專利名稱：一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用材料制造技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層制備方法，尤其涉及一種具有生物活性因子緩釋功能的仿生涂層制備方法，是牙科鈦種植體表面生物活化改性的處理方法。通過該方法在種植體表面構(gòu)建的仿生涂層模擬了天然胞外基質(zhì)的組織形式，既有生物大分子子構(gòu)成其主體結(jié)構(gòu)又負(fù)載了能調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的生物活性因子，通過該涂層實(shí)現(xiàn)的一種或多種生物活性因子的緩釋效應(yīng)能促進(jìn)種植體與骨組織之間的快速骨整合，也有利于種植體的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
由Branemark教授提出的骨整合(Osteointegration )理論是口腔種植領(lǐng)域的核心理論。種植體與周圍骨組織實(shí)現(xiàn)骨性結(jié)合是是評(píng)價(jià)種植成功與否的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。為了達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)，許多學(xué)者在種植材料及表面處理方面做了大量的工作。這些種植體表面處理方法的實(shí)施，其基本原理都是通過干預(yù)種植體周圍組織修復(fù)愈合的過程，來加快種植體周圍骨組織的形成速度，從而縮短種植義齒的治療周期。種植體植入體內(nèi)到實(shí)現(xiàn)與周圍骨組織的骨性結(jié)合一般會(huì)經(jīng)歷成骨源性細(xì)胞的募集、粘附、增殖和分化，最后是鈣鹽的沉積和骨質(zhì)礦化成熟的過程。種植體與血液接觸后在其表面吸附形成的蛋白層對(duì)成骨源性細(xì)胞對(duì)種植體表面的識(shí)別與粘附有重要作用，而成骨源性細(xì)胞的募集，增殖和分化以及隨后的鈣鹽沉積過程受到種植體周圍局部成骨微環(huán)境的影響，包括局部生物活性因子的種類和濃度等。基于對(duì)種植體周圍組織修復(fù)愈合過程了解的加深，以及對(duì)于細(xì)胞在基底表面的粘附機(jī)制和生物活性分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和組織重建方面作用的最新認(rèn)識(shí)，將有機(jī)分子引入種植體表面成為近年來種植體表面改性方法研究中的熱點(diǎn)問題。一方面，這些有機(jī)分子模擬了胞外基質(zhì)的主要成分，為成骨源性細(xì)胞在種植體表面生長(zhǎng)提供了有利的環(huán)境；另一方面，選擇性的使用一些已知功能的生物活性因子，特別是具有顯著促進(jìn)細(xì)胞和骨組織反應(yīng)功能的生長(zhǎng)因子，能更加有效的調(diào)節(jié)和控制種植體周圍的組織愈合過程。將有機(jī)分子引入種植體表面的方法也被稱之為表面生化改性。種植體表面生化改性中涉及的有機(jī)分子包括幾類一類是大分子量的成分，主要是胞外基質(zhì)成分如膠原和硫酸軟骨素等；一類是小分子量的促粘附多肽如含RGD (Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的多肽序列；還有一類是具有很強(qiáng)生物活性的生長(zhǎng)因子類成分如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors, FGFs)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors, IGFs)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transform growth factors, TGFs)等?，F(xiàn)有的體內(nèi)體外研究證實(shí)，這些有機(jī)分子的應(yīng)用，對(duì)種植體表面的細(xì)胞和組織反應(yīng)都有積極的效應(yīng)。特別是生長(zhǎng)因子類成分的單獨(dú)或者聯(lián)合其他有機(jī)分子的應(yīng)用，能為種植體表面的細(xì)胞生長(zhǎng)提供額外的線索，從而增加種植體周圍的骨組織再生?，F(xiàn)在種植體表面生化改性中存在的瓶頸問題是缺乏有效的手段將這些有機(jī)分子引入到種植體表面，尤其是對(duì)于具有高生物活性的生長(zhǎng)因子類成分。理想的將有機(jī)分子引入種植體表面的技術(shù)手段應(yīng)該具有這樣的特征在種植體表面構(gòu)建的有機(jī)分子涂層不僅保留其生物學(xué)活性，而且其降解或者釋放的動(dòng)力學(xué)過程與組織愈合的過程相匹配。 顯然現(xiàn)有的技術(shù)手段如物理吸附和化學(xué)偶聯(lián)的方式滿足不了這樣的要求。前者引入的涂層分布不均、效率低下、穩(wěn)定性差、重復(fù)性差以及結(jié)合力小容易在種植體植入過程中被擦掉。 而后者容易引起生物活性因子的構(gòu)象而影響其生物學(xué)活性。在酶解，水解以及還原性物質(zhì)的作用下，上述聚電解質(zhì)復(fù)合涂層在生理?xiàng)l件下的降解還是相對(duì)比較快的(存在時(shí)間約4-7天)。調(diào)節(jié)其降解速率并實(shí)現(xiàn)負(fù)載在涂層內(nèi)的生物活性因子的緩釋作用依賴于對(duì)該聚電解質(zhì)復(fù)合涂層穩(wěn)定性的進(jìn)一步調(diào)控。研究表明，二硫鍵(-S-S-)在維持生物大分子特別是蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用，且二硫鍵可在還原條件下被打開形成巰基(-SH)，而巰基很容易被氧化成二硫鍵。這兩者發(fā)生相互轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件相對(duì)溫和，對(duì)生物大分子的活性損傷較小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(I)RGD接枝的聚電解質(zhì)的制備
首先是合成含雙硫鍵的RGD多肽鏈段甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-S-S-半胱氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸 (GRGDSPC(S-S)CPSDGRG),由 SciLight Biotechnology, LLC 公司合成，然后在碳化二亞胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide, EDC] :N_ 羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide, NHS)催化體系存在的條件下，該多肽鏈段接枝到聚電解質(zhì)上， 將所得到的產(chǎn)物透析純化后，加入木蘇糖或者谷胱甘肽與之進(jìn)行反應(yīng)，將多肽鏈段間的雙硫鍵打開得到甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_絲氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH (GRGDSPC-SH)接枝的聚電解質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)聚電解質(zhì)的改性。聚電解質(zhì)為聚陽離子聚電解質(zhì)和聚陰離子聚電解質(zhì)。本發(fā)明所述的RGD是一種含精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸的線性七肽結(jié)構(gòu)，其肽鏈結(jié)構(gòu)為甘氨酸_精氨酸_甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-SH(GRGDSPC-SH)。本發(fā)明所述RGD接枝的聚電解質(zhì)均指的是被修飾了甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_絲氨酸_脯氨酸_半胱氨酸序列，并具有自由活潑巰基的聚電解質(zhì)。所述的聚陰電解質(zhì)選用透明質(zhì)酸、堿溶明膠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一種或者幾種，得到的產(chǎn)物是RGD接枝的聚陰離子電解質(zhì)。聚陰離子電解質(zhì)的分子量從 100-5000000D。所述聚陽電解質(zhì)選用I型膠原、殼聚糖、酸溶明膠、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚組氨酸中的一種或者幾種，得到的產(chǎn)物是RGD接枝的聚陽離子電解質(zhì)。聚陽離子電解質(zhì)的分子量從 100-2000000D。所述聚電解質(zhì)的濃度為0. l-50mg/ml，其中最佳濃度為5mg/ml ；所述的多肽鏈段的量與聚電解質(zhì)中羧基含量的摩爾比例為1 :10000-1 :1，其中最佳濃度比率為1 :20-50 ； 所述的碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺(EDCNHS)的用量為1 :1_20 :1，其中最佳濃度比例為10-5 1 ；EDC的用量與多肽鏈段的用量的摩爾比例為1 :1_10 :1，其中最佳濃度比例為2-5 1 ；所用的木蘇糖或者谷胱甘肽的濃度與EDC:NHS體系中雙硫鍵的摩爾比例為1 1-50 :1，其中最佳摩爾濃度比例為5 :1。(2)聚電解質(zhì)溶液的配制
添加有生物活性因子(BMP-2或bFGF)的聚陽離子電解質(zhì)溶液的配制將經(jīng)步驟(1)獲得的RGD接枝的聚陽離子電解質(zhì)或未改性的聚陽離子電解質(zhì)配制成溶液，并在其中添加生物活性因子BMP-2或bFGF，配制成具有一定生物活性因子濃度的聚陽離子電解質(zhì)溶液。生物活性因子(bmp-2或bFGF)只添加在聚陽離子電解質(zhì)溶液里，因?yàn)閮烧咴赑H值在4. 0左右都帶正電荷。聚陰離子電解質(zhì)溶液的配制將經(jīng)步驟(1)獲得的RGD接枝的聚陰離子聚電解質(zhì)或未改性的聚陰離子電解質(zhì)配制成溶液。步驟(2)中各種聚電解質(zhì)溶液的濃度范圍均為0. lmg/ml-10mg/ml，其中最佳濃度范圍為0. 5-lmg/ml，其中聚電解質(zhì)溶液中NaCl濃度為0. 1-0. 2mol/L, pH值為4. O。BMP-2 的濃度為0. 5-100(^g/ml，其中最佳濃度范圍為20_20(^g/ml，bFGF濃度為20_100(^g/ml， 其中最佳濃度為50_50(^g/ml。(3) RGD接枝的負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備
將步驟(2)的溶液作如下組合(a)添加生物活性因子(BMP-2或bFGF)的RGD接枝的聚陽離子聚電解質(zhì)溶液和未改性的聚陰離子電解質(zhì)溶液可以作為一組溶液；(b) RGD接枝的聚陰離子聚電解質(zhì)溶液和添加生物活性因子(BMP-2或bFGF)的未改性的聚陽離子電解質(zhì)溶液可以作為一組溶液；(c)添加生物活性因子(BMP-2或bFGF)的RGD接枝的聚陽離子聚電解質(zhì)溶液和RGD接枝的聚陰離子聚電解質(zhì)溶液可以作為一組溶液。用(a)-(c)任一組溶液，利用靜電自組裝技術(shù)，首先在鈦基種植體表面沉積聚陽離子電解質(zhì)和生物活性因子，沉積一定時(shí)間后，充分水洗，然后沉積聚陰離子電解質(zhì)層，沉積一定時(shí)間后，充分水洗；以上操作記為一次沉積循環(huán)，根據(jù)需要重復(fù)以上循環(huán)操作，最后得到需要的聚電解質(zhì)復(fù)合層；然后，該聚電解質(zhì)復(fù)合層在氯胺T溶液或者雙氧水溶液中浸泡一段時(shí)間，迅速取出，充分水洗，得到負(fù)載生物活性因子的仿生涂層。即是一種RGD交聯(lián)的具有生物活性因子緩釋功能的聚電解質(zhì)仿生涂層。其中沉積單一一層聚陰離子電解質(zhì)層或聚陽離子電解質(zhì)層所用的沉積時(shí)間為 5min-20min，沉積一層聚陽離子電解質(zhì)層和一層聚陰離子電解質(zhì)層稱為一個(gè)沉積循環(huán)，構(gòu)建聚電解質(zhì)復(fù)合涂層所需的沉積循環(huán)為0. 5-50次，根據(jù)實(shí)際臨床用途確定最后的沉積循環(huán)數(shù)，其中口腔用牙種植體的表面沉積最佳循環(huán)是4-10次，最外層為RGD修飾的聚電解質(zhì)層。步驟(3)中聚電解質(zhì)復(fù)合層在氯胺T中的浸泡時(shí)間為5-180秒，最佳時(shí)間為30_90 秒，氯胺T的濃度為0. 5-10 mM，其中最佳濃度為2mM，在雙氧水中浸泡時(shí)間為5_60分鐘，最佳時(shí)間為10-20分鐘，雙氧水的濃度為1-50 mM，其中最佳濃度為10_15mM。步驟(3)中所用的種植體表面為各種永久植入型種植體表面，可以選用經(jīng)氧化性酸處理的純鈦或者鈦合金表面、非氧化型酸處理的純鈦或者鈦合金種植體表面、噴砂/酸處理的表面、各種堿熱法得到的純鈦或者鈦合金種植體表面、電化學(xué)得到的各種表面、各種羥基磷灰石涂層的純鈦或者鈦合金種植體表面、鈦或者羥基磷灰石噴漿表面的純鈦或者鈦合金種植體表面、鈦噴漿/酸處理的純鈦或者鈦合金表面、離子注入的各種純鈦或者鈦合金種植體表面、或激光處理的各種純鈦或者鈦合金種植體表面。
本發(fā)明通過層層自組裝技術(shù)(layer by layer technique, LBL技術(shù))在種植體表面構(gòu)建負(fù)載有生物活性因子的有機(jī)涂層。LBL技術(shù)最早由法國科學(xué)家G. Decher提出，該方法具有操作簡(jiǎn)單，制備條件溫和，方便可控，能連續(xù)生產(chǎn)等特點(diǎn)。它的基本原理是在靜電力作用下，帶有相反電荷的聚電解質(zhì)可以交替沉積在固體支持物表面，得到物理化學(xué)性質(zhì)均一的聚電解質(zhì)復(fù)合膜。研究發(fā)現(xiàn)，具有電荷性質(zhì)的聚電解質(zhì)和兩性聚電解質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽、DNA等都可以利用LBL技術(shù)被引入到支持物表面，同時(shí)生物活性大分子在多層復(fù)合膜中活性幾乎得到了全部保留，而且具有更強(qiáng)的對(duì)抗環(huán)境變化的能力。本發(fā)明所選用的聚陰離子電解質(zhì)和聚陽離子電解質(zhì)為天然或經(jīng)RGD序列接枝改性的生物大分子。BMP-2或bFGF等生長(zhǎng)因子被添加在聚陽離子電解質(zhì)溶液中，在聚陽離子電解質(zhì)沉積到種植體表面的過程中被同時(shí)裝載到聚電解質(zhì)復(fù)合涂層內(nèi)。本發(fā)明中用于接枝生物大分子的RGD序列設(shè)計(jì)成末端帶有巰基，在氯胺T/無水嗎啉乙磺酸或過氧化氫存在的條件下，可以通過巰基與二硫鍵的相互轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)聚電解質(zhì)復(fù)合涂層的交聯(lián)，從而增加涂層的穩(wěn)定性并實(shí)現(xiàn)生物活性因子的緩慢釋放。同時(shí)，通過改變組裝的層數(shù)和交聯(lián)劑作用的時(shí)間來實(shí)現(xiàn)對(duì)涂層降解時(shí)間的調(diào)控。而且，由于雙硫鍵的存在，又賦予聚電解質(zhì)復(fù)合涂層對(duì)體內(nèi)生物降解的響應(yīng)性。本發(fā)明方法所構(gòu)建的RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚電解質(zhì)復(fù)合層，在成分上模擬了胞外基質(zhì)的主要組成，RGD多肽的引入為細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的識(shí)別提供了更多的線索。功能性RGD多肽序列引入的另一個(gè)更要的作用是溫和有效地特異性交聯(lián)一個(gè)負(fù)載生物活性因子載體，解決了長(zhǎng)期以來限制生物活性因子在種植體周圍應(yīng)用的瓶頸問題。期望可以促進(jìn)種植體周圍成骨的早期發(fā)生，可以早日實(shí)現(xiàn)骨整合。本發(fā)明是一種在鈦種植體表面構(gòu)建負(fù)載生物活性因子的仿細(xì)胞外基質(zhì)有機(jī)涂層的方法。種植體表面聚電解質(zhì)復(fù)合涂層的制備是通過層層自組裝技術(shù)(layer by layer technique, LBL技術(shù))實(shí)現(xiàn)的，而具有高生物活性的生長(zhǎng)因子類成分(BMP_2或bFGF等)隨著涂層的組裝過程被攜帶入涂層中。構(gòu)建涂層的聚電解質(zhì)至少有一種是經(jīng)末端帶有巰基的 RGD序列接枝改性的。利用巰基經(jīng)氧化生成雙硫鍵的反應(yīng)增加了聚電解質(zhì)涂層的穩(wěn)定性，而交聯(lián)后涂層中的雙硫鍵對(duì)生理環(huán)境下還原物質(zhì)的響應(yīng)性決定了涂層的降解具有生物響應(yīng)性，也使得生物活性因子的釋放具有緩釋效應(yīng)。RGD多肽序列的引入生物活性因子能穩(wěn)定負(fù)載的前提條件，同時(shí)又與生物活性因子在生物學(xué)效應(yīng)方面起到協(xié)同作用。該涂層的制備能實(shí)現(xiàn)種植體的早期骨整合，并有利于種植體的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。


圖1是聚電解質(zhì)涂層中負(fù)載的BMP-2在磷酸鹽緩沖液的緩釋行為。圖2是RGD交聯(lián)的負(fù)載BMP-2的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞骨鈣素(OC)表達(dá)的影響。圖3是RGD交聯(lián)的負(fù)載BMP-2的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)的影響。圖4是RGD交聯(lián)的負(fù)載BMP-2的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞AKP-2 mRNA表達(dá)的影響。圖5是不同組織愈合周期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的種植體的扭力大小。圖6是聚電解質(zhì)涂層中負(fù)載的bFGF在磷酸鹽緩沖液的緩釋行為。圖7是RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞粘附、增殖行為的影響。圖8是RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞骨鈣素(OC)表達(dá)的影響。
圖9是RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)的影響。圖10是RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞AKP-2 mRNA表達(dá)的影響。圖11是不同組織愈合周期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的種植體的扭力大小。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明，由于本發(fā)明可以在所有體內(nèi)永久性植入的種植體表面進(jìn)行構(gòu)建，從而可以實(shí)現(xiàn)植入體和硬組織間的快速骨整合和遠(yuǎn)期的種植成功率。實(shí)施例中只是以一種噴砂/酸處理表面作為說明，但是，其他體內(nèi)永久性植入種植體表面上用本發(fā)明所構(gòu)建的這種涂層都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施例只是為了更好說明本發(fā)明的特征，并不完全包含本申請(qǐng)的所保護(hù)內(nèi)容。實(shí)施例一 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的透明質(zhì)酸鈉。將RGD接枝的透明質(zhì)酸和膠原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為 lmg/ml。在配好的膠原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為2(^g/ml (若加的是 bFGF,則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(膠原+ BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(膠原+ BMP-2);然后，再浸泡于R⑶修飾的透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸鈉。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將膠原更換為酸溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例三RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將膠原更換為殼聚糖。實(shí)施例四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸的制備
方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將膠原更換為聚精氨酸。實(shí)施例五RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸的制備
方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將膠原更換為聚賴氨酸。實(shí)施例六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸的制備
方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將膠原更換為聚組氨酸。
/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層 /透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層 /透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層
實(shí)施例七RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的堿溶明膠溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的堿溶明膠。將RGD接枝的堿溶明膠和膠原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為 lmg/ml。在配好的膠原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是 bFGF,則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(膠原+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(膠原+BMP-2);然后，再浸泡于RGD修飾的堿溶明膠溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的堿溶明膠。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)膠原/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例八RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例七，區(qū)別在于將膠原更換為酸溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例九RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例七，區(qū)別在于將膠原更換為殼聚糖。實(shí)施例十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例七，區(qū)別在于將膠原更換為聚精氨酸。實(shí)施例十一 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例七，區(qū)別在于將膠原更換為聚賴氨酸。實(shí)施例十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例七，區(qū)別在于將膠原更換為聚組氨酸。實(shí)施例十三RGD交聯(lián)的膠原/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚谷氨酸溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚谷氨酸。將RGD接枝的聚谷氨酸和膠原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為 lmg/ml。在配好的膠原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是 bFGF,則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(膠原+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(膠原+BMP-2);然后，再浸泡于R⑶修飾的聚谷氨酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的聚谷氨酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)膠原/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例十四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十三，區(qū)別在于將膠原更換為酸溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例十五RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十三，區(qū)別在于將膠原更換為殼聚糖。實(shí)施例十六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸層的制備
方法同實(shí)施例十三，區(qū)別在于將膠原更換為聚精氨酸。實(shí)施例十七RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸層的制備
方法同實(shí)施例十三，區(qū)別在于將膠原更換為聚賴氨酸。實(shí)施例十八RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸層的制備
方法同實(shí)施例十三，區(qū)別在于將膠原更換為聚組氨酸。實(shí)施例十九RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚天冬氨酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖， 反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚天冬氨酸。將RGD接枝的聚天冬氨酸和膠原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的膠原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂W2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(膠原+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(膠原+BMP-2);然后，再浸泡于R⑶修飾的聚天冬氨酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的聚天冬氨酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)膠原/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例二十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十九，區(qū)別在于將膠原更換為酸溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例二i^一 =RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十九，區(qū)別在于將膠原更換為殼聚糖。實(shí)施例二十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)
/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合 /聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合 /聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十九，區(qū)別在于將膠原更換為聚精氨酸。實(shí)施例二十三RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十九，區(qū)別在于將膠原更換為聚賴氨酸。實(shí)施例二十四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例十九，區(qū)別在于將膠原更換為聚組氨酸。實(shí)施例二十五RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC(S-S)CPSDGRG和一定量的膠原溶于水中，隨后加入EDC/ NHS,反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4 小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的膠原。將該RGD接枝的膠原和透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的膠原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂W2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的膠原+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的膠原+BMP-2)；然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。 重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例二十六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例二十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例二十七RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例二十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例二十八RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例二十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例二十九RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG和一定量的殼聚糖溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的殼聚糖。將該RGD接枝的殼聚糖和透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的殼聚糖溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的殼聚糖+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD 接枝的殼聚糖+BMP-2);然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD 交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例三十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例二十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例三i^一 =RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例二十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例三十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例二十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例三十三RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的酸溶明膠溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的酸溶明膠。將該RGD接枝的酸溶明膠和透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的酸溶明膠溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂W2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的酸溶明膠+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的 (RGD接枝的酸溶明膠+BMP-2)；然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。 得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例三十四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例三十三，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例三十五RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例三十三，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例三十六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例三十三，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例三十七RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/透 明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚精氨酸溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚精氨酸。將該RGD接枝的聚精氨酸和透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的聚精氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2S04和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的聚精氨酸+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的 (R⑶接枝的聚精氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)聚精氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。 得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例三十八RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例三十七，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例三十九RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例三十七，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例四十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例三十七，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例四i^一 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚賴氨酸溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚賴氨酸。將該RGD接枝的聚賴氨酸酸和透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的聚賴氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為
ml (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。 種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面， 然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的聚賴氨酸+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚賴氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)聚賴氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。 將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺Τ。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例四十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例四十三RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例四十四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例四十五R⑶交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚組氨酸溶于水中，隨后加入 EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚組氨酸。將該RGD接枝的聚組氨酸和透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的聚組氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2S04和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的聚組氨酸+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的 (R⑶接枝的聚組氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)聚組氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。 得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例四十六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例四十七RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例四十八RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施 例四十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例四十九RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分別和一定量的膠原和透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，力口入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的膠原和具有自由巰基的RGD接枝的透明質(zhì)酸。將 RGD接枝的膠原和RGD接枝的透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的膠原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2S04和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的膠原+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD 接枝的膠原+BMP-2);然后，再浸泡于透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例五十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十九，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例五十一 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的膠原/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十九，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例五十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例四十九，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例五十三RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分別和一定量的殼聚糖和透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中， 加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，分別得到具有自由巰基的RGD接枝的殼聚糖和 RGD接枝的透明質(zhì)酸。將該RGD接枝的殼聚糖和RGD接枝的透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的殼聚糖溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為 5μδ/πι1 (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到 4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(R⑶接枝的殼聚糖+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的殼聚糖+BMP-2)；然后，再浸泡于RGD接枝的透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的RGD接枝的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例五十四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例五十三，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例五十五RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例五十三，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。 實(shí)施例五十六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的殼聚糖/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例五十三，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例五十七R⑶交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分別和一定量的酸溶明膠和透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的酸溶明膠和 RGD接枝的透明質(zhì)酸。將該RGD接枝的酸溶明膠和RGD接枝的透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的酸溶明膠溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到 4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的酸溶明膠+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的酸溶明膠+BMP-2 )；然后，再浸泡于RGD接枝的透明質(zhì)酸溶液中IOmin， 去離子水洗去物理吸附的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例五十八R⑶交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例五十七，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例五十九R⑶交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例五十七，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例六十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的酸溶明膠/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例五十七，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例六i^一 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分別和一定量的聚精氨酸和透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚精氨酸和 RGD接枝的透明質(zhì)酸。將該RGD接枝的聚精氨酸和RGD接枝的透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的聚精氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到 4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的聚精氨酸+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚精氨酸+BMP-2 )；然后，再浸泡于RGD接枝的透明質(zhì)酸溶液中IOmin， 去離子水洗去物理吸附的RGD接枝的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)聚精氨酸/ 透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例六十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例六十三RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例六十四RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例六十五RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分別和一定量的聚賴氨酸和透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的聚賴氨酸和 RGD接枝的透明質(zhì)酸。將該RGD接枝的聚賴氨酸酸和RGD接枝的透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的聚賴氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml )。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的聚賴氨酸+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚賴氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于RGD接枝的透明質(zhì)酸溶液中 lOmin，去離子水洗去物理吸附的R⑶接枝的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)聚賴氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30 秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例六十六RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例六十七RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例六十八RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚賴氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十五，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例六十九RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
將含RGD的多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分別和一定量的聚組氨酸和透明質(zhì)酸溶于水中，隨后加入EDC/NHS，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小時(shí)，透析一周，凍干，分別得到具有自由巰基的RGD接枝的聚組氨酸和RGD接枝的透明質(zhì)酸。將該RGD接枝的聚組氨酸和RGD接枝的透明質(zhì)酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 兩者的濃度都為lmg/ml。在配好的聚組氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最終濃度為5Pg/ml (若加的是bFGF，則終濃度為0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值調(diào)整到 4. 0。種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于(RGD接枝的聚組氨酸+BMP-2)溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚組氨酸+BMP-2 )；然后，再浸泡于RGD接枝的透明質(zhì)酸溶液中IOmin， 去離子水洗去物理吸附的RGD接枝的透明質(zhì)酸。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)聚組氨酸/ 透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/透明質(zhì)酸聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體。實(shí)施例七十RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/堿溶明膠聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十九，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為堿溶明膠(其來源為豬源，牛源或者鼠源)。實(shí)施例七i^一 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/聚谷氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十九，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚谷氨酸。實(shí)施例七十二 RGD交聯(lián)的負(fù)載生物活性因子的聚組氨酸/聚天冬氨酸聚電解質(zhì)復(fù)合層的制備
方法同實(shí)施例六十九，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸更換為聚天冬氨酸。實(shí)施例七十三聚電解質(zhì)涂層中負(fù)載的BMP-2在磷酸鹽緩沖液的緩釋行為
使用(膠原+BMP-2)和具有巰基末端RGD接枝改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的RGD交聯(lián)的負(fù)載有BMP-2的聚電解質(zhì)涂層(BEC-CL-TI group)(交聯(lián)組)。使用(膠原+BMP-2)和未帶末端巰基的RGD接枝改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的負(fù)載有BMP-2的聚電解質(zhì)涂層(BEC- TI group)(未交聯(lián)組)。將覆蓋兩種不同涂層的鈦片分別置于磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)中，使用酶聯(lián)免疫吸附的方法檢測(cè)這兩種涂層中BMP-2的釋放行為。結(jié)果參見圖1，顯示了未交聯(lián)組涂層中的BMP-2的釋放只持續(xù)了 3天，第一天的釋放量很高，呈爆發(fā)性釋放，接下來的釋放量就急劇下降。而交聯(lián)組BMP-2的釋放緩慢而持久， 到了第十天還有少量的BMP-2被釋放出來。實(shí)施例七十四RGD交聯(lián)的負(fù)載BMP-2的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞骨鈣素(OC)表達(dá)的影響
使用膠原和透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的聚電解質(zhì)涂層(CHC-TI group)(對(duì)照組)。使用膠原和RGD改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的聚電解質(zhì)涂層(CHRC-TI group)(實(shí)驗(yàn)組)。使用(膠原+BMP-2)和具有巰基末端R⑶接枝改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的RGD交聯(lián)的負(fù)載有BMP-2的聚電解質(zhì)涂層(BEC-CL-TI group)(實(shí)驗(yàn)組)。 小鼠成骨前體細(xì)胞細(xì)胞系MC3T3-E1 (中國科學(xué)院細(xì)胞庫)用來評(píng)價(jià)涂層的對(duì)細(xì)胞分化行為的影響。骨鈣素的表達(dá)是成骨前體細(xì)胞分化的重要指標(biāo)之一。測(cè)定的2周時(shí)四個(gè)組別間細(xì)胞骨鈣素表達(dá)量的結(jié)果顯示(參見圖2)，RGD多肽序列改性的組(CHRC-TI組)對(duì)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用要高于沒有RGD改性組(CHC-TI組)。BMP-2作為具有強(qiáng)烈誘導(dǎo)骨形成能力的生長(zhǎng)因子，其對(duì)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用是非常明顯的，因此在BEC-CL-TI組顯示了最高的OC 表達(dá)量，體現(xiàn)了交聯(lián)作用帶來的生物活性因子的緩釋效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。(“*”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“#”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。實(shí)施例七十五RGD交聯(lián)的負(fù)載BMP-2的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響
實(shí)驗(yàn)分組和使用的細(xì)胞系同實(shí)施例七十四。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法來分析不同組別間成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化。檢測(cè)了堿性磷酸酶(AKP-2 mRNA)及RunX2 mRNA的表達(dá)情況。Rimx2的表達(dá)是啟動(dòng)成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，而堿性磷酸酶 (ALP)是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志。結(jié)果顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)的早期，在BEC-CL-TI組Runx2 和ALP mRNA表達(dá)的上調(diào)的就明顯高于其他兩個(gè)組。而在7天和14天時(shí)，BEC-CL-TI組的優(yōu)勢(shì)就更加明顯了。(“*”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“#”代表 P<0. 05,實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。參見圖3、圖4。實(shí)施例七十六體內(nèi)試驗(yàn)
新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在成年雄性兔子的雙側(cè)股骨遠(yuǎn)心端植入種植體用于評(píng)價(jià)經(jīng)涂層改性后的種植體的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)照組(Contro 1)為經(jīng)噴砂酸蝕表面處理處理的種植體(SLA)。實(shí)驗(yàn)組(Test)為6個(gè)雙層的RGD交聯(lián)的負(fù)載有BMP-2的聚電解質(zhì)涂層改性的SLA種植體。分別在種植體植入后的2、4和8周，采用便攜式數(shù)字扭力測(cè)試儀分析種植體和骨組織的結(jié)合力。扭力值大小代表結(jié)合力大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在種植體植入后的2 周，實(shí)驗(yàn)組的種植體骨結(jié)合力要大于對(duì)照組，而到了 4和8周，實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)則更加明顯，也證實(shí)了在種植體表面制備的涂層具有在早期促進(jìn)骨組織-種植體結(jié)合的能力。(“*”代表 P<0. 05,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。參見圖5。實(shí)施例七十七聚電解質(zhì)涂層中負(fù)載的bFGF在磷酸鹽緩沖液的緩釋行為
使用(膠原+bFGF)和具有巰基末端RGD接枝改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的RGD交聯(lián)的負(fù)載有生物活性因子的聚電解質(zhì)涂層(Crossliked)(交聯(lián)組)。使用(膠原 + bFGF)和未帶末端巰基的RGD接枝改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的負(fù)載有生物活性因子的聚電解質(zhì)涂層(Ti-[(Col+bFGF)/HA-RGD])(未交聯(lián)組)。將覆蓋兩種不同涂層的鈦片分別置于磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)中，使用酶聯(lián)免疫吸附的方法檢測(cè)這兩種涂層中生物活性因子(bFGF)的釋放行為。結(jié)果顯示，未交聯(lián)組涂層中的bFGF在前4天就釋放完畢，且釋放的速率非常快，在前兩天釋放的量非常大。而交聯(lián)組bFGF的緩釋效應(yīng)可以持續(xù) 14天左右。參見圖6。實(shí)施例七十八RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞粘附、增殖行為的影響使用膠原和透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的聚電解質(zhì)涂層(CHC-Ti)(對(duì)照組)。使
用膠原和末端帶巰基的RGD改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的RGD交聯(lián)的聚電解質(zhì)涂層(CHC-RGD-Ti )(實(shí)驗(yàn)組)。使用(膠原+bFGF)和具有巰基末端RGD接枝改性的透明質(zhì)酸在鈦片上制備6個(gè)雙層的R⑶交聯(lián)的負(fù)載有bFGF的聚電解質(zhì)涂層(CC-Ti)(實(shí)驗(yàn)組)。小鼠成骨前體細(xì)胞細(xì)胞系MC3T3-E1用來評(píng)價(jià)涂層的對(duì)細(xì)胞增殖行為的影響。DNA含量的多少代表了細(xì)胞數(shù)目的多少。在Ih時(shí)CHC-RGD-Ti和CC-Ti組粘附的細(xì)胞量是最多的，顯示了 RGD多肽對(duì)細(xì)胞粘附的促進(jìn)作用。由于bFGF具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用，在3d時(shí)，CC-Ti 組的細(xì)胞較之于其它兩組是顯著增加的。(“*”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“#”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。參見圖7。實(shí)施例七十九RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞骨鈣素(OC)表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組和用于檢測(cè)分化行為的細(xì)胞系同實(shí)施例七十八。測(cè)定的2周時(shí)四個(gè)組別間
細(xì)胞骨鈣素表達(dá)量的結(jié)果顯示，RGD多肽序列改性的組(CHC-RGD-Ti組)對(duì)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用要高于沒有R⑶改性組(CHC-TI組)。CC-Ti上培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)的OC量最高表明， bFGF對(duì)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用也是非常明顯的。(“*”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“#”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。參見圖8。實(shí)施例八十RGD交聯(lián)的負(fù)載bFGF的涂層對(duì)MC3T3細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分組和用于檢測(cè)基因表達(dá)的細(xì)胞系同實(shí)施例七十八。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方
法來分析不同組別間成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化。檢測(cè)了堿性磷酸酶(AKP-2 mRNA)及Rimx2 mRNA的表達(dá)情況。Rimx2的表達(dá)是啟動(dòng)成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，而堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志。每種生長(zhǎng)因子的生物學(xué)效應(yīng)是有差異的。與BMP-2 強(qiáng)烈的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的效應(yīng)明顯不同的是，bFGF對(duì)Runx2和AKP_2mRNA表達(dá)的上調(diào)作用在2W的時(shí)候顯現(xiàn)出最明顯的優(yōu)勢(shì)來。(“*”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；“#”代表P<0. 05，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。參見圖9、圖10。實(shí)施例八i^一 體內(nèi)試驗(yàn)
新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在成年雄性兔子的雙側(cè)股骨遠(yuǎn)心端植入種植體用于評(píng)價(jià)經(jīng)涂層改性后的種植體的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)照組(Contro 1)為經(jīng)噴砂酸蝕表面處理處理的種植體(SLA)。實(shí)驗(yàn)組(Test)為6個(gè)雙層的RGD交聯(lián)的負(fù)載有不FGF的聚電解質(zhì)涂層改性的 SLA種植體。分別在種植體植入后的2、4和8周，采用便攜式數(shù)字扭力測(cè)試儀分析種植體和骨組織的結(jié)合力。扭力值大小代表結(jié)合力大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在種植體植入后的2和 4周，實(shí)驗(yàn)組的種植體骨結(jié)合力要大于對(duì)照組。到了 8周時(shí)，兩者的扭力值都較之前稍減小， 且兩者值比較接近?！?”代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。參見圖11。
權(quán)利要求
1.一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)RGD接枝的聚電解質(zhì)的制備將含雙硫鍵的RGD多肽鏈段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG在碳化二亞胺N_羥基琥珀酰亞胺催化體系存在的條件下，接枝到聚電解質(zhì)上，將所得到的產(chǎn)物透析純化后，加入木蘇糖或者谷胱甘肽與之反應(yīng)，得到甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_絲氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH接枝的聚電解質(zhì)，聚電解質(zhì)分別為聚陽離子聚電解質(zhì)和聚陰離子聚電解質(zhì)；所述的RGD是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的線性七肽結(jié)構(gòu)，其肽鏈結(jié)構(gòu)為甘氨酸-精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_絲氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH ；所述聚電解質(zhì)的濃度為0. l-50mg/ml，多肽鏈段的量與聚電解質(zhì)中羧基含量的摩爾比為1 :10000-1 :1，碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺的用量為1 :1-20 :1，碳化二亞胺的用量與多肽鏈段的用量的摩爾比為1 :1_10 :1，木蘇糖或者谷胱甘肽的濃度與催化體系中雙硫鍵的摩爾比為1 1-50 1 ；(2)聚電解質(zhì)溶液的配制聚陽離子電解質(zhì)溶液配置將步驟(1)獲得的RGD接枝的聚陽離子聚電解質(zhì)或未改性的聚電解質(zhì)陽離子配制成溶液，并在其中添加生物活性因子BMP-2或bFGF ；聚陰離子電解質(zhì)溶液的配制將步驟(1)獲得的RGD接枝的聚陰離子聚電解質(zhì)或未改性的聚陰離子電解質(zhì)配制成溶液；其中各種聚電解質(zhì)溶液的濃度范圍為0. lmg/ml-10mg/ml，聚電解質(zhì)溶液中NaCl濃度為 0. 1-0. 2mol/L, pH 值為 4. 0，BMP-2 的濃度為 0. 5-1000μδ/πι1, bFGF 濃度為 20-1000μδ/ ml ；(3)仿生涂層的制備將步驟(2)配置的溶液作如下組合(a)添加生物活性因子BMP-2或bFGF的RGD接枝的聚陽離子聚電解質(zhì)溶液和未改性的聚陰離子電解質(zhì)溶液；(b) RGD接枝的聚陰離子聚電解質(zhì)溶液和添加生物活性因子BMP-2或bFGF的未改性的聚陽離子電解質(zhì)溶液；(c)添加生物活性因子BMP-2或bFGF的RGD接枝的聚陽離子聚電解質(zhì)溶液和RGD接枝的聚陰離子聚電解質(zhì)溶液；用(a)-(c)任一組溶液，首先在鈦基種植體表面沉積聚陽離子電解質(zhì)和生物活性因子，沉積一定時(shí)間后，充分水洗，然后沉積聚陰離子電解質(zhì)層，沉積一定時(shí)間后，充分水洗， 以上操作記為一次沉積循環(huán)，根據(jù)需要重復(fù)以上循環(huán)操作，最后得到需要的聚電解質(zhì)復(fù)合層，然后，在濃度為0. 5-10 mM的氯胺T溶液或者濃度為1-50 mM的雙氧水溶液中浸泡，取出，充分水洗，得到負(fù)載生物活性因子的仿生涂層；在氯胺T中的浸泡時(shí)間為5-180秒，在雙氧水中浸泡時(shí)間為5-60分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的所述聚陽電解質(zhì)選用I型膠原、殼聚糖、酸溶明膠、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚組氨酸中的一種或者幾種，得到的產(chǎn)物是RGD接枝的聚陽離子電解質(zhì)，聚陽離子電解質(zhì)的分子量為100-2000000D ；聚陰電解質(zhì)選用透明質(zhì)酸、堿溶明膠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一種或者幾種，得到的產(chǎn)物是RGD接枝的聚陰離子電解質(zhì)，聚陰離子電解質(zhì)的分子量為 100-5000000D。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備方法，其特征在于，步驟(3)中一層聚陰離子電解質(zhì)層或聚陽離子電解質(zhì)層所用的沉積時(shí)間為 5min-20min，所需的沉積循環(huán)為0. 5-50次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所用的種植體表面為各種永久植入型種植體表面，選用經(jīng)氧化性酸處理的純鈦或者鈦合金表面、非氧化型酸處理的純鈦或者鈦合金種植體表面、噴砂/酸處理的表面、 堿熱法得到的純鈦或者鈦合金種植體表面、電化學(xué)得到的表面、羥基磷灰石涂層的純鈦或者鈦合金種植體表面、鈦或者羥基磷灰石噴漿表面的純鈦或者鈦合金種植體表面、鈦噴漿/ 酸處理的純鈦或者鈦合金表面、離子注入的純鈦或者鈦合金種植體表面、或激光處理的純鈦或者鈦合金種植體表面。
全文摘要
本發(fā)明提供一種負(fù)載生物活性因子的仿生涂層的制備方法，通過在碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺催化體系下，將含雙硫鍵的RGD多肽鏈段接枝到聚電解質(zhì)上，再配制成RGD接枝的聚陰離子電解質(zhì)溶液和RGD接枝的負(fù)載生物活性因子聚陽離子電解質(zhì)溶液，將聚陰離子電解質(zhì)溶液和負(fù)載生物活性因子的聚陽離子電解質(zhì)溶液組合，利用靜電自組裝技術(shù)，在種植體表面構(gòu)建負(fù)載有生物活性因子的有機(jī)復(fù)合涂層。該復(fù)合涂層解決了長(zhǎng)期以來限制生物活性因子在種植體周圍應(yīng)用的瓶頸問題，可促進(jìn)種植體周圍成骨的早期發(fā)生，早日實(shí)現(xiàn)骨整合，有利于種植體的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。該方法操作簡(jiǎn)單，制備條件溫和，方便可控，能連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K6/04GK102327645SQ201110288240
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者李曉東, 李曉軍, 黃穎 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)