全身麻醉藥與氫組合而成的藥品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供能夠預(yù)防和/或減輕腦(優(yōu)選為發(fā)育期)的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的全身麻醉用藥品，涉及將全身麻醉藥與氫組合而成的、能夠預(yù)防和/或減輕腦(優(yōu)選為發(fā)育期)的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品。
【專利說明】全身麻醉藥與氫組合而成的藥品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及全身麻醉藥與氫組合而成的藥品。

【背景技術(shù)】
[0002]人們擔(dān)心新生兒中的神經(jīng)障礙會(huì)引起長(zhǎng)期持續(xù)的效果(非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3)。因此，對(duì)新生兒使用可能使正常的神經(jīng)發(fā)育發(fā)生變化的藥物(例如引起細(xì)胞凋亡所致的神經(jīng)變性的醇、苯環(huán)利定、氯胺酮、N20、異氟烷、苯二氮類、巴比妥類和抗痙攣藥(非專利文獻(xiàn)4))時(shí)應(yīng)慎重。新生兒中的藥物所致的神經(jīng)障礙，即使是單次藥物曝露也可能充分誘發(fā)，因此在麻醉的給藥中應(yīng)慎重(非專利文獻(xiàn)5、非專利文獻(xiàn)6)。
[0003]正常的神經(jīng)發(fā)育是被周密地調(diào)節(jié)的以增殖、分化、遷移和突觸形成為代表的一系列的事項(xiàng)(非專利文獻(xiàn)7)。一般認(rèn)為谷氨酸在這些全部過程中發(fā)揮著作用(非專利文獻(xiàn)8)，例如在遷移的目標(biāo)區(qū)域中，除檢測(cè)中使用的NMDA受體(非專利文獻(xiàn)9)之外，高濃度的谷氨酸啟示作為神經(jīng)細(xì)胞的化學(xué)引誘物的作用(非專利文獻(xiàn)10)。各種解剖學(xué)領(lǐng)域中特定的NMDA受體亞型(例如NR2B和NR2D)的發(fā)現(xiàn)能夠?qū)w移調(diào)控的正確性質(zhì)的闡明發(fā)揮作用(非專利文獻(xiàn)10)。從同一小組的研究可以明確，物種不同時(shí)，在遷移調(diào)控中使用不同的介質(zhì)，可以使用GABA(與大鼠有關(guān)的研究)或谷氨酸(與小鼠有關(guān)的研究)中的任意一種(非專利文獻(xiàn)11)。
[0004]突觸形成(腦的快速生長(zhǎng)期)是指突觸快速地構(gòu)建的時(shí)期，其特征在于高水平的程序性細(xì)胞死亡(PCD)(最大I % (非專利文獻(xiàn)12))。其中包括廣泛的皮質(zhì)丘腦和丘腦皮質(zhì)投射的形成(非專利文獻(xiàn)13)。種間胚胎學(xué)無限復(fù)雜，但神經(jīng)發(fā)育的各階段具有以相同的順序發(fā)生的傾向，因此可以進(jìn)行比較(非專利文獻(xiàn)14)。因此，從7日齡的大鼠仔(非專利文獻(xiàn)15)能夠推定O?8個(gè)月的人(非專利文獻(xiàn)16)的突觸形成的高峰時(shí)期。但是，根據(jù)NMDA受體亞型的分析，對(duì)于人而言，突觸形成的時(shí)期涉及從妊娠的后期(妊娠8?10個(gè)月)開始直至幾歲的長(zhǎng)期的可能性高(非專利文獻(xiàn)17)。
[0005]1972年才提出的細(xì)胞凋亡(非專利文獻(xiàn)18)是細(xì)胞數(shù)目的削減、調(diào)整、調(diào)控和細(xì)胞的廢棄等過程中的正常的神經(jīng)發(fā)育的本質(zhì)特征。細(xì)胞凋亡的特征在于包括僅用于該目的的細(xì)胞蛋白引起的誘導(dǎo)、確定和實(shí)行的“積極的細(xì)胞死亡”(非專利文獻(xiàn)19)。
[0006]未成熟的中樞神經(jīng)系(CNS)中的程序性細(xì)胞死亡(P⑶)一般認(rèn)為由目標(biāo)來源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)控(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說)。據(jù)此，無法到達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存的靶細(xì)胞的突觸的神經(jīng)細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)20)伴隨環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)支持的中止，開始基于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和電刺激這兩者的特殊形式的細(xì)胞自殺(非專利文獻(xiàn)21、非專利文獻(xiàn)22)。神經(jīng)細(xì)胞由于其存活通路的復(fù)雜趨異性和趨同性，多個(gè)配體和機(jī)制參與維持生存。神經(jīng)細(xì)胞的胞漿和線粒體對(duì)應(yīng)于決定細(xì)胞命運(yùn)的、抗凋亡性因子(例如Bcl-2和cAMP應(yīng)答結(jié)合蛋白)和凋亡促進(jìn)性因子(例如BacUBax和Caspase家族)中的任意一種。Bcl_2及其相關(guān)肽被認(rèn)為在CNS的發(fā)育中是特別重要的(非專利文獻(xiàn)23)，這是從以下事實(shí)明確的:在新生兒中高水平的表達(dá)、Bcl-2在實(shí)驗(yàn)中的過表達(dá)可克服營(yíng)養(yǎng)支持的缺乏(非專利文獻(xiàn)24)、并且也能夠完全防止PCD (非專利文獻(xiàn)25)。Bcl-2的突變體(Bcl-Xj有可能在神經(jīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞的突觸到達(dá)前的神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育維持中具有特別的作用(非專利文獻(xiàn)26)。
[0007]1999年公開的數(shù)據(jù)顯示出通過新生大鼠中的NMDA受體拮抗劑的使用，發(fā)生特定模式的、與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不同的神經(jīng)變性(非專利文獻(xiàn)27)。電子顯微鏡下，該神經(jīng)變性與凋亡性細(xì)胞死亡相同，且在背外側(cè)丘腦核最為顯著。背外側(cè)丘腦核為參與學(xué)習(xí)和記憶的腦區(qū)之一(非專利文獻(xiàn)28)。之后，通過使用其他藥物在其他腦區(qū)重現(xiàn)了該現(xiàn)象(非專利文獻(xiàn)29)。
[0008]之后的研究顯示出，新生大鼠在突觸形成期間對(duì)麻醉藥的有害副作用是脆弱的。所述大鼠曝露于麻醉藥后，在背外側(cè)和前腹側(cè)丘腦核以及頂葉皮質(zhì)等區(qū)域中，變質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)最大增加到基準(zhǔn)值的68倍(非專利文獻(xiàn)30)。之后，作為該增加的結(jié)果，在行為學(xué)試驗(yàn)中觀察到功能性神經(jīng)障礙。具體而言，GABA激動(dòng)性麻醉藥異氟烷(非專利文獻(xiàn)31)本身用量依賴性地產(chǎn)生神經(jīng)變性，通過咪達(dá)唑侖的連續(xù)添加(雙重GABA激動(dòng)性混合物)、接著N20的連續(xù)添加(三重混合物)產(chǎn)生協(xié)同作用的神經(jīng)變性(非專利文獻(xiàn)30)。可知大鼠中，該過程由對(duì)麻醉藥以外的領(lǐng)域的GABA激動(dòng)性藥劑的曝露、例如抗痙攣藥治療和母體藥物亂用引起(非專利文獻(xiàn)32、非專利文獻(xiàn)33)。
[0009]如上所述，雖然存在種間的復(fù)雜度，但神經(jīng)發(fā)育的各階段以相同順序發(fā)生，因此從麻醉藥給藥對(duì)新生大鼠的影響可以某種程度地推定對(duì)人的影響，人的臨床研究中，對(duì)于發(fā)育期腦中的麻醉藥給藥誘發(fā)的神經(jīng)毒性，也有大量發(fā)現(xiàn)(非專利文獻(xiàn)34)。但是，關(guān)于發(fā)育期腦中麻醉藥給藥誘發(fā)的神經(jīng)毒性的作用機(jī)理，大量因子復(fù)雜地涉及其中且基本未知。根據(jù)之后的研究，作為上述作用機(jī)理，可考慮(1)細(xì)胞凋亡的增加、(2)對(duì)GABA神經(jīng)元的影響、
(3)對(duì)大腦皮質(zhì)臨界期(critical per1d)的影響等,也有報(bào)道稱對(duì)GABA神經(jīng)元的影響會(huì)引起神經(jīng)障礙(非專利文獻(xiàn)35)。迄今涉及上述作用機(jī)理的研究中，從研究方法的容易度考慮，興趣集中于細(xì)胞凋亡。
[0010]引起細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的分子是稱為caspase(caspase:Cysteine-ASPartic-acid-proteASE,半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶)的蛋白分解酶。細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化時(shí)，則引起細(xì)胞凋亡。凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要具有如下的通路。
(1)死亡受體介導(dǎo)的通路(眾所周知腫瘤壞死因子受體(TNFR1)、Fas/CD95)、(2)線粒體介導(dǎo)的通路(作為呼吸中的電子傳遞系統(tǒng)的構(gòu)成因子之一的細(xì)胞色素c在細(xì)胞凋亡的實(shí)行中擔(dān)負(fù)重要的作用)、(3)基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的通路(在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生成異常蛋白質(zhì)時(shí)等產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的信號(hào))、(4)直接活化效應(yīng)因子的通路(不經(jīng)過起始因子，應(yīng)激誘導(dǎo)因子直接活化效應(yīng)因子)。
[0011]死亡受體介導(dǎo)的通路中，caspase-8、caspase-?ο被活化。線粒體介導(dǎo)的通路中，caspase-9被從線粒體游離出來的細(xì)胞色素c活化。基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的通路中，caspase-12被活化。這些起始因子caspase組活化下游的效應(yīng)因子caspase (caspase-3、caspase-6、caspase-7)。在直接活化效應(yīng)因子的通路中，不經(jīng)過起始因子caspase,而直接將效應(yīng)因子caspase (caspase-3、caspase_6、caspase_7)活化。這些 caspase 以多聚腺苷二憐酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)為底物，通過底物的分解來實(shí)行細(xì)胞凋亡(非專利文獻(xiàn)36、非專利文獻(xiàn)37)。
[0012]關(guān)于認(rèn)為被麻醉藥誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，考慮有可能具有與一般的細(xì)胞凋亡不同的作用機(jī)理，其根本的機(jī)制尚不明確，有效的治療方法也未確立。因此，待開發(fā)出減輕麻醉藥所致的發(fā)育期腦的細(xì)胞凋亡、其后的認(rèn)知功能障礙的新治療方法。
[0013]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)1:Anand 和 Scalzo，2000，B1l.Neonate 77(2):69-82
[0016]非專利文獻(xiàn)2:Balduini 等，2000，fcain Research 859:318-325
[0017]非專利文獻(xiàn)3: Jevtovic-Todorovic 等，2003，The Journal of Neuroscience23(3):876-882
[0018]非專利文獻(xiàn)4:01ney 等，2002d，Brain Pathol 12 (4):488-498
[0019]非專利文獻(xiàn)5:1konomidou 等，2001，B1chemical Pharmacology62:401-405
[0020]非專利文獻(xiàn)6:Young 等，Cell Death and Differentiat1n (2003) 10, 1148 - 1155
[0021]非專利文獻(xiàn)7:Butler, 1999，TINS 22(8):332-334
[0022]非專利文獻(xiàn)8:Ikonomidou 和 Lechoslaw，2002，Lancet Neurology 1:383-386
[0023]非專利文獻(xiàn)9:Komuro 和 Rakie，1993，Science 260(5104):95-97
[0024]非專利文獻(xiàn)10:Behar等，I999，The Journal of Neurosciencel9(11):4449-4461
[0025]非專利文獻(xiàn)11:Behar 等，2001，Cerebral Cortex 11:744-753
[0026]非專利文獻(xiàn)12:01ney 等，2002b，Neurob1logy of Disease 9:205-219
[0027]非專利文獻(xiàn)13:Molar 和 Blakemore，1995，Trends Neurosc1.18 (9): 389-397
[0028]非專利文獻(xiàn)14:Clancy 等，2001，Neuroscience 105:7-17
[0029]非專利文獻(xiàn)15:01ney 等，2002a，Neurotoxicology 23 (6): 659-668
[0030]非專利文獻(xiàn)16:Ikonomidou 等，1999，Science 238:70-74
[0031]非專利文獻(xiàn)17:Dobbing 和 Sands, 1979, Early Hum Dev3:79-84
[0032]非專利文獻(xiàn)18:Kerr 等，1972，Br J Cancer 26 (4): 239-257
[0033]非專利文獻(xiàn)19:Sloviter，2002，TRENDS in PharmacologicalScience23(l):19-24
[0034]非專利文獻(xiàn)20:Sherrard 和 Bower， 1998，Clin Exp Pharmacol Phys1l25(7-8):487-495
[0035]非專利文獻(xiàn)21:Young 等，1999，Nature Med 5:448-453
[0036]非專利文獻(xiàn)22:Brenneman 等，1990，Brain Res Dev Brain Res51 (1): 63-68
[0037]非專利文獻(xiàn)23:Yuan 和 Yanker，2000, Nature 407:802-809
[0038]非專利文獻(xiàn)24:Garcia 等，1992，Science 258 (5080): 302-304
[0039]非專利文獻(xiàn)25:Martinou 等，1994，Neuron 13 (4): 1017-1030
[0040]非專利文獻(xiàn)26:Motoyama 等，1995，Science 267:1506-1510
[0041]非專利文獻(xiàn)27:1konomidou 等，1999，Science 238:70-74
[0042]非專利文獻(xiàn)28:Goen 等，2002，Behav1ural Brain Researchl36:329-337
[0043]非專利文獻(xiàn)29:Monti 和 Contestabile，2000，European Journal ofNeuroscience 12:3117-3123
[0044]非專利文獻(xiàn)30:V.Jevtovic-Todorovic 等 2003Journal of Neuroscience23:876-882
[0045]非專利文獻(xiàn)31:Gyulai 等，2001，Anesthes1logy 95:585-593
[0046]非專利文獻(xiàn)32 =Bittigau 等，2002，PNAS 99 (23): 15089-15094
[0047]非專利文獻(xiàn)33:Farber 和 Olney, 2003, Developmental Brain Research147:37-45
[0048]非專利文獻(xiàn)34:Wilder RT 等，Anesthes1logy 100:796-804, 2009
[0049]非專利文獻(xiàn)35:Anesthes1logy 2009;111:1365-1371
[0050]非專利文獻(xiàn)36 =Salveen GS, Riedl SJ 2008Adv Exp Med B1l.615:13-23
[0051]非專利文獻(xiàn)37:LA.Pradelli, M.Beneteau, JE, Ricci 2010Cell.Mol.LifeSc1.67:1589-1597


【發(fā)明內(nèi)容】

[0052]發(fā)明所要解決的問題
[0053]本發(fā)明的目的在于提供能夠預(yù)防和/或減輕腦(優(yōu)選為發(fā)育期)的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的全身麻醉用藥品。
[0054]用于解決問題的方法
[0055]本發(fā)明人為了解決上述課題反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過組合全身麻醉藥和氫，能夠預(yù)防和/或減輕腦(優(yōu)選為發(fā)育期)的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙。
[0056]S卩，本發(fā)明涉及以下的發(fā)明。
[0057][I] 一種人或人以外的動(dòng)物用藥品，將全身麻醉藥與氫組合而成。
[0058][2] 一種用于人或人以外的動(dòng)物的全身麻醉的藥品，其特征在于，并用全身麻醉藥和氫來給藥。
[0059][3]如上述[I]或[2]所述的藥品，其用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙。
[0060][4]如上述[3]所述的藥品，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
[0061][5] 一種含有全身麻醉藥的用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品，其特征在于，全身麻醉藥以與氫并用的方式使用。
[0062][6]如上述[I]?[5]中任一項(xiàng)所述的藥品，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
[0063][7]如上述[6]所述的藥品，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
[0064][8]如上述[I]?[7]中任一項(xiàng)所述的藥品，其以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象。
[0065][9]如上述[I]?[8]中任一項(xiàng)所述的藥品，其中，全身麻醉藥為選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
[0066][10]如上述[3]、[5]?[9]中任一項(xiàng)所述的藥品，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙為神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙或自閉癥。
[0067][11] 一種藥品的制備方法，為了預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙而并用全身麻醉藥和氫。
[0068][12]如[11]所述的制備方法，其特征在于，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
[0069][13]如上述[11]或[12]所述的制備方法，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
[0070][14]如上述[13]所述的制備方法，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
[0071][15]如上述[11]?[14]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，藥品以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象。
[0072][16]全身麻醉藥在制造與氫組合使用的全身麻醉劑中的應(yīng)用。
[0073][17]全身麻醉藥與氫在制造全身麻醉藥與氫組合而成的藥品中的應(yīng)用。
[0074][18]全身麻醉藥與氫在制造用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品中的應(yīng)用。
[0075][19]如上述[18]所述的應(yīng)用，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
[0076][20]如上述[16]?[18]中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
[0077][21]如上述[20]所述的應(yīng)用，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
[0078][22]如上述[16]?[18]中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象。
[0079][23]如上述[16]?[18]中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，全身麻醉藥為選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
[0080][24]如上述[18]所述的應(yīng)用，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙為神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙或自閉癥。
[0081][25] 一種預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法，其具有并用全身麻醉藥和氫而向?qū)ο蠼o藥的步驟。
[0082][26]如上述[25]所述的方法，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
[0083][27]如上述[26]所述的方法，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
[0084][28]如上述[25]所述的方法，其中，給藥對(duì)象為胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人。
[0085][29]如上述[25]所述的方法，其中，全身麻醉藥為選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
[0086][30]如上述[25]所述的方法，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙為神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙或自閉癥。
[0087][31]如上述[25]所述的方法，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
[0088]發(fā)明效果
[0089]本發(fā)明的藥品能夠預(yù)防和/或減輕腦(優(yōu)選為發(fā)育期)的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙。另外，本發(fā)明簡(jiǎn)便、無副作用、有效地發(fā)揮作用并且廉價(jià)，因此例如能夠在產(chǎn)科和兒科等的醫(yī)療中提供有效的全身麻醉用藥品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0090]圖1表示試驗(yàn)例I的結(jié)果。A表示使用分解PARP (凋亡性細(xì)胞死亡的生物標(biāo)記)的抗體后的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。使用肌動(dòng)蛋白反應(yīng)作為對(duì)照。B表示對(duì)分解PARP條帶定量而得的結(jié)果。圖中，_表示P <0.001。圖中，Sevo表示七氟烷。
[0091]圖2表不試驗(yàn)例2的小鼠腦的光學(xué)顯微鏡圖像。圖中,A表不載氣為30%氧、且未給藥七氟烷的樣品(對(duì)照)的結(jié)果，B表示載氣為30%氧、且在3%七氟烷中曝露6小時(shí)后的、小鼠腦的光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)的圖像，C表不載氣為30%氧、且在3%七氟燒和1.3%氫中曝露6小時(shí)后的、小鼠腦的光學(xué)顯微鏡圖像。圖中，茶色的點(diǎn)表示分解caspase-3陽性的細(xì)胞的存在、即細(xì)胞凋亡。各圖像為對(duì)每一個(gè)組從8?10只小鼠中選出的I只的圖像。圖中，比例尺為1_。
[0092]圖3表示通過試驗(yàn)例2的免疫化學(xué)染色檢測(cè)到的表示分解caspase-3的茶色點(diǎn)的數(shù)目的計(jì)數(shù)結(jié)果。對(duì)照、七氟烷和七氟烷+氫的各組的平均值的比較通過使用單因素方差分析和其后的Newman-Keuls事后檢驗(yàn)(對(duì)于每一組,η = 8-10只小鼠)來實(shí)施。F值和P值顯示在各組的下方。圖中，與對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)，*表示P < 0.05、#表示P < 0.01、_表示 P < 0.001。另外/表示 P < 0.05、## 表示 P < 0.01、■表示 P < 0.001。
[0093]圖4表示使用了末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法的染色結(jié)果。圖中，A表示載氣為30%氧、未給藥七氟烷樣品(對(duì)照)的結(jié)果，B表示載氣為30%氧、且在3%七氟燒中曝露6小時(shí)后、再經(jīng)過6小時(shí)后的小鼠腦的光學(xué)顯微鏡圖像，C表不載氣為30%氧、且在3%七氟烷和1.3%氫中曝露6小時(shí)后、再經(jīng)過6小時(shí)后的小鼠腦的光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)的圖像。圖中，茶色的點(diǎn)為TUNEL陽性的細(xì)胞，表示發(fā)生了凋亡的細(xì)胞。各圖像為對(duì)每一個(gè)組從8只小鼠中選出的I只小鼠的圖像。圖中，比例尺為1mm。
[0094]圖5表示氫氣在發(fā)育期的腦中緩和七氟烷曝露引起的氧化應(yīng)激。圖中，A表示載氣為30%氧、且未給藥七氟燒的樣品(對(duì)照)的結(jié)果，B表不載氣為30%氧、且在3%七氟燒中曝露6小時(shí)后的、小鼠腦的光學(xué)顯微鏡圖像，C表不載氣為30%氧、且在3%七氟燒和1.3%氫(C)中曝露6小時(shí)后的、小鼠腦的熒光顯微鏡觀察時(shí)的圖像。圖中，紅色為4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)陽性的細(xì)胞，表示受到了氧化應(yīng)激。圖中，比例尺為ΙΟΟμπι。各圖像為對(duì)每一個(gè)組從8只小鼠中選出的I只小鼠的圖像。
[0095]圖6表示試驗(yàn)例3的結(jié)果。圖中，A表示曠場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果，B表示Y字型迷宮試驗(yàn)的結(jié)果，C表示條件性恐懼試驗(yàn)場(chǎng)景試驗(yàn)的結(jié)果，D表示條件性恐懼試驗(yàn)噪音試驗(yàn)的結(jié)果。圖中，與對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)，#表示P < 0.0U***表示P < 0.001。另外，■表示P < 0.01、.表示 P < 0.001。
[0096]圖7表示試驗(yàn)例3的結(jié)果。圖中，A表示社會(huì)性試驗(yàn)的結(jié)果、B表示嗅覺試驗(yàn)的結(jié)果、C表示新物體試驗(yàn)的結(jié)果。圖中，與對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)廣表示P < 0.01、#表示P < 0.05。另外，與對(duì)應(yīng)的生物靶進(jìn)行比較時(shí)，§§§表示P <0.001。

【具體實(shí)施方式】
[0097]本發(fā)明的藥品為全身麻醉藥與氫組合而成的、用于人或人以外的動(dòng)物的藥品。另夕卜，本發(fā)明的藥品為將全身麻醉藥和氫并用給藥的、用于人或人以外的動(dòng)物的全身麻醉的藥品。本發(fā)明的藥品能夠用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙。本發(fā)明中的全身麻醉藥適宜以與氫并用的方式使用。本發(fā)明的藥品是指全身麻醉藥與氫組合而成的藥品，包括分別各自從相同或不同的給藥途徑同時(shí)給藥的給藥方式、和分別各自經(jīng)相同或不同的給藥途徑且錯(cuò)開間隔的給藥中的任一種給藥方式。
[0098]關(guān)于全身麻醉藥，本【技術(shù)領(lǐng)域】中已知，對(duì)作為NMDA受體拮抗劑的全身麻醉藥的曝露會(huì)在腦發(fā)育的突觸形成階段中誘發(fā)凋亡性神經(jīng)變性。
[0099]由于對(duì)麻醉藥的曝露，在神經(jīng)元以外的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等幾個(gè)區(qū)域中凋亡增加(Anesthes1logy 2010 ;112:834-841)、以及由于NMDA受體的上調(diào)而發(fā)生凋亡(Int.J.Devl Neuroscience 27 (2009) 727-731)，因此認(rèn)為麻醉藥通過與一般的細(xì)胞凋亡不同的作用機(jī)理誘發(fā)細(xì)胞凋亡，結(jié)果，擔(dān)心會(huì)誘發(fā)神經(jīng)障礙。
[0100]另外，一般認(rèn)為，具有GABA受體激動(dòng)作用的麻醉藥通過影響GABA神經(jīng)元、擾亂興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元的平衡而誘發(fā)神經(jīng)障礙(Anesthes1logy 2009；111:1365-1371)。
[0101]以兒童麻醉與細(xì)胞凋亡水平上升的后述明確的關(guān)聯(lián)為前提，為了確定該過程的背景機(jī)理，多個(gè)研究正在進(jìn)行中。已知，GABA受體和NMDA受體兩者的活化會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Brunet 等，2001，Current Opin1n in Neurob1logy 11:297-305 ；Bittigau等，2002，PNAS 99 (23): 15089-15094)?？紤]到該方面，乙醇中毒的小鼠形成了用于該過程的研究的動(dòng)物模型的基礎(chǔ)。caspase-3為凋亡細(xì)胞的優(yōu)良標(biāo)記，但其為高度分支的死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的最終效應(yīng)因子，因此從其位置幾乎無法洞察細(xì)胞凋亡的機(jī)理。caspase-3活化是細(xì)胞凋亡的外因性死亡受體介導(dǎo)通路和內(nèi)因性線粒體介導(dǎo)通路這兩者共通的步驟(Green, 2000，Cell 102:1-4)。
[0102]Young等考慮了通過使用一系列合格的實(shí)驗(yàn)來在細(xì)胞凋亡的機(jī)制中使研究對(duì)象縮小為單一通路。通過使用雙重免疫組織化學(xué)-免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡分析和基因敲除小鼠的組合，明確了通路特異的成分，尤其是Bax和細(xì)胞色素c (內(nèi)因性)和caspase-8 (外因性)(Young 等，Cell Death and Differentiat1n(2003) 10，1148-1155)。用乙醇處理后的野生型小鼠顯示出乙醇誘發(fā)性凋亡的特征性模式，與此相對(duì)，實(shí)施了同樣處理的純合體Bax-基因敲除小鼠實(shí)質(zhì)上完全不顯示出細(xì)胞凋亡的跡象。實(shí)際上，細(xì)胞凋亡水平低于在作為對(duì)照的生理學(xué)性細(xì)胞死亡中觀察到的細(xì)胞凋亡水平。另外，Bax-基因敲除小鼠證實(shí)未發(fā)生caspase-8活化。由此可以明確，在麻醉誘發(fā)性凋亡中，內(nèi)因性細(xì)胞凋亡通路參與其中。
[0103]以線粒體周邊為中心的內(nèi)因性通路被神經(jīng)細(xì)胞的胞漿中的凋亡促進(jìn)性和抗凋亡性介質(zhì)的組合調(diào)控。在與發(fā)生中的神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)聯(lián)中，Bcl-XjBcl-2家族的成員)主要呈抗凋亡性，與此相對(duì)，Bax 呈凋亡促進(jìn)性(Yuan and Yanker, 2000, Nature 407:802-809)。Young等設(shè)立了如下的假說:乙醇、雙重NMDA受體拮抗劑(2種NMDA受體拮抗劑的同時(shí)給藥)和GABA激動(dòng)性麻醉劑具有將通常以非活性狀態(tài)保存于線粒體膜的Bax釋放到胞漿的能力。
[0104]Bax存在于胞漿中時(shí)(不被Βο?-Χ^φ制時(shí))成為活性的復(fù)合體的一部分，其可以回到線粒體膜并破壞線粒體膜(Korsmeyer 等，2002，Cell Death and Differentiat1n7:1166-1173)。認(rèn)為之后的線粒體內(nèi)容物(具體而言，細(xì)胞色素c_細(xì)胞能量產(chǎn)生的通常部分)向胞漿的輸送產(chǎn)生極強(qiáng)的凋亡促進(jìn)信號(hào)。胞漿的細(xì)胞色素c與Apaf-1和caspase-8形成復(fù)合體，接著該復(fù)合體活化caspase-3，導(dǎo)致進(jìn)一步級(jí)聯(lián)的開始，最終，引起細(xì)胞骨架蛋白和 DNA 兩者的特征性斷裂(Dikranian 等，2001，Neurob1logy of Disease 8:359-379)。
[0105]當(dāng)然，從上述分析不可能鑒定麻醉藥與該通路相互作用的正確點(diǎn)。另外，各個(gè)種類的藥劑能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡(例如異氟燒單獨(dú)(Jevtovic-Todorovic等，2003)和氯胺酮單獨(dú)(Ikonomidou等，1999，Science 238:70-74))。因此,接著引起的細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)雖然向下游收斂(Brunet 等，2001，Current Opin1n in Neurob1logy 11:297-305 ;Bittigau等，2002, PNAS 99 (23): 15089-15094)，但雙重GABA激動(dòng)性藥劑和NMDA受體拮抗劑的使用并不區(qū)別2種受體相互作用間的潛在不同。異氟烷和/或一氧化二氮很有可能通過使細(xì)胞內(nèi)鈣輸送混亂，而使細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2之比變得調(diào)節(jié)不良。
[0106]如下的谷氨酸-鈣離子學(xué)說得到支持:細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升時(shí)，鈣離子依賴性酶的活化(N0S、PLA2、CaM激酶等)介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)系統(tǒng)被活化，并引起作為膜構(gòu)成成分的脂質(zhì)的障礙、自由基(ROS)的產(chǎn)生、線粒體呼吸鏈的障礙和ATP產(chǎn)生不良，這些成為導(dǎo)火索而誘發(fā)急性或遲發(fā)性細(xì)胞凋亡。但是，在該學(xué)說的級(jí)聯(lián)中，細(xì)胞凋亡的真正原因因子不明(麻酔、“虛血性神経細(xì)胞死O分子生物學(xué)的機(jī)序△薬物療法C3脳保護(hù)”、2007，56:248-270)。
[0107]作為本發(fā)明中的全身麻醉藥，只要是可得到全身性麻醉效果的藥，則沒有特別限定，例如優(yōu)選列舉吸入麻醉藥和靜脈麻醉藥等。
[0108]作為本發(fā)明中的吸入麻醉藥，沒有特別限定，例如可舉出:氟烷、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷等揮發(fā)性吸入麻醉藥；乙烯、環(huán)丙烷、乙醚、氯仿、一氧化二氮或氙氣等氣體性吸入麻醉藥，優(yōu)選異氟烷、安氟醚、七氟烷、地氟烷等齒代醚系化合物或一氧化二氮等。吸入麻醉藥也可以與通過注射或靜脈輸液進(jìn)行給藥的靜脈麻醉藥組合使用。
[0109]作為本發(fā)明中的靜脈麻醉藥，沒有特別限定，例如可舉出:異丙酚、咪達(dá)唑侖、氯胺酮、替來他明、硫噴妥鈉、美索比妥或依托咪酯等，優(yōu)選異丙酚、咪達(dá)唑侖等。
[0110]作為本發(fā)明中使用的全身麻醉藥，更優(yōu)選上述具體例中的選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
[0111]上述具體例中的氟烷、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、依托咪酯、硫噴妥鈉、異丙酚和咪達(dá)唑侖等麻醉藥為GABAa受體激動(dòng)劑。另外，所述麻醉藥中的幾種(例如N20、氯胺酮和異氟烷等)為NMDA受體拮抗劑，但并沒有對(duì)全部麻醉藥明確NMDA受體拮抗作用。
[0112]關(guān)于全身麻醉藥的用量，根據(jù)年齡、健康狀態(tài)、與其他藥品的相互作用和所實(shí)施的手術(shù)種類，每個(gè)患者都不同，只要是能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明效果的范圍，則沒有特別限定，例如，上述吸入麻醉藥和靜脈麻醉藥等全身麻醉藥在藥品中的濃度可以為0.1?10% (v/v)，可以為0.2?8% (v/v)，也可以為0.2?5% (v/v)。另外，也可以改變麻醉導(dǎo)入時(shí)和麻醉狀態(tài)維持時(shí)的濃度。
[0113]本發(fā)明中，氫表示氫分子(H2),只要是氫分子(H2)，則形態(tài)沒有特別限定，可以使用氫氣，也可以使用將氫氣溶解在水中而得到的氫水。
[0114]作為所述全身麻醉藥和氫的應(yīng)用對(duì)象，沒有特別限定，例如可舉出:人、牛、馬、綿羊、山羊、狗、猴子、貓、熊、大鼠、兔子等動(dòng)物。
[0115]本發(fā)明的藥品的應(yīng)用對(duì)象的年齡等沒有特別限定，優(yōu)選應(yīng)用于容易受到麻醉影響的時(shí)期的動(dòng)物。例如對(duì)象為人時(shí)，優(yōu)選以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象，考慮到腦處于發(fā)育期且容易受到麻醉影響的方面，更優(yōu)選為胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童等。進(jìn)一步優(yōu)選為胎兒、新生兒、嬰兒或3歲以下的幼兒。所述胎兒是指妊娠第8周以后且出生前的胎兒。所述新生兒是指出生后且未滿28天的嬰兒。所述嬰兒是指未滿I歲的小孩。所述幼兒是指I歲以上且未滿7歲。所述兒童是指7歲以上且未滿15歲。所述老年人是指65歲以上的人。
[0116]作為本發(fā)明的藥品的實(shí)施方式，可以并用全身麻醉藥和氫，也可以預(yù)先將全身麻醉藥和氫混合。
[0117]本發(fā)明的藥品中，全身麻醉藥的形態(tài)和氫的形態(tài)沒有特別限定，從顯著表現(xiàn)出優(yōu)良的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的預(yù)防和/或減輕效果的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選吸入麻醉藥或靜脈麻醉藥與氫氣的組合。
[0118]對(duì)于本發(fā)明的藥品而言，在并用全身麻醉藥與氫的情況下，使用全身麻醉藥和氫的時(shí)機(jī)沒有特別限定，可以以全身麻醉藥的前給藥、同時(shí)給藥或后給藥中的任意一種方式使用氫，并且可以組合任意方式，但從沒有對(duì)對(duì)象進(jìn)行預(yù)處理的負(fù)擔(dān)的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選全身麻醉藥與氫的同時(shí)給藥。在此，“前給藥”是指對(duì)未給藥全身麻醉藥的狀態(tài)的對(duì)象給藥一定時(shí)間的氫。另外，“同時(shí)給藥”是指從全身麻醉藥的給藥開始時(shí)到給藥停止時(shí)持續(xù)地對(duì)對(duì)象給藥氫、或者從全身麻醉藥的給藥開始時(shí)到給藥停止時(shí)之間對(duì)對(duì)象給藥一定時(shí)間的氫?！昂蠼o藥”是指從停止給藥全身麻醉藥后對(duì)對(duì)象給藥一定時(shí)間的氫。需要說明的是，全身麻醉藥和氫的給藥時(shí)間沒有特別限定，例如在將七氟烷以4.0%以下的濃度與氧和一氧化二氮組合使用的情況下，可以為10分鐘?8小時(shí)左右。
[0119]全身麻醉藥與氫的并用中，全身麻醉藥的形態(tài)和氫的形態(tài)沒有特別限定，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式中，從顯著地顯示出優(yōu)良的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的預(yù)防和/或減輕效果的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為全身麻醉藥為吸入麻醉藥或靜脈麻醉藥、且氫為氫氣的并用。
[0120]對(duì)于本發(fā)明的藥品而言，在將全身麻醉藥和氫預(yù)先混合的情況下，混合比率沒有特別限定，例如在使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)，藥品中的氫氣濃度通常為0.01?7% (v/v)，考慮到安全性時(shí)上限值優(yōu)選低，例如可以為0.15?4% (v/v)，可以為0.18?3% (v/v),可以為0.2?1.5% (v/v)，可以為0.25% (v/v)以上且小于I % (v/v)，也可以為0.28?0.9% (ν/ν) ο 使
[0121]關(guān)于本發(fā)明中使用的氫的用量，根據(jù)年齡、健康狀態(tài)、與其他藥品的相互作用和所實(shí)施的手術(shù)種類，每個(gè)患者都不同，只要是能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明效果的范圍，則沒有特別限定，藥品中的氫濃度通常為0.01?7% (v/v)，考慮到安全性時(shí)上限值優(yōu)選低，例如可以為
0.15 ?4% (v/v)，可以為 0.18 ?3% (v/v)，可以為 0.2 ?1.5% (v/v)，可以為 0.25 %(v/v)以上且小于I % (v/v),也可以為0.28?0.9% (v/v)。
[0122]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式，在將吸入麻醉藥和氫氣組合而成的、用于人或人以外的動(dòng)物的藥品中，沒有特別限定，但藥品中的氫氣濃度通常為0.01?7% (v/v)，考慮到安全性時(shí)上限值優(yōu)選低，例如可以為0.15?4% (v/v)，可以為0.18?3% (v/v)，可以為0.2?L5% (v/v)，可以為0.25% (v/v)以上且小于1% (v/v)，也可以為0.28?0.9%(v/v)。
[0123]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式，在將液態(tài)的靜脈麻醉藥與氫氣組合而成的、用于人或人以外的動(dòng)物的藥品中，沒有特別限定，但藥品中的作為氣體的氫氣濃度通常為0.01?7% (v/v)，考慮到安全性時(shí)上限值優(yōu)選低，例如可以為0.15?4% (v/v)，可以為0.18?3% (v/v),可以為0.2?1.5% (v/v),可以為0.25% (v/v)以上且小于1% (v/v),也可以為 0.28 ?0.9% (v/v)。
[0124]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式，在將吸入麻醉藥與氫氣并用使用時(shí)，藥品中的氫氣濃度沒有特別限定，通常為0.01?7% (v/v)，考慮到安全性時(shí)上限值優(yōu)選低，例如可以為0.15 ?4% (v/v)，可以為 0.18 ?3% (v/v)，可以為 0.2 ?1.5% (v/v)，可以為 0.25%(v/v)以上且小于1% (v/v),也可以為0.28?0.9% (v/v)。
[0125]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式，在將液態(tài)的靜脈麻醉藥與氫氣并用使用時(shí)，藥品中的作為氣體的氫氣濃度沒有特別限定，通常為0.01?7% (v/v)，考慮到安全性時(shí)上限值優(yōu)選低，例如可以為0.15?4% (v/v)，可以為0.18?3% (v/v),可以為0.2?1.5% (v/v)，可以為0.25% (v/v)以上且小于1% (v/v)，也可以為0.28?0.9% (v/v)。
[0126]只要不妨礙本發(fā)明的效果，則也可以在本發(fā)明的藥品中加入氧、氮、一氧化二氮等。本發(fā)明的藥品中含有的氧濃度通常為20?90% (v/v)左右、優(yōu)選20?70% (v/v)左右、優(yōu)選20?50% (v/v)左右。只要不妨礙本發(fā)明的效果，則氮和一氧化二氮的濃度不受限定。
[0127]本發(fā)明中，關(guān)于藥品的氣體成分的構(gòu)成成分，上述的成分以外的余量可以全部為氮?dú)?，除氮?dú)庖酝庖部梢院锌諝庵泻械奈⒘砍煞帧?br> [0128]作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)含有0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的藥品；(ii)含有0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的藥品；或者(iii)含有0.1?5% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5(v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的藥品等。
[0129]作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:⑴含有0.1?10 % (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5 % (v/v)的氫氣和20?90 %(v/v)的氧的藥品；(ii)含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的藥品；或者(iii)含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的藥品等。
[0130]作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方式，在將靜脈麻醉藥和氫水組合而成的、用于人或人以外的動(dòng)物的藥品中，藥品中的氫水濃度沒有特別限定。
[0131]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方式中，在將靜脈麻醉藥與氫水并用使用時(shí)，藥品中的氫水濃度沒有特別限定。
[0132]本發(fā)明的藥品能夠預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙?！邦A(yù)防和/或減輕神經(jīng)障礙”是指在對(duì)應(yīng)用了本發(fā)明的藥品的對(duì)象(例如在人的情況下為患者)、與在不存在氫的條件下應(yīng)用了全身麻醉藥的對(duì)象進(jìn)行比較的情況下，使一種以上的神經(jīng)障礙的嚴(yán)重度下降。另外，“預(yù)防和/或減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷”是指在對(duì)應(yīng)用了本發(fā)明的藥品的對(duì)象、與在不存在氫的條件下應(yīng)用了全身麻醉藥的對(duì)象進(jìn)行比較的情況下，使一種以上的神經(jīng)細(xì)胞的損傷的嚴(yán)重度下降。
[0133]從現(xiàn)有數(shù)據(jù)可以推定，發(fā)育中的人腦在子宮內(nèi)和人生的最初I年這兩個(gè)時(shí)間從胎兒表型向與成人表型類似的表型發(fā)生極為動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)變。該過程具有如下特征:突觸的極快轉(zhuǎn)化(夕一 > 才一一)(高達(dá) 20% / 天(Okabe 等，1999, Nat.Neuroscience 2:804-811))和高水平的背景細(xì)胞凋亡(Hua 和 Smith, 2004，Nature Neuroscience 7 (4): 327-332)。這大概是由于為了維持能量效率，無法到達(dá)靶細(xì)胞的突觸的神經(jīng)細(xì)胞被排除。該研究確認(rèn):神經(jīng)發(fā)生(突觸形成)在該決定性階段內(nèi)對(duì)麻醉劑的曝露會(huì)在發(fā)育中的腦中引起細(xì)胞凋亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)GABA激動(dòng)性吸入劑(例如異氟烷等)的曝露會(huì)在皮質(zhì)中誘發(fā)細(xì)胞凋亡水平上升4倍。另外，對(duì)于一氧化二氮(作為單一的藥劑時(shí)不顯示神經(jīng)變性)而言，大幅增強(qiáng)至以異氟烷誘發(fā)性凋亡為對(duì)照觀察到的12倍，由此顯示出其神經(jīng)變性潛力。從海馬中得到同樣的結(jié)果，該結(jié)果中，異氟烷和異氟烷-一氧化二氮混合物使細(xì)胞凋亡水平上升(分別為4倍和7倍)。
[0134]海馬、即形成邊緣系統(tǒng)的一部分的皮質(zhì)組織特化而成的層，在記憶形成中具有重要的功能(Aggleton and Brown, 1999, Behav Brain Sci22 (3):425-44)。海馬的神經(jīng)細(xì)胞具有顯示出下述現(xiàn)象的能力:突觸的效力因特定模式的神經(jīng)活性而逐漸增強(qiáng)、即作為“長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)”(LTP)已知的現(xiàn)象。認(rèn)為該過程是細(xì)胞水平上的記憶的基礎(chǔ)。一般而言，海馬的處理在海馬和海馬旁回(下托)這兩者發(fā)生，然后投影到穹窿?？紤]到海馬和下托中神經(jīng)細(xì)胞損傷的擴(kuò)展，就不會(huì)驚訝于曝露于高水平麻醉藥的新生大鼠顯示出成人學(xué)習(xí)障礙的跡象(Jevtovic-Todorovic等，2003),這在相同的研究中被LTP抑制的發(fā)現(xiàn)證實(shí)。
[0135]作為本發(fā)明中的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙，可優(yōu)選舉出:腦的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙，本發(fā)明的神經(jīng)障礙沒有特別限定，可舉出:神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙、智力障礙、自閉癥等。所述神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙包括強(qiáng)度、平衡和移動(dòng)性的障礙。所述神經(jīng)認(rèn)知障礙包括學(xué)習(xí)障礙和記憶障礙。一般認(rèn)為上述神經(jīng)障礙因神經(jīng)變性、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞壞死等因素引起，認(rèn)為其可能不是因特定的一個(gè)因素、而是因復(fù)合因素引起。其中，推測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡在所述任一障礙中造成某些影響。所述神經(jīng)變性是指伴隨細(xì)胞收縮、邊緣化和封入膜中的凋亡小體的形成的染色質(zhì)凝聚。
[0136]這樣的神經(jīng)認(rèn)知障礙通常通過如下充分確立的基準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)=Randt記憶測(cè)驗(yàn)的短故事模型(short-story module) [Randt C，Brown E.Administrat1n manual: RandtMemory Test.New York:Life Sciences, 1983]、修訂韋氏成人智力測(cè)驗(yàn)(Wechsler AdultIntelligence Scale Revised)的數(shù)字廣度分測(cè)驗(yàn)(Digit Span subtest)和數(shù)字符號(hào)分測(cè)驗(yàn)(Digit Symbol subtest) [Wechsler D.The Wechsler Adult IntelligenceScale-Revised(WAIS-R).San Anton1, Tex.!Psychological Corporat1n, 1981.]、 修訂本頓視覺保持測(cè)驗(yàn)(Benton Revised Visual Retent1n Test) [Benton AL, HansherK.Multilingual aphasia examinat1n.1owa City!University of 1wa Press, 1978]和連線測(cè)驗(yàn)(Trail Making Test) (B部分)[Reitan RM.Validity of the Trail Making Testas an indicator of organic brain damage.Percept Mot Skills 1958 ；8:271-6]等。其他適合的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)認(rèn)知檢查記載于:Combs D，D’Alecy L:Motor performance inrats exposed to severe forebrain ischemia:Effect of fasting and 1，3—butaned1l.Stroke 1987;18:503-511 和 G1net T，Thomas J, Warner D,Goodlett C,WassermanE, West J:Forebrain ischemia induces selective behav1ral impairments associatedwith hippocampal injury in rats.Stroke 1991 ;22:1040-1047。
[0137]本發(fā)明的另一方式涉及將全身麻醉藥與氫并用的、麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的預(yù)防和/或減輕用藥品的制備方法。全身麻醉藥、氫、藥品的應(yīng)用對(duì)象和麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙以及它們的組合如上所述。本制備方法可以具有將全身麻醉藥與氫并用的步驟，也可以具有將全身麻醉藥和氫預(yù)先混合的步驟。
[0138]本制備方法中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)具備以含有0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的方式將吸入麻醉藥與氫氣并用的步驟、或?qū)⑽肼樽硭幒蜌錃忸A(yù)先混合的步驟的藥品的制備方法；(ii)具備以含有0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的方式將吸入麻醉藥與氫氣并用的步驟、或?qū)⑽肼樽硭幒蜌錃忸A(yù)先混合的步驟的藥品的制備方法；或者(iii)具備以含有0.1?5%(v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的方式將吸入麻醉藥與氫氣并用的步驟、或?qū)⑽肼樽硭幒蜌錃忸A(yù)先混合的步驟的藥品的制備方法；等。
[0139]本制備方法中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)具備以含有0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的方式將靜脈麻醉藥與氫氣并用的步驟、或?qū)㈧o脈麻醉藥和氫氣預(yù)先混合的步驟的藥品的制備方法；(ii)具備以含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的方式將靜脈麻醉藥與氫氣并用的步驟、或?qū)㈧o脈麻醉藥和氫氣預(yù)先混合的步驟的藥品的制備方法；或者(iii)具備以含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的方式將靜脈麻醉藥與氫氣并用的步驟、或?qū)㈧o脈麻醉藥和氫氣預(yù)先混合的步驟的藥品的制備方法；等。
[0140]作為本發(fā)明的另一方式，可舉出全身麻醉藥在與氫組合使用的全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用。以藥效成分的穩(wěn)定、患者的水分補(bǔ)給和維持電解質(zhì)平衡為目的，所述麻醉劑中可以加入公知的賦形劑、添加劑。作為所述賦形劑、添加劑，只要不妨礙本發(fā)明的效果，就可以使用現(xiàn)有公知的賦形劑、添加劑。例如異丙酚的麻醉劑中可以添加豆油、中鏈脂肪酸甘油三酯、純化蛋黃卵磷脂、濃甘油、油酸鈉等。全身麻醉藥、氫和藥品的應(yīng)用對(duì)象如上所述。
[0141]該應(yīng)用中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥在如下全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用，所述全身麻醉劑含有0.1?10%(v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧、還可以根據(jù)需要含有添加劑；(ii)全身麻醉藥在如下全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用，所述全身麻醉劑含有
0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧、還可以根據(jù)需要含有添加劑；或者(iii)全身麻醉藥在如下全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用，所述全身麻醉劑含有0.1?5% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50%(v/v)的氧、還可以根據(jù)需要含有添加劑；等。
[0142]該應(yīng)用中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥在如下全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用，所述全身麻醉劑含有
0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧、還可以根據(jù)需要含有添加劑；(ii)全身麻醉藥在如下全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用，所述全身麻醉劑含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧、還可以根據(jù)需要含有添加劑；或者(iii)全身麻醉藥在如下全身麻醉劑的制造中的應(yīng)用，所述全身麻醉劑含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧、還可以根據(jù)需要含有添加劑；等。
[0143]本發(fā)明的另一方式涉及全身麻醉藥與氫在將全身麻醉藥與氫組合而成的藥品的制造中的應(yīng)用。全身麻醉藥、氫和藥品的應(yīng)用對(duì)象以及它們的組合如上所述。作為該應(yīng)用的實(shí)施方式，可以將全身麻醉藥與氫并用，也可以將全身麻醉藥和氫預(yù)先混合。
[0144]該應(yīng)用中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥與氫在含有0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的藥品的制造中的應(yīng)用；(ii)全身麻醉藥與氫在含有0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的藥品的制造中的應(yīng)用；或者(iii)全身麻醉藥與氫在含有0.1?5% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?
1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的藥品的制造中的應(yīng)用；等。
[0145]該應(yīng)用中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥與氫在含有0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5%(v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的藥品的制造中的應(yīng)用；(ii)全身麻醉藥與氫在含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的藥品的制造中的應(yīng)用；或者(iii)全身麻醉藥與氫在含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的藥品的制造中的應(yīng)用；等。
[0146]本發(fā)明的另一方式涉及全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用。全身麻醉藥、氫、藥品的應(yīng)用對(duì)象、麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙和實(shí)施方式以及它們的組合如上所述。
[0147]該應(yīng)用中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧；(ii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧；或者(iii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?5% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧；等。
[0148]該應(yīng)用中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧；(ii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5%(v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧；或者(iii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧；等。
[0149]本發(fā)明的另一方式涉及全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用。全身麻醉藥、氫、藥品的應(yīng)用對(duì)象、麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙和實(shí)施方式以及它們的組合如上所述。
[0150]該應(yīng)用中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?
1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧；(ii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧；或者(iii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?5% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5%(v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧；等。
[0151]該應(yīng)用中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧；(ii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧；或者(iii)全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品的制造中的應(yīng)用，所述藥品含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧；等。
[0152]本發(fā)明的再一方式涉及全身麻醉藥與氫在用于預(yù)防和/或減輕麻醉誘發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的藥品的制造中的應(yīng)用。全身麻醉藥、氫、藥品的應(yīng)用對(duì)象、麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙和實(shí)施方式以及它們的組合如上所述。
[0153]本發(fā)明的另一方式涉及具有并用全身麻醉藥和氫而向?qū)ο蠼o藥的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法。全身麻醉藥、氫和麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙以及它們的組合如上所述。該方法可以具有將全身麻醉藥與氫并用的步驟，也可以具有將全身麻醉藥和氫預(yù)先混合的步驟。
[0154]該方法中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)具有向?qū)ο蠼o藥包括0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法；(ii)具有向?qū)ο蠼o藥包括0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法；或者(iii)具有向?qū)ο蠼o藥包括0.1?5% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50%(v/v)的氧的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法；等。
[0155]該方法中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)具有向?qū)ο蠼o藥包括0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/V)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法；(ii)具有向?qū)ο蠼o藥包括0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法；或者
(iii)具有向?qū)ο蠼o藥包括0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的步驟的、預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法；等。
[0156]該方式中，將全身麻醉藥與氫并用的時(shí)機(jī)沒有特別限定，可以以全身麻醉藥的前給藥、同時(shí)給藥或后給藥中的任一種方式使用氫，并且可以組合任意方式，但從沒有對(duì)對(duì)象進(jìn)行預(yù)處理的負(fù)擔(dān)的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選全身麻醉藥與氫的同時(shí)給藥。在此，“前給藥”是指對(duì)未給藥全身麻醉藥的狀態(tài)的對(duì)象給藥一定時(shí)間的氫。另外，“同時(shí)給藥”是指從全身麻醉藥的給藥開始時(shí)到給藥停止時(shí)持續(xù)地對(duì)對(duì)象給藥氫、或者從全身麻醉藥的給藥開始時(shí)到給藥停止時(shí)之間對(duì)對(duì)象給藥一定時(shí)間的氫?！昂蠼o藥”是指從停止給藥全身麻醉藥后對(duì)對(duì)象給藥一定時(shí)間的氫。需要說明的是，全身麻醉藥和氫的給藥時(shí)間沒有特別限定。作為所述全身麻醉藥和氫的給藥對(duì)象，沒有特別限定，例如可舉出:人、牛、馬、綿羊、山羊、狗、猴子、貓、熊、大鼠、兔子等動(dòng)物。
[0157]本發(fā)明的全身麻醉藥和氫的給藥對(duì)象的年齡等沒有特別限定，優(yōu)選應(yīng)用于容易受到麻醉影響的時(shí)期的動(dòng)物。例如對(duì)象為人時(shí)，優(yōu)選以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象，考慮到腦處于發(fā)育期且容易受到麻醉影響的方面，更優(yōu)選為胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童等，進(jìn)一步優(yōu)選為胎兒、新生兒、嬰兒或3歲以下的幼兒。胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人的各定義如上所述。
[0158]本發(fā)明的另一方式涉及具有將全身麻醉藥與氫組合而成的藥品向?qū)ο蠼o藥的步驟的、抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法。全身麻醉藥、氫和藥品的應(yīng)用對(duì)象以及它們的組合如上所述。本方法可以具有將全身麻醉藥與氫并用的步驟，也可以具有將全身麻醉藥和氫預(yù)先混合的步驟。
[0159]該方法中，作為使用吸入麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)具有下述步驟的抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法:以含有0.1?10% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的方式并用吸入麻醉藥與氫氣的步驟或預(yù)先混合吸入麻醉藥和氫氣的步驟、以及向?qū)ο蠼o藥由上述步驟得到的藥品的步驟；(?)具有下述步驟的抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法:以含有0.1?8% (v/v)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的方式并用吸入麻醉藥與氫氣的步驟或預(yù)先混合吸入麻醉藥和氫氣的步驟、以及向?qū)ο蠼o藥由上述步驟得到的藥品的步驟；或者(iii)具有下述步驟的抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法:以含有0.1?5% (v/V)的吸入麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的方式并用吸入麻醉藥與氫氣的步驟或預(yù)先混合吸入麻醉藥和氫氣的步驟、以及向?qū)ο蠼o藥由上述步驟得到的藥品的步驟；等。
[0160]該方法中，作為使用液態(tài)的靜脈麻醉藥和氫氣時(shí)的優(yōu)選實(shí)施方式，沒有特別限定，例如可舉出:(i)具有下述步驟的抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法:以含有0.1?10% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?90% (v/v)的氧的方式并用靜脈麻醉藥與氫氣的步驟或預(yù)先混合靜脈麻醉藥和氫氣的步驟、以及向?qū)ο蠼o藥由上述步驟得到的藥品的步驟；(ii)具有下述步驟的抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法:以含有0.1?8% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?70% (v/v)的氧的方式并用靜脈麻醉藥與氫氣的步驟或預(yù)先混合靜脈麻醉藥和氫氣的步驟、以及向?qū)ο蠼o藥由上述步驟得到的藥品的步驟；或者(iii)具有下述步驟的抑制麻醉藥誘發(fā)性凋亡的方法:以含有0.1?5% (w/w)的靜脈麻醉藥、0.15?1.5% (v/v)的氫氣和20?50% (v/v)的氧的方式并用靜脈麻醉藥與氫氣的步驟或預(yù)先混合靜脈麻醉藥和氫氣的步驟、以及向?qū)ο蠼o藥由上述步驟得到的藥品的步驟；等。
[0161]本發(fā)明中，從細(xì)胞凋亡和行為學(xué)試驗(yàn)評(píng)價(jià)了麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙。對(duì)于細(xì)胞凋亡，通過(i)分解PARP的定量、(ii)活性caspase-3染色、或者(iii)TUNEL法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0162]本發(fā)明中，分解PARP的檢測(cè)和定量中使用蛋白質(zhì)印跡分析。細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)的主要起始因子之一為caspase的活化、和基于此的聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(PARP)的分解。正常時(shí)作為參與DNA修復(fù)、DNA的穩(wěn)定化和其他細(xì)胞內(nèi)事件的核內(nèi)酶的PARP，在細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)中是caspase-3的最終祀標(biāo)。相對(duì)于在細(xì)胞凋亡過程中分解的活性型caspase的測(cè)定，分解PARP的測(cè)定在細(xì)胞凋亡的后期階段也能夠檢測(cè)到持續(xù)的信號(hào)。
[0163]本發(fā)明中，活性caspase-3染色中使用caspase-3免疫組織化學(xué)法。在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的最后，caspase-9將caspase-3 (半胱氨酸蛋白酶)活化，因此caspase-3是處于細(xì)胞凋亡涉及點(diǎn)的下游的細(xì)胞標(biāo)記。廣泛平行地進(jìn)行銀染色的所述免疫組織化學(xué)法作為神經(jīng)細(xì)胞凋亡的合適標(biāo)記發(fā)揮作用，對(duì)于生理學(xué)上的細(xì)胞死亡的定量化目的和特性確定這兩方面而言都是優(yōu)良的(Olney 等，2002b, Neurob1logy of Disease9:205-219)。caspase-3為細(xì)胞質(zhì)酶，因此用活化caspase-3染色后的細(xì)胞整體被染色，定量化比較容易。
[0164]本發(fā)明中，通過TUNEL法使細(xì)胞凋亡初期中的DNA的片段化可視化。DNA的片段化由雙鏈的斷裂和單鏈的斷裂構(gòu)成。任一斷裂類型都能夠通過使用標(biāo)記核苷酸的酶反應(yīng)對(duì)其片段的自由3’ -0H末端進(jìn)行標(biāo)記而檢測(cè)。TUNEL法作為高靈敏度的細(xì)胞凋亡檢測(cè)法使用。
[0165]實(shí)施例
[0166]接著，舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的任何限定，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思內(nèi)在本領(lǐng)域中具有一般知識(shí)的技術(shù)人員能夠做出大量變形。
[0167]以下實(shí)施例中的統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism5 (GraphPad Software Inc., LaJolla, CA)來進(jìn)行。各組的平均值的比較通過單因素方差分析和雙因素方差分析來實(shí)施，然后分別對(duì)它們實(shí)行Newman-Keuls和Bonferroni的事后檢驗(yàn)。Y字型迷宮試驗(yàn)中，與組間的隨機(jī)行為有關(guān)的行動(dòng)的比較通過使用雙側(cè)的單樣品t檢驗(yàn)來進(jìn)行。將P < 0.05設(shè)為統(tǒng)計(jì)上具有顯著性差異。值以平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
[0168]全部實(shí)驗(yàn)按照防衛(wèi)醫(yī)科大學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用倫理指南來實(shí)行，由防衛(wèi)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(所澤市、埼玉縣、日本)認(rèn)可。
[0169][實(shí)施例1]
[0170]動(dòng)物:該研究中使用的C57BL/6小鼠在12小時(shí)的明暗周期(照明的亮燈時(shí)間為7點(diǎn)?19點(diǎn))和22±2°C的室溫條件下進(jìn)行管理。小鼠在自由攝食和自由攝水條件下飼養(yǎng)。該研究中使用的全部小鼠為同齡的同窩仔。
[0171]麻醉藥和氫處理:將處于腦的發(fā)育期的6日齡(P6)的小鼠從母親所在的籠子中移出后，馬上將小鼠置于帶有操作手套的濕度大的室中。將混合空氣、氧(空氣之外的)、氫、七氟烷而最終制備的氧30%、氫1.3%、七氟烷3%的麻醉藥混合氣體向上述小鼠吸入給藥。氣體的總流量為2L/分鐘、麻醉藥的給藥時(shí)間為6小時(shí)。氧和麻醉藥的百分率通過使用氣體分析系統(tǒng)(Capnomac Ultima, GE Healthcare,東京都、日本)來測(cè)定。氫氣濃度通過在企業(yè)(Breath Lab C0.,奈良縣、日本)使用氣相色譜來測(cè)定。在暴露于麻醉藥的過程中，將小鼠在加溫至38±1°C的墊上進(jìn)行保溫。
[0172][實(shí)施例2]
[0173]將空氣、氧(空氣之外的)、氫和七氟烷混合，制備最終氧為30%、氫為0.6%、七氟烷(3% )的麻醉藥混合氣體，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0174][實(shí)施例3]
[0175]將空氣、氧(空氣之外的)、氫和七氟烷混合，制備最終氧為30%、氫為0.3%、七氟烷(3% )的麻醉藥混合氣體，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0176][實(shí)施例4]
[0177]將空氣、氧(空氣之外的)、氫和地氟烷混合，制備最終氧為30%、氫為1.3%、地氟烷(5.7% )的麻醉藥混合氣體，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0178][實(shí)施例5]
[0179]將空氣、氧(空氣之外的)和氫混合，一邊使氧為30%、氫為1.3%的混合氣體與麻醉藥同時(shí)吸入，一邊與異丙酹(100mg/kg ip)的腹腔內(nèi)給藥同時(shí)并用來吸入給藥,除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0180][實(shí)施例6]
[0181 ] 將空氣、氧(空氣之外的)、氫和七氟烷混合，制備最終氧為30 %、氫為1.3 %、七氟烷(2% )的麻醉藥混合氣體，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0182][比較例I]
[0183]將空氣、氧(空氣之外的)和七氟烷混合，制備最終氧為30%、七氟烷(3%)的麻醉藥混合氣體，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0184][比較例2]
[0185]將空氣、氧(空氣之外的)和地氟烷混合，制備最終氧為30%、地氟烷(5.7% )的麻醉藥混合氣體，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0186][比較例3]
[0187]將空氣和氧(空氣之外的)混合，一邊使氧為30%的混合氣體與麻醉藥同時(shí)吸入，一邊與異丙酚(100mg/kg ip)的腹腔內(nèi)給藥同時(shí)并用吸入給藥，除此以外與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
[0188][試驗(yàn)例1-A]
[0189]蛋白提取物的純化:蛋白提取物的制備按照KodamaM.等，Anesthes1logy, 2011 ;115:979_991中記載,通過蛋白質(zhì)印跡法來實(shí)施。以下簡(jiǎn)單記載該方法。將小鼠的前腦迅速取出，并在含有50mM的tris-HCl、pH7.4、150mM的NaCl、l%的NP_40、0.5%的脫氧膽酸鈉、蛋白酶抑制劑混合物(Complete ;Roche Diagnostics,潘茨堡，德國)和磷酸酶抑制劑(20mM的甘油磷酸、ImM的Na3V04、2mM的NaF)的、4倍量的勻漿緩沖液中均質(zhì)化。接著，在15000g、30分鐘、4°C的條件下對(duì)勻漿進(jìn)行離心分離。分離上清液，在-80°C下保存直至使用時(shí)。各試樣的蛋白濃度通過使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(Pierce, Rockford, IL)來測(cè)定。
[0190]蛋白質(zhì)印跡分析:蛋白質(zhì)印跡法按照Kodama Μ.等，Anesthes1logy, 2011 ;115:979-991中記載的方法來實(shí)施。以下簡(jiǎn)單記載該方法。將勻漿供于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后，將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P;Millipore, Bedford, MA)上。印跡與抗-聚_(腺苷二磷酸核糖)_聚合酶(抗-PARP)(兔多克??；Cell Signaling Technology)或抗-β -肌動(dòng)蛋白(小鼠單克??；Sigma, St.Louis, M0)抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)。接著，加入過氧化物酶復(fù)合型二次抗體，對(duì)印跡進(jìn)行孵育。蛋白條帶通過使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(SuperSignal West Pico ；Pierce)來可視化。分解PARP條帶的定量用β_肌動(dòng)蛋白來標(biāo)準(zhǔn)化。使用雙因素方差分析和其后的Bonfeironi的事后檢驗(yàn)(每一組中，η = 3-6小鼠)來實(shí)施比較。
[0191]對(duì)于所述前腦的提取物，使用分解PARP (凋亡性細(xì)胞死亡的生物標(biāo)記)的抗體來實(shí)施蛋白質(zhì)印跡分析。分析結(jié)果如圖1Α所示。分解PARP條帶的定量化的結(jié)果如圖1Β所示。從圖1Α和Β可知，僅曝露于含有氧30%的氣體、或含有氧30%和氫1.3%的氣體的小鼠腦的分解PARP的免疫活性為檢測(cè)下限以下，但對(duì)于含有氧30%和七氟烷3%的氣體中曝露6小時(shí)后的小鼠(比較例1)而言，分解PARP的生成反應(yīng)被誘導(dǎo)。另一方面，對(duì)于在含有氧30%、氫1.3%和七氟烷3%的氣體中曝露后小鼠(實(shí)施例1)而言，與在含有氧30%的氣體中的七氟烷中曝露后的小鼠相比，觀察到對(duì)分解PARP的免疫活性的顯著下降(即、氫氣抑制了 PARP的分解)，確認(rèn)了 1.3%的氫氣可抑制新生小鼠的由七氟烷曝露引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。利用雙因素方差分析(two-way AN0VA)確認(rèn)了它們的顯著性差異，顯示出氫吸入的主要效果(F = 12.17、P < 0.01)、七氟烷給藥的主要影響(F = 45.66、P < 0.0001)、和相互作用(氫給藥X七氟烷給藥；F = 15.28、P < 0.01)。
[0192]將比較例1的分解PARP的定量值設(shè)為100 %時(shí)，實(shí)施例1?3的分解PARP的相對(duì)定量值分別為:實(shí)施例1減少約45%、實(shí)施例2減少約50%、實(shí)施例3減少約55%，分解PARP的定量值顯著減少了。實(shí)施例6中也與實(shí)施例1同樣地神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著減少了。這些情況顯示出，本發(fā)明與未使用氫的情況相比，能夠?qū)⒂善叻榈钠芈兑鸬纳窠?jīng)細(xì)胞凋亡抑制40%以上。
[0193][試驗(yàn)例1-B]
[0194]與[試驗(yàn)例1-A]同樣地，對(duì)實(shí)施例4和比較例2進(jìn)行評(píng)價(jià)。將比較例2的分解PARP的定量值設(shè)為100%時(shí)，實(shí)施例4的分解PARP的相對(duì)定量值減少47.7%，分解PARP的定量值顯著減少了。該情況顯示出，本發(fā)明也將由地氟烷曝露引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制了45%以上。
[0195][試驗(yàn)例1-C]
[0196]與[試驗(yàn)例1-A]同樣地對(duì)實(shí)施例4和比較例3進(jìn)行評(píng)價(jià)。將比較例3的分解PARP的定量值設(shè)為100 %時(shí)，實(shí)施例5的分解PARP的相對(duì)定量值減少55.1 %，分解PARP的定量值顯著減少了。該情況顯示出，本發(fā)明也將由異丙酚曝露引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制了 50%以上。
[0197][試驗(yàn)例2]
[0198]病理組織學(xué)研究:免疫組織化學(xué)的染色按照KodamaΜ.等，Anesthes1logy,2011 ； 115:979-991 和 SatohY.等，J Neurosci,2011 ；31:11953-11967中記載的方法來實(shí)施。以下簡(jiǎn)單記載該方法。用含有4%低聚甲醛的0.1M磷酸緩沖液經(jīng)心臟灌流小鼠。打開頭蓋骨，將頭部在相同緩沖液中浸潰至少2小時(shí)。然后，將腦從頭蓋骨取出，使用石蠟包埋后的切片(5μπι厚)進(jìn)行病理組織學(xué)分析。對(duì)于切片，按照確立的方法在二甲苯中將石臘剝離，使用梯度乙醇系列(graded ethanol series)進(jìn)行水和?？乖罨幚硗ㄟ^使用抗原活化溶液(Antigen Unmasking Solut1n ；VectorLaboratories, Burlingame, CA)在高壓爸中加熱5分鐘(121。。)來實(shí)施。然后，為了使背景染色變淡，將切片用封閉試劑(Protein Block, Serum-Free ；Dako, Glostrup,丹麥)處理30分鐘。接著，將切片與一次抗體一起在濕度大的室中在4°C下孵育一夜。該研究中使用的一次抗體為抗-活性 Caspase-3 (兔多克?。籆ell Signaling Technology, Beverly, MA)和抗-4-羥基-2-壬烯醛(ant1-4-HNE)(小鼠單克??；日本老化調(diào)控研究所、靜岡縣、日本)抗體。
[0199]為了進(jìn)行明視野染色，加入過氧化物酶復(fù)合型二次抗體(Dako EnVis1n+system ；Dako)后對(duì)切片進(jìn)行恒溫處理。免疫反應(yīng)性通過按照制造商的操作規(guī)程使用3，3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB, Vector Laboratories)來檢測(cè)。最后，用蘇木精對(duì)切片進(jìn)行對(duì)比染色。熒光染色中加入Alexa-Fluor 546-復(fù)合型-抗小鼠IgG抗體(LifeTechnologies, Eugene, OR)對(duì)切片進(jìn)行孵育。
[0200]如Kodama M.等，Anesthes1logy, 2011 ; 115:979-991 中所記載的那樣,按照制造商的操作規(guī)程，使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(ApopTag ；Chemicon, Temecula, CA),來實(shí)施使用了末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法。為了檢測(cè)活性而使用DAB。用蘇木精對(duì)切片進(jìn)行對(duì)比染色。
[0201]每一個(gè)組中，將從8至10只小鼠采集的樣品供于各自的試驗(yàn)，所述小鼠在與實(shí)施例I和比較例I相同的條件下暴露于麻醉?；钚詂aspase3陽性或TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目的計(jì)數(shù)由不知道處理?xiàng)l件的試驗(yàn)者來實(shí)施。
[0202]使用活性caspase-3 (凋亡性細(xì)胞死亡的另一生物標(biāo)記)的抗體來實(shí)施組織學(xué)分析(圖2)。為了研究caspase-3的活性，對(duì)切片進(jìn)行免疫化學(xué)染色。在蛋白質(zhì)印跡分析中，如上述內(nèi)容所記載，在含有氧30%和氫1.3%的氣體中曝露的小鼠的細(xì)胞凋亡顯示出與在含有氧30%的氣體中曝露的小鼠相同的水平，因此僅對(duì)3個(gè)組實(shí)施了組織學(xué)定量:(i)含有氧30%的氣體(以下示為對(duì)照含有氧30%和七氟烷3%的氣體(以下示為七氟烷)(比較例I)、和(iii)含有氧30%、氫1.3%和七氟烷3%的氣體(以下示為七氟烷+氫)(實(shí)施例1)。將剛施加完6小時(shí)麻醉后的腦的某區(qū)域作為模擬對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)，通過6小時(shí)的七氟烷曝露(比較例I)，誘發(fā)了活性caspase-3陽性的細(xì)胞數(shù)的顯著增加(圖2B)。另一方面，與僅七氟燒曝露相比，七氟燒+氫的曝露(實(shí)施例1)中，小鼠的活性caspase-3陽性的細(xì)胞數(shù)顯著地少(圖2和圖3)。從圖2和圖3可知，由七氟烷引起的、發(fā)育期的腦中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡被氫氣緩和。發(fā)明人另外將TUNEL法作為細(xì)胞水平的凋亡性細(xì)胞死亡的測(cè)定法進(jìn)行了實(shí)施(圖4)。麻醉6小時(shí)后的TUNEL染色的圖案與活性caspase-3的染色圖案相似。這些結(jié)果顯示出，1.3%氫使新生小鼠的由七氟烷曝露引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著下降。
[0203]羥基自由基作用于脂質(zhì)時(shí)，形成脂質(zhì)過氧化物而產(chǎn)生4-HNE。因此，4-HNE被廣泛用作脂質(zhì)的過氧化和氧化應(yīng)激的標(biāo)記。圖5示出將神經(jīng)元暴露于七氟烷6小時(shí)后(圖5B、比較例1)，與模擬對(duì)照(圖5A)相比，誘發(fā)了更多的脂質(zhì)過氧化。另一方面，暴露于七氟烷+氫的小鼠(實(shí)施例1)的腦的4-HNE的染色(圖5C)與僅暴露于七氟烷的情況(圖5B)相比顯著減少了。從這些的結(jié)果可以確認(rèn)，新生小鼠的3%七氟烷暴露可誘發(fā)腦內(nèi)的氧化應(yīng)激，但氫使氧化應(yīng)激減少。
[0204][試驗(yàn)例3]
[0205]行為學(xué)試驗(yàn):供于行為學(xué)研究的小鼠全部為在與實(shí)施例1和比較例1相同的條件下暴露于麻醉的同齡、同窩仔的雄性。將3周齡的小鼠與母親分離，收容到有3或4只小鼠的籠子中。在規(guī)定的年齡對(duì)它們進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)(為了評(píng)價(jià)麻醉藥的影響，進(jìn)行了作為長(zhǎng)期記憶障礙評(píng)價(jià)的對(duì)照的曠場(chǎng)試驗(yàn)、用于評(píng)價(jià)短期記憶障礙的Y字型迷宮中的自發(fā)性交替行為學(xué)試驗(yàn)、用于評(píng)價(jià)長(zhǎng)期記憶障礙的條件性恐懼試驗(yàn)、社會(huì)性試驗(yàn)。對(duì)于社會(huì)性試驗(yàn)，除社會(huì)性相互作用試驗(yàn)外，作為其對(duì)照而進(jìn)行了新物體試驗(yàn)和嗅覺試驗(yàn))。觀察各小鼠的行動(dòng)，使用計(jì)算機(jī)控制錄像追跡系統(tǒng)(SMART ;巴塞羅那、西班牙)進(jìn)行分析。試驗(yàn)中，使用具有臂的裝置，對(duì)小鼠的4只腳全部進(jìn)入臂的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。裝置在每次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行打掃。該研究中使用的裝置全部為0’Hara&C0.，LTD(東京都、日本)制。相同的小鼠的組供于全部試驗(yàn)。
[0206]曠場(chǎng)試驗(yàn):使用Satoh Y.等，J Neurosci, 2011 ;31:11953-11967 中記載的方法，通過曠場(chǎng)試驗(yàn)就對(duì)新環(huán)境的情緒反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。行動(dòng)以10分鐘的總移動(dòng)距離(米)來測(cè)定。試驗(yàn)對(duì)12周齡的小鼠實(shí)施。結(jié)果如圖6A所示。
[0207]Y字型迷宮中的自發(fā)性交替行為學(xué)試驗(yàn):為了評(píng)價(jià)空間工作記憶，按照SatohY.等，J Neurosci, 2011 ;31:11953-11967中記載的方法實(shí)施了 Y字型迷宮試驗(yàn)。左右對(duì)稱的亞力克制的Y字型迷宮由在120°C下分開的3條臂(25X 5cm)構(gòu)成，由高度15cm的透明的壁包圍。將小鼠分別置于Y字型迷宮的中央，并使其自由探索8分鐘，記錄侵入臂的連續(xù)次數(shù)或總次數(shù)。交替反應(yīng)(alternat1n)的比例是用連續(xù)的3次進(jìn)入為全部3條臂的進(jìn)入時(shí)的次數(shù)除以交替反應(yīng)的最大可能數(shù)(對(duì)臂的總進(jìn)入次數(shù)減去2而得的值)后，乘以100而得的數(shù)。試驗(yàn)對(duì)12周齡的小鼠實(shí)施。結(jié)果如圖6B所示。
[0208]條件性恐懼試驗(yàn):按照Satomoto Μ.等，Anesthes1logy 2009 ; 110:628-637 中記載的方法實(shí)施條件性恐懼試驗(yàn)。以下簡(jiǎn)單記載該方法。將小鼠裝入特殊的籠子，播放20秒80dB的白噪音。在第20秒施加1秒的1mA的足底電擊(foot shock)，將該刺激以1分鐘周期重復(fù)3次。在刺激24小時(shí)后將施加了足底電擊的小鼠放回籠子，對(duì)小鼠木僵(1秒的持續(xù)時(shí)間中身體的任何部分都不動(dòng)的狀態(tài))的時(shí)間測(cè)量5分鐘(條件性恐懼試驗(yàn)場(chǎng)景試驗(yàn))。在48小時(shí)后將小鼠放入完全不同的場(chǎng)所的不同形狀的籠子中，僅播放白噪音，對(duì)小鼠木僵的時(shí)間測(cè)量3分鐘(條件性恐懼試驗(yàn)噪音試驗(yàn))。木僵反應(yīng)用錄像追跡系統(tǒng)進(jìn)行記錄，作為恐懼記憶的指數(shù)。試驗(yàn)對(duì)13周齡的小鼠實(shí)施。供于該試驗(yàn)的小鼠不再用于之后的任一試驗(yàn)(將與用于曠場(chǎng)試驗(yàn)和Y字型迷宮中的自發(fā)性交替行為學(xué)試驗(yàn)的小鼠相同的小鼠的組供于試驗(yàn))。在施加條件24小時(shí)后，將小鼠放入進(jìn)行過施加條件的室中，測(cè)定木僵(基于場(chǎng)景的恐懼反應(yīng))的結(jié)果如圖6C所示。在施加條件訓(xùn)練48小時(shí)后，將小鼠放入完全不同的場(chǎng)所的不同形狀的籠子中，僅播放白噪音并測(cè)定木僵的結(jié)果如圖6D所示。
[0209]社會(huì)性試驗(yàn):確認(rèn)社會(huì)性的測(cè)試中進(jìn)行社會(huì)性相互作用試驗(yàn)、新物體試驗(yàn)、嗅覺試驗(yàn)這3個(gè)試驗(yàn)。
[0210]為了試驗(yàn)對(duì)社會(huì)性相互作用的能力，按照Satoh Y.等，J Neurosci, 2011 ；31:11953-11967中記載的方法實(shí)施了社交性試驗(yàn)。對(duì)于是優(yōu)先選擇生物靶(放入籠子中的成體小鼠)還是非生物靶(放入籠子中的仿制小鼠)，作為相互作用的目標(biāo)，在曠場(chǎng)室中實(shí)施了試驗(yàn)。將生物或非生物的標(biāo)靶放置在圓柱型的籠子中，使得雖然能夠聞到氣味但只能進(jìn)行最小限的接觸。圓柱型的籠子高度10cm、直徑為9cm,柵的間隔為7mm。在701ux的照明條件下觀察10分鐘直接聞籠子的氣味的動(dòng)作并計(jì)數(shù)。試驗(yàn)對(duì)12周齡的小鼠實(shí)施(對(duì)照:η = 18 ;七氟烷:η = 20 ;七氟烷+氫:η = 19)。全部生物靶使用野生型的雄性小鼠。結(jié)果如圖7A所示。
[0211]嗅覺試驗(yàn):對(duì)Satoh Y.等，J Neurosci, 2011 ;31:11953-11967 中記載的方法施加一些變更后實(shí)施嗅覺試驗(yàn)。以下簡(jiǎn)單記載該方法。使小鼠在第一天習(xí)慣新食物(藍(lán)莓芝士)的香味。在48小時(shí)的攝食限制后，測(cè)定直至找到被掩埋的食物為止所需要的時(shí)間:將藍(lán)莓芝士的碎片埋藏在清潔的籠子中的敷草的2cm下。試驗(yàn)對(duì)12周齡的小鼠實(shí)施(將與在社會(huì)性試驗(yàn)中使用的小鼠相同的小鼠的組供于試驗(yàn))。結(jié)果如圖7B所示。
[0212]新物體試驗(yàn):按照Satoh Y.等，J Neurosci, 2011 ;31:11953-11967 中記載的方法實(shí)施新物體試驗(yàn)。將小鼠單獨(dú)收容，測(cè)定在10分鐘內(nèi)與非生物的新物體(小的紅色管)互動(dòng)的時(shí)間的合計(jì)。試驗(yàn)對(duì)12周齡的小鼠實(shí)施(將與在社會(huì)性試驗(yàn)和嗅覺試驗(yàn)中使用的小鼠相同的小鼠的組供于試驗(yàn))。結(jié)果如圖7C所示。
[0213]就用于評(píng)價(jià)對(duì)新環(huán)境的情緒反應(yīng)而實(shí)施的曠場(chǎng)試驗(yàn)中的10分鐘總移動(dòng)距離而言，在組間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(對(duì)照:n = 18 ;七氟烷:n = 20 ;七氟烷+氫:n =19)(圖6A)。因此，顯示出全身麻醉藥不影響情緒反應(yīng)。
[0214]工作記憶是用于完成復(fù)雜的認(rèn)知工作的、將信息保持一段時(shí)間的能力(Saxe MD等，Proc Natl Acad Sci USA 2006 ;103:17501-17506、Jones MW, Curr Mol Med 2002 ；2:639-647)。在為了評(píng)價(jià)空間工作記憶而實(shí)施的Y字型迷宮試驗(yàn)中(圖6B)，未在組間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異(將與在曠場(chǎng)試驗(yàn)中使用的小鼠相同的小鼠的組供于試驗(yàn))。因此，顯示出全身麻醉藥不影響短期記憶。
[0215]為了評(píng)價(jià)氫對(duì)新生仔的由七氟烷曝露引起的長(zhǎng)期記憶損傷的影響，對(duì)曝露于有氫同時(shí)給藥(實(shí)施例1)或無氫同時(shí)給藥(比較例I)的七氟烷后的小鼠，在成為成體的階段進(jìn)行條件性恐懼試驗(yàn)(圖6C和D)。在條件恐懼場(chǎng)景試驗(yàn)中(圖6C)，曾曝露于七氟烷的小鼠(比較例I)的、在接受刺激起24小時(shí)后的木僵(畏縮行動(dòng))與對(duì)照動(dòng)物相比，在場(chǎng)景學(xué)習(xí)方面顯著下降(單因素方差分析、F = 7.22, P = 0.0017 ;在對(duì)照與七氟烷的比較中，Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、P < 0.01),顯不出新生仔的七氟燒曝露對(duì)成體的長(zhǎng)期記憶造成損傷。與此形成對(duì)照的是，曾曝露于七氟烷+氫的小鼠(實(shí)施例1)與僅曾給藥七氟烷的小鼠(比較例I)相比，行動(dòng)得到改善(在七氟烷與七氟烷+氫的比較中，Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、P < 0.01)，顯示出與對(duì)照幾乎同等的表現(xiàn)(在對(duì)照與七氟烷+氫的比較中，Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、P < 0.05)。另外,在條件恐懼噪音試驗(yàn)中(圖6D),與對(duì)照相比，七氟烷曝露的小鼠(比較例I)在施加條件訓(xùn)練48小時(shí)后的噪音試驗(yàn)中的木僵也顯著下降(單因素方差分析、F = 12.08、P = 0.0001 ;在對(duì)照與七氟烷的比較中，Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、P < 0.001)。另一方面，曾曝露于七氟燒+氫的小鼠(實(shí)施例1)與僅曝露于七氟烷的小鼠(比較例I)相比，顯示出更優(yōu)秀的行動(dòng)(在七氟烷與七氟烷+氫的比較中，Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、P < 0.001),顯示出與對(duì)照幾乎同等的表現(xiàn)(在對(duì)照與七氟燒+氫的比較中，Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、P < 0.05)。
[0216]這些結(jié)果顯示出，新生仔的由全身麻醉藥曝露引起的記憶障礙的種類是長(zhǎng)期記憶障礙，氫可預(yù)防和/或減輕所述記憶障礙。
[0217]小鼠是具有社交性的物種，顯示出社會(huì)性相互作用行為(Kamsler A等，MolNeurob1l 2004;29:167-178)。發(fā)明人以前曾經(jīng)報(bào)導(dǎo)了新生仔時(shí)期曝露于七氟烷的小鼠在成為成體時(shí)顯示出社會(huì)性行動(dòng)缺陷(Satomoto Μ.等，Anesthes1logy 2009 ；110:628-637)。本實(shí)驗(yàn)中，為了研究氫是否能夠抑制新生兒的由七氟烷曝露引起的社會(huì)性行動(dòng)缺陷，而實(shí)施了小鼠的社交性試驗(yàn)(圖7)。
[0218]在將生物或非生物作為標(biāo)靶的相互作用試驗(yàn)中，全部組花費(fèi)與非生物相比顯著多的時(shí)間與生物進(jìn)行互動(dòng)(t檢測(cè)、全部P< 0.001)。但是，與對(duì)照相比，在新生仔時(shí)期曾曝露于七氟烷的小鼠(比較例1)與生物靶交流的時(shí)間減少。被同時(shí)給藥氫的小鼠(實(shí)施例
1)顯示出與對(duì)照幾乎同等的行動(dòng)，顯示出由七氟烷引起的社會(huì)性行動(dòng)缺陷能夠通過將氫與七氟烷同時(shí)給藥來預(yù)防(圖7A)。通過單因素方差分析證實(shí)了這些結(jié)果(F = 6.12、P =0.004、Newman-Keuls事后檢驗(yàn)、在對(duì)照與七氟烷的比較中P < 0.01、在對(duì)照與七氟烷+氫的比較中P < 0.05)。嗅覺試驗(yàn)(單因素方差分析、F = 0.50、P = 0.71、圖7B)和新物體試驗(yàn)(單因素方差分析、F = 0.04, P = 0.96、圖7C)中，在僅給藥七氟烷(比較例1)和給藥七氟烷+氫(實(shí)施例1)的組間，無法檢測(cè)到顯著不同，因此不能說上述社會(huì)性相互作用的不同起因于嗅覺的損傷、或?qū)π挛矬w興趣的喪失。因此可以說，氫能夠抑制新生仔的由七氣燒曝露引起的社會(huì)性彳丁動(dòng)缺陷。
[0219]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0220]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供通過將全身麻醉藥與氫組合使用來預(yù)防和/或減輕腦(例如發(fā)育期)的麻醉誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品。另外，本發(fā)明簡(jiǎn)便、無副作用，有效地發(fā)揮作用，并且廉價(jià)，因此例如在產(chǎn)科和兒科醫(yī)療中能夠提供有效的藥品。
【權(quán)利要求】
1.一種用于人或人以外的動(dòng)物的藥品，將全身麻醉藥與氫組合而成。
2.一種用于人或人以外的動(dòng)物的全身麻醉的藥品，其特征在于，并用全身麻醉藥和氫來給藥。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥品，其用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙。
4.如權(quán)利要求3所述的藥品，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
5.一種含有全身麻醉藥的用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品，其特征在于，全身麻醉藥以與氫并用的方式使用。
6.如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的藥品，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
7.如權(quán)利要求6所述的藥品，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
8.如權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的藥品，其以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象。
9.如權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的藥品,其中,全身麻醉藥為選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
10.如權(quán)利要求3、5?9中任一項(xiàng)所述的藥品，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙為神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙或自閉癥。
11.一種藥品的制備方法，為了預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙而并用全身麻醉藥和氫。
12.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
13.如權(quán)利要求11或12所述的制備方法，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
14.如權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
15.如權(quán)利要求11?14中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，藥品以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象。
16.全身麻醉藥在制造與氫組合使用的全身麻醉劑中的應(yīng)用。
17.全身麻醉藥與氫在制造全身麻醉藥與氫組合而成的藥品中的應(yīng)用。
18.全身麻醉藥與氫在制造用于預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的藥品中的應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
20.如權(quán)利要求16?18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
22.如權(quán)利要求16?18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，以胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人為對(duì)象。
23.如權(quán)利要求16?18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，全身麻醉藥為選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
24.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙為神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙或自閉癥。
25.一種預(yù)防和/或減輕麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙的方法，其具有并用全身麻醉藥和氫而向?qū)ο蠼o藥的步驟。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，全身麻醉藥為吸入麻醉藥或液態(tài)的靜脈麻醉藥，氫為氫氣。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，氫氣濃度在藥品中為0.15?7% (v/v)。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，給藥對(duì)象為胎兒、新生兒、嬰兒、幼兒、兒童或老年人。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，全身麻醉藥為選自由一氧化二氮、異氟烷、安氟醚、甲氧氟烷、七氟烷、地氟烷、乙醚、異丙酚和咪達(dá)唑侖組成的組中的一種以上的麻醉藥。
30.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙為神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)認(rèn)知障礙、精神認(rèn)知障礙或自閉癥。
31.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，麻醉藥誘發(fā)性神經(jīng)障礙是伴隨神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的。
【文檔編號(hào)】A61P25/18GK104394873SQ201380028933
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】風(fēng)間富榮, 佐藤泰司, 與那嶺龍二 申請(qǐng)人:丸石制藥株式會(huì)社