專利名稱：治療肝癌的藥物及jarid2 單克隆抗體的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體而言，涉及一種治療肝癌的藥物及JARID2單克隆抗體的應用。
背景技術：
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球男性第五大常見腫瘤,具有預后惡劣、死亡率高等特點，嚴重威脅我國人民的生命與健康。據(jù)統(tǒng)計HCC是全球男性第二大癌癥死因，2008年新肝癌病例74.83萬人，而同年肝癌死亡病例聞達到69.59萬人，其發(fā)病率與死亡率幾乎近1:1，中國尤為如此，嚴重影響我國人民的生命與健康。盡管近年來隨著影像診斷與手術技術的不斷進步以及以索拉非尼為代表的肝癌靶向治療藥物的面世，為肝癌的早期診斷與治療提供了可能與更多且更有效的治療選擇，使肝癌的治療水平得到了一定的提高。然而，綜觀目前肝癌臨床治療現(xiàn)狀，現(xiàn)今尚缺乏真正有效、副作用少的肝癌治療藥物，肝癌術后復發(fā)轉移率仍高居不下，術后5年生存率仍徘徊在30%上下，嚴重制約了肝癌總體治療水平的提高，無法使之得到根本性的改善。目前，可用于治療肝癌的藥物主要有傳統(tǒng)化療藥物和靶向藥物。常用化療藥物主要有5-氟脲嘧啶、阿霉素、表阿霉素、絲裂霉素、順鉬、卡鉬等。目前有關口服氟嘧啶類藥物治療不能手術肝癌的研究較多，包括卡培他濱和優(yōu)福定(UFT即替加氟+尿嘧啶)等。卡培他濱具有良好的抗腫瘤活性和低毒性，可以用于合并肝硬化的肝癌患者。其他的吉西他濱復合物和新的鉬類制劑(如奧沙利鉬)在肝癌中的應用正在觀察中。其他藥，如新的蒽環(huán)類抗生素在肝癌中的作用，也處于實驗觀察階段。總體來說，到目前為止還沒有哪個新的化療藥物表現(xiàn)出有長遠的研究價值。前述化療藥物的有效率均在10% 20%，治療效果不令人滿意，且特異性差，副作用大。雖然隨后還有新的、對腫瘤細胞殺傷力強的藥物上市，但是從治療效果，改變患者手 術后癌細胞的復發(fā)和轉移，延長生命等綜合效果來說并不理想。生物技術藥研究是當今生命科學研究中最為活躍的領域之一，其中的分子靶向藥物因其選擇性高，廣譜有效，不易發(fā)生耐藥，同時安全性也明顯優(yōu)于細胞毒性化療藥物，各國均予以高度重視，現(xiàn)已有多個此類藥物獲得批準上市應用。新近經(jīng)FDA批準的索拉非尼(Sorafenib)即是一種新型多祀點的抗腫瘤藥物。在最近的一項多中心、雙盲、安慰劑對照的III期臨床試驗中，Llovet等隨機對602名以前未經(jīng)過系統(tǒng)性治療的晚期肝癌患者給予索拉非尼或安慰劑治療，研究發(fā)現(xiàn):在晚期肝癌中，索拉非尼組患者的中位生存時間比安慰劑組患者延長2.8個月。因此，美國FDA宣布索拉非尼適用于治療無法手術切除的肝細胞肝癌。國內(nèi)陳志南院士自主研發(fā)的國家生物制品一類新藥“碘[1311]美妥昔單抗注射液(利卡汀)”，也是專門用于治療肝癌的特異性抗體靶向藥物，現(xiàn)已經(jīng)批準在國內(nèi)上市。該放射免疫靶向藥物在前期的臨床應用中顯示對晚期肝癌具有一定療效。此外，有研究報告，以抗人AFP單抗為載體、1311和絲裂霉素為“雙彈頭”，治療中晚期肝癌患者，結果顯示治療后腫瘤縮小率高于對照組。也有報告研究人肝癌單抗Hepama-1與1311偶聯(lián)制成的1311-Hepama_l單克隆抗體導向治療晚期肝癌,雖能使部分患者癌性癥狀減輕。但這后兩項研究均未見有關提聞生存率的報告。目前單克隆抗體大多是鼠源性的，而鼠源性單克隆抗體應用于人體治療時存在諸多問題:一是不能有效地激活人體中補體和Fe受體相關的效應系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human antigen mouse antibody, HAMA);三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。對于不能手術的晚期HCC，藥物治療是其主要治療方式。然而，迄今系統(tǒng)化療仍然沒有高效的化療藥物或方案，大量的臨床試驗統(tǒng)計顯示，化療藥物單藥治療肝癌的有效率大約在O 25%之間，與非治療組比較收益甚微，僅有姑息效果，且缺乏相關的大規(guī)模III期臨床試驗的數(shù)據(jù)以供參考。阿霉素是傳統(tǒng)的用于肝癌治療的藥物，但是客觀緩解率僅為10% 15%，且不能延長患者生存期。靶向藥物的治療效果也并不理想，其中最為成功的索拉菲尼藥物對患者生存時間的延長也僅為3個月。綜上所述，有關肝癌的藥物的研究尚存在許多問題，目前仍然無法很好的解決提高肝癌病人臨床治療的生存率這一關鍵問題，根本無法滿足肝癌病人的治療需求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種治療肝癌的藥物及JARID2單克隆抗體的應用，以解決現(xiàn)有技術中無法很好的解決提高肝癌病人臨床治療的生存率的技術問題。為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種治療肝癌的藥物。該藥物包括藥物有效量的JARID2單克隆抗體。進一步地，JARID2單克隆抗體為人源JARID2單克隆抗體。進一步地，人源JARID2單克隆抗體通過以下步驟制備得到:提取原發(fā)性肝細胞癌患者外周血淋巴細胞總RNA，通過逆轉錄PCR法克隆JARID2 DNA ;采用JARID2 DNA進行噬菌體抗體庫構建；篩選噬菌體抗體庫得到目的細菌；提取目的細菌中的質粒DNA，切除質粒DNA中的噬菌體外殼蛋白III基因，將剩余部分的質粒DNA進行表達、純化得到人源JARID2單克隆抗體。進一步地，克隆JARID2 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:1 ;下游引物的序列如 SEQ ID NO:2o進一步地，克隆JARID2 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 ;下游引物的序列如 SEQ ID NO:4ο根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種JARID2單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應用。進一步地，JARID2單克隆抗體為人源JARID2單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供一種JARID2單克隆抗體在體外抑制肝癌細胞中的應用，包括將JARID2單克隆抗體以有效抑制濃度與肝癌細胞接觸。應用本發(fā)明的技術方案，將JARID2單克隆抗體用于制備肝癌的藥物，JARID2單克隆抗體能夠特異性地抑制JARID2在人體內(nèi)的表達水平，從而有效的降低肝癌侵襲轉移能力，提高肝癌患者的五年生存率。優(yōu)選地，JARID2單克隆抗體采用的是人源JARID2單克隆抗體，其具有特異性好、親和力高、免疫原性小、副作用低等諸多優(yōu)點。


構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。圖1示出了 JARID2 mRNA和蛋白在肝癌組織中高表達；A:Real-time PCR檢測30對肝癌組織及相應的癌旁組織中JARID2mRNA水平，結果顯示JARID2mRNA在肝癌組織中呈顯著性高表達；T，肝癌組織；ANLT，鄰近非腫瘤肝組織；NL，正常肝組織；B:Western-blot檢測肝癌組織及鄰近非腫瘤肝組織中JARID2蛋白的表達，結果顯示，JARID2蛋白在肝癌組織中表達明顯高于鄰近非腫瘤肝組織及正常肝組織，*，P〈0.01 ；圖2示出了 Real-time PCR及Western-blot檢測JARID2在6種肝細胞系中的表達；A: Real-time PCR檢測6種肝細胞系中JARID2mRNA水平，結果顯示JARID2mRNA水平隨細胞系侵襲轉移潛能升高而增加；B:Western-bl0t檢測6種肝細胞系中JARID2蛋白水平，結果顯示JARID2蛋白水平隨細胞系侵襲轉移潛能升高而增加；圖3示出了免疫組化研究JARID2在肝癌組織中的表達水平及其與肝癌預后的關系；A-D JARID2 表達依次為 3+ CA), 2+ (B), 1+ (C)1O(D);放大倍數(shù):X400 ；E:JARID2 高表達組與JARID2低表達組的無瘤生存率比較；F JARID2高表達組與JARID2低表達組的總體生存率比較；圖4示出了抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體在體外抑制肝癌細胞侵襲轉移；A:Transwell侵襲小室實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞系HCCLM3侵襲能力的影響:劃痕愈合實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞HCCLM3遷移運動能力的影響；C =Transwell侵襲小室實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞MHCC97-H侵襲能力的影響；D:劃痕愈合實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞MHCC97-H遷移運動能力的影響；圖5示出了抗肝癌人源性JARID2單克隆抗`體在體內(nèi)抑制肝癌侵襲轉移；A:利用HCCLM3control, HCCLM3JARID2-, MHCC97_Hcontrol 和 MHCC97-HJARID2-細胞構建裸鼠肝癌轉移模型；紅色箭頭指原位瘤，黑色箭頭指轉移瘤:a, b圖為肝癌轉移灶；c，d圖為肺內(nèi)轉移灶；C:原位瘤，抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體處理細胞所成瘤，對照組所成瘤；D:抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體組與對照組轉移灶數(shù)目比較；以及圖6示出了抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體在體內(nèi)外抑制肝癌細胞侵襲轉移；A: Transwell侵襲小室實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞系HCCLM3和MHCC97-H侵襲能力的影響；B:劃痕愈合實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞系HCCLM3 (a)和MHCC97_H(b)遷移運動能力的影響；C:抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體組(HCCLM3TAKID2_和MHCC97-HTAKID2_)與相應對照組裸鼠肝內(nèi)及肺部轉移灶數(shù)目比較。
具體實施例方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明的發(fā)明人采用Real-time PCR方法檢測JARID2 (JARID2為已知基因，基因序列可在互聯(lián)網(wǎng)上的基因庫中下載，例如NCBI)在肝癌組織及肝癌細胞系中的表達，結果發(fā)現(xiàn)JARID2 mRNA在肝癌組織中呈高表達，且其在高侵襲轉移能力的肝癌細胞系HCCLM3中的表達也明顯高于低侵襲轉移能力的肝癌細胞系H印G2，JARID2 mRNA表達水平隨著肝癌細胞系侵襲轉移能力由弱到強依次增強。由此可見JARID2與肝癌的侵襲轉移能力關系密切。同時，采用Western-bolt方法檢測JARID2蛋白在肝癌組織及肝癌細胞系中的表達。結果同樣顯示JARID2蛋白在肝癌組織中呈高表達，且其表達水平隨著肝癌細胞系侵襲轉移能力由弱到強依次增強，與Real-time PCR結果完全一致，如圖1和圖2所示。其中，圖1示出了 JARID2 mRNA和蛋白在肝癌組織中高表達。圖1中的A示出了Real-time PCR 檢測 30 對肝癌組織(編號分別為 D229、D290、D209、D285、D222、D324、D312、D291、D260、D306、D207、D326、D243、D252、D328、D232、D244、D214、D303、D266、D268、D293、D248、D216、D273、D263、D265、D292、D247、D297)及相應的癌旁組織中 JARID2mRNA 水平。其中，JARID2 PCR檢測引物如下:上游引物:5’ -GACACCAAACCCAATCACCAC-3’ ；下游引物:5’ -GTTCAACCTGCCACTGACCTT-3’。GAPDH (甘油醛_3_磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參引物:上游引物:5’ -GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物:5’ -TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。所有引物均按100 μ M濃度稀釋備用。按Τ0Υ0Β0公司PCR試劑盒說明書，建立50 μ I PCR反應體系如下:SYBR Green Realtime PCR MasterMix-Plus-25 μ I ；Plus Solution5 μ I ;上游引物(10μΜ)2μ I ;下游引物(ΙΟμΜ) 2μ I ;所檢測樣品 cDNA 溶液 5 μ I ;(1Η2011μ I。PCR 反應過程在 ABI Prism7300Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Foster City, CA,USA)上完成，反應條件為95°C預變性60sec ；95°C 15sec，60°C 15sec，72°C 45sec。結果顯示JARID2mRNA在肝癌組織中呈顯著性高表達。圖1中的B示出了 Western-blot檢測肝癌組織及鄰近非腫瘤肝組織中JARID2蛋白的表達。其操作步驟如下:取預先加入loading buffer的100μ g從組織或細胞提取的總蛋白。在沸水中變性約十分鐘，然后將樣本以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(Bio-Rad, Hercules, CA, USA),先80V電泳約30min,蛋白樣品跑出積層膠后轉至120V電泳到底后分離蛋白后經(jīng)電泳槽濕轉法至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA。將所需條帶區(qū)域膠切下后在12V下轉膜約80-90min后，將5%脫脂奶粉溶于PBST封閉約一小時后置入一定濃度的一抗溶液中(抗體濃度按抗體說明書稀釋)，4°C孵育過夜，PBST洗滌PVDF膜45min，再置入1:3000稀釋的HRP標記的兔抗山羊IgG 二 抗常溫下孵育約一小時，用PBST洗滌PVDF膜十分鐘，三次后，用高靈敏度化學發(fā)光試劑盒一比一混合后顯影。本試驗使用的一抗為 anti human JARID2 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA),內(nèi)參照一抗選擇鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz Biotechnology), 二抗選擇HRP標記的兔抗鼠IgG抗體(KPL, Gaithersburg, MD)。數(shù)碼相機拍取結果,用Bandscan 5.0對條帶圖像進行分析，以條帶的灰度值表示蛋白水平的表達量。每個樣本重復檢測3次，結果取其平均值。T為肝癌組織；ANLT為鄰近非腫瘤肝組織；NL為正常肝組織；結果顯示，JARID2蛋白在肝癌組織中表達明顯高于鄰近非腫瘤肝組織及正常肝組織，*，P〈0.01 ；圖2示出了 Real-time PCR及Western-blot檢測JARID2在6種肝細胞系中的表達(步驟同上)，這六種肝細胞系分別為HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L、H印G2、CCLl3、L02，Real-time PCR檢測6種肝細胞系中JARID2 mRNA水平，結果顯示JARID2 mRNA水平隨細胞系侵襲轉移潛能升高而增加；B:Western-bl0t檢測6種肝細胞系中JARID2蛋白水平，結果顯示JARID2蛋白水平隨細胞系侵襲轉移潛能升高而增加。進一步采用免疫組化法檢測了肝癌組織中JARID2蛋白的表達，結果顯示，JARID2蛋白在肝癌組織中高表達，而癌旁肝組織中則未見明顯表達，且JARID2高表達組的患者術后無瘤生存時間及總生存時間低于JARID2低表達組，證實其高表達與肝癌差的預后密切相關，結果如圖3所示。圖3示出了免疫組化研究JARID2在肝癌組織中的表達水平及其與肝癌預后的關系；A-D JARID2表達依次為3+ (A)，2+ (B)，1+ (C) ,-(D)(免疫組織化學結果判斷標準如下:A:按細胞染色強度計分:0分:無染色；1分:淺染色；2分:深染色。B:按細胞染色比例計分:1分定義為三分之一以下；2分定義為三分之一到三分之二 ；3分定義為三分之二以上。將A、B的乘積用作評分標準，O分定義為為“一” ；1至2分定義為為“ + ”;3至4分定義為“ + + ”;5至6分定義為“ + + + ”。其中“一”和“ + ”定義為低表達；“ + + ”和“ + + + ”定義為高表達);放大倍數(shù):X400 ;圖3E和3F為采用Log-rank法比較JARID2高表達組與低表達組間無瘤生存率和總體生存率比較。E: JARID2高表達組與JARID2低表達組的無瘤生存率比較；F JARID2高表達組與JARID2低表達組的總體生存率比較。上述實驗操作步驟如下:所有石蠟標本均以3 5μπι厚度進行連續(xù)切片，在開展免疫組化前將石蠟切片60°C烤片約30min，然后把片子浸泡在二甲苯中進行脫蠟。大約20分鐘后取出，分別用100%，95%，80%，70%乙醇和蒸餾水依次梯度脫水，室溫下3min，迅速取出載玻片，浸泡在PBS中5min。將玻片用放于破片架，浸在1:50稀釋的EDTA修復液(北京中杉金橋生物技術有限公司，北京)中，放入微波爐中用高火煮10分鐘。然后用Polink-2plus 通用型二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，北京)進行染色，染色后用PBS漂洗3次后，漂洗后的片子滴加3% H2O2孵育。大約10分鐘后PBS漂洗3次。滴加 1:400 稀釋的 antihuman JARID2 抗體(Santa Cruz Biotechnology) 37°C孵育 I 小時,PBS漂洗3次后，滴加Po Iy-HRP ant1-Goat IgG, 37°C下孵育30分鐘，PBS漂洗3次。漂洗后滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色。當鏡下觀察到細胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色著色時迅速停止染色。自來水沖洗后，浸入蘇木素復染液復染后，大約I分鐘左右，完成后用60°C烤箱烘干切片，中性樹脂封片。發(fā)明人研究結果表明，JARID2在肝癌的侵襲轉移過程中發(fā)揮了關鍵性作用。JARID2通過PTEN/TGFi3 /Akt信號通路調(diào)控肝細胞癌的上皮細胞間質轉化過程從而促進肝癌侵襲轉移，作用機制明確，功能強大，特異性強，有望成為肝癌治療靶點。本發(fā)明的發(fā)明人在上述發(fā)現(xiàn)的基礎上，制備相應的人源性單克隆抗體，通過離體及在體實驗驗證其抗腫瘤的 藥效學作用，最終獲得肝癌治療候選藥物。采取噬菌體抗體庫技術制備JARID2人源性單克隆抗體,曬菌體抗體庫(phage antibody library)技術是20世紀90年代初期抗體工程領域的重大研究進展，它結合了噬菌體展示與抗體組合文庫技術，把外源的DNA插入噬菌體編碼的外殼蛋白P III或P VDI的基因中，使外源DNA片段對應的表達產(chǎn)物融合在曬菌體外殼蛋白中形成融合蛋白。此方法包括曬菌體庫的產(chǎn)生、結合抗原的展示抗體的篩選、展示有高親和力抗體的噬菌體擴增、有高親和力的抗體的分離和定性的具體步驟。其具體操作步驟如下:其基本方法是從人外周血淋巴細胞中提取RNA或基因組DNA，設計核苷酸引物，用PCR方法克隆人全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因組裝到噬菌體表達載體內(nèi)，與噬菌體外殼蛋白基因融合，感染大腸桿菌并使抗體片段表達于噬菌體。然后利用抗原-抗體特異性結合而篩選出所需要的抗體，并進行克隆性擴增，獲得可溶性抗體片段(如Fab、scFV及dsFv等)，即噬菌體抗體。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種治療肝癌的藥物。該治療肝癌的藥物包括JARID2單克隆抗體。JARID2單克隆抗體可以是本領域技術人員通過常規(guī)的技術手段根據(jù)JARID2全基因序列制備的單克隆抗體?？贵w制劑用于體內(nèi)給藥時必須是無菌的，這一點易于實現(xiàn)，比如，使用除菌濾膜過濾?？贵w給藥途徑與已知方法一致，如通過靜脈、腹膜、大腦、肌肉、眼內(nèi)、動脈、鞘內(nèi)、吸入或損傷區(qū)途徑注射或輸液等。治療所用的抗體的有效量依賴于，比如，治療目標、給藥的途徑和患者的病情。因此，治療學家優(yōu)選滴定確定劑量并根據(jù)要求修改給藥途徑，以獲得最佳治療效果。一般情況下，臨床醫(yī)師將給藥抗體直至達到實現(xiàn)所需效果的劑量。這種治療方法的進行易于由常規(guī)檢測方法監(jiān)控。本發(fā)明中所提到的“有效量”與本領域通常的“有效量”含義相同；同樣，本發(fā)明中所指的“有效抑制濃度”是臨床醫(yī)師將給藥抗體直至達到實現(xiàn)所需效果的濃度。本發(fā)明所述的單克隆抗體，可以同藥用的載體制備成混合物。這種藥物組合物可通過靜脈、鼻或肺給藥，優(yōu)選為液體或粉末氣霧劑(凍干)。組合物還可以根據(jù)需要腸胃外給藥或皮下給藥。當全身給藥時，治療組和物應該是無菌、無熱源，并且在可用于腸胃外的溶液中，并適當考慮到PH值、等滲壓性和穩(wěn)定性。這些條件均為本領域技術人員所公知的。簡言之，將具有所需純度的單克隆抗體同生理可用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合。這些物質的使用量和濃度上對接受者是無毒的，包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽和其他有機鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；小分子量(小于10個氨基酸殘基)肽如聚精氨酸，蛋白如血清蛋白、明膠或免疫球蛋白等。人源化抗體是指抗體的可變區(qū)部分(即Vh和Vl區(qū))或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應。優(yōu)選地，JARID2單克隆抗體為人源JARID2單克隆抗體。因為，人源單克隆抗體具有特異性好，親和力高，免疫原性小，副作用低的特點。優(yōu)選地，人源JARID2單克隆抗體通過以下步驟制備得到:提取原發(fā)性肝細胞癌患者外周血淋巴細胞總RNA，通過逆轉錄PCR法克隆JARID2 DNA;采用步驟I)克隆獲得的JARID2DNA進行噬菌體抗體庫構建；篩選噬菌體抗體庫得到目的細菌；提取目的細菌中的質粒DNA，切除質粒DNA中的噬菌體外殼蛋白III基因，將剩余部分的質粒DNA進行表達、純化得到人源JARID2單克隆·抗體。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，克隆JARID2 DNA所用的上游引物的序列如 SEQ ID NO:1 (5，-GACACCAAACCCAATCACCAC-3，);下游引物的序列如 SEQ ID NO:2(5’ -GTTCAACCTGCCACTGACCTT-3’)。根據(jù)本發(fā)明另一種典型的實施方式，克隆JARID2 DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 (5’-TCGGCTCAGGACTTACGGAAAC-3’);下游引物的序列如 SEQ ID NO:4 (5，-GAACTGGGCTTGTGGTGATTGG-3’)。本發(fā)明中，提供一種JARID2單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應用，其中，JARID2單克隆抗體為人源JARID2單克隆抗體，即將干擾JARID2基因的表達作為治療肝癌的一種方法。下面將結合實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1I)總RNA的提取、逆轉錄PCR法克隆JARID2基因用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取JARID2高表達原發(fā)性肝細胞癌患者(原發(fā)性肝細胞癌患者I例，男性，50歲)外周血淋巴細胞總RNA。取約20 μ g總RNA，加入I μ gOligo dT，5ul 250mmol/L dNTP 及 200UM-MLV 逆轉錄酶(GIBC0LBRL)，按 MLV 逆轉錄酶(GIBC0LBRL)的產(chǎn)品說明書進行cDNA合成。PCR擴增JARID2基因，其中，擴增引物如下:上游引物的序列如SEQ ID NO:1 (5’-GACACCAAACCCAATCACCAC-3’)；下游引物的序列如SEQID NO:2 (5，-GTTCAACCTGCCACTGACCTT-3’)。PCR 擴增的條件為:94°0變性11^11、521:退火50s、72°C延伸1.5min，共進行35輪循環(huán)，最后72°C延伸IOmin02)用于電穿孔轉化的大腸桿菌的制備2.5ml過夜培養(yǎng)的XLl-Blue菌液接種到500ml SB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至A600=0.7 0.8，冰浴15min，4°C離心，棄上清，用10%冷甘油將細菌洗滌2次后，懸浮于2mll0%甘油中，_70°C凍存?zhèn)溆谩ｋ姶┛讜r將細菌取出融化，使用Bio-Rad公司的Genepulsertransfection 系統(tǒng)，按 Genepulsertransfection 系統(tǒng)的說明書進行穿孔。3)噬菌體抗體庫的構建將PCR擴增的JARID2 DNA經(jīng)Sacl+Xbal消化、電泳純化后插入載體pComb3H中，電穿孔轉化XLl-Blue，然后向XLl-Blue中加3ml SOC培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)Ih后加入含氨芐青霉素50μ g/ml、四環(huán)素10μ g/ml的SB培養(yǎng)基20ml，37°C振蕩培養(yǎng)2h，加入約1012空斑形成單位(PFU)的輔助噬菌體VCSM13，接種到IOOml含相同(即氨芐青霉素50 μ g/ml、四環(huán)素10 μ g/ml)抗生素的SB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2h，加入卡那霉素至終濃度70 μ g/ml,30 37°C振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集上清，加入PEG-8000到4%，NaCl到3%，冰浴30min后，離心棄上清，以2ml含1%BSA的TBS溶解沉淀，離心收集上清即為噬菌體抗體庫。4)噬菌體抗體庫滴度的測定將噬菌體抗體庫溶液按1:100的比例稀釋于SB培養(yǎng)基中，取IOml加到lOOmlXLl-Blue (A600=l.0)中 ，鋪氨芐青霉素培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，次日計數(shù)集落，計算集落形成單位(CFU)。5 )菌落直接PCR鑒定法挑取單個細菌集落，懸于200ml水中，煮沸2min，取2ml以適當引物(上游引物:5’ -GACACCAAACCCAATCACCAC-3’ ；下游引物:5’ -GTTCAACCTGCCACTGACCTT-3’ )進行 PCR 反應，瓊脂糖凝膠電泳檢測相應擴增帶。6)卩遼菌體抗體庫的篩選(Panning)將將噬菌體抗體庫溶液以0.05%碳酸鹽緩沖液稀釋至40 μ g/ml，每孔25 μ I(I μ gJARID2)包被ELISA板，吸去包被液，以含3%BSA (牛血清白蛋白)的PBS緩沖液加滿小孔，37°C封閉lh，吸去封閉液，加入50 μ I噬菌體抗體庫液(約1011 1012個CFU)，37。。培育2h，吸去噬菌體抗體液，以含0.05%吐溫的TBS加滿小孔，用力吹打。5min后吸棄TBS(第2輪洗5次，第3輪以后洗10次)，加入50 μ I的洗脫液(0.lmol/L HCl,以甘氨酸調(diào)至ρΗ2.2，加BSA至0.1%)，室溫靜置lOmin，將洗脫液稍加吹打后吸出，立即加入3 μ 12mol/L Tris中和，加2ml XLl-Blue (A600=l)，室溫靜置15min感染，接種到IOml SB培養(yǎng)基(含氨節(jié)青霉素20 μ g/ml,四環(huán)素10 μ g/ml)中，取1.0 μ I和10 μ I鋪盤測定CFU,其余菌液30°C振蕩培養(yǎng)lh，加入氨芐青霉素至終濃度50μ g/ml，37°C繼續(xù)培養(yǎng)lh，加入輔助噬菌體(VCSM13)1012PFU，接種到IOOml SB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素20 μ g/ml，四環(huán)素10 μ g/ml)中，37°C培養(yǎng)2h，加入卡那霉素至終濃度70μ g/ml，30 37°C振蕩培養(yǎng)過夜，離心，上清進行PEG (聚乙二醇)沉淀。7)可溶性Fab分子的表達將篩選擴增的噬菌體抗體庫提取雙鏈質粒DNA，用Spel/Nhel消化，切除噬菌體外殼蛋白III的編碼基因，經(jīng)連接酶連接自身環(huán)化后轉化XLl-Blue細菌，鋪氨芐青霉素盤(20 μ g/ml),次日隨機挑取單集落,接種到IOml SB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml氨節(jié)青霉素，20mmol/LMgCl2), 37°C振蕩培養(yǎng)6h，加入IPTG(異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至Immol/L，誘導表達可溶性Fab分子，然后降低培養(yǎng)溫度至30°C，振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集上清用于ELISA檢測(上清即為可用于治療肝癌的單克隆抗體)。實施例2PCR擴增JARID2基因(來自原發(fā)性肝細胞癌患者I例，女性，43歲)其中，擴增引物如下:上游引物的序列如SEQ ID NO:3 (5，-TCGGCTCAGGACTTACGGAAAC-3’)；下游引物的序列如SEQ ID NO:4 (5，-GAACTGGGCTTGTGGTGATTGG-3’)。其余實驗條件均與實施例1相同。下述實驗中JARID2單克隆抗體是通過加入細胞培養(yǎng)液中對細胞進行處理的。將實施例1獲得的單克隆抗體進行體外試驗操作如下:先按常規(guī)流程培養(yǎng)實驗所需細胞(HCCLM3e°ntMl 和 HCCLM3TAKID2_ 以及MHCC97-He°ntMl 和 MHCC97_HTAKID2_)，所有能滅菌的器械均消毒滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射30min。先以0.25%胰酶消化細胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中和，并輕微吹打制成單細胞懸液，按5X 105個/孔細胞密度接種于小培養(yǎng)皿或6孔板，當細胞貼壁生長至95%-100%融合時，用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5-lcm—道，用10μ1移液器頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，劃痕后用無菌PBS洗細胞3次，清洗漂浮起來的碎細胞，然后加入無血清培養(yǎng)基在5% C02、37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。分別于劃痕后48小時給細胞拍照，觀察劃痕愈合情況，每組細胞做3個平行孔，重復3次，計算劃痕愈合率(圖4B，D)實驗結果表明經(jīng)JARID2單克隆抗體處理后的肝癌細胞遷移運動能力明顯下降。用侵襲小室實驗觀察抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞侵襲能力的影響。所需檢測細胞(HCCLM3_tMl 和 HCCLM3JAm^ 以及 MHCC97-H_tMl 和 MHCC97-Hjakid2O 以 2X IO4 細胞總數(shù)加入每個小室，再加入300 μ I DMEM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時于下室加入500 μ I含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將小室置于配套的下室上，我們采用孔徑為8 μ m的預鋪Matrigel膠的Transwell板(Costar, Cambridge, USA)檢測肝癌細胞侵襲能力。每板為16孔,使用前于小室內(nèi)加入少量的無血清DMEM讓其水化。完成上述操作后在5%C02、37°C條件下培養(yǎng)12-24小時。取出Transwell小室,用棉簽擦盡上室面的Matrigel膠和細胞，固定后下室面用1%結晶紫溶液染色，顯微鏡觀察。隨機取3個高倍鏡視野，計數(shù)小室下室面的細胞數(shù)即為穿透Matrigel膠的細胞數(shù)，實驗重復3次，結果取平均值(圖4A，C)結果表明，經(jīng)JARID2單克隆抗體處理后的肝癌細胞侵襲能力明顯下降。即圖4示出了抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體在體外抑制肝癌細胞侵襲轉移；A =Transwell侵襲小室實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞系HCCLM3侵襲能力的影響；B:劃痕愈合實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞HCCLM3遷移運動能力的影響；C =Transwell侵襲小室實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞MHCC97-H侵襲能力的影響；D:劃痕愈合實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞MHCC97-H遷移運動能力的影響。上述體外系列實驗表明，利用抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體抑制JARID2表達，能明顯降低HCCLM3細胞系的運動侵襲能力。將實施例1獲得的單克隆抗體進行體內(nèi)裸鼠成瘤實驗操作如下:在實驗過程中對動物的飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理與保護的有關規(guī)定。飼養(yǎng)條件如下:恒溫(250C -27°C)、恒濕(45% -50% )、新鮮空氣高度除塵除菌、無特殊支原體環(huán)境下飼養(yǎng)一周左右。購買4-6周齡雄性BALB/C-nu/nu裸鼠8只(每組4只)，飼養(yǎng)于SPF級無菌飼養(yǎng)室。動物置于專用培養(yǎng)箱內(nèi)，安放于層流式超凈架內(nèi)。將處于對數(shù)生長期的實驗組細胞(加入GFP熒光)和對照組細胞(無GFP)，培養(yǎng)至足夠量時(達到IXlO7/只)時開展裸鼠肝臟原位種植成瘤實驗。細胞實驗前準備:首先將實驗組細胞和對照組細胞1:1混合(HCCLM3_tn)1和HCCLM3WKI1^以及ΜΗΟ^-Η —1和MHCC97_HWKID20,用ImlTIP頭將細胞反復吹打使其成為細胞懸液，將細胞轉移至離心管離心后，繼續(xù)加培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為5X107/ml。實驗用裸鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉，每只裸鼠用量約0.2-0.5ml，先注射0.2ml，觀察2分鐘左右，如注射量不夠再加0.1ml，直至裸鼠達到麻醉效果為止。用絡合碘消毒已麻醉好裸鼠右上腹部皮膚，范圍約3cm左右，于右上腹肋緣下作長約Icm斜切口，顯露肝臟右葉，用注射器吸取準備好的細胞懸液0.2ml，在肝右葉區(qū)域作肝臟被膜下注射0.2ml量后，觀察肝臟出血情況，必要時止血。仔細縫合關腹，平均縫合2針每只。實驗結果觀察:約40天時，采用頸椎脫位法處死裸鼠，完整解剖取出肝臟種植瘤，肉眼觀察肝臟種植瘤并拍照，將肺組織浸泡于10%的中性甲醛中過夜，石蠟包埋后行連續(xù)切片，常規(guī)用抗GFP抗體做免疫組織化學染色后顯微鏡下計數(shù)肝肺轉移灶的數(shù)量。并做統(tǒng)計分析。圖5示出了抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體在體內(nèi)抑制肝癌侵襲轉移；A:利用HCCLM3control，HCCLM3JARID2-，MHCC97-Hcontrol和MHCC97-HJARID2-細胞構建裸鼠肝癌轉移模型；紅色箭頭指原位瘤，黑色箭頭指轉移瘤:a, b圖為肝癌轉移灶；c，d圖為肺內(nèi)轉移灶；C:原位瘤，抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體處理細胞所成瘤，對照組所成瘤；D:抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體組與對照組轉移灶數(shù)目比較，在體內(nèi)裸鼠成瘤實驗中，證明抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體下調(diào)JARID2能明顯抑制HCCLM3細胞的侵襲轉移。在體內(nèi)裸鼠成瘤實驗中，證明抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體下調(diào)JARID2能明顯抑制HCCLM3細胞的侵襲轉移。
將實施例2獲得的單克隆抗體進行實驗，實驗步驟同上，圖6示出了抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體在體內(nèi)外抑制肝癌細胞侵襲轉移A =Transwell侵襲小室實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞系HCCLM3和MHCC97-H侵襲能力的影響。B:劃痕愈合實驗研究抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體對肝癌細胞系HCCLM3(a)和MHCC97_H(b)遷移運動能力的影響。C:抗肝癌人源性JARID2單克隆抗體組(HCCLM3WKID21PMHCC97-HWKID2_)與相應對照組裸鼠肝內(nèi)及肺部轉移灶數(shù)目比較。JARID2在肝癌的侵襲轉移過程中發(fā)揮了關鍵性作用。JARID2通過PTEN/TGFi3 /Akt信號通路調(diào)控肝細胞癌的上皮細胞間質轉化過程從而促進肝癌侵襲轉移，作用機制明確，功能強大，特異性強，且JARID2表達水平與肝癌的預后密切相關。通過體內(nèi)外研究，我們已經(jīng)證實應用JARID2單克隆抗體可以明顯抑制肝癌侵襲轉移。應用本發(fā)明的技術方案，將JARID2單克隆抗體用于制備肝癌的藥物，JARID2單克隆抗體能夠特異性的抑制JARID2在人體內(nèi)的表達水平，從而有效的降低肝癌侵襲轉移能力，提高肝癌患者的五年生存率。JARID2單克隆抗體采用的是人源JARID2單克隆抗體，其具有特異性好、親和力高、免疫原性小、副作用低等諸多優(yōu)點。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。`
權利要求
1.一種治療肝癌的藥物，其特征在于，包括藥物有效量的JARID2單克隆抗體。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于，所述JARID2單克隆抗體為人源JARID2單克隆抗體。
3.根據(jù)權利要求2所述的藥物，其特征在于，所述人源JARID2單克隆抗體通過以下步驟制備得到: O提取原發(fā)性肝細胞癌患者外周血淋巴細胞總RNA，通過逆轉錄PCR法克隆JARID2DNA ； 2)采用所述JARID2DNA進行噬菌體抗體庫構建； 3)篩選所述噬菌體抗體庫得到目的細菌； 4)提取所述目的細菌中的質粒DNA，切除所述質粒DNA中的噬菌體外殼蛋白III基因，將剩余部分的所述質粒DNA進行表達、純化得到所述人源JARID2單克隆抗體。
4.根據(jù)權利要求3所述的藥物，其特征在于，所述克隆JARID2DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:1 ;下游引物的序列如SEQ ID NO:2。
5.根據(jù)權利要求3所述的藥物，其特征在于，所述克隆JARID2DNA所用的上游引物的序列如SEQ ID NO:3 ;下游引物的序列如SEQ ID NO: 4。
6.JARID2單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應用。
7.根據(jù)權利要求6所述的JARID2單克隆抗體為人源JARID2單克隆抗體。
8.JARID2單克隆抗體在體外抑制肝癌細胞中的應用，其特征在于，將所述JARID2單克隆抗體以有效抑制濃度與所述肝癌細胞接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療肝癌的藥物及JARID2單克隆抗體的應用。其中，該藥物包括藥物有效量的JARID2單克隆抗體。應用本發(fā)明的技術方案，將JARID2單克隆抗體用于制備肝癌的藥物，該藥物能夠特異性的抑制JARID2在人體內(nèi)的表達水平,從而有效的降低肝癌侵襲轉移能力，提高肝癌患者的五年生存率。
文檔編號A61P35/00GK103230591SQ20131018232
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月16日 優(yōu)先權日2013年5月16日
發(fā)明者楊連粵, 徐江鋒 申請人:中南大學湘雅醫(yī)院