專利名稱：白花檵木提取物在制備愈傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白花檣木提取物在制備愈傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚創(chuàng)傷是人類常見的健康問(wèn)題，大致分為開放式和封閉式兩類，其中開放式創(chuàng)傷包括擦傷，撕裂傷，射傷，割傷，切除傷和手術(shù)傷等，封閉式創(chuàng)傷包括挫傷、擠壓傷、扭傷、 震蕩傷、關(guān)節(jié)脫位和半脫位、閉合性骨折、閉合性內(nèi)臟傷等。皮膚最主要功能是作為天然屏障，防止機(jī)體外液流失，保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境干擾和侵害。皮膚創(chuàng)傷是一種常見的健康問(wèn)題，自古有之，并且發(fā)生率較高，如處理不當(dāng)，會(huì)引起嚴(yán)重問(wèn)題甚至死亡。因此，尋找促進(jìn)傷口愈合的藥物，是藥物研發(fā)領(lǐng)域最古老，也是最重要的挑戰(zhàn)之一。白花檣木(Loropetalum chinens)又稱白花檣木，是檣木的一種，是金縷梅科 (Hamamelidaceae)檣木屬的常青灌木植物,具有重要的藥用價(jià)值。白花檣木始載于《植物名實(shí)圖考》，具有“愈合止血、澀腸止瀉、生肌、消炎、鎮(zhèn)痛”之功效，應(yīng)用于治療創(chuàng)傷出血。盡管白花檣木的歷史記載、民間用藥及相關(guān)研究報(bào)道均顯示白花檣木止血愈合、促進(jìn)傷口愈合效果顯著，但其功效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚。未見有報(bào)道用白花檣木的提取物制備促進(jìn)傷口愈合的藥物。因此，對(duì)白花檣木進(jìn)行促皮膚愈合研究，尋找有效成分，對(duì)于尋找皮膚創(chuàng)傷治療藥物有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種用白花檣木提取物為原料制備具有促進(jìn)傷口愈合的作用的藥物。所述白花檣木包括白花檣木植物的花、莖、葉、枝。所述白花檣木的提取物，是用藥物可接受的溶劑對(duì)白花檣木進(jìn)行浸提所得的粗提物。所述白花檣木提取物優(yōu)選的提取方法是將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產(chǎn)物，采用動(dòng)態(tài)溫浸法提取16小時(shí)，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除綠素等脂溶性雜質(zhì)，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質(zhì)，得到白花檣木粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。所述生物組合菌(名稱代號(hào)D424)，為景德板雞(ZL92108674. I)制作時(shí)的發(fā)酵粉， 來(lái)源于江西景德板雞實(shí)業(yè)公司保存的原菌種荷蘭株芽孢。本發(fā)明人以白花檣木及其分離產(chǎn)物為研究對(duì)象，采取國(guó)際常用的呋喃西林作為陽(yáng)性對(duì)照，以大鼠皮膚割傷和切除傷作為研究模型展開實(shí)驗(yàn)，觀察白花檣木促大鼠皮膚傷口愈合作用，并對(duì)有效組分進(jìn)行促愈合作用篩選，為白花檣木促皮膚愈合物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定工作基礎(chǔ)。
本發(fā)明采用的研究方法是I、采用液質(zhì)聯(lián)用對(duì)白花檣木可能的化學(xué)成分進(jìn)行初步分析；2、對(duì)白花檣木粗提物采用大鼠皮膚割傷模型(incision wound model)和切除傷模型(excision wound model)兩種國(guó)際常用體內(nèi)模型研究其促愈合作用。割傷模型，是指用銳利刀片將皮膚或其他組織割開，能以最小的并行損傷快速破壞組織完整性。割傷后傷口大小與多種因素有關(guān)，如皮下脂肪，傷口處張力大小以及動(dòng)物種屬等。通過(guò)機(jī)械方式使傷口閉合，傷口恢復(fù)迅速，并且疤塊組織生成最少。處理傷口時(shí)無(wú)論是用繃帶，縫合還是夾住的方法，主要目的均是為了將組織間縫隙縮小至最小，使傷口邊緣能通過(guò)肉芽組織和表皮再生而迅速愈合。因此，這種創(chuàng)傷模型最適合于分析傷口愈合強(qiáng)度； 由于受到傷口愈合時(shí)體積或面積的限制，該模型不適合用于組織學(xué)檢測(cè)或生化及表皮再生的評(píng)估。切除傷模型，這種傷口指的是目標(biāo)區(qū)域中有較大體積的組織被移除掉，根據(jù)嚴(yán)重程度，切除傷又可細(xì)分為膠帶粘除傷，起泡，撕裂傷，全切除傷等。全切除模型指將表皮和真皮全部切除，直達(dá)皮下脂肪層，出血及體液流失更為嚴(yán)重，而且更易被感染。這種模型具有多種優(yōu)勢(shì)，如傷口體積較大，真皮組分均參與愈合過(guò)程，只在傷口邊緣開始表皮再生，以及可以對(duì)傷口位置進(jìn)行生化、組織學(xué)及細(xì)胞增殖研究等。在這一模型中，以初始傷口面積或體積為基礎(chǔ)的傷口愈合速率也是經(jīng)常被研究的指標(biāo)。3、對(duì)白花檣木粗提取進(jìn)行進(jìn)一步提取將上述白花檣木粗提物用乙醇提取，將乙醇提取物用水分散，再分別用選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇的有機(jī)溶劑萃取。并采用大鼠皮膚割傷模型對(duì)不同溶劑萃取后所得的提取物進(jìn)行促愈合作用的篩選結(jié)果I、白花檣木提取物可顯著促進(jìn)大鼠皮膚愈合速度，縮短傷口愈合時(shí)間，增加傷口愈合強(qiáng)度，促進(jìn)傷口處細(xì)胞及血管新生；2、白花檣木分離提取組分中，石油醚層，乙酸乙酯層和正丁醇層促皮膚愈合作用較強(qiáng)，提示白花檣木的促愈合作用物質(zhì)極性較小。結(jié)論白花檣木具有明顯促愈合作用，促愈合作用物質(zhì)極性較小，主要分布在石油醚層，乙酸乙酯層和正丁醇層。


圖I是白花檣木提取物紫外檢測(cè)色譜圖，其中Red 254nm, Blue 285nm, Green 360nm.；圖2是白花檣木提取物的離子色譜圖Black :m/z 191 (奎尼酸的母核)；Blue :m/ z 285 (山萘酹/木犀草素的母核)；Red:m/z 301(槲皮黃酮的母核)；Green :m/z 316(楊梅酮的母核).;圖3ELC增加切割傷模型恢復(fù)第10日的創(chuàng)面皮膚牽拉張力，*P < 0. 05，***P < 0. 001，與空白對(duì)照組比較;#P < 0. 05，與陽(yáng)性藥組比較.數(shù)據(jù)表示為均值土標(biāo)準(zhǔn)差.η =5 ；圖4ELC縮短切除傷模型的創(chuàng)面完全愈合時(shí)間，*Ρ < 0. 05，< 0. 001，與空白對(duì)照組比較;#Ρ < 0. 05，與陽(yáng)性藥組比較.數(shù)據(jù)表示為均值土標(biāo)準(zhǔn)差.η = 5 ;
圖5大鼠切除傷創(chuàng)面恢復(fù)過(guò)程圖像記錄；圖6大鼠切除傷模型的新生皮膚組織染色切片，模型組(A)，ECL組(B) (40X)；圖7大鼠切除傷模型的新生皮膚組織⑶34免疫組化染色結(jié)果，模型組(A)，ECL組 ⑶(40X)；圖8切割傷模型恢復(fù)第10天的創(chuàng)面皮膚的牽拉張力，*P < O. 05，< O. 001， 與空白對(duì)照組比較.數(shù)據(jù)表示為均值土標(biāo)準(zhǔn)差.η = 5 ;圖9切割傷模型恢復(fù)第8日的創(chuàng)面皮膚牽拉張力，*Ρ < O. 05，***Ρ < O. 001，與空白對(duì)照組比較.數(shù)據(jù)表示為均值土標(biāo)準(zhǔn)差.η = 5。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I白花檣木粗提物的提取及化學(xué)成分分析I、白花檣木粗提物的提取將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產(chǎn)物，采用動(dòng)態(tài)溫浸法提取16小時(shí)，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質(zhì)，對(duì)白花檣木的粗提物初步分離純化，得到粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。所述組合菌酶解所用菌種是荷蘭株芽孢，來(lái)源于景德板雞發(fā)酵粉，由江西景德板雞實(shí)業(yè)公司生產(chǎn)。原菌種荷蘭株芽孢是唯一不產(chǎn)生腸毒素的菌種，經(jīng)培養(yǎng)，在二次代謝中分離出 D429，過(guò)程是肉湯斜面培養(yǎng)。石臘封存2個(gè)月后再次分離菌體，并組擴(kuò)大培養(yǎng)，然后再分離， 最后經(jīng)擴(kuò)群，提取其浮生藻，凍干成活性菌體粉。(菌種培養(yǎng)基為肉湯瓊脂等)。具體方法按中國(guó)專利200910242020. 9和200910242037. 4的方法操作。
2、白花檣木化學(xué)成分分析
一、樣品制備
精稱粗提粉末I. 06mg, lmL50%甲醇溶解，過(guò)O. 45 μ m微孔濾膜，即得。
~■、色譜條件
高效液相色譜儀=Agilent 1200系列高效液相色譜儀(美國(guó)AgilentTechnologies公司)，包括二極管陣列檢測(cè)器，四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器。
色譜柱YMC-Pack Pro C18(150mmX3. Omm ID,5ym)；
流動(dòng)相:A (甲醇)，B (O. I %甲酸H20)
梯度洗脫(O — 35min, A :10%— 98% ;35min_40m
in, A :98%— 98% ；)；
流速 0. 3mL/min ；
紫外掃描范圍200-400nm ；
檢測(cè)波長(zhǎng)200-400nm ;柱溫40°C。
三、質(zhì)譜條件
I、質(zhì)譜儀Q TRAPTM型四極桿-線性離子講串聯(lián)質(zhì)譜儀(AppliedBiosystems/MDSSCIEX，USA)，離子源采用負(fù)離子檢測(cè)模式的ESI源。
2、LC-MS測(cè)定條件
Scan TypeEnhanced MS (EMS)PolarityNegativeScan ModeProfileIon SourceTurbo sprayScan Rate:4000 Da/sLIT fill time80.00 msecQ3 Entry Barrier8.00VCurtain Gas(CUR)25.00CADHighIonspray Voltage (IS)-4.5kVTEM350.00Nebulizer Gas (GSl)70Source Gas 2 (GS2)60ihe:ONDeclustering Potential(DP)-80 VEntrance Potential (EP)-10VCollision Energy (Experiment I)-10VCollision Energy (Experiment 2)-40 eV液質(zhì)聯(lián)用對(duì)白花檣木樣品進(jìn)行檢測(cè)。白花檣木化學(xué)成分初步分析根據(jù)白花檣木樣品的紫外色譜圖和提取子離子色譜圖，白花檣木可能含有的化學(xué)成分推測(cè)如下表I白花檣木主要化學(xué)成分
權(quán)利要求
1.白花檣木提取物在制備促進(jìn)傷口愈合藥物中的用途，所述白花檣木提取物，是將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產(chǎn)物，采用動(dòng)態(tài)溫浸法提取16小時(shí)，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質(zhì)，得到白花檣木粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。
2.權(quán)利要求I所述的用途，所述白花檣木提取物是將權(quán)利要求I所得到的白花檣木粗提物用乙醇提取，將乙醇提取物用水分散，分別用選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇萃取所得到的提取物。
3.權(quán)利要求I所述的用途，所述白花檣木選自白花檣木的花、莖、葉、枝。
4.一種促進(jìn)傷口愈合的藥物，其活性成分是白花檣木提取物；所述白花檣木提取物， 是將白花檣木鮮材料破碎，采用組合菌酶解方法獲得白花檣木生物破壁產(chǎn)物，采用動(dòng)態(tài)溫浸法提取16小時(shí)，得到提取浸膏；先用醇提水沉法去除葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，再用水提醇沉法去除糖類等水溶性雜質(zhì)，對(duì)白花檣木的粗提物初步分離純化，得到粗提物，重量為原料重量的5. 5-6%。
5.權(quán)利要求I所述的藥物，所述白花檣木提取物是將權(quán)利要求I所得到的白花檣木粗提物用乙醇提取，將乙醇提取物用水分散，分別用選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇萃取所得到的提取物。
6.權(quán)利要求I所述的藥物，所述白花檣木選自白花檣木的花、莖、葉、枝。
全文摘要
本發(fā)明涉及白花檵木提取物在制備促進(jìn)傷口愈合藥物中的用途。本發(fā)明采用大鼠皮膚割傷模型(incision wound model)和切除傷模型(excision wound model)兩種國(guó)際常用體內(nèi)模型研究白花檵木粗提物的促愈合作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)可顯著促進(jìn)大鼠皮膚愈合速度，縮短傷口愈合時(shí)間，增加傷口愈合強(qiáng)度，促進(jìn)傷口處細(xì)胞及血管新生；本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)將白花檵木粗提物進(jìn)一步分離提取的組分中，石油醚層，乙酸乙酯層和正丁醇層促進(jìn)傷口愈合作用較強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102579524SQ20121008548
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者劉浩元, 曲淑娟, 李曉濱 申請(qǐng)人:江西徳宇集團(tuán)