一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法，是針對人體皮膚組織的結(jié)構(gòu)特征，采用殼聚糖、明膠、人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)薄膜成型、培養(yǎng)液浸泡、組織構(gòu)建，在高壓無菌狀態(tài)下生成人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的人體表皮組織，此制備方法工藝先進(jìn)，氣體壓力裝置的構(gòu)建和使用，可有效提高人體表皮組織的制備效率和速度，可做燒傷病人的植皮治療使用，增強(qiáng)了皮膚移植的效果，是十分理想的人體表皮組織的構(gòu)建制備方法。
【專利說明】一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法，屬生物組織材料構(gòu)建及制備應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】
皮膚覆蓋于人體表面，是人體最大的器官，皮膚作為人體的第一道生理防線，時刻參與著機(jī)體的功能活動，通過分泌、排泄和吸收等功能維持體內(nèi)代謝平衡，保護(hù)機(jī)體內(nèi)組織器官免受外界環(huán)境傷害；人體皮膚組織由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，人體表皮在皮膚創(chuàng)傷后的修復(fù)中具有重要作用，如創(chuàng)面不能及時愈合常會造成水份、蛋白質(zhì)的丟失，增加感染幾率，且極易形成增生性瘢痕，如能及早移植表皮封閉創(chuàng)面，可有效減少或減輕增生性瘢痕的形成。 [0003]瘢痕病人是一個巨大的群體，尤其是皮膚燒傷居多，小面積皮膚燒傷病人多采用自體皮膚移植，對于大面積皮膚深度燒傷病人，自體供皮有限，體外構(gòu)建類似人體的表皮結(jié)構(gòu)治療皮膚燒傷病人是有效的；體外表皮重建的方法也有多種形式，例如Genzyme公司的表皮膜，以及表皮替代物；但是由于人體表皮組織體外培養(yǎng)條件嚴(yán)格，時間較長，往往達(dá)不到臨床治療快速封閉創(chuàng)面的要求和時間，故尋求一種快速構(gòu)建制備人體表皮組織的方法是十分必要的。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是針對【背景技術(shù)】的情況，采用殼聚糖和明膠形成薄膜，培養(yǎng)人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，在高壓無菌下生成人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞薄膜，以快速構(gòu)建制成人體表皮組織，增強(qiáng)皮膚移植治療的效果。
[0005]技術(shù)方案
本發(fā)明使用的化學(xué)物質(zhì)材料為:人體皮膚組織、殼聚糖、明膠、人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液、高糖培養(yǎng)基、氯化鈣、碘酒、磷酸鹽溶液、硫酸慶大霉素、青霉素、蛋白酶、膠原酶、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、醋酸、戊二醛、氫氧化鈉、硼氫化鈉、二氧化碳、滅菌去離子水、二甲基亞砜、生理鹽水，其準(zhǔn)備用量如下:以克、毫升、毫米、厘米3為計量單位；人體皮膚組織:50g±0.1g
殼聚糖:5g±0.01g
明膠:5g±0.01g
人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液=Ca2+濃度0.09 mmol/L 200mL土 ImL 高糖培養(yǎng)基:Ca2+濃度 1.8mmol/L200mL±lmL
氯化鈣:0.5 g±0.0Olg
碘酒:IOmL±0.1mL
磷酸鹽溶液:500mL±5mL
硫酸慶大霉素:40000單位/mL4mL±0.1mL
青霉素:800000 單位 /g5g±0.1g蛋白酶:0.5g±0.0Olg
膠原酶:0.5g±0.0Olg
胎牛血清:20mL±lmL
胰蛋白酶:0.5g±0.0Olg
乙二胺四乙酸:0.05g±0.0Olg
醋酸:5mL±0.1mL
戊二醛:濃度 50%5mL±0.1mL
氫氧化鈉:5g±0.1g
硼氫化鈉:5g±0.1g
二氧化碳:氣體5000cm3± IOOcm3
滅菌去離子水:1000mL±10mL
二甲基亞諷2mL±0.1mL
生理鹽水IOOmLilmL
快速構(gòu)建制備方法如下:
(1)配制細(xì)胞培養(yǎng)液
①配制人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液:
量取高糖培養(yǎng)基90mL，胎牛血清10mL，混勻，成人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液；
②配制人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的混合培養(yǎng)液:
量取人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液IOOmU高糖培養(yǎng)基IOOmL,比例1:1，混勻，加入氯
化鈣0.0105g,震蕩搖晃5min，過濾器過濾，在冰箱保存，保存溫度4°C，成混合培養(yǎng)液；
(2)人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞的提取
①手術(shù)獲取人體皮膚組織
選取健康人體，手術(shù)提取人體皮膚組織50g ；
②將人體皮膚組織置于培養(yǎng)皿中，加入碘酒10mL，迅速進(jìn)行沖洗；
③量取磷酸鹽溶液500mL，加入硫酸慶大霉素2mL、青霉素0.125g,過濾器過濾，成混合液；將沖洗后的人體皮膚組織置于另一培養(yǎng)皿中，加入磷酸鹽溶液-硫酸慶大霉素-青霉素混合液10mL，浸泡人體皮膚組織，浸泡時間15min ；
④用剪刀、刀片刮除人體皮膚組織真皮皮下組織，用磷酸鹽溶液-硫酸慶大霉素-青霉素混合液IOmL,浸泡5min ；
⑤量取人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，加入蛋白酶0.025g,搖勻，過濾器過濾，將人體皮膚組織表皮面朝上平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液-蛋白酶混合溶液10mL，在冰箱4°C下無菌放置12h ;然后用尖鑷分離人體皮膚組織，使表皮與真皮分開；
⑥ 量取高糖培養(yǎng)基10mL，加入膠原酶0.02g，搖勻，過濾器過濾，將人體皮膚組織的真皮組織剪碎，成Imm3塊，加入高糖培養(yǎng)基-膠原酶溶液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C下消化240min，然后加入胎牛血清lmL，混勻，成混合溶液；
⑦離心分離人體真皮成纖維細(xì)胞，靜置培養(yǎng)
將混合溶液收集于離心管內(nèi)，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集于培養(yǎng)瓶中，將盛有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C、5 % 二氧化碳?xì)怏w下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間72h后，倒掉人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，再次加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，繼續(xù)培養(yǎng)時間72h ；
⑧量取磷酸鹽溶液IOOmL,加入胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸0.01g,搖勻，過濾器過濾，將人體皮膚組織的表皮組織剪碎，成Imm3塊，加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C下消化5min ；
⑨離心分離人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，靜置培養(yǎng)
用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾表皮碎片，與混合液混合，收集于離心管內(nèi)，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集于培養(yǎng)瓶中，將盛有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中,在37°C、5 % 二氧化碳?xì)怏w下靜置培養(yǎng)72h后,倒掉人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液,再次加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，繼續(xù)培養(yǎng)時間72h ；
(3)制備殼聚糖-明膠膜片
①配制醋酸水溶液
量取醋酸lmL，滅菌去離子水99mL，放入燒杯中，混勻，成醋酸水溶液；
②溶解殼聚糖
稱取殼聚糖4g，加入 醋酸水溶液96mL，攪拌4h，使其溶解，成殼聚糖醋酸水溶液；
③配制明膠水溶液
稱取明膠4g，量取滅菌去離子水96mL，置于燒杯中，然后置于水浴箱中，加熱溫度40°C，使其溶解，成溶解液；
將溶解液用100目濾紙過濾，得明膠水溶液；
④配制殼聚糖-明膠溶液
量取殼聚糖醋酸水溶液95mL，明膠水溶液95mL，比例1: 1，加入燒杯中，磁力攪拌60min,
然后置于水浴箱中，在40°C恒溫混勻12h，成殼聚糖-明膠溶液；
⑤配制戊二醛水溶液
量取戊二醛0.08mL,量取滅菌去離子水15.92mL,混勻，成0.05mol/L的戊二醛水溶
液；
⑥殼聚糖-明膠溶液中添加戊二醛水溶液
將戊二醛水溶液16mL、殼聚糖-明膠溶液185mL，加入燒杯中，快速攪拌15min，成殼聚糖-明膠-戊二醛混合溶液；
⑦制備水凝膠
將殼聚糖-明膠-戊二醛混合溶液倒入96孔培養(yǎng)板中，孔徑為6_，在25°C下靜置12h，成水凝膠；
⑧冷凍、冷凍干燥
將水凝膠置于冷凍箱中冷凍，在_20°C冷凍24h，然后在-80°C冷凍24h ；
將冷凍的水凝膠置于石英容器中，然后置于冷凍干燥箱中干燥，冷凍干燥溫度_80°C，真空度18Pa,時間24h,形成05mmX Imm的圓柱體薄膜；
⑨清洗、還原戊二醛配制0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液IOOmL ；
配制0.26mol/L的硼氫化鈉水溶液IOOmL ；
加入滅菌去離子水IOOmL,加入燒杯中，成中性混合液；
將冷凍干燥的殼聚糖-明膠薄膜置于中性混合液中浸泡60min，然后將薄膜置于另一燒杯中，加入滅菌去離子水200mL沖洗薄膜，使薄膜的pH=7，呈中性；
沖洗后薄膜置于冷凍箱中冷凍，在_20°C冷凍24h，然后在-80°C冷凍24h ;將冷凍的薄膜置于石英容器中，然后在冷凍干燥箱中干燥，冷凍干燥溫度_80°C，真空度18Pa，時間24h ；
⑩Y射線輻射滅菌
將殼聚糖-明膠薄膜裝入密封玻璃瓶中，用Y射線輻射滅菌，Y射線輻射劑量25kgy，滅菌時間24h，滅菌后薄膜為無菌保存；
(4)人體表皮組織的快速構(gòu)建和制備
人體表皮組織的快速構(gòu)建和制備是在高壓釜內(nèi)，在氣體壓力中進(jìn)行的，是在37°C下、
3.4KPa壓力下、無菌狀態(tài)下完成的；
①將殼聚糖-明膠薄膜置于培養(yǎng)皿中，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10mL、人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液IOmL,置于恒溫培養(yǎng)箱中,加熱溫度37°C,恒溫培養(yǎng)12h ；
②將濕潤的殼聚糖-明膠薄膜置`于無菌潔凈工作臺上吹干；
③接種細(xì)胞
倒掉培養(yǎng)瓶中的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C消化5min，成細(xì)胞懸液，然后收集于離心管中，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞以30萬個/cm2的密度接種于殼聚糖-明膠薄膜上，用人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒培養(yǎng)24h ；
倒掉培養(yǎng)瓶中的人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C消化5min，成細(xì)胞懸液，然后收集在離心管中，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將人體真皮成纖維細(xì)胞以30萬個/cm2的密度接種于殼聚糖-明膠薄膜上，用人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒培養(yǎng)24h，
生成:人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊、人體真皮成纖維細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊；
④將人體真皮成纖維細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊置于96孔培養(yǎng)板中底層，作為滋養(yǎng)層，將人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊置于96孔培養(yǎng)板上層，每孔中加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞的混和培養(yǎng)液0.1mL,并施加無菌空氣與二氧化碳混合氣體，高壓釜內(nèi)底層置放滅菌去離子水，做濕潤劑，加熱溫度37°C，氣體壓力3.4KPa，進(jìn)行氣-液界面壓力培養(yǎng)72h ；
⑤氣-液界面壓力培養(yǎng)后，在96孔培養(yǎng)板上合成人體表皮組織；
(5)人體表皮組織的檢測、分析、表征
對制備的人體表皮組織的形貌、細(xì)胞生長、分層進(jìn)行檢測、分析、表征；
用酶聯(lián)免疫檢測儀進(jìn)行人體表皮組織中人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況；用倒置顯微鏡進(jìn)行人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞排列及分層的檢測；
結(jié)論:制備的人體表皮組織為無色薄膜狀，組織成分為人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合物，組織活性良好，人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分層生長良好；
(6)人體表皮組織的保存
人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液8mL，加入胎牛血清lmL，二甲基亞砜lmL，形成人工表皮保護(hù)液；人體表皮組織置于棕色透明無菌的塑料容器中，加入保護(hù)液IOmL,在4°C放置30min ;在-20°C放置30min ;在-80°C放置24h ;在液氮中長期保存；
(7)人體表皮組織的復(fù)溫
將盛有保護(hù)液和人體表皮組織的塑料容器置于恒溫水浴箱中，在37°C下解凍5min，人體表皮組織復(fù)溫，用無菌生理鹽水沖洗人體表皮組織3次，每次lmin。
[0006]有益效果 本發(fā)明與【背景技術(shù)】相比具有明顯的先進(jìn)性，是針對人體皮膚組織的結(jié)構(gòu)特性，采用殼聚糖、明膠、人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)，薄膜成型，培養(yǎng)液浸泡、組織構(gòu)建，在高壓無菌狀態(tài)下形成人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠薄膜，此制備方法工藝先進(jìn)、數(shù)據(jù)精確翔實，可快速構(gòu)建制成人體表皮組織，氣體壓力裝置的構(gòu)建和作用可有效提高表皮組織的制備效率，制備的人體表皮組織可做燒傷病人的植皮治療使用，增強(qiáng)了皮膚移植效果，是十分理想的人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法。
[0007]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1人體表皮組織快速構(gòu)建制備狀態(tài)圖 圖2人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞形貌圖 圖3人體真皮成纖維細(xì)胞形貌圖 圖4殼聚糖-明膠薄膜表觀形貌圖 圖5人體表皮組織的蘇木素-伊紅染色后形貌圖 圖中所示，附圖標(biāo)記清單如下:
1.高壓釜，2.高壓密封釜蓋，3.支架，4.培養(yǎng)板，5.人體表皮組織，6.滅菌去離子水，
7.混合氣體，8.出氣閥，9.氣壓表，10.進(jìn)氣管，11.混合氣體過濾滅菌裝置，12.混合氣體進(jìn)氣閥，13.二氧化碳?xì)怏w閥，14.壓縮空氣氣體閥，15.空氣壓縮機(jī)，16.二氧化碳?xì)怏w瓶，17.導(dǎo)線，18.電控器，19.顯示屏，20.指示燈，21.電源開關(guān)，22.加熱溫度控制器，23.空氣壓縮機(jī)控制器。
【具體實施方式】
[0008]以下結(jié)合附圖將本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
圖1所示，為人體表皮組織快速構(gòu)建制備狀態(tài)圖，各部位置、連接關(guān)系要正確，安裝牢固，按量配比，按序操作。
[0009]制備使用的化學(xué)物質(zhì)的量值是按預(yù)先設(shè)置的范圍確定的，以克、毫升、毫米、厘米3為計量單位。
[0010]人體表皮組織的快速構(gòu)建制備是在高壓釜內(nèi)、在氣體壓力中進(jìn)行的，是在37°C下、在3.4KPa壓力下、無菌狀態(tài)下完成的；
高壓釜為矩形，高壓釜I下部為電控箱18、上部為高壓密封釜蓋2 ;在高壓釜I內(nèi)底部為滅菌去離子水6，高壓釜I內(nèi)中間位置安裝支架3，在支架3上置放培養(yǎng)板4，在培養(yǎng)板4上置放人體表皮組織5，在人體表皮組織5上部由混合氣體7充填；在高壓密封釜蓋2上部由左至右設(shè)置進(jìn)氣管10、氣壓表9、出氣閥8，進(jìn)氣管10左部連接混合氣體過濾滅菌裝置11、混合氣體進(jìn)氣閥12，混合氣體進(jìn)氣閥12通過進(jìn)氣管10同時連通二氧化碳?xì)怏w閥13、壓縮空氣氣體閥14，二氧化碳?xì)怏w閥13連通二氧化碳?xì)怏w瓶16，壓縮空氣氣體閥14連通空氣壓縮機(jī)15 ;在高壓釜I的下部為電控器18，在電控器18上設(shè)有顯示屏19、指示燈20、電源開關(guān)21、加熱溫度控制器22、空氣壓縮機(jī)控制器23 ;電控器18通過導(dǎo)線17與空氣壓縮機(jī)15連接。
[0011]圖2所示，為人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞形貌圖，圖中可知:提取的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈圓形、三角形和多邊形交織形貌。
[0012]圖3所示，為人體真皮成纖維細(xì)胞形貌圖，圖中可知:提取的人體真皮成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈長梭形旋渦狀形貌。
[0013]圖4所示，為殼聚糖-明膠薄膜表觀形貌圖，圖中可知:殼聚糖-明膠薄膜具有均勻的三維孔洞結(jié)構(gòu)。
[0014]圖5所示，為人體表皮組織的蘇木素-伊紅染色后形貌圖，圖中可知:殼聚糖-明膠支架染色呈紅色，人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體等呈藍(lán)紫色；人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞圍繞殼聚糖-明膠支架的孔洞生長，鋪展?fàn)顟B(tài)良好，呈圓形、三角形和多邊形生長，與單層生長的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞狀態(tài)一致，且在殼聚糖-明膠支架中生長的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞可聚集成片，呈多層生長，逐漸與支架融合，說明構(gòu)建的人體表皮組織具有良好的細(xì) 胞活性和分層情況。
【權(quán)利要求】
1.一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法，其特征在于:使用的化學(xué)物質(zhì)材料為--人體皮膚組織、殼聚糖、明膠、人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液、高糖培養(yǎng)基、氯化鈣、碘酒、磷酸鹽溶液、硫酸慶大霉素、青霉素、蛋白酶、膠原酶、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、醋酸、戊二醛、氫氧化鈉、硼氫化鈉、二氧化碳、滅菌去離子水、二甲基亞砜、生理鹽水，其準(zhǔn)備用量如下:以克、毫升、毫米、厘米3為計量單位； 人體皮膚組織:50g±0.1g殼聚糖:5g±0.01g明膠:5g±0.01g 人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液=Ca2+濃度0.09 mmol/L 200mL土 ImL 高糖培養(yǎng)基:Ca2+濃度 1.8mmol/L200mL±lmL 氯化鈣:0.5 g±0.0Olg碘酒:IOmL±0.1mL 磷酸鹽溶液:500mL±5mL 硫酸慶大霉素:40000單位/mL4mL±0.1mL 青霉素:800000 單位 /g5g±0.1g 蛋白酶:0.5g±0.0Olg 膠原酶:0.5g±0.0Olg胎牛血清:20mL±lmL 胰蛋白酶:0.5g±0.0Olg 乙二胺四乙酸:0.05g±0.0Olg醋酸:5mL±0.1mL 戊二醛:濃度 50%5mL±0.1mL氫氧化鈉:5g±0.1g硼氫化鈉:5g± 0.1g 二氧化碳:氣體5000cm3± IOOcm3 滅菌去離子水:1000mL±10mL 二甲基亞諷2mL±0.1mL生理鹽水IOOmLilmL 快速構(gòu)建制備方法如下: 配制細(xì)胞培養(yǎng)液 ①配制人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液: 量取高糖培養(yǎng)基90mL，胎牛血清10mL，混勻，成人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液； ②配制人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的混合培養(yǎng)液: 量取人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液IOOmU高糖培養(yǎng)基IOOmL,比例1:1，混勻，加入氯化鈣0.0105g,震蕩搖晃5min，過濾器過濾，在冰箱保存，保存溫度4°C，成混合培養(yǎng)液； 人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞的提取 ①手術(shù)獲取人體皮膚組織 選取健康人體，手術(shù)提取人體皮膚組織50g ； ②將人體皮膚組織置于培養(yǎng)皿中，加入碘酒10mL，迅速進(jìn)行沖洗；③量取磷酸鹽溶液500mL，加入硫酸慶大霉素2mL、青霉素0.125g,過濾器過濾，成混合液；將沖洗后的人體皮膚組織置于另一培養(yǎng)皿中，加入磷酸鹽溶液-硫酸慶大霉素-青霉素混合液IOmL,浸泡人體皮膚組織，浸泡時間15min ； ④用剪刀、刀片刮除人體皮膚組織真皮皮下組織，用磷酸鹽溶液-硫酸慶大霉素-青霉素混合液IOmL,浸泡5min ； ⑤量取人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，加入蛋白酶0.025g,搖勻，過濾器過濾，將人體皮膚組織表皮面朝上平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液-蛋白酶混合溶液10mL，在冰箱4°C下無菌放置12h ;然后用尖鑷分離人體皮膚組織，使表皮與真皮分開； ⑥量取高糖培養(yǎng)基10mL，加入膠原酶0.02g，搖勻，過濾器過濾，將人體皮膚組織的真皮組織剪碎，成Imm3塊，加入高糖培養(yǎng)基-膠原酶溶液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C下消化240min，然后加入胎牛血清lmL，混勻，成混合溶液； ⑦離心分離人體真皮成纖維細(xì)胞，靜置培養(yǎng) 將混合溶液收集于離心管內(nèi)，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集于培養(yǎng)瓶中，將盛有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C、5 %二氧化碳?xì)怏w下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間72h后，倒掉人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，再次加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，繼續(xù)培養(yǎng)時間72h ； ⑧量取磷酸鹽溶液IOOmL,加入胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸0.01g,搖勻，過濾器過濾，將人體皮膚組織的表皮組織剪碎，成Imm3塊，加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C下消化5min ；` ⑨離心分離人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，靜置培養(yǎng) 用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾表皮碎片，與混合液混合，收集于離心管內(nèi)，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集于培養(yǎng)瓶中，將盛有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中,在37°C、5 % 二氧化碳?xì)怏w下靜置培養(yǎng)72h后,倒掉人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液,再次加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，持續(xù)培養(yǎng)時間72h ； 制備殼聚糖-明膠膜片 ①配制醋酸水溶液 量取醋酸lmL，滅菌去離子水99mL，放入燒杯中，混勻，成醋酸水溶液； ②溶解殼聚糖 稱取殼聚糖4g，加入醋酸水溶液96mL，攪拌4h，使其溶解，成殼聚糖醋酸水溶液； ③配制明膠水溶液 稱取明膠4g，量取滅菌去離子水96mL，置于燒杯中，然后置于水浴箱中，加熱溫度40°C，使其溶解，成溶解液； 將溶解液用100目濾紙過濾，得明膠水溶液； ④配制殼聚糖-明膠溶液 量取殼聚糖醋酸水溶液95mL，明膠水溶液95mL，比例1: 1，加入燒杯中，磁力攪拌60min，然后置于水浴箱中，在40°C恒溫混勻12h，成殼聚糖-明膠溶液； ⑤配制戊二醛水溶液 量取戊二醛0.08mL,量取滅菌去離子水15.92mL,混勻，成0.05mol/L的戊二醛水溶液； ⑥殼聚糖-明膠溶液中添加戊二醛水溶液 將戊二醛水溶液16mL、殼聚糖-明膠溶液185mL，加入燒杯中，快速攪拌15min，成殼聚糖-明膠-戊二醛混合溶液； ⑦制備水凝膠 將殼聚糖-明膠-戊二醛混合溶液倒入96孔培養(yǎng)板中，孔徑為6_，在25°C下靜置12h，成水凝膠； ⑧冷凍、冷凍干燥 將水凝膠置于冷凍箱中冷凍，在_20°C冷凍24h，然后在-80°C冷凍24h ； 將冷凍的水凝膠置于石英容器中，然后置于冷凍干燥箱中干燥，冷凍干燥溫度-80°C，真空度18Pa,時間24h,形成05mmX Imm的圓柱體薄膜； ⑨清洗、還原戊二醛 配制0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液IOOmL ； 配制0.26mol/L的硼氫化鈉水溶液IOOmL ； 加入滅菌去離子水IOOmL,加入燒杯中，成中性混合液； 將冷凍干燥的殼聚糖-明膠薄膜置于中性混合液中浸泡60min，然后將薄膜置于另一燒杯中，加入滅菌去離子水200mL沖洗薄膜，使薄膜的pH=7，呈中性； 沖洗后薄膜置于冷凍箱中冷凍，在_20°C冷凍24h，然后在-80°C冷凍24h ;將冷凍的薄膜置于石英容器中，然后在冷凍干燥箱中干燥，冷凍干燥溫度_80°C，真空度18Pa，時間24h ； ⑩Y射線輻射滅菌 將殼聚糖-明膠薄膜裝入密封玻璃瓶中，用Y射線輻射滅菌，Y射線輻射劑量25kgy，滅菌時間24h，滅菌后薄膜為無菌保存； (4)人體表皮組織的快速構(gòu)建和制備 人體表皮組織的快速構(gòu)建和制備是在高壓釜內(nèi)，在氣體壓力中進(jìn)行的，是在37°C下、3.4KPa壓力下、無菌狀態(tài)下完成的； ①將殼聚糖-明膠薄膜置于培養(yǎng)皿中，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10mL、人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液IOmL,置于恒溫培養(yǎng)箱中,加熱溫度37°C,恒溫培養(yǎng)12h ； ②將濕潤的殼聚糖-明膠薄膜置于無菌潔凈工作臺上吹干； ③接種細(xì)胞 倒掉培養(yǎng)瓶中的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C消化5min，成細(xì)胞懸液，然后收集于離心管中，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞以30萬個/cm2的密度接種于殼聚糖-明膠薄膜上，用人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒培養(yǎng)24h ； 倒掉培養(yǎng)瓶中的人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37°C消化5min，成細(xì)胞懸液，然后收集在離心管中，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時間5min，倒掉上清液，加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將人體真皮成纖維細(xì)胞以30萬個/cm2的密度接種于殼聚糖-明膠薄膜上，用人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒培養(yǎng)24h， 生成:人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊、人體真皮成纖維細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊； ④將人體真皮成纖維細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊置于96孔培養(yǎng)板中底層，作為滋養(yǎng)層，將人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊置于96孔培養(yǎng)板上層，每孔中加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞的混和培養(yǎng)液0.1mL,并施加無菌空氣與二氧化碳混合氣體，高壓釜內(nèi)底層置放滅菌去離子水，做濕潤劑，加熱溫度37°C，氣體壓力3.4KPa，氣體壓力3.4KPa，進(jìn)行氣-液界面壓力培養(yǎng)72h ； ⑤氣-液界面壓力培養(yǎng)后，在96孔培養(yǎng)板上合成人體表皮組織； (5)人體表皮組織的檢測、分析、表征 對制備的人體表皮組織的形貌、細(xì)胞生長、分層進(jìn)行檢測、分析、表征； 用酶聯(lián)免疫檢測儀進(jìn)行人體表皮組織中人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況； 用倒置顯微鏡進(jìn)行人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞排列及分層的檢測； 結(jié)論:制備的人體表皮組織為無色薄膜狀，組織成分為人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合物，組織活性良好，人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分層生長良好； (6)人體表皮組織的保存 人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液8mL，加入胎牛血清lmL，二甲基亞砜lmL，形成人工表皮保護(hù)液；人體表皮組織置于棕色透明無菌的塑料容器中，加入保護(hù)液10mL，在4°C放置30min ;在-20°C放置30min ;在-80°C放置24h ;在液氮中長期保存； (7)人體表皮組織的復(fù)溫 將盛有保護(hù)液和人體表皮組織的塑料容器置于恒溫水浴箱中，在37°C下解凍5min，人體表皮組織復(fù)溫，用無菌生理鹽水沖洗人體表皮組織3次，每次lmin。
2.根據(jù)權(quán)利的要求I所述的一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法，其特征在于:人體表皮組織的快速構(gòu)建制備是在高壓釜內(nèi)、在氣體壓力中進(jìn)行的，是在37°C下、在3.4KPa壓力下、無菌狀態(tài)下完成的； 高壓釜為矩形，高壓釜(1)下部為電控箱(18)、上部為高壓密封釜蓋(2);在高壓釜(1)內(nèi)底部為滅菌去離子水(6)，高壓釜(1)內(nèi)中間位置安裝支架(3)，在支架(3)上置放培養(yǎng)板(4)，在培養(yǎng)板(4)上置放人體表皮組織(5)，在人體表皮組織(5)上部由混合氣體(7)充填；在高壓密封釜蓋(2)上部由左至右設(shè)置進(jìn)氣管(10)、氣壓表(9)、出氣閥(8)，進(jìn)氣管(10)左部連接混合氣體過濾滅菌裝置(11)、混合氣體進(jìn)氣閥(12)，混合氣體進(jìn)氣閥(12)通過進(jìn)氣管(10)同時連通二氧化碳?xì)怏w閥(13)、壓縮空氣氣體閥(14)，二氧化碳?xì)怏w閥(13)連通二氧化碳?xì)怏w瓶(16)，壓縮空氣氣體閥(14)連通空氣壓縮機(jī)(15);在高壓釜(1)的下部為電控器(18)，在電控器(18)上設(shè)有顯示屏(19)、指示燈(20)、電源開關(guān)(21)、加熱溫度控制器(22)、空氣壓縮機(jī)控制器(23);電控器(18)通過導(dǎo)線(17)與空氣壓縮機(jī)(15)連接。
【文檔編號】A61L27/60GK103721294SQ201310737713
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】安美文, 劉陽, 王立, 陳凌峰 申請人:太原理工大學(xué)