Alport綜合征新的突變致病基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明通過(guò)外顯子測(cè)序方法鑒定了與Alport綜合征相關(guān)的兩個(gè)致病基因的兩個(gè)新發(fā)突變。具體地，發(fā)明人以兩個(gè)ATS家系為研究對(duì)象，對(duì)這兩個(gè)家系中的患病個(gè)體和非患病個(gè)體分別進(jìn)行外顯子組測(cè)序和比較，在其中一個(gè)家系的C0L4A4基因上發(fā)現(xiàn)移碼缺失突變(c.3213delA,p.Lysl071fs*5)，在另一個(gè)家系的C0L4A5基因上發(fā)現(xiàn)移碼缺失突變（c.499delC,p.Prol67Glnfs*36)，這兩個(gè)移碼缺失位點(diǎn)分別是這兩個(gè)家系真正的致病位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了突變的C0L4A4基因和C0L4A5基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含突變的C0L4A4基因和/或C0L4A5基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。利用該突變的C0L4A4基因和/或C0L4A5基因，可以對(duì)Alport綜合征進(jìn)行分子診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。這兩個(gè)突變基因及其編碼蛋白質(zhì)還可作為治療Alport綜合征的藥物革巴點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】Alport綜合征新的突變致病基因及其編碼蛋白和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人體變異的基因，尤其涉及一種Alport綜合征新的突變致病基 因。本發(fā)明還涉及Alport綜合征新的突變致病基因的編碼蛋白質(zhì)和應(yīng)用，包含突變的 Alport綜合征致病基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] Alport綜合征（Alport syndrome, ATS)是以家族性進(jìn)行性出血性腎炎、眼疾和 耳聾為特征的一種遺傳病，發(fā)病率約為1/5000。1927年，Alprot首次報(bào)道該病，家系中受 累患者表現(xiàn)為進(jìn)行性血尿和耳聾，男性患者早年死于尿毒癥，女性患者存活時(shí)間較長(zhǎng)。ATS 首發(fā)癥狀一般為腎臟癥狀，兒童期表現(xiàn)為周期性鏡下或肉眼血尿，男性患者比女性患者發(fā) 病早。其它癥狀還包括神經(jīng)性耳聾和眼部疾病。典型病理改變?yōu)槟I臟基底膜超微結(jié)構(gòu)改 變（變薄、增厚和破裂），但疾病早期可能觀察不到患兒腎臟的病理改變，給病理學(xué)快速 診斷帶來(lái)一定難度。腎功能衰竭呈漸進(jìn)性，約0. 3%?2. 3%的患者最終進(jìn)展為末期腎病 (endstagerenal disease, ESRD)。X 連鎖 ATS (X-linked ATS, XL-ATS)患者發(fā)生 ESRD 比例 較高，12%的女性患者在40歲之前發(fā)展為ESRD，30%的女性患者在60歲前發(fā)展為ESRD，而 男性患者幾乎全部發(fā)展為ESRD。且大多數(shù)ATS患者存在耳聾癥狀。
[0003] ATS是一種單基因遺傳病，由編碼IV型膠原的基因突變引起。其致病基因包括 C0L4A3(the collagen of basement membrane, alpha_3chain gene)、C0L4A4 和 C0L4A5。 最常見(jiàn)的ATS為XL (X連鎖，X-I inked)，約占80 %，其次為AR (常染色體隱性遺傳性， autosomal recessive),約占15%，還有少數(shù)患者呈AD(常染色體顯性遺傳性，autosomal dominant)〇
[0004] 常染色體隱性遺傳性 ATS (autosomal recessive ATS, AR-ATS)由 C0L4A3 或 C0L4A4基因純合或復(fù)合雜合突變引起?；颊甙Y狀較嚴(yán)重，男女無(wú)明顯區(qū)別，一般在30歲左 右發(fā)生ESRD。女性患者具有嚴(yán)重的臨床表型，患者父母多為近親結(jié)婚，男性患者的父親存 在鏡下血尿和免疫組化檢測(cè)缺乏α 3- α 5標(biāo)記。已發(fā)現(xiàn)至少47種C0L4A3基因突變和27 種C0L4A4基因突變與AR-ATS發(fā)病相關(guān)。常染色體顯性遺傳性ATS (autosomal dominant ATS, AD-ATS)較為罕見(jiàn)。共報(bào)道6個(gè)家系，3個(gè)由C0L4A3基因突變引起，3個(gè)由C0L4A4基因 突變引起。可表現(xiàn)為父到子遺傳傳遞模式，該類型癥狀較輕，男女表現(xiàn)類似癥狀，ESRD和聽(tīng) 力損傷一般出現(xiàn)在50歲以后，無(wú)眼部疾病。X連鎖顯性遺傳型ATS伴彌漫性平滑肌瘤患者 有發(fā)現(xiàn)C0L4A6及C0LA4A5基因突變，這種突變多為C0L4A6和C0LA4A5基因5'端的缺失， 導(dǎo)致腎小球及食管平滑肌瘤的基底膜的改變。
[0005] C0L4A4基因定位于染色體2q36_37,其包含48個(gè)外顯子，長(zhǎng)度從9bp至287bp不 等，其內(nèi)含子、外顯子的分界基本明確。ATS小鼠動(dòng)物模型在插入了突變了的C0L4A3和 C0L4A4表現(xiàn)出與人類ATS -樣的表型與超微結(jié)構(gòu)。該基因編碼IV型膠原的α 4鏈（1690 個(gè)氨基酸殘基）。IV型膠原是構(gòu)成基底膜的主要成分，由三條α鏈構(gòu)成一個(gè)三螺旋分子， 兩個(gè)IV型膠原分子以端端連接或端側(cè)吻合/四個(gè)IV型膠原分子以側(cè)側(cè)吻合方式組成一個(gè) 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成基底膜的支架。到目前為止，通過(guò)特異的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)6種不同 a鏈，分別稱a I- α 6,而構(gòu)成IV型膠原的6條α鏈在參與構(gòu)成IV型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)時(shí) 不一致，通常認(rèn)為IV型膠原α?和α2鏈形成三股螺旋，構(gòu)成一類IV型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；而 由IV型膠原α 3- α 6鏈形成的三股螺旋，將構(gòu)成另一類IV型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。α 1和α 2 鏈廣泛分布于幾乎所有的基底膜，α 3、α 4和α 4鏈僅局限性分布于腎小球，內(nèi)耳及眼部。 Boye等人通過(guò)PCR-SSCP法對(duì)31例來(lái)源于不同國(guó)家及地區(qū)的AR-ATS患者C0L4A4基因所有 外顯子進(jìn)行基因突變的檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)移碼突變、錯(cuò)義突變及連接點(diǎn)突變。Btlzza等也在該基 因不同部位發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變。
[0006] C0L4A5基因位于Xq22. 3,長(zhǎng)250kb，含51個(gè)外顯子，編碼1685個(gè)氨基 酸殘基（α 5 (IV)鏈）。α 5 (IV)鏈由26個(gè)氨基酸信號(hào)肽、甘氨酸-X-Y三聯(lián)結(jié)構(gòu) (Gly-Xaa-Yaa-repeat sequence, GXY)反復(fù)串聯(lián)而成的膠原區(qū)（1430個(gè)氨基酸）和羧基端 非膠原區(qū)（carboxyl-terminal noncollagenous domain, NCl ; 229 個(gè)氨基酸）組成。NCl 區(qū)對(duì)啟動(dòng)IV型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的形成有重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的C0L4A5基因突變超 過(guò)440種，不同地區(qū)和種族患者的基因突變不同，且不存在突變熱點(diǎn)。絕大部分突變?yōu)檫z傳 性，也有10% -15%的突變是新發(fā)生的，提示該病存在很大的危害性。由于女性患者保留一 條正常X染色體，基因功能未完全喪失，而男性患者只存在一條異常X染色體，因此男性患 者一般比女性患者表現(xiàn)為更嚴(yán)重臨床癥狀。
[0007] 最近，外顯子組測(cè)序（exome sequencing)被成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的 致病基因，如Freeman - Sheldon綜合癥的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合征的SETBPl 基因，以及嚴(yán)重大腦畸形的WDR62突變等。全外顯子測(cè)序技術(shù)已被證明為降低稀有單基因 疾病候選基因甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段，僅通過(guò)對(duì)幾個(gè)很少的個(gè)體（包括患 者及正常對(duì)照）的全外顯子進(jìn)行測(cè)序來(lái)篩選與疾病相關(guān)的變異，其成功率大為提升。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的在于利用外顯子組測(cè)序技術(shù)鑒別出Alport綜合征致病基因新 的突變位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，提供Alport綜合征新位點(diǎn)突變的致病基因及其編碼蛋白質(zhì)和應(yīng) 用，包含Alport綜合征新位點(diǎn)突變致病基因的載體、宿主細(xì)胞以及試劑盒，以對(duì)Alport綜 合征進(jìn)行分子診斷和患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步治療該疾病提供設(shè)計(jì)藥物的靶點(diǎn)，同時(shí)為闡 明該病的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
[0009] 因此，一方面，本發(fā)明提供了一種突變的C0L4A4基因，所述突變的C0L4A4基因序 列導(dǎo)致Alport綜合征的發(fā)生，其基因序列如SEQ ID NO: 2所示。野生型的C0L4A4基因序 列如SEQ ID NO: 1所示，編碼區(qū)具有5073個(gè)堿基，與野生型的C0L4A4基因序列相比，突變 的 C0L4A4 基因發(fā)生了移碼缺失突變（c. 3213delA, p. Lysl071fs*5)，即 SEQ ID NO: 1 中第 3213位的堿基A缺失了，只有5072個(gè)堿基，導(dǎo)致了第3213位后所有的堿基序列發(fā)生移碼。 [0010] 第二方面，本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO:2序列編碼的蛋白質(zhì)，由于突變的C0L4A4 基因在第3213位發(fā)生了移碼缺失突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列在第1071位后與野生型 的C0L4A4蛋白質(zhì)氨基酸序列完全不同，且移碼導(dǎo)致了終止密碼子的出現(xiàn)，使得SEQ ID N0:2 序列編碼的蛋白質(zhì)翻譯提前終止，突變的C0L4A4基因編碼的蛋白質(zhì)只有1139個(gè)氨基酸，其 氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。野生型的C0L4A4蛋白質(zhì)序列有1690個(gè)氨基酸，其序列 如SEQ ID N0:3所示，比突變型的C0L4A4蛋白質(zhì)序列更長(zhǎng)。
[0011] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種突變的C0L4A5基因，所述突變的C0L4A5基因序列導(dǎo)致 Alport綜合征的發(fā)生，其基因序列如SEQ ID NO:6所示。野生型的C0L4A5基因序列如SEQ ID N0:5所示，編碼區(qū)具有5058個(gè)堿基，與野生型的C0L4A5基因序列相比，突變的C0L4A5 基因發(fā)生了移碼缺失突變（c. 499delC，p. Prol67Gln fs*36)，即SEQ ID N0:5中第499位的 堿基C缺失了，只有5057個(gè)堿基，且導(dǎo)致了第499位后所有的堿基序列發(fā)生移碼。
[0012] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了 SEQ ID N0:6序列編碼的蛋白質(zhì)，由于突變的C0L4A5基因 在第499位發(fā)生了移碼缺失突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列在第167位以后與野生型的 C0L4A5蛋白質(zhì)氨基酸序列完全不同，且移碼導(dǎo)致了終止密碼子的出現(xiàn)，使得SEQ ID N0:6序 列編碼的蛋白質(zhì)翻譯提前終止，突變的C0L4A5基因編碼的蛋白質(zhì)只有201個(gè)氨基酸，其氨 基酸序列如SEQ ID N0:8所示。野生型的C0L4A5蛋白質(zhì)序列有1685個(gè)氨基酸，其序列如 SEQ ID N0:7所示，比突變型的C0L4A5蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)很多。
[0013] 第三方面，本發(fā)明還提供了含有上述突變的C0L4A4基因和/或突變的C0L4A5基 因的載體。
[0014] 第四方面，本發(fā)明還提供了被上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述突變的 C0L4A4基因和/或突變的C0L4A5基因直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
[0015] 第五方面，本發(fā)明還提供了上述突變的C0L4A4基因和/或突變的C0L4A5基因在 用作治療Alport綜合征的藥物祀點(diǎn)或制備Alport綜合征診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0016] 第六方面，本發(fā)明還提供了 一種用于診斷Alport綜合征的試劑盒，所述試劑盒包 含能夠特異性擴(kuò)增上述突變的C0L4A4基因和/或如突變的C0L4A5基因的引物，或能夠特 異性檢測(cè)上述突變的C0L4A4基因和/或突變的C0L4A5基因的探針。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物包括上游引物5'-GGATTTCCAGGGACACCAG-3'， 下游引物 5' -TGTAATAGCCAAGACCTGAAGACA-3' ；和 / 或上游引物 5, -TGAATCTTCAGATCATTTTTCTGG-3，，下游引 5, -GAGGGATTGTTGTAATCTTCTGG-3，。
[0018] 第七方面，本發(fā)明還提供了一種抗體，所述抗體與上述突變的C0L4A4基因編碼的 突變C0L4A4蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，且不作用于野生型C0L4A4基因所編碼的蛋白質(zhì)。
[0019] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種抗體，所述抗體與上述突變的C0L4A5基因編碼的突變 C0L4A5蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，且不作用于野生型C0L4A5基因所編碼的蛋白質(zhì)。
[0020] 第八方面，本發(fā)明還提供了 Alport綜合征治療劑，所述治療劑包含了上述兩種抗 體中的至少一種。
[0021] 本發(fā)明通過(guò)外顯子組測(cè)序技術(shù)鑒定了與Alport綜合征相關(guān)的兩個(gè)致病基因的兩 個(gè)新發(fā)突變。一方面，通過(guò)檢測(cè)受試者是否攜帶有這兩個(gè)致病基因的兩個(gè)新發(fā)突變，可以早 期篩查Alport綜合征致病突變基因攜帶者，提供優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)；也可為Alport綜合征患 者提供分子診斷依據(jù)。特別地，本發(fā)明所提供的診斷試劑盒可用于快速、有效地預(yù)測(cè)或診 斷Alport綜合征。另一方面，本發(fā)明為Alport綜合征的發(fā)病機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)，為 Alport綜合征患者的治療提供全新的理論依據(jù)。第三方面，本發(fā)明可以為治療Alport綜合 征提供可能的藥物靶點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是某四代Alport綜合征家系1圖，其中正方形表示男性，圓圈表示女性；帶斜 線為死亡，實(shí)心為患病個(gè)體，空心為正常個(gè)體；N/N表示normal，即正常個(gè)體，N/M表示攜帶 有C0L4A4c. 3213delA突變的雜合個(gè)體，即患者。
[0023] 圖2是某四代Alport綜合征家系2圖，其中正方形表示男性，圓圈表示女性；帶斜 線為死亡，實(shí)心為患病個(gè)體，空心為正常個(gè)體；N/N表示normal，即正常個(gè)體，N/M表示攜帶 有C0L4A5c. 499delC突變的雜合個(gè)體，即患者。
[0024] 圖3為移碼缺失突變C0L4A4基因（c. 3213delA, P. Lysl071fs*5)序列分析示意 圖，箭頭指示C0L4A4基因中缺失突變的新位點(diǎn)c. 3213delA(p. Lysl071fs*5)，上部分為家 系1正常人（111:1)測(cè)序峰圖，下部分為家系1患者雜合c.3213delA突變（111:7)測(cè)序峰 圖，箭頭指示C0L4A4基因中缺失突變的新位點(diǎn)c. 3213delA，（p. Lysl071fs*5)。
[0025] 圖4為移碼缺失突變C0L4A5基因（c. 499delC, p. Prol67Gln fs*36)序列分析示意 圖，箭頭指示C0L4A5基因中缺失突變的新位點(diǎn)c. 499delC (p. Pr〇167Gln f s*36)，上部分為 家系2正常人（11:2)序列圖，下部分為家系2患者雜合c.499delC突變（IV :1)序列圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，但是以下描述僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn) 行解釋性說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行任何的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求 書(shū)限定的范圍為準(zhǔn)。
[0027] 在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)術(shù)語(yǔ) 和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語(yǔ)和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本 發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。
[0028] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"外顯子"是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA對(duì) 應(yīng)于基因中的部分。內(nèi)含子是在mRNA加工過(guò)程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外顯子和內(nèi)含子都是對(duì)于基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內(nèi)含子，內(nèi)含子沒(méi) 有遺傳效應(yīng)。
[0029] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"外顯子捕獲"與"芯片雜交"可互換使用，指的是探針對(duì)文庫(kù)中 外顯子區(qū)域的DNA片段進(jìn)行特異性選擇和結(jié)合的過(guò)程。DNA分子正常情況下是雙鏈，因此捕 獲之前，DNA分子必須變?yōu)閱捂?，一般是通過(guò)加熱使其變性而達(dá)到解鏈目的，解鏈的DNA分 子被迅速冷卻，即保持單鏈狀態(tài)。文庫(kù)變性后在雜交平臺(tái)與芯片進(jìn)行捕獲雜交。含有外顯 子區(qū)域的DNA片段與固定在芯片上的探針之間在嚴(yán)格的條件下進(jìn)行分子雜交。較佳地，芯 片上探針?lè)肿拥臐舛纫h(yuǎn)遠(yuǎn)高于靶分子濃度。待雜交完畢后，通過(guò)變性等方法收集捕獲的 序列并純化，得到來(lái)自捕獲后的序列混合物。
[0030] 在本發(fā)明中，"高通量測(cè)序"是指采用三種第二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序： 454FLX(Roche 公司）、Solexa Genome Analyzer(Illumina 公司）和 Applied Biosystems 公司的SOLID等。這些平臺(tái)共同的特點(diǎn)是極高的測(cè)序通量，相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序的96道毛細(xì)管 測(cè)序，高通量測(cè)序一次實(shí)驗(yàn)可以讀取40萬(wàn)到400萬(wàn)條序列，根據(jù)平臺(tái)的不同，讀取長(zhǎng)度從 25bp到450bp不等，因此不同的測(cè)序平臺(tái)在一次實(shí)驗(yàn)中，可以讀取IG到14G不等的堿基數(shù)。
[0031] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"DNA文庫(kù)"是指對(duì)基因組的目的片段進(jìn)行打斷，獲得一組具有一 定大小的DNA片段混合物。DNA文庫(kù)的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)優(yōu)選例 中，還可以對(duì)打斷產(chǎn)物、末端修復(fù)產(chǎn)物、接頭產(chǎn)物和富集產(chǎn)物進(jìn)行純化。對(duì)反應(yīng)的條件進(jìn)行 一定的變化或優(yōu)化也在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。
[0032] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"突變"是指野生型的C0L4A4基因和/或C0L4A5基因多核苷酸 序列發(fā)生改變，成為變異體，變異體可以是天然發(fā)生的或非天然發(fā)生的。
[0033] 本發(fā)明還涉及與所述的突變的C0L4A4基因或C0L4A5基因雜交且兩個(gè)序列之間具 有至少80 %，較佳地至少90 %，更佳地至少95 %，至少99 %同源性的多核苷酸。本發(fā)明特 別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0034] 本發(fā)明野生型或突變的C0L4A4基因或C0L4A5基因核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常 可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi) 的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的 序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞， 然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0035] 本發(fā)明中，"載體"包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是 商購(gòu)可得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體包含與上述突變的C0L4A4基因或C0L4A5 基因可操作地連接的表達(dá)控制序列，例如但不限于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止子。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述載體任選地還包含選擇標(biāo)記。
[0036] 包含上述適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng) 的宿主細(xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌 細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例 如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等）。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系。
[0037] 本發(fā)明還涉及到突變C0L4A4基因或C0L4A5基因編碼的蛋白質(zhì)，由于突變的 C0L4A4基因或C0L4A5基因發(fā)生了移碼缺失突變，導(dǎo)致缺失位點(diǎn)后的編碼的氨基酸序列完 全改變，且提前出現(xiàn)終止密碼子，因此不具有野生型C0L4A4蛋白質(zhì)或C0L4A5蛋白質(zhì)正常的 結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明的突變型的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)、天然蛋白質(zhì)、 合成蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)，即使用重組技術(shù)從原核或真核宿主（例如，細(xì)菌、酵母、高等 植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）中產(chǎn)生。
[0038] 在本發(fā)明中，突變型C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)還涉及具有與突變型C0L4A4或 C0L4A5蛋白質(zhì)相同功能的的變異形式。變異形式包括：同源序列、保守性變異體、誘導(dǎo)突變 體等。發(fā)明還涉及突變型C0L4A4或⑶L4A5蛋白質(zhì)類似物。這些類似物與突變型C0L4A4或 C0L4A5蛋白質(zhì)的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差 異，或者兼而有之。
[0039] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本發(fā)明提供的突變 C0L4A4基因和/或C0L4A5基因的用途包括但不限于：用作治療Alport綜合征的藥物靶點(diǎn)； 制備Alport綜合征診斷試劑盒；用于產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型；為治療Alport綜合征提供新的 藥物作用途徑。
[0040] 本發(fā)明所述的"試劑盒"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員以C0L4A4基因和/或C0L4A5野生 型或突變型核苷酸序列為基因探針，根據(jù)基因雜交的原理，可以檢測(cè)生物樣本中是否存在 與該探針序列互補(bǔ)的核苷酸序列，因此使用這種試劑盒可以檢測(cè)出樣本中是否存在著本發(fā) 明的基因突變位點(diǎn)。試劑盒一般包括：引物、探針、核酸芯片、說(shuō)明書(shū)等，還可能包括與活性 成分相容的緩沖液、載體或媒介等。
[0041] 在本發(fā)明中，"引物"指用于在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的多核苷酸片段，其通常為 寡核苷酸，例如含有至少 5 個(gè)堿基，例如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個(gè)或者更多個(gè)堿基的多核苷酸片段。引物不必與待擴(kuò)增 的目的基因或其互補(bǔ)鏈完全互補(bǔ)，只要其能夠特異性擴(kuò)增目的基因。如本文中所使用的，術(shù) 語(yǔ)"特異性擴(kuò)增"是指引物能夠通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，而不擴(kuò)增其他基因。例如，特 異性擴(kuò)增C0L4A5基因是指，在PCR反應(yīng)中引物只擴(kuò)增C0L4A5基因，而不擴(kuò)增其他基因，此 類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0042] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"特異性檢測(cè)C0L4A4基因和/或C0L4A5突變的探針"是指探 針能夠區(qū)分出含有突變的C0L4A4基因和/或C0L4A5與不含有突變的C0L4A4基因和/或 C0L4A5基因 。一般而言，可以通過(guò)控制雜交條件的嚴(yán)緊性，使得探針能夠區(qū)分出含有突變 的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴(yán)緊條件下，與C0L4A4基因精確互補(bǔ)的探針可 以與不含有突變的C0L4A4基因雜交，而不與甚至只包含一個(gè)點(diǎn)突變的突變的C0L4A4基因 雜交，從而將二者區(qū)分開(kāi)。同樣，還可以設(shè)計(jì)與突變的C0L4A4基因基因精確互補(bǔ)的探針，從 而其在高度嚴(yán)緊條件下與突變的C0L4A4基因雜交，而不與不含有突變的C0L4A4基因雜交。 在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，探針的設(shè)計(jì)和雜交技術(shù)是熟知的。
[0043] 本發(fā)明涉及對(duì)突變的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆抗體和單克隆 抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于突變的C0L4A4或C0L4A5蛋 白質(zhì)。較佳地，指那些能與突變的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié) 合于野生型的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克 隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab，或（Fab) 2片段；抗體重鏈； 抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù) 人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
[0044] 本發(fā)明的突變的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)抗體可以用來(lái)鑒定突變的C0L4A4或 C0L4A5蛋白質(zhì)。例如，可以用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸（FITC)來(lái)標(biāo)記突變的 C0L4A4蛋白質(zhì)特異抗體，然后讓突變的C0L4A4蛋白質(zhì)特異抗體與樣品接觸，再用熒光顯微 鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與突變的C0L4A4蛋白質(zhì)特異抗體結(jié)合的樣品，從而為預(yù)測(cè)或診斷 患者是否存在Alport綜合癥提供依據(jù)和指導(dǎo)。
[0045] 本發(fā)明的突變的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)抗體還可以用來(lái)中和突變的C0L4A4或 C0L4A5蛋白質(zhì)。如果有足夠的數(shù)據(jù)表明某個(gè)體的Alport綜合征與本發(fā)明突變C0L4A4或 C0L4A5蛋白質(zhì)的存在相關(guān)，可以考慮用突變的C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)特異性抗體中和這 些致病突變C0L4A4或C0L4A5蛋白質(zhì)分子，從而緩解患者的病癥。
[0046] 實(shí)施例1 :樣本獲取
[0047] 發(fā)明人近幾年在國(guó)內(nèi)收集到兩個(gè)ATS家系，家系1為4代30個(gè)漢族家系成員（圖 1)，呈常染色體顯性遺傳，家系2為4代10個(gè)漢族家系成員（圖2)，呈X染色體顯性遺傳，家 系1和家系2的所有家庭成員均進(jìn)行了尿常規(guī)及腎功能的檢查。家系1先證者（III: 12,病 例1)和家系2先證者（1111，病例2)均通過(guò)腎活檢發(fā)現(xiàn)全部和節(jié)段性硬化及系膜擴(kuò)張，電子 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)腎小球基底膜（GBMS)呈不規(guī)則增厚和分裂，依據(jù)臨床和生化指標(biāo)以及影 像學(xué)證據(jù)，結(jié)合我們所收集到的家族性病例，提示ATS的可能性較大。在家系1中選取10例 患者樣本（11:1，11:3, 11:5, 11:7, 111:7, 111:9, 111:10, 111:12, III: 14,和 III: 15)，9 例 正常家系樣本共19例樣本作為研究樣本，在家系2中選取4例患者樣本（II 1，III 1，III 3 和IV 1)，2例正常家系樣本共6例樣本作為研究樣本，每個(gè)樣本采集外周血樣品2ml，加入 EDTA抗凝，-80°C保存。
[0048] 隨機(jī)收集100位與所述家系1和家系2無(wú)關(guān)的正常個(gè)體作為二次驗(yàn)證樣本，每位 采集外周血樣品2ml，加入EDTA抗凝，-80°C保存。
[0049] 實(shí)施例2 :樣本DNA制備
[0050] 采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取試劑盒從外周血樣品中提取DNA， 提取步驟如下：
[0051] (1)取 2ml 全血樣本，加入 150ul OB Protease，2. Iml Buffer BL 和 20ul RNase A,最大速度漩渦1分鐘,徹底混勻。
[0052] (2) 65°C水浴15-20分鐘，并在水浴過(guò)程中漩渦5次。
[0053] (3)加入2. 2ml無(wú)水乙醇，最大速度漩渦30秒，徹底混勻。
[0054] (4)將3. 5ml裂解液移入帶過(guò)濾柱的15ml離心管，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾 柱,倒掉過(guò)濾液體,放回過(guò)濾柱。
[0055] (5)將第3步剩余裂解液加入帶過(guò)濾柱的15ml離心管，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出 過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾液體，放回過(guò)濾柱。
[0056] (6)加入3ml HB Buffer，洗滌過(guò)濾柱，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾 液體，放回過(guò)濾柱。
[0057] (7)加入3ml DNA Wash Buffer, 4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾液體， 放回過(guò)濾柱。
[0058] (8)再次加入3ml DNA Wash Buffer, 4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出過(guò)濾柱，倒掉過(guò)濾液 體,放回過(guò)濾柱。
[0059] (9) 4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，甩干過(guò)濾柱。
[0060] (10)將過(guò)濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul70攝氏度的Elution Buffer,室 溫靜置5分鐘，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集含有DNA的過(guò)濾液。
[0061] (11)再次將過(guò)濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul70攝氏度的Elution Buffer，室溫靜置5分鐘，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集含有DNA的過(guò)濾液。
[0062] (12)利用分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度及純度，所得的每個(gè)標(biāo)本基因組DNA的 0D260/0D280均位于1. 7?2. 0之間，濃度不少于200ng/ul，總量不少于30 μ g。
[0063] 實(shí)施例3 :外顯子捕獲與測(cè)序
[0064] 發(fā)明人用Agilent SureSelect人全外顯子捕獲試劑盒（Agilent SureSelect Human All Exon Kit)結(jié)合Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)選取的實(shí)施例1的樣本的外顯子組 序列進(jìn)行了測(cè)序，具體如下：
[0065] 1)將基因組DNA隨機(jī)打斷成150-200bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上 接頭制備雜交文庫(kù)（參見(jiàn)http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù) 說(shuō)明書(shū)）。
[0066] 2)文庫(kù)經(jīng)純化后經(jīng)過(guò)連接介導(dǎo)PCR(ligation-mediated PCR(LM-PCR))的線性擴(kuò) 增與SeqCap EZ Oligo pool進(jìn)行雜交富集，再經(jīng)過(guò)LM-PCR的線性擴(kuò)增后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè) 序平臺(tái)為Illumina Hiseq2000,讀取長(zhǎng)度為90bp，每個(gè)樣本的平均測(cè)序深度最少為50X。
[0067] 3)測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling SoftwareL 7進(jìn)行處 理，經(jīng)過(guò)過(guò)濾去污染、使用S0APaligner2. 20#比對(duì)參考基因組Hgl9 (參考Li R，Li Y, KristiansenK, et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinforma tics2008, 24(5):713-714；Li R, Yu C, Li Y, et al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics2009, 25 (15) :1966-1967,通過(guò)參考的方式 將其全文并入本文），以便獲得比對(duì)到基因組上的唯一比對(duì)序列。然后利用SOAP snp(可 參見(jiàn):Li R, Li Y, Fang X, Yang H, et al, SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009, 19(6) :1124_1132，通過(guò)參考的方式將 其全文并入本文）確定祀?yún)^(qū)域的基因型。Indel (insertion-deletion,插入/缺失標(biāo) 記）米用BWA(通過(guò)Burrows-Wheeler變換比對(duì)）（versionO. 5. 9_rl6)比對(duì)到參考基因 組 Hgl9(snpl32)，然后利用 GATK(Genome Analysis Toolkit) (versionvl. 0.4705)確定 indel 的類型。（可參見(jiàn) Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics2010 ；26(5):589-595 ；McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al.The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research2010 ；20 (9):1297-1303)〇
[0068] 結(jié)果顯示，在病例I中發(fā)現(xiàn)有96772個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)和9712處的插 入 / 缺失（Indel)。隨后通過(guò) dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ SNP/snp_summary. cgi)，千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www. IOOOgenomes. org/)、HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://hapmap. ncbi. nlm. nih. gov/)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾，去掉所有已知的且在數(shù)據(jù)庫(kù) 中等位基因頻率大于0. 005的變異。通過(guò)比對(duì)正常樣本，去掉所有已知變異、同義突變以及 非編碼區(qū)的變異，影響蛋白功能較小的位點(diǎn)，包括intron、intergenic、UTR、同義突變，并利 用SIFT軟件進(jìn)行SNP功能預(yù)測(cè)，最終得到72個(gè)雜合可能具有致病意義的SNP位點(diǎn)和14個(gè) Indel。
[0069] 在病例2中發(fā)現(xiàn)有105963個(gè)SNPs和7335個(gè)Indel。隨后通過(guò)dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾，去掉所有已知的且在數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基 因頻率大于0.005的變異。通過(guò)比對(duì)正常樣本，去掉所有已知變異、同義突變以及非編碼區(qū) 的變異，影響蛋白功能較小的位點(diǎn)，包括intron、intergenic、UTR、同義突變，并利用SIFT 軟件進(jìn)行SNP功能預(yù)測(cè)，最終得到70個(gè)雜合可能具有致病意義的SNP位點(diǎn)和13個(gè)Indel。
[0070] 實(shí)施例4 : Sanger法測(cè)序驗(yàn)證
[0071] 由于外顯子組測(cè)序存在一定程度的假陽(yáng)性，因此我們進(jìn)一步利用Sanger測(cè)序法， 對(duì)上述對(duì)家系1的72個(gè)雜合可能具有致病意義的SNP位點(diǎn)以及14個(gè)Indel進(jìn)行驗(yàn)證，以 及對(duì)家系2的70個(gè)雜合可能具有致病意義的SNP位點(diǎn)以及13個(gè)Indel進(jìn)行驗(yàn)證，具體方 法步驟如下：
[0072] I. DNA 提取
[0073] 對(duì)實(shí)施例1的樣本以及100例無(wú)血緣關(guān)系的正常對(duì)照的外周血按照實(shí)施例2的方 法提取基因組DNA。
[0074] 2.弓丨物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0075] 引物設(shè)計(jì)參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)hgl9/build37. 1，具體如下。
[0076] 檢測(cè)移碼缺失突變C0L4A4基因（c. 3213delA，P. Lysl071fs*5)的引物序列：
[0077] 上游引物：5'GGAITTCCAGGGACACCAG3'
[0078] 下游引物：5' TGTAATAGCCAAGACCTGAAGACA3'
[0079] 檢測(cè)移碼缺失突變C0L4A5基因上（c. 499delC，p. Prol67Gln fs*36)的引物序列：
[0080] 上游引物：5'TGAATCTTCAGATCATTTTTCTGG3'
[0081] 下游引物：5，GAGGGATTGTTGTAATCTTCTGG3，
[0082] 反應(yīng)體系：

【權(quán)利要求】
1. 一種突變的C0L4A4基因，其特征在于：所述突變的C0L4A4基因序列導(dǎo)致Alport綜 合征的發(fā)生，其基因序列如SEQ ID N0:2所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的突變的C0L4A4基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：所述蛋白 質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
3. -種突變的C0L4A5基因，其特征在于：所述突變的C0L4A5基因序列導(dǎo)致Alport綜 合征的發(fā)生，其基因序列如SEQ ID N0:6所示。
4. 一種如權(quán)利要求3所述的突變的C0L4A5基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：所述蛋白 質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
5. -種載體，其特征在于：所述載體含有如權(quán)利要求1所述的突變的C0L4A4基因和/ 或如權(quán)利要求3所述的突變的C0L4A5基因。
6. -種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為權(quán)利要求5所述的載體 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
7. 如權(quán)利要求1所述的突變的C0L4A4基因在作為治療Alport綜合征的藥物靶點(diǎn)或制 備Alport綜合征診斷試劑盒中的應(yīng)用。
8. 如權(quán)利要求3所述的突變的C0L4A5基因在作為治療Alport綜合征的藥物靶點(diǎn)或制 備Alport綜合征診斷試劑盒中的應(yīng)用。
9. 一種用于診斷Alport綜合征的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含能夠特異性擴(kuò) 增如權(quán)利要求1所述的突變的C0L4A4基因和/或如權(quán)利要求3所述的突變的C0L4A5基因 的引物，或能夠特異性檢測(cè)如權(quán)利要求1所述的突變的C0L4A4基因和/或如權(quán)利要求3所 述的突變的C0L4A5基因的探針。
10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述引物包括上游引物 5' -GGAITTCCAGGGACACCAG-3'，下游引物 5' -TGTAATAGCCAAGACCTGAAGACA-3' ；和 / 或上游 引物 5' -TGAATCTTCAGATCATTTTTCTGG-3'，下游引 5' -GAGGGATTGTTGTAATCTTCTGG-3'。
11. 一種抗體，其特征在于：所述抗體與權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，且不作 用于野生型C0L4A4基因所編碼的蛋白質(zhì)。
12. -種抗體，其特征在于：所述抗體與權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，且不作 用于野生型C0L4A5基因所編碼的蛋白質(zhì)。
13. -種Alport綜合征治療劑，所述治療劑包含權(quán)利要求11和/或權(quán)利要求12所述 的抗體。
【文檔編號(hào)】A61P27/02GK104212806SQ201410352908
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】肖晶晶, 管李萍, 張建國(guó), 鄧昊, 徐洪波, 宋治, 鄭文 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司