專利名稱：一種光基因氣味仿真系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光基因氣味仿真系統(tǒng)，可應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嗅覺作為五大感覺之一，起著識別同類、尋找食物、報警、影響情緒等功能。相對 視覺、聽覺研究，人們對嗅覺的研究相對滯后。1991年，Richard Axel和Linda B. Buch 在cell上發(fā)表論文，指出嚙齒類動物有1000種不同類型的氣味基因家族，并證明一種嗅覺 受體能夠特異地和多種氣味分子結(jié)合，同時一種氣味分子也可能特異地與多個嗅覺受體結(jié) 合。這一發(fā)現(xiàn)引起人們對嗅覺的極大興趣，使得嗅覺研究達(dá)到空前的高潮，之后眾多的論文 得以發(fā)表。由于他們在嗅覺上的開創(chuàng)性研究，2004生物學(xué)、醫(yī)學(xué)諾貝爾獎授予他們，以表彰 他們的杰出貢獻(xiàn)。迄今，仍有兩個方面的問題亟待解決，一個是嗅覺系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)對 各種氣味刺激是如何編碼和識別的；另一個是信號在各級嗅覺系統(tǒng)中如何加工、整合及傳 遞的。功能性磁共振成像(FMRI)技術(shù)從功能上證明大腦中哪些區(qū)域參與某種思維活動， 無法從細(xì)胞層次揭示其中的相互連接及其功能?；陔姶碳さ碾娚頊y量技術(shù)，受到電刺 激位置不易精確控制、刺激重復(fù)差、刺激范圍大、存在電泄露的局限性。采用化學(xué)物質(zhì)(如硫 化氫)的刺激，雖然相對電刺激更接近嗅覺生理，但由于不同氣味分子的擴散系數(shù)、溶解度 和吸附差異很大，使得研究非常復(fù)雜，難以實驗控制。另外，氣味種類繁多，化學(xué)成分非常復(fù) 雜，細(xì)微的變化更增加研究的難度。小鼠第一級嗅感系統(tǒng)一嗅感神經(jīng)元的受體分布在鼻腔粘膜內(nèi)，負(fù)責(zé)把氣味的刺激 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動，如果能夠跳過第一級傳感系統(tǒng)，直接從嗅覺第二級系統(tǒng)出發(fā)，通過刺激嗅 小球來模擬不同氣味或不同濃度氣味的刺激將會非常有利于嗅覺系統(tǒng)的研究。光基因技術(shù) (Optogenetic technique)的出現(xiàn)，使得這成為可能。利用遺傳學(xué)手段在嗅覺第二級系統(tǒng)表 達(dá)光敏蛋白，通過光學(xué)手段照射這些嗅小球，就可以激活特定細(xì)胞、神經(jīng)回路，并控制特定 神經(jīng)元的放電活動，因此就可模擬氣味刺激引起的嗅覺反應(yīng)。光基因技術(shù)的特異性有利于 避免健康細(xì)胞的損傷、將副作用降低到最小，因此可用于在體實驗。小鼠的嗅小球平均直徑為50Mffl，通常激活光敏蛋白采用的光源是寬場光源如高壓 汞燈，這樣就可能把所有嗅小球都激活，無法實現(xiàn)單個嗅小球的激活，因而無法精確研究嗅 覺系統(tǒng)工作機理。為此需要局部刺激單個嗅小球而不擴散到其它區(qū)域，而且要精確控制刺 激光強、刺激時間，方便于活體小動物實驗。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，包括計算機、控制單 元、光源驅(qū)動單元、光纖耦合單元、傳導(dǎo)光纖、光纖探頭、記錄電極和放大運算單元。計算機把仿真的參數(shù)通過總線輸入到控制箱，控制箱根據(jù)輸入?yún)?shù)控制光源驅(qū)動 單元產(chǎn)生特定要求的輸出光，通過傳導(dǎo)光纖耦合進入光纖探頭，實現(xiàn)對嗅球的光刺激。
所述控制單元作為計算機的外設(shè)接口，分別連接所述光源驅(qū)動單元、放大運算單 元，所述計算機通過控制單元實現(xiàn)對光源控制單元、放大運算單元的通信控制。所述光纖探頭、記錄電極的固定通過過渡板實現(xiàn)，用于精確定位，以及消除多個光 纖探頭安裝帶來的干擾。所述過渡板的加工制作基于嗅球的熒光圖像，在有熒光的嗅小球位置處，以其中 心加工直徑不超過0. 2mm的通孔。所述光纖探頭在通孔的固定采用折射率匹配的膠水凝固，既保證不損傷嗅覺系 統(tǒng)，也不影響光的穿透。所述光纖探頭用單?；蚨嗄９饫w制作，可加工成端窗型、錐形、聚焦型光纖探頭， 從而獲得不同形狀、不同尺寸的出射光斑用于刺激嗅小球。優(yōu)選的，光纖探頭采用角度型、復(fù)合型結(jié)構(gòu)可以減少傳導(dǎo)光的泄露，實現(xiàn)數(shù)十納米 深度的照射嗅小球。所述光纖探頭與傳導(dǎo)光纖屬于同一規(guī)格的光纖，通過FC/PC接頭連接，也可采用 光纖熔接機熔接，提高耦合效率。所述光源優(yōu)選高強度LED，尤其適合多個LED分別刺激不同嗅小球，并適合控制單 元獨立控制，實現(xiàn)多種模式的刺激。優(yōu)選的，可采用藍(lán)光、黃光雙色LED，用于表達(dá)興奮型和抑制性的光敏蛋白細(xì)胞的 刺激。所述LED與傳導(dǎo)光纖的耦合優(yōu)選直接耦合方式，具有耦合效率高、方便封裝、穩(wěn)定 等特征。所述系統(tǒng)具有刺激時間精度、空間精度、刺激強度等參數(shù)連續(xù)可調(diào)的功能，可以仿 真不同濃度、不同方向來源、不同成分、不同傳播速度氣味的仿真。所述系統(tǒng)可以開展閾值特性、可靠性、信息編碼、信息整合、方向性及對稱性等方 面的測量，用于研究嗅覺系統(tǒng)對各種氣味刺激的編碼與識別，以及信號在嗅覺系統(tǒng)中加工、 整合及傳遞的規(guī)律。本發(fā)明使用光纖探頭實現(xiàn)光束傳導(dǎo)，能夠?qū)Ρ磉_(dá)有不同類型光敏蛋白的嗅小球進 行不同模式的光刺激，根據(jù)記錄的電生理信號和行為表現(xiàn)，可以揭示嗅覺系統(tǒng)的工作機理， 用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究。


圖1是小鼠左右嗅球結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是固定光纖探頭過渡板結(jié)構(gòu)示意圖3是氣味仿真系統(tǒng)實施方式的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖4是基于透鏡的激光耦合結(jié)構(gòu)示意圖； 圖5是光纖到LED直接耦合方式示意圖； 圖6是LED驅(qū)動電路模塊示意圖； 圖7是不同結(jié)構(gòu)光纖探頭示意圖； 圖8是仿真參數(shù)與實際刺激參數(shù)對照示意圖； 圖9是閾值測量示意圖；圖10是時間刺激示意圖； 圖11是強度刺激示意圖。
具體實施例方式下面通過借助實例更加詳細(xì)地說明本發(fā)明，但以下實施例僅是說明性的，本發(fā)明 的保護范圍并不受這些實施例的限制。這里以小鼠為研究對象，但該系統(tǒng)不僅僅局限于小鼠研究。利用病毒轉(zhuǎn)染或遺傳 學(xué)手段將興奮型光敏感蛋白Channelrhodopsi (ChR2)，也可以選擇ChEF或ChIEF光敏蛋 白，表達(dá)到小鼠的第二級嗅感神經(jīng)細(xì)胞(如顆粒細(xì)胞、從狀細(xì)胞等)上，則嗅覺系統(tǒng)第一、第 二級的突觸連接一嗅小球會特異性的表達(dá)有光敏蛋白。當(dāng)光刺激這些嗅小球時，可使光敏 蛋白膜通道打開，進而引起細(xì)胞上膜通道的打開，使鈉、鈣等陽離子進入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜 去極化而誘導(dǎo)出動作電位，隨后通過嗅覺的第二級、第三級傳遞到更高級的中樞神經(jīng)系統(tǒng)， 引起后續(xù)一系列的響應(yīng)，如小鼠有抽鼻子的動作，做出積極迎合或規(guī)避的動作，因此可模仿 周圍環(huán)境散發(fā)有氣味小鼠的反應(yīng)行為，為深入、精細(xì)的研究小鼠的嗅覺系統(tǒng)工作機理提供 可能。為方便被光敏蛋白表達(dá)的嗅小球的可視化，在構(gòu)建質(zhì)粒時，光敏蛋白上還帶有熒光蛋 白基團，如綠色熒光蛋白(YFP)等，當(dāng)用汞燈照射這些細(xì)胞時，可以清晰觀察到發(fā)熒光的嗅 小球，因此就可刺激感興趣的嗅小球。待小鼠內(nèi)嗅感神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定，麻醉小鼠。利用外科手術(shù)的方法，剔除小鼠腦袋 頂部皮毛，用鉆頭磨去其頂部顱骨，剝離骨膜，使得左右兩側(cè)嗅球裸露出來，在熒光顯微鏡 下觀察記錄其熒光圖像。如圖1所示，左右兩個區(qū)域分別代表左右半球，每個區(qū)域內(nèi)的圓環(huán) 代表嗅小球，其中有灰度的圓環(huán)表示該嗅小球有熒光，表明它表達(dá)有光敏蛋白。根據(jù)嗅球熒光圖像，加工制作固定光纖探頭、電極的過渡板，如圖2所示，厚度 l-2mm，大的圓環(huán)表示此處為通孔，用于埋置電極，直徑小于0. 5mm，小的圓環(huán)表示此處為通 孔，用于埋置光纖探頭，直徑小于0. 2mm。這樣設(shè)計的目的是為精確定位光纖探頭，特別是當(dāng) 光纖探頭數(shù)量多的時候，可消除安裝帶來的干擾。利用膠水把過渡板凝固到裸露的嗅球表 面，要確保上面的通孔不被堵塞。當(dāng)小鼠經(jīng)過上述制備后，利用圖3所示的系統(tǒng)即可進行氣味仿真實驗研究。圖3是 是仿真系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖，它包括計算機1、控制單元2、光源驅(qū)動單元3、光纖耦合單元4、 傳導(dǎo)光纖5、FC/PC接頭6、光纖探頭7、記錄電極9和放大運算單元10。根據(jù)拍攝的嗅球熒光圖像，在有熒光的嗅小球位置處，插入一根或數(shù)根光纖探頭 7，用膠水把光纖探頭凝固到過渡板上，再把記錄電極9通過通孔插入到小鼠大腦皮層，并 用膠水凝固。之后在過渡板上涂上一層厚厚的膠層，使得光纖探頭、電極牢固的封裝到小鼠 的頭部。開啟氣味刺激監(jiān)控軟件，讀取嗅球熒光圖像，選擇要刺激的嗅小球、刺激模式、刺 激光功率以及刺激時間，計算機1把嗅球的位置信息進行編碼，通過控制單元2控制對應(yīng)光 纖探頭的光源驅(qū)動電路3工作，在光纖耦合單元4把光耦合到傳導(dǎo)光纖5內(nèi)，傳導(dǎo)光纖5的 另一端通過FC/PC接口 6與光纖探頭7的另一端連接，從而光纖探頭有光輸出，照射到小鼠 8的選定嗅小球上。由于這些嗅小球表達(dá)有光敏蛋白，光刺激會誘導(dǎo)出動作電位，借助記錄 電極9可以把小鼠嗅覺活動電信號傳輸?shù)椒糯筮\算單元10中，進而通過控制單元2，輸入到計算機進行顯示、保存及后續(xù)處理。根據(jù)ChR2光譜特征，光纖耦合單元4中應(yīng)選用藍(lán)色光源，可選用473nm波長的激 光器，用透鏡或物鏡匯聚激光光束，用微型調(diào)節(jié)架調(diào)節(jié)光纖端面到透鏡的角度、距離等參 數(shù)，如圖4所示。這種耦合方式往往需要調(diào)節(jié)架，使得系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，另外耦合效率也有限。 特別是當(dāng)需要用幾根光纖探頭刺激不同嗅小球時，往往需要采用大功率的激光器，并利用 分光器件把激光器輸出的激光分到不同的光纖探頭中。為了調(diào)節(jié)每一光纖的輸出功率，則 每一光纖耦合前需要添設(shè)功率調(diào)節(jié)器件，如聲光調(diào)制器(Α0Μ)，這樣系統(tǒng)龐大，成本增加。另一種可選擇的光源是發(fā)光二極管(LED)，它具有啟動快(μ8級別)體積小、 壽命長、驅(qū)動電壓低、成本廉價等優(yōu)點。相對激光器，LED的發(fā)射角較大，采用透鏡或 物鏡直接耦合效率較低，采用直接耦合是一種比較實際的耦合方式，如圖5所示。通 過微型調(diào)節(jié)架調(diào)節(jié)光纖到LED發(fā)光材料的距離，使的得光纖輸出功率最大，即最佳耦 合位置，用凝固膠敷在上面，使二者成為一體。由于刺激光敏蛋白的功率應(yīng)不低于1 Τ/稱挑2，因此要采用高強度發(fā)光二極管。另外，為保證每個LED亮度、色度的一致性，其 驅(qū)動電路要考慮恒流設(shè)計，以及過流、過壓、散熱的設(shè)計，具體如圖6所示。 另外，采用藍(lán)光、黃光雙色LED，可以刺激不同類型的光敏蛋白。如果神經(jīng)細(xì)胞還表 達(dá)有抑制性光敏蛋白如NpHR，它對黃光(589nm最大響應(yīng)波長)敏感，黃光可以使其膜通道 打開，進而引起細(xì)胞其它通道打開，使氯離子進入細(xì)胞膜而超極化，從而抑制細(xì)胞的活性。 這樣系統(tǒng)即可興奮細(xì)胞，也可抑制細(xì)胞，因此可更全面的研究嗅覺系統(tǒng)。光纖探頭用光纖加工制作，具有多種不同結(jié)構(gòu)，如圖7所示。利用光纖切割刀直接 切割光纖可制作端窗型光纖探頭，這是最常規(guī)的用法，但由于市場只有幾種通用尺寸規(guī)格 的光纖，只能獲得固定尺寸的光纖探頭。為獲得不同尺寸大小的光纖探頭，可用化學(xué)腐蝕、 機械拉制方法獲得不同尺寸的錐形光纖探頭。也可采用光學(xué)微加工，在光纖端面制作出微 透鏡，得到聚焦型光纖探頭。為了更加局部的激活嗅球，也可對光纖端面采用研磨處理，得 到一定角度的角度型光纖探頭。它使出射光在研磨的斜面上發(fā)生全反射，所產(chǎn)生的倏逝場 可激活淺層的嗅小球，而不會刺激深層嗅小球。另外，采用復(fù)合型結(jié)構(gòu)可減少傳導(dǎo)光泄露， 提高倏逝場能量。系統(tǒng)具有精確仿真多個實際參數(shù)的功能，如圖8所示。通過控制光源工作時間可 以控制光刺激嗅小球時間，因此可以模仿氣味對小鼠的持續(xù)刺；采用現(xiàn)代光學(xué)和電路控制 技術(shù)，可微秒量級的開啟光源，用不同的刺激速度模仿不同傳輸速度氣味對小鼠的刺激；光 纖探頭采用多模或單模光纖制作，尺寸小，可以局部的刺激特定嗅小球，采用不同組合的光 纖探頭刺激不同嗅小球，可以模仿不同方向不同成分氣味的刺激；通過光源調(diào)節(jié)裝置改變 光纖探頭輸出功率，可模擬不同濃度氣體對小鼠的刺激響應(yīng)；應(yīng)用軟件可產(chǎn)生不同波形、不 同頻率、不同占空比的光輸出，可模仿不同條件下的氣味刺激。系統(tǒng)不僅可方便地以多種形式的刺激模仿真實氣味對小鼠的刺激，還可借助電極 記錄的電信號、小鼠的行為或功能性磁共振成像結(jié)果，結(jié)合刺激模式，開展小鼠嗅覺工作機 理的研究，具體如下
閾值測量研究，如圖9所示，1-6號環(huán)形圓表示的表達(dá)有光敏蛋白的嗅小球，L1、L2、L3、 RU R2、R3分別表示所對應(yīng)連接的光纖探頭。不斷增加光纖探頭Ll輸出光強，觀察小鼠行為，是否存在某一設(shè)定值A(chǔ)，小鼠有聞到氣味的行為表現(xiàn)。再分別改變光強刺激其它嗅小 球，是否也存在這樣一個強度閾值，它們之間是否存在一致性。另外，固定刺激光強in，不斷
減少刺激時間，是否存在一個時間值，小鼠不再有反應(yīng)，證明是否存在一個時間閾值?？煽啃匝芯?，如圖9所示，用一定的光強刺激小鼠有響應(yīng)，如果把光強均分到2個、 3個或更多個嗅小球，如1-6號嗅小球，小鼠的行為反應(yīng)是否與刺激單個嗅小球Ll存在一致 性。從而可以證明單個強的信號可靠，還是多個弱的信號可靠。信息編碼研究，由于相同嗅覺受體的神經(jīng)元都投射到同一個嗅小球，同一種氣味 可以與不同嗅覺受體結(jié)合，因此對于同一種氣味刺激，會有一個或多個嗅小球參與編碼。如
圖9所示，假如1-6號嗅小球是同一氣味引起反應(yīng)的嗅小球，則分別采用C61、C16、C36、Q4、
C|、C66組合選取嗅小球用于光刺激，分析記錄的電信號及其行為反應(yīng)，可用于分析這些嗅 小球編碼機理。信息整合研究，如圖9所示，分別選取左右半球上的嗅小球Ll和R1，利用圖10所 示的刺激模式，采用同步及不同時間延遲的刺激這兩個嗅小球，以及不同光強同時刺激這 兩個嗅小球，如圖11所示，分析研究嗅覺系統(tǒng)信息整合的機理。方向性研究，假如圖9所示的嗅小球Ll和Rl分別與小鼠左右鼻腔的嗅感神經(jīng)元 連接，用不同時間延遲的光刺激這兩個嗅小球，可以分析小鼠嗅覺系統(tǒng)是否存在方向性。對稱性研究，研究證明同一氣味刺激會引起嗅覺左半右半球的內(nèi)測、外側(cè)的四個 嗅小球做出響應(yīng)，即對應(yīng)一種氣味刺激小鼠嗅覺會有4個響應(yīng)位置，且這四個響應(yīng)位置之 間是相互制約的。假如圖1灰色圓環(huán)所示為相應(yīng)的4個嗅小球，采用不同模式的刺激，可以 揭示嗅覺系統(tǒng)的編碼機制以及信號是如何整合、傳遞的。以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實施例和附圖所 公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保 護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，包括依次擺放的計算機、控制單元、光源驅(qū)動單元、光纖耦合單元、傳導(dǎo)光纖、光纖探頭、記 錄電極和放大運算單元；所述計算機把仿真參數(shù)通過總線輸入到所述控制單元，所述控制單元根據(jù)輸入?yún)?shù)控 制所述光源驅(qū)動單元產(chǎn)生特定要求的輸出光，所述光纖耦合單元把輸出光耦合到傳導(dǎo)光纖 內(nèi)，傳導(dǎo)光纖的另一端連接光纖探頭，光纖探頭有光輸出，照射到動物的選定嗅小球上；所述嗅小球在光刺激下誘導(dǎo)出嗅覺活動電信號，所述記錄電極采集該嗅覺活動電信號 并傳輸?shù)剿龇糯筮\算單元中，進而通過控制單元輸入到所述計算機進行顯示、保存和處 理。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于所述光纖探頭、記錄電極的固 定通過過渡板實現(xiàn)，用于精確定位，以及消除多個光纖探頭安裝帶來的干擾；所述過渡板在有熒光的嗅小球位置處，以其中心加工直徑不超過0. 2mm的通孔；所述光纖探頭在所述通孔內(nèi)通過折射率匹配的膠水凝固，既保證不損傷嗅覺系統(tǒng)，也 不影響光的穿透。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，所述光纖探頭用單模 或多模光纖制作，加工成端窗型、錐形、聚焦型、角度型、復(fù)合型結(jié)構(gòu)光纖探頭，分別獲得不 同形狀、不同尺寸的出射光斑來刺激嗅小球；其中，角度型、復(fù)合型結(jié)構(gòu)光纖探頭能減少傳導(dǎo)光的泄露，實現(xiàn)數(shù)十納米的照射嗅小球。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，所述光源驅(qū)動單元包括 選多個高強度LED光源，該高強度LED光源的輸出刺激不同嗅小球。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，所述LED光源包括藍(lán)光、 黃光雙色LED，分別用于表達(dá)興奮型和抑制性的光敏蛋白細(xì)胞的刺激。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，所述LED與傳導(dǎo)光纖的耦 合采用直接耦合方式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，所述計算機的仿真參數(shù) 包括刺激時間精度、空間精度、刺激強度，其中時間、強度參數(shù)能夠連續(xù)調(diào)節(jié)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光基因氣味仿真系統(tǒng)，其特征在于，所述光源驅(qū)動單元在所 述計算機控制下，輸出不同波形、頻率和脈寬的光波，用于研究嗅覺系統(tǒng)對各種氣味刺激的 編碼和識別，以及信號在嗅覺系統(tǒng)中加工、整合及傳遞規(guī)律。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的氣味仿真系統(tǒng)，包括計算機把仿真參數(shù)通過總線輸入到所述控制單元，控制單元根據(jù)輸入?yún)?shù)控制光源驅(qū)動單元產(chǎn)生特定模式輸出光，光纖耦合單元把輸出光耦合到光纖探頭，光纖探頭有光輸出并照射到選定嗅小球上，嗅小球在光刺激下誘導(dǎo)出嗅覺活動電信號，記錄電極采集該嗅覺活動電信號并傳輸?shù)椒糯筮\算單元中，進而通過控制單元輸入到計算機進行顯示、保存和處理。本發(fā)明通過對表達(dá)有不同類型光敏蛋白的嗅小球進行不同模式的光刺激，并記錄和分析嗅小球的電生理信號和行為表現(xiàn)，研究嗅覺系統(tǒng)對各種各樣氣味刺激的編碼和識別，以及信號在嗅覺系統(tǒng)中加工、整合及傳遞的規(guī)律，來揭示嗅覺系統(tǒng)的工作機理。
文檔編號A61B5/00GK102106722SQ20111004757
公開日2011年6月29日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者劉亞豐, 呂曉華, 曾紹群 申請人:華中科技大學(xué)