìn)行選擇(Riceetal.,199064:3770-3778)。這些研究和許多其它工作者的研究表明，即使密切相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄病毒是否能相互假型化也是不可能預(yù)言的。此外，如果一種所給的被膜對(duì)一種特定病毒的假型化失敗了，也不可能預(yù)測可能賦予假型化能力的分子改變。盡管假型化已經(jīng)取得了一些成功，但顯然受到病毒成分和異源被膜蛋白間的相容性要求的限制。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建中，需要改造天然病毒成具有不同靶細(xì)胞特異性的載體，以便能傳遞遺傳物質(zhì)至更廣泛的或改變的細(xì)胞類型中去。完成這一方案的一種方式是通過改造病毒被膜蛋白以改變它的專一性。另一種方法是引進(jìn)異源被膜蛋白至載體以代替或添加到病毒的天然被膜蛋白中。MLV被膜蛋白具有假型化多種不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的能力。來源于一種兼嗜性病毒的MLV被膜蛋白能轉(zhuǎn)導(dǎo)廣泛的細(xì)胞類型，包括人類細(xì)胞。但有時(shí)候可能不希望逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染大量的細(xì)胞類型。棒狀病毒水泡性口炎病毒(VSV)的被膜糖蛋白(G)是另一種已經(jīng)證實(shí)有能力假型化某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的被膜蛋白。逆轉(zhuǎn)錄病毒MLV已被成功地假型化(Burnsetal1993ProcNatlAcadSciUSA90:8033-7)，并形成了一種與MLV的天然形式相比含有改變的宿主范圍的載體。VSV-G假型化的載體已經(jīng)證實(shí)不僅能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而且能感染來源于魚、爬行類動(dòng)物和昆蟲的細(xì)胞系(Burnsetal1993)。VSV-G蛋白也能假型化某些逆轉(zhuǎn)錄病毒是因?yàn)樗陌|(zhì)尾能與逆轉(zhuǎn)錄病毒核心相互作用。VSV-G和MLV被膜蛋白都有短的胞質(zhì)尾部，分別為28到31和32個(gè)氨基酸，長度非常相似。提供非逆轉(zhuǎn)錄病毒假型化被膜如VSV-G蛋白的優(yōu)點(diǎn)是載體粒子能被濃縮至高效價(jià)而不喪失感染性(Akkinaetal；1996“病毒學(xué)雜志”.70:2581-5)。逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜蛋白明顯地不能抵抗超速離心過程中的剪切力，可能是因?yàn)樗鼈兪怯蓛蓚€(gè)非共價(jià)連接地亞單位組成的。通過離心亞單位間的相互作用也許被破壞。相比較而言，VSV糖蛋白是由單個(gè)單位組成。因而假型化VSV-G蛋白提供了潛在的優(yōu)點(diǎn)。但是，可能也需要與使用VSV-G蛋白獲得的靶細(xì)胞專一性不同的靶細(xì)胞專一性。已經(jīng)嘗試通過改造蛋白中的靶位點(diǎn)而改變VSV-G的靶細(xì)胞范圍。在1997年關(guān)于傳遞治療基因的靶載體策略會(huì)議上(ColdSpringHarbor,USA)報(bào)導(dǎo)這些嘗試是不成功的。因此需要改變逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶細(xì)胞范圍的其它方法。已經(jīng)嘗試用其它棒狀病毒的被膜有效地假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒。在1997年關(guān)于傳遞治療基因的靶載體策略會(huì)議上(ColdSpringHarbor,USA)僅有的一篇報(bào)導(dǎo)(Reiseretal)聲稱狂犬病毒和Mokola氏病毒的糖蛋白能假型化HIV-1粒子，但是獲得的效價(jià)遠(yuǎn)低于用VSV-G蛋白獲得的效價(jià)。本發(fā)明通過提供一種已經(jīng)用狂犬病毒蛋白特別是狂犬病毒G蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，希望克服這些問題。以上說明書中提及的所有出版物在此引用作為參考。本發(fā)明所描述的方法和系統(tǒng)的不同修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，而不會(huì)偏離本發(fā)明的范圍和精神。盡管結(jié)合了具體的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解本發(fā)明不限于這些具體方案。實(shí)際上，本發(fā)明的權(quán)利要求書旨在包括本文所述的實(shí)施本發(fā)明的各種方式的修正，其對(duì)分子生物學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的。序列表SEQIDNO.1狂犬病毒毒株ERA的核苷酸序列Genbank位置RAVGPLS，入藏號(hào)M384521aggaaagatggttcctcaggctctcctgtttgtaccccttctggtttttccattgtgttt61tgggaaattccctatttacacgatactagacaagcttggtccctggagcccgattgacat121acatcacctcagctgcccaaacaatttggtagtggaggacgaaggatgcaccaacctgtc181agggttctcctacatggaacttaaagttggatacatcttagccataaaaatgaacgggtt241cacttgcacaggcgttgtgacggaggctgaaacctacactaacttcgttggttatgtcac301aaccacgttcaaaagaaagcatttccgcccaacaccagatgcatgtagagccgcgtacaa361ctggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgtaccctgacta421ccgctggcttcgaactgtaaaaaccaccaaggagtctctcgttatcatatctccaagtgt481agcagatttggacccatatgacagatcccttcactcgagggtcttccctagcgggaagtg541ctcaggagtagcggtgtcttctacctactgctccactaaccacgattacaccatttggat601gcccgagaatccgagactagggatgtcttgtgacatttttaccaatagtagagggaagag661agcatccaaagggagtgagacttgcggctttgtagatgaaagaggcctatataagtcttt721aaaaggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctaggacttagacttatggatggaac781atgggtcgcgatgcaaacatcaaatgaaaccaaatggtgccctcccgatcagttggtgaa841cctgcacgactttcgctcagacgaaattgagcaccttgttgtagaggagttggtcaggaa901gagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatgacaaccaagtcagtgagtttcag961acgtctcagtcatttaagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatataccatattcaa1021caagaccttgatggaagccgatgctcactacaagtcagtcagaacttggaatgagatcct1081cccttcaaaagggtgtttaagagttggggggaggtgtcatcctcatgtgaacggggtgtt1141tttcaatggtataatattaggacctgacggcaatgtcttaatcccagagatgcaatcatc1201cctcctccagcaacatatggagttgttggaatcctcggttatcccccttgtgcaccccct1261ggcagacccgtctaccgttttcaaggacggtgacgaggctgaggattttgttgaagttca1321ccttcccgatgtgcacaatcaggtctcaggagttgacttgggtctcccgaactgggggaa1381gtatgtattactgagtgcaggggccctgactgccttgatgttgataattttcctgatgac1441atgttgtagaagagtcaatcgatcagaacctacgcaacacaatctcagagggacagggag1501ggaggtgtcagtcactccccaaagcgggaagatcatatcttcatgggaatcacacaagag1561tgggggtgagaccagactgtgaggactggccgtcctttcaacgatccaagtcctgaagat1621cacctccccttggggggttctttttaaaaaaSEQIDNO.2狂犬病毒毒株ERA的氨基酸序列Genbank位置RAVGPLS，入藏號(hào)M38452PID:g333574MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTILDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKFSLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL權(quán)利要求1．一種能轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)靶位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中該逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)包括編碼至少部分被膜蛋白的第一核苷酸序列；和一個(gè)或多個(gè)可來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、保證逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)對(duì)靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它核苷酸序列；其中第一核苷酸序列至少與其它核苷酸序列之一是異源的；并且第一核苷酸序列編碼能夠識(shí)別靶位點(diǎn)的狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體，變體，衍生物或片段。2．根據(jù)權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中第一核苷酸序列編碼全部的狂犬病毒G蛋白或其突變體，變體，衍生物或片段。3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中至少其它核苷酸序列之一可來源于一種慢病毒或一種致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒。4．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中其它核苷酸序列可來源于一種慢病毒或一種致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒。5．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中其它核苷酸序列可來源于MLV、HIV或EIAV。6．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中該逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)包括至少一個(gè)NOI。7．根據(jù)權(quán)利要求6的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中NOI具有治療效應(yīng)或編碼一種具有治療效應(yīng)的蛋白。8．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，其中靶位點(diǎn)是一種細(xì)胞。9．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)可獲得的病毒粒子。10．一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或可由其獲得。11．用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或權(quán)利要求9的病毒粒子或權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。12．權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或權(quán)利要求9的病毒粒子或權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在醫(yī)藥中的用途。13．權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或權(quán)利要求9的病毒粒子或權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在制造一種藥物組合物中的用途，所述組合物用以傳遞一種NOI至需要其的靶位點(diǎn)。14．一種方法，包括讓一種細(xì)胞與權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或權(quán)利要求9的病毒粒子或權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體接觸。15．一種載體，用以制備權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或權(quán)利要求9的病毒粒子或權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中該載體包括一個(gè)核苷酸序列，其編碼狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體，變體，衍生物或片段。16．一種質(zhì)粒，用以制備權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)或權(quán)利要求9的病毒粒子或權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中該質(zhì)粒包括一個(gè)核苷酸序列，其編碼狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體，變體，衍生物或片段。17．多種質(zhì)粒，其中至少一種質(zhì)粒是權(quán)利要求16的質(zhì)粒，且至少一種其他質(zhì)粒包括一個(gè)或多個(gè)可來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的核苷酸序列。18．狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子以影響該逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病粒子的感染譜的用途。19．狂犬病毒G蛋白假型化一種逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子以影響該逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病粒子的宿主范圍和/或細(xì)胞嗜性的用途。20．用狂犬病毒G蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子。21．一種逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，包括一個(gè)異源env區(qū)，其中該異源env區(qū)包括編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列的至少一部分。22．一種逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)，包括一段異源env區(qū)，其中該異源env區(qū)包括一個(gè)編碼狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。23．基本上如本文所述的假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子。全文摘要描述了一種能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靶位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)。此該逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)包括編碼至少部分被膜蛋白的第一核苷酸序列;和一個(gè)或多個(gè)可來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、保證逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)對(duì)靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的核苷酸序列;其中第一核苷酸序列至少與其它核苷酸序列之一是異源的;并且第一核苷酸序列編碼能夠識(shí)別靶位點(diǎn)的狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突變體,變體,衍生物或片段。文檔編號(hào)A61K48/00GK1302334SQ99806500公開日2001年7月4日申請(qǐng)日期1999年5月21日優(yōu)先權(quán)日1998年5月22日發(fā)明者K·A·米特拉法諾斯,D·帕蒂爾,A·J·金斯曼,S·M·金斯曼,F·M·埃拉德申請(qǐng)人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國)有限公司