本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術領域，特別涉及一種具有坐骨神經保護功能的plga復合微球及其制備方法。

發(fā)明背景

外周神經損傷是臨床上常見的疾病類型，然而其修復一直是臨床醫(yī)生面臨的棘手問題。研究表明，一些細胞因子在神經修復工具有重要作用，典型的代表如神經生長因子(ngf)與促紅細胞生成素(epo)。在以往的研究中，相關研究人員分別在坐骨損傷動物模型中探討了ngf與epo的神經保護作用，并發(fā)現(xiàn)均具有顯著的粗神經功能恢復作用。然而，直接以水溶液形式注射的細胞因子，在體內作用時間非常短暫，難以達到有效的神經保護作用，而長時間的定期注射在實踐中又較為繁瑣?；诖?，控制細胞因子的體內長時間釋放成為研究人員關注的。

聚乳酸羥基乳酸(plga)是臨床批準應用的醫(yī)用高分子材料，由于其較好的生物相容性與可降解性，在藥物控釋領域受到眾多研究人員的青睞。在以往的研究中，不同的研究團隊分別嘗試了利用plga材料用于細胞因子或化學藥物的體內遞送，且在坐骨神經損傷動物模型的試驗表明，基于生物材料的藥物緩釋策略能夠達到顯著的神經保護作用。盡管如此，由于神經損傷后導致的病理環(huán)境是較為復雜的，單一的藥物或者神經保護因子在神經損傷后的保護作用是較為局限的。近年來的基礎研究發(fā)現(xiàn)，盡管ngf與epo均具有神經保護作用，但其神經保護作用的機制卻具有顯著差異。ngf的神經保護機制涉及到促進感覺與運動神經元再生、stat3通路調控、促進軸突生長等；epo的神經保護機制涉及到生長相關蛋白43的上調、rhoa/rock通路調控、抑制神經細胞凋亡等等。ngf與epo在神經保護中的不同作用提示我們，兩者在坐骨神經損傷保護中可能發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用。因此，發(fā)展一種具有同時ngf與epo的藥物制劑，有望獲得雙重神經保護作用，從而提高神經保護效果，具有重要意義。然而，相關產品與研究尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于制備一種同時攜帶ngf與epo的plga藥物緩釋微球，從而賦予其雙重神經保護作用，以提高對坐骨神經損傷的保護效果。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種具有坐骨神經雙重保護功能的plga微球，包括以下步驟；

(1)將epo與ngf共溶于水，混合均勻；

(2)0.5mlepo/ngf水溶液加入到4ml10％的plga溶液中，超聲乳化分鐘，制備初乳液；

(3)將初乳液倒入外水相中，初乳液與外水相比例1∶10；

(4)利用勻質機在10000rpm速率下均質1min；

(5)室溫固化5小時，并在100rpm轉速下緩慢攪拌使溶劑揮發(fā)；

(6)200g離心5min收集微球，并使用去離子水洗3次；

(7)收集的微球凍干備用。

步驟(1)中所述的epo與ngf水溶液，溶液濃度不是本發(fā)明的關鍵，但較高的濃度能夠提高所制備plga微球的藥物攜帶量；

步驟(3)中所述的外水相，為含2％聚乙烯醇(pva)、3％nacl水溶液。

本發(fā)明的有益效果是，通過將ngf與epo同時包裹于plga微球，以獲得具有同時緩釋ngf與epo兩種神經保護因子的藥物制劑，從而達到增強的神經損傷保護效果。相對于以往的神經保護藥物緩釋方法而言，本發(fā)明制備的plga微球攜帶了在神經機制上具有顯著不同的兩種因子，他們在共同緩釋過程中將發(fā)揮協(xié)同作用，從而增強作用效果。

附圖說明

圖1plga載藥微球的電鏡觀察；(a)ngf/plga微球；(b)epo/plga微球；(c)ngf/epo/plga復合微球。

圖2ngf/plga微球、epo/plga微球以及ngf/epo/plga復合微球中細胞因子體外釋放曲線。

圖3坐骨神經損傷大鼠接受不同處理后的神經恢復狀況觀察；a，接受pbs注射實驗組；b，接受對照plga微球注射實驗組；c，接受ngf/plga微球注射實驗組；d，接受epo/plga微球注射實驗組；e，接受ngf/epo/plga復合微球注射實驗組。

具體實施方式

下面通過以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，以便本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不對本發(fā)明構成任何限制。

實施例1：plga載藥微球制備與表征

(1)plga載藥微球制備

1)ngf微球：將5000iungf溶于0.5ml水中，再將藥物的水溶液于4ml油相(10％plga溶液，溶劑二氯甲烷)混合，超聲乳化1min后，倒入40ml外水相中(2％pva與3％nacl混合溶液)，再用均質機10000rpm速率下均質1min后，室溫固化5h，超純水洗滌3次(200g離心3min)，冷凍干燥后，得到最終的微球；

2)epo微球：將5000iuepo溶于0.5ml水中，隨后與4ml油相(10％plga溶液，溶劑二氯甲烷)混合，超聲乳化1min后，倒入40ml外水相中(2％pva與3％nacl混合溶液)，再用均質機10000rpm速率下均質1min后，室溫固化5h，超純水洗滌3次(200g離心3min)，冷凍干燥后，得到最終的微球；

3)ngf和epo緩和微球：將5000iuepo與ngf共融于0.5ml水中，混合均勻后，再將藥物的水溶液與4ml油相(10％plga溶液，溶劑二氯甲烷)混合，超聲乳化1min后，倒入40ml外水相中(2％pva與3％nacl混合溶液)，再用均質機10000rpm速率下均質1min后，室溫固化5h，超純水洗滌3次(200g離心3min)，冷凍干燥后，得到最終的微球。

(2)plga載藥微球形態(tài)觀察

用導電膠粘取少許微球后，將其貼與樣品臺上，120ma噴金30s后，用電鏡觀察表面形貌。如附圖1所示，所制備的微球形態(tài)規(guī)則，表面光滑，大小相對較為均一。激光粒度儀中測定不同微球的直徑分別為：ngf/plga微球19.72±6.41μm，epo/plga微球17.86±7.56μm，ngf/epo/plga復合微球22.14±4.98μm。

(3)plga載藥微球體外藥物釋放曲線測定

稱取約10mg載藥微球，將其懸浮于1ml10mmpbs中，37℃孵育，在不同時間點取出全部上清液，再加入等量的新鮮pbs。用elisa試劑盒測量上清液中藥物濃度。如圖2所示為不同微球的釋放曲線，提示ngf、epo蛋白的釋放持續(xù)約2周。

實施例2：plga載藥微球對坐骨神經損傷大鼠的神經保護作用

(1)大鼠坐骨神經損傷模型制備與plga微球注射

1)大鼠通過腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，取出鼠毛后碘伏消毒，右后肢作切口；

2)鈍性分離肌肉暴露坐骨神經；

3)在臀大肌下面神經中央區(qū)作2mm的神經損傷切口，盡量減少其他部位組織損傷；

4)將0.5mlplga微球懸液，分別含微球100mg注射到神經損傷周圍，對照組注射0.5mlpbs或0.5ml空載plga微球。

5)縫合傷口，單籠常規(guī)飼養(yǎng)。

(2)坐骨神經的透射電鏡觀察

1)手術后4周取材坐骨神經標本，浸泡于3％戊二醛溶液中4攝氏度固定過夜；

2)隨后將標本固定于oso4溶液，4攝氏度3-4小時；

3)低度酒經脫水后，包埋于環(huán)氧樹脂做成標本；

4)做橫斷切面1-1.5μm厚切片，使用0.5％甲苯胺(0.5％硼酸鹽配制)，使用投射電鏡進行觀察坐骨神經再生情況。如圖3所示，pbs對照組與plga空載體對照組神經纖維明顯退化，軸突直徑不規(guī)則，大小不一，能夠觀察到明顯的成纖維細胞侵入；相比之下，ngf/plga與epo/plga對照組損傷的神經結構形態(tài)有明顯改善，髓鞘形成較好，成纖維侵入少；ngf/epo/plga復合微球處理組動物，坐骨神經損傷改善最為明顯。提示：ngf/epo/plga復合微球鉸單一的ngf/plga或epo/plga微球具有明顯較好的神經損傷保護功能。