本發(fā)明涉及一種用于調(diào)節(jié)受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞數(shù)量水平的方法。本發(fā)明還涉及一種用于治療受試者中t細胞免疫介導的疾病的方法。本發(fā)明還涉及pd-1h激動劑或拮抗劑在制備用于調(diào)節(jié)受試者的誘導型調(diào)節(jié)性t細胞數(shù)量水平的藥物組合物中的應用。本發(fā)明還涉及pd-1h激動劑或拮抗劑在制備用于治療受試者中t細胞免疫介導的疾病的藥物組合物中的應用。

背景技術(shù)：

調(diào)節(jié)性t細胞(treg)是cd4⁺t細胞的一個亞群，其具有從維持自身耐受性到調(diào)節(jié)免疫反應程度的廣泛功能。treg不是終末分化的細胞，并且可以在炎癥期間被轉(zhuǎn)化為其他cd4⁺t細胞亞群(包括th1和th17)。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子foxp3在功能性定向調(diào)節(jié)性t細胞譜系的建立中起重要作用。foxp3⁺treg細胞可以通過tgf-β分為胸腺衍生的天然treg細胞(ntreg)和誘導型treg細胞(itreg)，tgf-β調(diào)節(jié)itreg細胞的分化和胸腺衍生的ntreg穩(wěn)定。在外周，itreg細胞的分化主要是由微環(huán)境驅(qū)動的。例如，炎性細胞因子ifn-γ和il-4抑制tgf-β誘導的itreg細胞，而il-6在tgf-β存在下引導th17細胞分化。因此，treg細胞的可塑性可決定正在進行的免疫反應的方向并控制炎癥，如在幾種小鼠模型(包括結(jié)腸炎模型、急性移植物抗宿主病(gvhd)模型和哮喘模型)中所顯示的。

pd-1h(也稱為gi24、dies1、b7-h5、vista和dd1)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞表面免疫球蛋白超家族分子，其還在調(diào)節(jié)成骨細胞、脂肪細胞和胚胎干細胞的分化以及細胞凋亡中扮演多種作用。pd-1h在造血細胞(如t細胞、nk細胞、單核細胞、nk細胞和dc)上組成型表達(b細胞除外)。不同于ctla-4敲除(ko)小鼠(其快速發(fā)展淋巴增殖性表型和致命的全身性自身免疫性疾病)，pd-1h缺乏癥具有更加溫和的表型：pd-1hko幼鼠具有正常數(shù)量的t細胞、nk細胞、b細胞、巨噬細胞和單核細胞，而更老的小鼠經(jīng)歷自發(fā)的t細胞活化，當小鼠老齡化時，觀察到記憶細胞水平增加和脾臟增大。此外，如加速的cona誘導的急性肝炎和gvhd中所示，pd-1h缺陷型小鼠對急性炎癥和對抗原的免疫應答更敏感。pd-1h已在幾個體外和體內(nèi)研究中被證明分別作為配體或受體在專職抗原呈遞細胞(apc)和t細胞中起作用。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，pd-1h激動型單克隆抗體已被證明是各種類型的對抗原的免疫應答的免疫抑制劑，而拮抗性mab顯示為免疫刺激劑。雖然pd-1h的反受體尚未被鑒定，但最近的一項研究表明，pd-1h/dd1α可以通過血友病性相互作用(hemophilicinteraction)介導其作用。

早期研究表明，pd-1h在treg上組成型表達，其后幾項研究表明其在treg功能調(diào)節(jié)中的作用。pd-1hig融合蛋白在體外能夠在tgf-β存在下促進小鼠和人cd4⁺t細胞中的foxp3⁺itreg的誘導。在b16-ova腫瘤模型中，pd-1hmab的給藥降低了腫瘤抗原特異性itreg細胞的分化。該結(jié)果被解釋為通過該mab阻斷pd-1h與其推定的反受體之間的相互作用。然而，一個不同的pd-1h激動型mab(mh5a)被證明可以在體外促進tgf-β誘導的treg細胞，并且輸注mh5a可抑制小鼠模型中g(shù)vhd的進展，并且伴隨著itreg的擴增。雖然這些數(shù)據(jù)表明pd-1h在treg誘導和功能中的可能作用，但尚未闡明pd-1h是否對treg細胞具有直接作用。更重要的是，pd-1h對treg細胞調(diào)節(jié)作用的機制尚不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)小鼠中pd-1h的遺傳消融阻斷了初始t細胞向foxp3⁺誘導型treg細胞(itreg)的分化，淋巴器官中itreg明顯減少。pd-1h的這種效應對于itreg是高度特異性的，因為在腸相關(guān)組織中的天然產(chǎn)生的itreg和tgf-β體外誘導的itreg都降低，而天然treg(ntreg)的生成保持正常。然而，itreg和ntreg的抑制功能不受pd-1h缺失的影響。除了生成量降低，pd-1h缺陷型itreg還可以在炎癥環(huán)境中迅速轉(zhuǎn)化為cd4⁺t輔助細胞1或t輔助細胞17。這些結(jié)果表明，通過促進其分化并防止其轉(zhuǎn)化為其他cd4⁺t細胞亞群，pd-1h可維持itreg細胞數(shù)量水平。這些發(fā)現(xiàn)可能對操縱treg來控制炎癥具有重要意義。

在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞的細胞水平方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑在制備用于調(diào)節(jié)受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞的細胞水平的藥物組合物中的用途。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中t細胞免疫介導的疾病的方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑在制備用于治療受試者中的t細胞免疫介導的疾病的藥物組合物中的用途。

在本發(fā)明的一些實施方案中，pd-1h激動劑的施用導致受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞水平升高。在本發(fā)明的一些實施方案中，pd-1h拮抗劑的施用導致受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞的水平降低。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述施用是靜脈內(nèi)給藥。在本發(fā)明的一些實施方案中，pd-1h激動劑是抗pd-1h的激動型單克隆抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，pd-1h拮抗劑選自靶向pd-1h編碼多核苷酸的dsrna、sirna和shrna的反義寡聚體。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述受試者是人。在本發(fā)明的一些實施方案中，t細胞免疫介導的疾病包括炎癥、自身免疫疾病和癌癥。

本發(fā)明證明pd-1h在炎性環(huán)境中抑制itreg細胞轉(zhuǎn)化為th1和th17細胞，至少部分是由于其在維持foxp3表達和itreg表型中的作用導致的。這些發(fā)現(xiàn)對調(diào)節(jié)treg生長和功能具有重要意義。同時，如先前所示，pd-1h抑制初始t細胞的激活以限制t細胞介導的免疫應答的啟動，它促進免疫應答期間itreg的生長和轉(zhuǎn)化。除了調(diào)節(jié)早期t細胞活化外，pd-1h似乎通過調(diào)節(jié)treg水平參與t細胞耐受性的調(diào)節(jié)。因此，pd-1h途徑可能作為一種新的靶標而被用來在炎癥、自身免疫疾病和癌癥中控制和操縱的t細胞介導的免疫。

附圖說明

圖1.pd-1h在foxp3⁺itreg細胞的新生成中的作用。(a)從wtot-ii或pd-1hkoot-ii小鼠純化的初始t細胞首先用5μmcfse標記，隨后以2×10⁶/小鼠i.v.轉(zhuǎn)移至b6小鼠。24小時后，在飲用水中喂食1.5％ova，喂養(yǎng)5天。通過流式細胞儀在代表性小鼠中分析門控cd4⁺cfse⁺vβ5.1/5.2tcr⁺上的foxp3頻率。(b，c)實驗概要，每個符號代表單個小鼠(n＝5)。所顯示的數(shù)據(jù)代表3個獨立實驗。

圖2.pd-1h對itreg的轉(zhuǎn)化和功能的影響。(a)腸道相關(guān)淋巴器官中itreg的天然發(fā)育中的pd-1h缺失。通過在流式細胞術(shù)中用特異性抗體來表征細胞表面cd25和細胞內(nèi)foxp3表達，從而測定腸系膜淋巴結(jié)(mln)、payer氏集合淋巴結(jié)(pp)和固有層(lp)中cd25⁺foxp3⁺treg細胞的百分比。pd-1hko小鼠及其同窩wt仔鼠(每組n＝5)用于分析。左圖表示來自每組的配對單個小鼠，右圖是一個代表性實驗的總結(jié)(每組中n＝5)。(b)腸道相關(guān)淋巴器官中cd25⁺foxp3⁺treg的絕對數(shù)。(c)itreg的體外誘導。在存在或不存在5ng/mltgf-β的情況下，用抗-cd3/cd28刺激來自wt和pd-1hko小鼠的cd4⁺cd25^-cd62l^hi初始t細胞3-5天。通過細胞內(nèi)染色測定cd25⁺foxp3⁺細胞的頻率。(d，e)itreg抑制功能的體外評價。如上所述，誘導來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始cd4⁺t細胞成為foxp3(gfp⁺)itreg細胞。從b6小鼠中純化初始cd8⁺t細胞或cd4⁺t細胞，用cfse標記并與分選的gfp⁺itreg細胞在存在抗cd3的情況下以指定的treg/teff細胞比率共培養(yǎng)。通過與沒有添加itreg細胞的孔進行比較來確定包含itreg細胞時csfe的減少量。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨立實驗。僅teff：沒有抗cd3刺激的t細胞；對照：具有抗cd3的teff細胞，不含有itreg細胞。(f)通過在流式細胞儀上門控cd4⁺foxp3(gfp⁺)來測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達。

圖3.細胞因子環(huán)境對pd-1h介導itreg細胞轉(zhuǎn)化缺陷的影響。(a)在沒有pd-1h的情況下誘導itreg細胞的細胞因子譜。如上所述，將初始t細胞在體外誘導為itreg，并在第4天收集培養(yǎng)上清液，通過小鼠th1/th2/th17cba試劑盒測定細胞因子水平。(b)在培養(yǎng)開始時向培養(yǎng)物中加入ifn-γ和il4的中和mab以從wt或pd-1hko初始t細胞體外誘導itreg細胞。培養(yǎng)3-5天后評價cd25⁺foxp3⁺細胞。呈現(xiàn)的結(jié)果來自一對小鼠。(c)來自(b)的數(shù)據(jù)的柱狀圖，數(shù)據(jù)來自一組5只小鼠。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨立實驗。

圖4.pd-1h對eae模型中itreg細胞穩(wěn)定性的影響。(a)來自wt或ko的cd45.2⁺foxp3(gfp⁺)itreg細胞在體外誘導后通過細胞分選獲得。將1×10⁶個wt或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細胞i.v.轉(zhuǎn)移到cd45.1b6小鼠(n＝4或5每組)中，再用mog35-55肽免疫。對照小鼠用pbs接種。監(jiān)測eae疾病進展和嚴重程度作為臨床評分(見方法部分)。*p<0.05，(雙向abova檢驗)。顯示的數(shù)據(jù)代表3次具有相似的結(jié)果和疾病表型的實驗中的1個。(b，c)在eae誘導的第13天，門控脾臟和引流ln(dln)細胞中的cd45.2⁺cd4⁺，并分析foxp3(gfp⁺)itreg細胞。(d)計數(shù)來自eae小鼠的脾臟和dln中的cd45.2⁺foxp3⁺的絕對數(shù)量。(e)使用pma/離子霉素/bfa離體將第13天的eae小鼠脾臟和dln細胞再次刺激4小時。門控cd4⁺cd45.2⁺gfp⁺細胞，用細胞內(nèi)染色分析ifn-γ⁺或il-17⁺表達。顯示的數(shù)據(jù)來自代表性的一對小鼠。(f)在4只或5只小鼠組中顯示的(e)中的數(shù)據(jù)的圖表。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨立實驗。

圖5.pd-1h促進itreg細胞的定型。(a)在第13天分析來自eae模型中各組的所轉(zhuǎn)移的itreg細胞(cd45.2⁺cd4⁺門控)。用具有特異性mab的pstat3或pstat5對脾臟細胞和dln細胞進行細胞內(nèi)染色。(b)與a相同，但轉(zhuǎn)移的itreg細胞上stat3和stat5的磷酸化以繪圖值顯示。(c)通過亞硫酸氫鹽測序確定cns2區(qū)域的dna甲基化狀態(tài)。每條線代表一個克隆(一個dna鏈)；空心圓，非甲基化引物；實心圓，甲基化引物。

圖6.pd-1h影響itreg細胞的從頭分化。(a)將wt和koot-iit細胞(cd25^-t細胞)分別轉(zhuǎn)移到宿主小鼠中。轉(zhuǎn)移的ot-iit細胞在轉(zhuǎn)移前用cfse標記。該圖顯示了cfse的稀釋和foxp3誘導。(b)wt(cd45.1/cd45.2)初始ot-iit細胞和ko(cd45.2)ot-ii初始t細胞以1:1的比例混合并共轉(zhuǎn)移到宿主小鼠(cd45.1)。用1.5％ova口服飼養(yǎng)宿主小鼠后，分析mln和pp，并通過細胞內(nèi)染色測定foxp3的頻率。(c)計數(shù)所示器官中的foxp3⁺t細胞的絕對數(shù)量。

圖7.pd-1h調(diào)節(jié)淋巴細胞環(huán)境中itreg細胞的分化。(a)將來自wt小鼠(cd45.2)和pd-1hko小鼠(cd45.1)的初始cd4⁺cd62l^hit細胞以1:1的比例混合，將總共2百萬個細胞轉(zhuǎn)移到rag1ko小鼠(n＝4)并在20天后測定foxp3上調(diào)。該圖顯示轉(zhuǎn)移前后wt和kocd4⁺t細胞比例的變化。通過細胞內(nèi)染色測定foxp3+細胞的頻率。(b)計數(shù)來自rag1ko小鼠的所示器官中的cd25⁺foxp3⁺t細胞的絕對數(shù)量。(c)分析轉(zhuǎn)移的初始cd4⁺t細胞的細胞因子的產(chǎn)生。在pma/離子霉素/bfa存在下，將來自所示器官的細胞體外活化4小時，然后通過細胞內(nèi)染色進行分析。所顯示的數(shù)據(jù)代表2次獨立的實驗。

圖8.pd-1h對ntreg細胞的產(chǎn)生和抑制功能起著重要作用。(a)使用foxp3的細胞內(nèi)染色和cd25的細胞表面染色，通過流式細胞術(shù)測定脾臟和ln中cd25⁺foxp3⁺ntreg的百分比。使用來自wt和pd-1hko小鼠的六周齡同窩出生小鼠(n＝5)。計數(shù)脾臟和ln中foxp3⁺cd25⁺t細胞的絕對數(shù)量。(b)通過流式細胞儀上門控cd4⁺foxp3(gfp⁺)測定來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的ntreg上的cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos和pd-1的表達。(c)對來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的foxp3(gfp⁺)ntreg進行分選，并在存在絲裂霉素c處理的脾細胞及抗cd3抗體的情況下以不同的treg/teff比率與cfse標記的cd8⁺teff細胞共培養(yǎng)3天。通過流式細胞術(shù)測定cfse稀釋度。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨立實驗。

圖9.pd-1h決定了骨髓嵌合小鼠中treg細胞的水平。(a)將來自cd45.1wt小鼠和cd45.2小鼠的總數(shù)為1000萬各混合骨髓細胞轉(zhuǎn)移到亞致死性輻射處理的小鼠(cd45.1/cd45.2)中。重構(gòu)后10周分析小鼠。顯示wt和kot細胞的門控策略。(b)通過細胞內(nèi)染色測定所示器官中的foxp3頻率。(c)脾臟中的foxp3頻率，并顯示foxp3⁺細胞和foxp3^-細胞的絕對數(shù)量。所顯示的數(shù)據(jù)是兩個獨立實驗的其中一個。

圖10.pd-1h激動型mab輕微促進itreg細胞的分化。(a)從wtfoxp3(gfp)小鼠中分離初始t細胞，隨后在tgf-β存在下用對照小鼠igg或mam82用預包被的抗cd3刺激4天。通過流式細胞術(shù)分析cd25⁺foxp3(gfp⁺)itreg細胞。(b)顯示不同時間點誘導的itreg細胞。顯示的結(jié)果來自3個單獨的實驗。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨立實驗。

圖11.在eae模型中用wt或pd-1hkoitreg細胞轉(zhuǎn)染后，受試者中cd4⁺th1和th17細胞的分析。(a)來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的初始t細胞如上所述在體外分化成itreg細胞。將ifn-γ和il-4中和mab加入到培養(yǎng)物中以促進itreg的產(chǎn)生。分離foxp3(gfp⁺)細胞，通過facs評估純度。(b，c)在轉(zhuǎn)移itreg細胞的eae模型中的受試者cd45.1⁺cd4⁺t細胞通過pma/離子霉素/bfa離體再刺激。通過門控cd45.2^-cd4⁺t細胞，通過細胞內(nèi)染色測定受試者cd4⁺t細胞的ifn-γ⁺或il-17⁺細胞。來自代表性的一對小鼠的數(shù)據(jù)顯示在(b)中，顯示的數(shù)據(jù)的曲線圖來自4或5只小鼠的組(c)。所顯示的數(shù)據(jù)代表至少3次獨立實驗。

圖12.pd-1h缺乏的itreg細胞不能保留其抑制功能和foxp3表達。(a)單獨或與來自wt或ko小鼠的cd45.2⁺foxp3(gfp⁺)itreg細胞一起轉(zhuǎn)移cd25^-cd45rb^hicd45.1t細胞后不同時間的rag1ko宿主小鼠的重量(每組n＝5)(見方法)。轉(zhuǎn)移后受體小鼠的體重變化被標準化至其在轉(zhuǎn)移前的初始體重。*p<0.05，(雙向abova檢驗)。(b)誘導結(jié)腸炎后(第10周，n＝5)，rag1ko宿主小鼠的結(jié)腸組織h&e染色(標尺：100μm)和臨床評分(c)。(d，e，f)分析來自rag1ko宿主小鼠的脾臟和dln中cd45.2treg細胞中foxp3⁺t細胞的百分比，并根據(jù)比例和活細胞計數(shù)foxp3⁺cd45.2t細胞的絕對數(shù)量。(g)流式細胞術(shù)分析來自rag1ko小鼠的所示器官中cd45.2treg細胞中ifn-γ和il-17的表達。用pma/離子霉素/bfa在體外刺激脾細胞和dln細胞4小時，并染色以測定細胞內(nèi)的細胞因子。(h)(g)中的數(shù)據(jù)總結(jié)，每個點代表一只小鼠。(i)流式細胞術(shù)分析來自rag1ko宿主小鼠的所示器官中的teff細胞(cd45.1)中ifn-γ和il-17的表達。用pma/離子霉素/bfa在體外刺激脾細胞和dln細胞4小時，并染色以測定細胞內(nèi)的細胞因子。顯示的數(shù)據(jù)代表2個獨立實驗中的其中一個。

具體實施方式

定義

在本發(fā)明中，術(shù)語“治療”是指療法上的以及預防性的措施，其阻止或減緩對象發(fā)生不期望的生理學改變或病癥，例如哮喘發(fā)作或癌癥進展。有利或期望的臨床效果包括，但不限于，癥狀的緩解、疾病程度的降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定化(即不惡化)、疾病進展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的減輕或緩和以及疾病的部分或全部治愈，不論上述效果是否可檢測到?！爸委煛币部芍概c不治療相比生存期延長。需要治療的對象包括已患有該疾病或病癥的對象，以及有可能患有該疾病或病癥的對象，或要預防該疾病或病癥的對象。

“對象”或“患者”、“個體”是指任何期望進行診斷、預后或治療的對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物包括人、家畜、農(nóng)畜、動物園動物、競技動物或?qū)櫸?，例如狗、貓、幾?nèi)亞豬、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。本文所稱的對象優(yōu)選是人。

本文所用的術(shù)語“有治療需要的患者”或“有治療需要的對象”包括因施用本發(fā)明用于例如檢測、診斷和/或治療用途的多肽或其組合物而受益的對象，如哺乳動物對象。

本文所用的術(shù)語“激動劑”是指任何能夠增加pd-1h的水平和/或活性的試劑。例如，術(shù)語“激動劑”是指使能夠使pd-1h的表達和/或活性增加至少10％或更多(例如10％或更多、50％或更多、100％或更多、200％或更多、500％或更多、1000％或更多)的試劑。pd-1h的激動劑的非限制性例子可包括pd-1h多肽或其激動劑片段以及編碼pd-1h多肽的核酸。

如本文所用，術(shù)語“拮抗劑”是指降低pd-1h的水平和/或活性的任何試劑。拮抗劑是與特定蛋白(例如配體)競爭結(jié)合另一種蛋白質(zhì)(例如受體)的化合物。這種結(jié)合通常誘導被競爭性拮抗劑阻斷的特異性生物反應或作用。拮抗劑具有親和力但對其同源結(jié)合蛋白沒有功效，并且結(jié)合將破壞相互作用并抑制這種同源蛋白的功能。拮抗劑通過結(jié)合至任何同源蛋白(或在適用情況下受體)上的活性(正位體＝正確的位置)位點或變構(gòu)(＝其他位置)位點來調(diào)節(jié)其作用，或者它們可能在通常不涉及的獨特結(jié)合位點相互作用。

本發(fā)明使用反義低聚物和類似物質(zhì)用于調(diào)節(jié)編碼pd-1h的核酸分子的功能或作用。這通過提供與編碼pd-1h的一種或多種核酸分子特異性雜交的寡核苷酸來實現(xiàn)。如本文所用，術(shù)語“靶核酸”和“編碼pd-1h的核酸分子”被用于方便地包括編碼pd-1h的dna、從該dna轉(zhuǎn)錄的rna(包括前mrna和mrna或其部分)，以及衍生自這些rna的cdna。本發(fā)明的低聚物與其靶核酸的雜交通常稱為“反義”。因此，被認為包括在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中的優(yōu)選機理在本文中稱為“反義抑制”。這種反義抑制通?；诠押塑账徭溁蜴湺蔚幕跉滏I的雜交，使得至少一個鏈或鏈段被切割、降解或以其它方式不可操作。在這方面，目前優(yōu)選靶向特異性核酸分子及其用于這種反義抑制的功能。在一些實施方案中，反義寡聚物選自dna寡核苷酸、rna寡核苷酸(例如microrna)和嵌合寡核苷酸。例如，反義寡聚物選自dsrna、sirna和shrna。

本發(fā)明的一個方面提供一種調(diào)節(jié)對象的誘導型調(diào)節(jié)性t細胞的細胞水平的方法，包括向有此需要的對象施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑或包含pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供上述pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑在調(diào)節(jié)對象的誘導型調(diào)節(jié)性t細胞的細胞水平的方法中的應用。

在一些實施方式中，該pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑或其藥物組合物以腸胃外方式給藥，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮或皮內(nèi)給藥。

在某些實施方案中，pd-1h激動劑的施用導致受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞水平的增加，例如itreg細胞的擴增。在某些實施方案中，施用pd-1h拮抗劑導致受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞水平降低。在一些實施方案中，itreg細胞的水平降低伴隨著th1和/或th17細胞的產(chǎn)生增加。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或減輕t細胞免疫介導的疾病的方法。該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑或包含pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑的藥物組合物。本文使用的術(shù)語“t細胞免疫介導的疾病”是指與t細胞免疫相關(guān)的疾病或病癥，包括炎癥、自身免疫性疾病和癌癥。

組合物

本發(fā)明的一個方面提供了包含治療有效量的pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物可用于調(diào)節(jié)受試者中誘導型調(diào)節(jié)性t細胞的水平。pd-1h激動劑或pd-1h拮抗劑可以在合適的藥學上可接受的載體或賦形劑中制備。

本文使用的術(shù)語“載體”包括任何或所有的溶劑、分散介質(zhì)、載體、包衣、稀釋劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸附延緩劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這些用于藥物活性成分的介質(zhì)和試劑的使用在本領(lǐng)域是已知的。除非已知任何常規(guī)介質(zhì)或試劑不能與該活性成分配伍，否則本發(fā)明預期可在組合物中使用任何上述載體。

“藥學上可接受的”是指當施用至人體時不會產(chǎn)生過敏反應或類似的不期望的反應的分子和成分。本領(lǐng)域已知如何制備包含作為活性組分的蛋白的水性組合物。通常，這些組合物被制備成注射劑，例如液態(tài)溶液或懸浮液；也可以制備成適于在注射之前配制成溶液或懸浮液的固體形式。

實施例

材料和方法

小鼠：8周齡的c57bl/6(b6)小鼠購自中山大學動物供應中心。b6背景的pd-1h-ko小鼠已有報道。轉(zhuǎn)基因品系cd45.1、ot-ii、foxp3(gfp)、rag1ko均購自thejacksonlaboratory。pd-1hko和野生型(對照小鼠)的同窩小鼠由pd-1h雜合子產(chǎn)生并保持在相同的條件下。將foxp3(gfp)小鼠和ot-ii小鼠分別與pd-1hko小鼠回交，產(chǎn)生pd-1h缺陷型foxp3(gfp)報道小鼠和pd-1h缺陷型ot-ii小鼠。將小鼠保持在特定的無病原體設施中，所有動物實驗均按照“國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南”進行，經(jīng)中山大學科學調(diào)查委員會批準(廣東，中國)。

抗體、試劑盒和流式細胞術(shù)分析：對于小鼠pd-1h的細胞表面染色，使用mh5a(倉鼠抗小鼠pd-1h)，之后使用抗倉鼠igg-pe(ebioscience)；倉鼠igg(ebioscience)被用作同種型對照。pd-1h激動劑mab克隆mam82(小鼠抗小鼠igg1)已有描述。所有其他熒光標記的抗體包括cd4、cd25、cd44、cd69、foxp3、tcrvβ5.1/5.2、p-stat3、p-stat5、ctla-4、lag-3、gitr、iocs、cd45.1和cd45.2從ebioscience和bdpharmingen購買。對于中和試驗，從r&dsystem購買抗-ifn-γ(克隆xmg1.2)、抗il-4(克隆11b11)，抗il-6(克隆mp5-20f3)中和抗體。根據(jù)bd的cytofix/cytoperm試劑盒手冊進行foxp3和其他細胞內(nèi)細胞因子的細胞內(nèi)染色。使用小鼠th1/th2/th17cba試劑盒(bdbioscience)進行細胞因子分析。小鼠pan-t分離試劑盒、cd8⁺t細胞分離試劑盒、cd4⁺t細胞分離試劑盒、cd25微珠試劑盒和初始cd4⁺t細胞分離試劑盒購自miltenyibiotec(cambridge，ma)。使用bdfacsverse(bdbiosciences)進行流式細胞術(shù)分析，并使用flowjo軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。

細胞分選和純化：收集脾臟和ln的單細胞懸浮液，使用初始cd4⁺t細胞分離試劑盒(miltenyibiotec)分離初始的cd4⁺cd25^-cd44^locd62^hit細胞。對于foxp3(gfp)敲入小鼠，在使用cd4⁺t細胞分離試劑盒純化后，通過facsaria(bdbiosciences)對cd4⁺cd25^-foxp3(gfp)t細胞和cd4⁺cd25⁺foxp3(gfp⁺)t細胞進行分選。在所示的實驗中，使用cd4⁺t細胞分離試劑盒首先富集cd4⁺t細胞，然后使用cd25微珠試劑盒(miltenyibiotec)去除cd25⁺t細胞，得到cd4⁺cd25^-t細胞。使用該方法分選的細胞的純度通常大于95％。

itreg細胞的體外轉(zhuǎn)化：使用結(jié)合至平板的抗cd3(克隆2c11，2μg/ml，ebioscience)和可溶性抗cd28(1μg/ml)在存在或不存在重組tgf-β(5ng/ml，r&dsystems)和il-2(5ng/ml，peprotech)的情況下在體外刺激分選的cd4⁺cd25^-foxp3(gfp^-)t細胞3-5天。然后通過流式細胞儀基于gfp的表達或foxp3的細胞內(nèi)染色分析foxp3⁺treg細胞的轉(zhuǎn)化。在所示實驗中，在用抗cd3(1μg/ml)包被平板之后，將細胞在包被pd-1h激動劑mam82(10μg/ml)的平板中培養(yǎng)。對于細胞因子中和實驗，在培養(yǎng)開始時向孔中加入10μg/ml的il-4、il-6和ifn-γ的mab。在所示時間點收集培養(yǎng)的上清液進行細胞因子分析。

treg細胞的抑制試驗：按之前文獻所述方法進行treg細胞抑制功能試驗。簡言之，首先用1μmcfse(lifetechnologies)標記初始cd8⁺t細胞(在一些實驗中使用cd4⁺初始t細胞)，隨后在存在作為飼養(yǎng)細胞的1×10⁵絲裂霉素c處理的同基因脾細胞的情況下以1×10⁵共同培養(yǎng)細胞。在u底96孔板中以指定的比例向培養(yǎng)物加入或不加入treg細胞并培養(yǎng)72小時，隨后加入抗小鼠cd3(1μg/ml)以進行刺激。通過cfse稀釋法測定t細胞的增殖。在一些實驗中，向培養(yǎng)物中加入可溶性小鼠對照igg或pd-1h激動劑mam82(10μg/ml)。在這些情況下，飼養(yǎng)細胞是pd-1hko脾細胞。

口服耐受小鼠模型：根據(jù)公開的方案進行foxp3⁺itreg細胞的全新生成。簡言之，如前所述，從ot-ii小鼠(或pd-1hkoot-ii小鼠)中分離初始cd4⁺cd25^-t細胞，并在過繼轉(zhuǎn)移前用5μmcfse標記。向wtb6小鼠靜脈內(nèi)注射2×10⁶個細胞。24小時后，將籠中飲用水連續(xù)5天替換為1.5％ova溶液(v級；sigma-aldrich)。在第6天，收集腸系膜ln和pp，通過流式細胞術(shù)利用foxp3的細胞內(nèi)染色測定tcr特異性foxp3⁺treg細胞。

骨髓嵌合體：將來自wt(cd45.1)和pd-1hko小鼠(cd45.2)的脛骨和股骨的骨髓以1:1的比例混合，并將總共1×10⁷個細胞轉(zhuǎn)移到亞致死性輻射處理的(6gy)同源wt小鼠(cd45.1/cd45.2)。重構(gòu)10周后分析所示器官。通過細胞內(nèi)染色測定foxp3⁺細胞的頻率。

eae疾病模型：按文獻方法進行實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型。簡言之，將7-8周齡雌性小鼠s.c.免疫在完全弗氏佐劑(difco)中的200μgmog35-55(lifetechnologies)。在免疫后第0天和第2天，給小鼠腹腔注射在500μlpbs中的400ng百日咳毒素(listbiologicallabs)。對于過繼轉(zhuǎn)移，在第0天，進行免疫前，靜脈注射1×10⁶個wtfoxp3(gfp⁺)itreg細胞或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細胞。wt小鼠靜脈注射相同體積的pbs(鹽水)作為對照。每天觀察小鼠，以0-5的等級確定臨床評分(盲法)：0＝健康；1＝拖尾；2＝拖尾和后肢無力；3＝后肢癱瘓；4＝所有后肢癱瘓和前肢無力；5＝垂死狀態(tài)。對于從eae小鼠獲得的細胞的間接體內(nèi)分析，收集每組的脾和dln，并且用pma/離子霉素/bdgolgiplug再次刺激細胞懸浮液4小時。使用細胞內(nèi)染色評估ifn-γ和il-17的水平，并通過facs(bdcytofix/cytoperm試劑盒)分析。

慢性結(jié)腸炎的t細胞轉(zhuǎn)移模型：簡言之，如上所述制備和分選來自wt和pd-1hko小鼠的foxp3⁺itreg細胞。通過腹膜內(nèi)，將同源cd4⁺cd45rb^hit細胞(cd45.1,4×10⁵)和或不和2x10⁵itreg細胞(cd45.2)一起共注射到rag1ko小鼠。每周稱重一次小鼠，10周后，收集結(jié)腸組織，用h&e進行組織染色。收集脾臟和mln細胞，并使用pma/離子霉素/bfa離體活化4小時，然后分析細胞因子產(chǎn)量。

dna甲基化分析：分離foxp3(gfp⁺)itreg細胞，用dneasyblood&tissuekit(qiagen)純化基因組dna。使用ezdna甲基化-金試劑盒(zymo研究)進行dna的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。使用文獻報道的引物組擴增foxp3增強子的cns2區(qū)，并將t/a克隆到pmd18-t載體(clonetech)中。對每組10個插入的質(zhì)粒進行純化和測序，并通過biqanalyzer2.0分析甲基化結(jié)果。

圖表和統(tǒng)計分析：圖形和數(shù)據(jù)分析是使用graphpad軟件生成。進行非配對studentt檢驗的統(tǒng)計學分析，p值小于0.05被認為是顯著的。圖中的誤差條表示標準誤差(se)。對于疾病進展，使用雙因素方差分析(*p<0.05)進行分析。所有實驗重復至少3次。

結(jié)果

pd-1h對于treg細胞的全新生成是必需的

發(fā)明人首先探索了pd-1h在口服耐受模型中的作用，在該模型中口服給予雞卵清蛋白(ova)顯示能夠促進itreg細胞在外周血中的擴增和全新生成。將ot-iitcr轉(zhuǎn)基因小鼠與pd-1hko小鼠回交得到新的koot-ii品系。從wtot-ii或koot-ii小鼠的脾細胞中純化cd4⁺t細胞，并去除cd25⁺t細胞(以避免ntreg污染)，隨后轉(zhuǎn)移到wtb6小鼠中。小鼠隨后在飲用水中連續(xù)5天加入1.5％ova(圖1a)。與之前公開的結(jié)果一致，foxp3⁺v5.1/5.2⁺ot-ii細胞可以在包括腸系膜淋巴結(jié)(mln)和派耶氏集合淋巴結(jié)(pp)的腸道相關(guān)淋巴器官中檢測到，而在脾臟、外周ln和椎板固有層(lp)中可檢測到較少的細胞(數(shù)據(jù)未顯示)，表明腸道相關(guān)淋巴器官對ova的treg反應。在不存在pd-1h的情況下，盡管mln和pp中wt和koot-ii細胞基于cfse稀釋度的分裂速度相當(圖6a)但與wtot-ii相比，mln和pp中的foxp3⁺v5.1/5.2⁺ot-ii細胞顯著降低(圖1b和1c)。當將初始wtot-ii細胞和koot-ii細胞共轉(zhuǎn)移到ova喂養(yǎng)小鼠中時，觀察到了類似的結(jié)果(圖6b和6c)。我們發(fā)現(xiàn)在相同的宿主小鼠中，與共轉(zhuǎn)移的wtot-ii細胞相比，ot-ii細胞上的pd-1h缺乏導致foxp3⁺t細胞的分化受損(圖6b和6c)。我們的研究結(jié)果表明pd-1h的喪失影響體內(nèi)ova特異性itreg細胞的誘導。

將初始cd4⁺t細胞轉(zhuǎn)移到淋巴球減少癥小鼠可實現(xiàn)其穩(wěn)態(tài)增殖，該作用可以上調(diào)foxp3的表達，并且這些foxp3⁺itreg細胞在體外獲得抑制功能。為了確定pd-1h是否影響該過程，將來自wt(cd45.1)和ko(cd45.2)小鼠的初始cd4⁺t細胞以1:1的比例混合，并轉(zhuǎn)移到rag1ko小鼠中。3周后分析指示器官中cd25⁺foxp3⁺t細胞的百分數(shù)和絕對數(shù)量(圖7)。我們發(fā)現(xiàn)kocd4⁺t細胞的總數(shù)比脾臟中的wtcd4⁺t細胞增加了兩倍多(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，與wtcd4⁺t細胞相比，在脾、ln和mln中發(fā)現(xiàn)kocd4⁺t細胞中的cd25⁺foxp3⁺itreg細胞的顯著更低。此外，盡管在脾臟中未觀察到明顯變化，但cd4⁺t細胞上的pd-1h損失也導致在ln和mln中比wtcd4⁺t細胞數(shù)量少的foxp3⁺itreg細胞(圖7b)。此外，與淋巴細胞環(huán)境中的wtcd4⁺t細胞相比，我們發(fā)現(xiàn)回收的kocd4⁺t細胞產(chǎn)生顯著更高的ifn-γ和il-17細胞因子(圖7c)。我們得出結(jié)論，pd-1h是foxp3⁺itreg細胞從頭生成所必需的。

pd-1h是itreg細胞的擴增是必需的，但非其產(chǎn)生和功能所必需

pd-1hko小鼠在胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中顯示出正常數(shù)量的ntreg細胞。此外，pd-1hko小鼠中ntreg細胞的表型和抑制功能也與wt同窩小鼠相似(圖8)。這些發(fā)現(xiàn)與以前的觀察結(jié)果一致，即幼年pd-1hko小鼠沒有明顯的自身免疫樣表型。因此，pd-1h似乎對于淋巴器官中ntreg的發(fā)育和功能成熟不是必需的。

因為itreg細胞主要在穩(wěn)定狀態(tài)或炎癥的腸道中產(chǎn)生，我們接下來考察pd-1h的缺乏是否影響itreg的產(chǎn)生和功能。雖然在pd-1hko小鼠和wt同窩出生小鼠中都發(fā)現(xiàn)了在mln和pp中的相似比例的foxp3⁺treg細胞，但pd-1hko小鼠的lp中的foxp3⁺細胞顯著更低，盡管foxp3⁺細胞的絕對數(shù)量在不存在pd-1h的情況下不變(圖2a和2b)。當pd-1hko/wt小鼠回交到foxp3(gfp)小鼠(其中g(shù)fp基因處于foxp3啟動子的控制下)時，lp中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明在體內(nèi)不存在pd-1h的情況下，itreg細胞的分化具有缺陷。為了進一步驗證我們在pd-1hko小鼠中的發(fā)現(xiàn)，我們創(chuàng)建了混合骨髓嵌合體。將來自wt(cd45.1)和ko小鼠(cd45.2)的混合骨髓過繼轉(zhuǎn)移至被亞致死量輻射的b6小鼠。10周后分析指示器官中foxp3⁺細胞的頻率。我們發(fā)現(xiàn)kot細胞總數(shù)比wtt細胞增加了近兩倍(圖9a)。相比之下，kofoxp3⁺t細胞顯著低于外周器官中的wtt細胞和受體t細胞(圖9b和9c)。在嵌合小鼠的脾臟中，kofoxp3⁺t細胞的絕對數(shù)量也低于wtt細胞，而foxp3^-效應t細胞(teff)則更加劇烈地擴增(圖9c)。這些數(shù)據(jù)表明pd-1h對t細胞的活化和穩(wěn)態(tài)是共抑制的，但促進體內(nèi)foxp3⁺treg細胞的發(fā)育。

接下來我們測試pd-1h的損失是否會影響體外itreg細胞的轉(zhuǎn)化。從wt和pd-1hko脾細胞純化得到初始cd4⁺cd25^-cd62l^hi細胞，并在tgf-β存在下用抗cd3/cd28刺激。從wt初始t細胞分化出的foxp3⁺itreg細胞的頻率顯著高于由ko初始t細胞分化出的foxp3⁺itreg細胞(圖2c)。綜上，我們得出結(jié)論，pd-1h對于itreg的從頭分化是必需的。

為了進一步測試pd-1h損失是否影響itreg功能，如上所述在體外誘導來自wt或pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠的itreg細胞，并通過分選進行純化。通過抗cd3刺激純化的cd4⁺cd25^-cd62l^hi初始t細胞產(chǎn)生teff。在受輻射的脾細胞(作為抗原呈遞細胞)及可溶性抗cd3的存在下，將wt或koitreg細胞與效應細胞以指定的treg/teff比共同培養(yǎng)3天。teff在共培養(yǎng)前被cfse標記，并且使用降低的cfse稀釋液作為treg抑制的指標。如圖2d和2e所示，來自wt和ko小鼠的itreg細胞以相當?shù)幕钚砸种苩eff的增殖。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們未在wt與koitreg中發(fā)現(xiàn)激活標記物cd25、gitr、lag-3、ctla-4、icos或pd-1的表達的顯著差異(圖2f)。因此，盡管對itreg的分化有影響，但pd-1h不影響itreg的抑制功能。

我們最后測試了pd-1h激動劑mabmam82對itreg擴增的影響。從wtfoxp3(gfp)敲入小鼠中分選初始t細胞，隨后在tgf-β存在下用抗cd3/cd28刺激。在刺激下測量gfp⁺cd25⁺itreg細胞的誘導。加入mam82輕微增加foxp3⁺cd25⁺itreg擴增，盡管效果呈現(xiàn)中等水平(圖10a和10b)。然而，這種中等水平的作用可能是由于體外t細胞的細胞表面pd-1h的快速損失導致。總而言之，我們的數(shù)據(jù)表明，pd-1h是從初始t細胞產(chǎn)生itreg是必需的，但不影響其抑制功能。

pd-1h通過細胞因子調(diào)節(jié)itreg分化

之前文獻報道活化的pd-1hkocd4⁺t細胞比wtt細胞在體外產(chǎn)生更高水平的ifn-γ和il-17。此外，將來自wt和ko小鼠的初始t細胞共轉(zhuǎn)染淋巴細胞小鼠導致ko與wtt細胞中的foxp3⁺t細胞減少并增加ifnγ⁺和il-17⁺細胞(圖7)。因此，細胞因子可能在不存在pd-1h的情況下調(diào)節(jié)itreg細胞的分化。為了驗證該推測，首先用抗cd3/cd28刺激純化的cd4⁺t細胞，并收集培養(yǎng)的上清液用于細胞因子檢測。與我們以前的發(fā)現(xiàn)一致，與wtcd4⁺t細胞相比，活化的kocd4⁺t細胞產(chǎn)生較高水平的ifn-γ和il-17(圖3a)。在tgf-β存在下，這些細胞因子的產(chǎn)生進一步增加，而tnf-α沒有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，pd-1hkocd4⁺t細胞產(chǎn)生更多il-4，伴隨tgf-β增加或不增加(圖3a)。因為這些細胞因子是由不同的cd4⁺t細胞亞群產(chǎn)生的，所以我們的發(fā)現(xiàn)支持pd-1h作為t輔助細胞的泛抑制劑。

將il-4和/或ifn-γ的中和mab加入到培養(yǎng)物中以利用這些細胞因子在誘導itreg細胞中的作用。如圖所示，與wt對照相比，中和il-4或ifn-γ部分恢復pd-1hkoitreg細胞的分化，而包含兩種mab恢復了大部分活性。作為對照，單獨或組合使用ifn-γ/il-4中和mab也可以增強itreg分化(圖3b和3c)。這些研究結(jié)果表明，在不存在pd-1h的情況下，受損的itreg分化至少部分地是由于t細胞改變細胞因子產(chǎn)生而導致的。

pd-1h的損失有助于在炎癥環(huán)境中itreg轉(zhuǎn)化為th17

隨后我們確定了pd-1h是否對已經(jīng)分化的itreg細胞有直接作用。建立鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型，以測試foxp3⁺itreg細胞的穩(wěn)定性。簡言之，如上所述產(chǎn)生wt或pd-1hkofoxp3(gfp⁺)itreg細胞，并通過基于gfp陽性的流式細胞術(shù)(>97％foxp3⁺，圖11a)進行分選。濃度為1×10⁶/小鼠的foxp3(gfp⁺)cd45.2⁺itreg細胞被靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移到cd45.1⁺b6免疫前小鼠中，其中轉(zhuǎn)移的wtitreg的數(shù)目不足以阻止eae進展。然后用髓磷脂堿性蛋白質(zhì)免疫小鼠以誘導eae。在這種情況下，與對照相比，wtitreg細胞的轉(zhuǎn)移稍微延遲了疾病的發(fā)病。然而，pd-1hkoitreg細胞的轉(zhuǎn)移導致更嚴重的疾病(如臨床評分所示)，盡管在疾病高峰期沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖4a)。有趣的是，eae小鼠脊髓的h&e染色顯示kotreg轉(zhuǎn)移的小鼠和wttreg轉(zhuǎn)移的小鼠之間的淋巴細胞浸潤具有微小差異(數(shù)據(jù)未顯示)。然后我們分析了在疾病進展期間轉(zhuǎn)移的treg細胞中foxp3表達的穩(wěn)定性。與wt小鼠的itreg相比，koitreg的foxp3頻率(gfp⁺)在脾臟和dln中都降低了50％以上(圖4b和4c)。此外，dln中kofoxp3⁺細胞的絕對數(shù)量與dln中的wtfoxp3⁺細胞相比顯著減少，盡管脾臟中foxp3⁺t細胞的數(shù)量相當(圖4c)。因此，我們的研究結(jié)果表明了pd-1h在維持itreg表型和功能方面的作用。

在treg向其他cd4⁺t細胞亞群的可轉(zhuǎn)換性方面，我們的研究結(jié)果表明了itreg向包括th1和th17在內(nèi)的效應性t細胞亞群的轉(zhuǎn)化(在eae中被認為是致病性的)。為了驗證這種可能性，用pma/離子霉素在第13天刺激來自宿主小鼠的脾臟和dln細胞4小時，使用細胞內(nèi)染色檢查cd45.2⁺cd4⁺門控細胞的gfp(foxp3表達的指標)、ifn-γ和il-17。與用wtitreg細胞轉(zhuǎn)移的小鼠相比，用pd-1hkoitreg細胞轉(zhuǎn)移的小鼠的脾臟和dln中觀察到轉(zhuǎn)化的th1樣細胞(ifn-γ⁺foxp3^-)的比例適度增加(圖4e)。然而，在這兩組小鼠中，轉(zhuǎn)化的th1樣細胞ifn-γ⁺細胞的絕對數(shù)量沒有顯著差異(圖4e)，表明itreg向th1的轉(zhuǎn)化非常少。然而，大部分pd-1hkoitreg細胞(脾臟中16.7％、dln中6.1％)轉(zhuǎn)化為il-17⁺細胞，并且從wtitreg細胞到il-17⁺細胞的轉(zhuǎn)化非常少(在脾臟和dln中均少于2％)(圖4e和4f)。使用相同的策略，我們分析了受試者cd4⁺t細胞(門控cd45.1⁺)，其顯示與wt或pd-1hkoitreg細胞轉(zhuǎn)移的兩組小鼠中ifn-γ⁺和il-17⁺細胞的相當水平(圖11b和11c)。這些結(jié)果表明，pd-1h的損失促進了itreg在炎性環(huán)境中轉(zhuǎn)化為th17樣細胞。因此，pd-1hkoitreg細胞部分促進eae進展的作用(圖4a)可能是炎癥環(huán)境中itreg轉(zhuǎn)化為th17的結(jié)果。

發(fā)明人還評估了pd-1hkotreg對慢性結(jié)腸炎t細胞轉(zhuǎn)移模型的影響。如上所述制備wt和kofoxp3(gfp⁺)treg(cd45.2)，分別與同種cd45.1teff(cd45rb^hicd25^-cd4⁺)混合，并且隨后轉(zhuǎn)移到rag1ko小鼠中。在這個實驗中，即使單獨轉(zhuǎn)移cd45rbhiteff，我們也沒有觀察到疾病進展期間明顯的體重減輕(圖12a)。然而，共轉(zhuǎn)移pd-1hkotreg/teff導致大量白細胞浸潤和結(jié)腸嚴重的組織損傷(通過h&e染色看出)，而wttreg/teff的共轉(zhuǎn)移顯示結(jié)腸組織沒有明顯的損傷(圖12b和12c)。為了確定pd-1hkotreg細胞減弱的抑制能力是否與foxp3表達的損失相關(guān)，我們評估了宿主rag1ko小鼠的脾臟和mln中的foxp3表達。與treg功能損失一致，與wttreg相比(脾臟17％，mln中為54％)，pd-1hkotreg中foxp3表達下調(diào)(脾臟11％，mln39％)(圖12d和12e)。然而，在pd-1hkotreg與wttreg共轉(zhuǎn)移小鼠之間，foxp3⁺t細胞的絕對數(shù)量沒有顯著差異(圖12f)。此外，用pd-1hkotreg轉(zhuǎn)移的小鼠(脾臟為30.7％，mln為14.9％)比用wttreg(脾臟為7％，mln為3.95％)轉(zhuǎn)移的小鼠具有顯著更多的ifn-γ⁺細胞(圖12g)。最后，pd-1hkotreg(脾臟為13.3％，mln為9.8％)轉(zhuǎn)移后比wttreg(脾臟3.64％，mln為4.44％)轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)更多的il-17⁺t細胞(圖12g和12h)。在pd-1hkotreg/teff轉(zhuǎn)移和在wttreg/teff轉(zhuǎn)移之間未觀察到ifn-γ⁺和il-17⁺teff(cd45.1)在脾臟和mln中的差異(圖12i)。我們的研究結(jié)果表明，treg缺乏pd-1h導致treg快速轉(zhuǎn)化為其他可能促進炎癥的效應cd4細胞。因此，pd-1h對于維持treg細胞在炎癥下的抑制功能和foxp3的表達是必需的。

在pd-1hkoitreg細胞中stat3活性和foxp3增強子甲基化增加

stat5激活驅(qū)動treg譜系定型，而stat3抑制foxp3表達并促進th17細胞反應。為了檢查pd-1h的損失是否形成了treg細胞中的stat通路，我們分析了eae模型中stat-5和stat-3的激活。pd-1hkoitreg細胞(高達47％的p-stat3)在eae小鼠的脾和dln中比wtitreg細胞表達顯著更高水平的磷酸化stat-3(p-stat3)。然而，在wt和pd-1hkoitreg細胞中發(fā)現(xiàn)相當?shù)膒-stat5水平(圖5a和5b)，暗示stat3(而不是stat5)在pd-1h功能中的作用。

以前的研究表明，foxp3增強子的cns2(保守的非編碼dna序列2)區(qū)域的dna甲基化狀態(tài)對維持foxp3表達特別重要。我們在本發(fā)明中確定了pd-1hkoitreg細胞中cns2區(qū)域的甲基化。如圖5c所示，體外誘導的wtitreg顯示cns2區(qū)域的幾乎一半被去甲基化(平均為40.8％)。然而，pd-1hkoitreg細胞的去甲基化顯著減少(平均17.5％)，foxp3增強子cns2區(qū)域的超甲基化平均為82.5％。這一觀察結(jié)果解釋了pd-1hkoitreg細胞在foxp3表達方面的不穩(wěn)定性?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，pd-1h缺乏對treg的分化和表型穩(wěn)定性具有顯著影響。

本發(fā)明的結(jié)果表明，pd-1h是一種關(guān)鍵的細胞表面信號分子，通過兩種不同的機制控制誘導性treg的細胞數(shù)量水平。第一，從初始t細胞產(chǎn)生itreg需要pd-1h。這種作用主要是通過抑制炎性細胞因子(如ifn-γ、il-4和il-17)介導的。結(jié)果，響應環(huán)境刺激的itreg的數(shù)量減少。盡管pd-1h不影響itreg在每個細胞水平的抑制功能，但itreg水平的減少可能最終會影響免疫反應期間treg的整體抑制功能。第二，pd-1h信號傳導阻止在炎癥環(huán)境中將itreg轉(zhuǎn)化為th1和th17。這種作用可能是由于pd-1h對itreg細胞上的foxp3表達的直接調(diào)節(jié)作用導致的。通過促進itreg的產(chǎn)生和防止itreg轉(zhuǎn)化為th1和th17，pd-1h有助于在炎癥期間保持恒定的itreg水平。據(jù)我們所知，這是描述pd-1h的調(diào)解機制和控制調(diào)節(jié)性t細胞的機制的第一次全面研究。

雖然pd-1h的共抑制功能已經(jīng)在早期研究中得到證實，但這種作用所依賴的機制尚未闡明。wang及其同事表明，在tgf-β存在下，pd-1hig部分促進了itreg細胞的分化，這種作用可以在小鼠和人類cd4⁺t細胞中發(fā)現(xiàn)。此外，pd-1h的單克隆抗體降低腫瘤抗原特異性itreg細胞在體內(nèi)的分化。在這些研究中，pd-1h被認為是一種配體，它與treg上的一個尚未鑒別的抑制性受體結(jié)合，以調(diào)節(jié)這種作用。我們使用pd-1h缺陷小鼠和pd-1h激動劑mab的結(jié)果顯示pd-1h作為t細胞上的共抑制受體。還應注意，pd-1h在抑制免疫應答中的作用可能更復雜，并且可以通過多于一種單一機制起作用。我們最近的研究表明，pd-1h介導的對同種異體抗原的t細胞耐受性的抑制是由兩種不同的機制介導的：早期阻止細胞增殖和晚期誘導treg以維持移植物耐受性。在本發(fā)明中，我們揭示了pd-1h在控制treg細胞數(shù)量水平中的關(guān)鍵作用，這可能有助于誘導t細胞反應的長期耐受

pd-1h對treg的影響是一個高度選擇性的事件。雖然pd-1h對于從初始t細胞產(chǎn)生itreg是必不可少的，但ntreg和itreg的抑制功能不受影響。特別是pd-1h對于通過自身抗原選擇的、胸腺來源的ntreg細胞的產(chǎn)生和抑制功能不是必需的(圖8)。這個結(jié)果可能部分解釋了為什么在年幼pd-1hko小鼠中沒有觀察到自發(fā)性自身免疫疾病或淋巴組織增生癥狀。然而，在初始小鼠中自發(fā)產(chǎn)生的itreg細胞明顯受到影響(圖2a)，這在先前在tgf-β和視黃酸存在下在活化的cd4+t細胞中觀察到過，并且該群體主要積聚在腸和皮膚中粘膜。

盡管發(fā)現(xiàn)foxp3⁺itreg細胞的頻率在腸內(nèi)降低，特別是在pd-1hko小鼠的lp中，但lp中foxp3⁺itreg的絕對數(shù)量沒有變化(圖2a)。這可能部分解釋了為什么pd-1hko小鼠不會在腸道中發(fā)展自發(fā)性致病性疾病。我們還在pd-1hko小鼠驗證了這個結(jié)論，該小鼠與foxp3(gfp)小鼠(gfp表達在foxp3啟動子控制下)交配而產(chǎn)生pd-1hkofoxp3(gfp)小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)。使用口服耐受模型進一步證實了這些發(fā)現(xiàn)，如前所述，該模型用于在體內(nèi)從體內(nèi)產(chǎn)生全新itreg細胞。與pd-1hko小鼠的腸道中的發(fā)現(xiàn)一致，pd-1h缺乏導致在mln和pp中抗原特異性foxp3⁺itreg細胞的全新生成受損(圖1a和1b)。此外，初始cd4⁺t細胞在tgf-β存在下體外轉(zhuǎn)化為itreg細胞進一步證明pd-1h缺乏可減少itreg細胞的分化(圖2c)。最后，與wtitreg細胞相比，itreg細胞的pd-1h缺乏表現(xiàn)出相似的抑制功能，盡管treg/teff比值較高時可以發(fā)現(xiàn)微小的差異(圖2d和2e)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在淋巴細胞環(huán)境中，cd4⁺t細胞上pd-1h的損失導致平衡增殖后外周器官中foxp3⁺treg數(shù)量的減少，同時產(chǎn)生大量的促炎細胞，這進一步阻礙了treg的體內(nèi)分化(圖7)。在骨髓嵌合小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的發(fā)現(xiàn)，造血來源的細胞上的pd-1h的損失導致骨髓細胞(如嗜中性粒細胞、巨噬細胞)(數(shù)據(jù)未顯示)的更高的恢復，因此促炎細胞因子的產(chǎn)生可能阻礙外周treg細胞的數(shù)量水平(圖9)。因此，我們的研究結(jié)果支持pd-1h在產(chǎn)生itreg方面的高度選擇性作用。

treg不是終末分化的，并且itreg可以通過特異性細胞因子或炎癥環(huán)境轉(zhuǎn)化成th1或th17亞類。treg細胞的這種可塑性使得在慢性炎癥期間難以研發(fā)出治療策略。本發(fā)明表明，pd-1h對于treg譜系的標志物foxp3的穩(wěn)定性是必需的，并保持了treg的表型。pd-1h的損失導致各種體外和體內(nèi)系統(tǒng)和模型中itreg的快速降低。我們的研究表明，在缺乏pd-1h的情況下，itreg細胞易于在炎癥狀態(tài)下重編程成為th17細胞，這可能解釋了pd-1hkoitreg的轉(zhuǎn)移不是抑制而是促進eae疾病的觀察結(jié)果。在這個模型中，itreg主要轉(zhuǎn)化為th17，很少轉(zhuǎn)化為th1。pd-1h也可能影響itreg向th1的轉(zhuǎn)化，因為在不存在pd-1h的情況下，在cd4⁺t細胞中檢測到高水平的ifn-γ。有意思的是，我們的研究結(jié)果表明il-4水平也顯著增加，這些數(shù)據(jù)暗示pd-1h在控制th2中的可能作用。pd-1h在itreg向其他t細胞亞群的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)化中的作用尚待闡明。

總之，本發(fā)明支持pd-1h在炎性環(huán)境中抑制itreg細胞轉(zhuǎn)化為th1和th17細胞，至少部分是由于其在維持foxp3表達和itreg表型中的作用。這些發(fā)現(xiàn)對調(diào)節(jié)treg生長和功能具有重要意義。同時，如先前所示，pd-1h抑制初始t細胞的激活以限制t細胞介導的免疫應答的啟動，它促進免疫應答期間itreg的生長和轉(zhuǎn)化。除了調(diào)節(jié)早期t細胞活化外，pd-1h似乎通過調(diào)節(jié)treg細胞數(shù)量水平參與t細胞耐受性的調(diào)節(jié)。因此，pd-1h途徑可能一種是在炎癥、自身免疫疾病和癌癥中控制和操縱t細胞介導的免疫方面有希望的靶標。

本發(fā)明雖然已針對具體實施方式做詳細的描述，但應當理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在所公開的實施例的基礎(chǔ)上對本發(fā)明做出修改和改進而不違背本發(fā)明的精神，而這些改進和修改仍屬于本發(fā)明的范圍。