專利名稱：用于免疫接種水禽物種的重組禽皰疹病毒載體和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及免疫學(xué)和疫苗技術(shù)領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用于水禽免疫接種的疫苗，所述疫苗基于活的重組馬立克氏病病毒(在后文中稱為rMDV)、更具體為火雞重組皰疹病毒(在后文中稱為rHVT病毒)，其包含編碼并表達(dá)水禽病原體的抗原性肽的至少一種核苷酸序列。還提供了免疫接種的方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病病毒(MDV)是雞的常見淋巴細(xì)胞增生性疾病——馬立克氏病的病原體。在世界范圍內(nèi)，馬立克氏病(MD)是雞群中高度接觸傳染的疾病。已經(jīng)鑒定到馬立克氏病病毒(MDV)是MD的病原體。MDV在雞中感染法氏囊來(lái)源和胸腺來(lái)源的淋巴細(xì)胞，并可能隨后誘導(dǎo)胸腺來(lái)源淋巴細(xì)胞的淋巴瘤。MDV是一類禽皰疹病毒的名稱。例如，MDV(MDVl)是雞中的皰疹病毒強(qiáng)毒株，SB-I (MDV2)是雞中天然減毒的皰疹病毒毒株，HVT(MDV3)是通常在火雞中發(fā)現(xiàn)的非致病性皰疹病毒。對(duì)于宿主范圍來(lái)說(shuō)，只報(bào)道了雞和火雞被MDV和HVT自然感染。而到目前為止，發(fā)現(xiàn)其他鳥類對(duì)疾病或感染具有抵抗力。許多水禽鳥類例如鴨和鵝，由于被飼養(yǎng)以獲取肉、蛋和羽毛，在經(jīng)濟(jì)上是重要的。 因此，對(duì)這些鳥類進(jìn)行針對(duì)常見病原體的免疫接種，是提高這些家禽的質(zhì)量的必要條件。此外，作為所有已知甲型流感病毒的天然宿主的野生水禽，是在家禽中引起高致命性疾病散在爆發(fā)的病毒的來(lái)源。最近在家禽中出現(xiàn)并隨后在東南亞向人類傳播的高致病性禽流感 (HPAI)毒株，其在家禽中的頻繁爆發(fā)導(dǎo)致數(shù)以億計(jì)動(dòng)物的破壞，已經(jīng)引起了關(guān)于致命疾病可能大流行蔓延的顧慮。為了限制病原體的這種傳播，重要的是對(duì)天然宿主即水禽進(jìn)行免疫接種。本申請(qǐng)人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，馬立克氏病病毒(MDV)能夠感染水禽物種，并能以潛伏感染或持續(xù)感染的狀態(tài)在被感染的水禽宿主中復(fù)制、維持和存活，從而提供了有效的免疫接種手段。因此，本發(fā)明的疫苗能夠?qū)崿F(xiàn)水禽的有效免疫接種，并具有優(yōu)越的免疫接種性質(zhì)， 因?yàn)樗鼈兡軌蛞鸨幻庖咚菟拗鞯拈L(zhǎng)期持續(xù)的免疫。因此，有利情況下，通過(guò)給藥其中插入了外來(lái)抗原基因的重組HVT或MDV，為水禽宿主提供了足夠的免疫接種效果。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的重組馬立克氏病病毒(rMDV)，具體為火雞重組皰疹病毒(rHVT)，其包含引入到病毒基因組中的一種或多種異源或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列能夠在水禽物種細(xì)胞中編碼并表達(dá)病原體的至少一種抗原性肽，并且還能夠誘導(dǎo)針對(duì)在水禽中引起感染的病原體的穩(wěn)定并長(zhǎng)期持續(xù)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及用于對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的疫苗，所述疫苗包含免疫接種有效量的rHVT或rMDV，其任選用溶劑、穩(wěn)定劑、佐劑、稀釋劑、防腐劑和其他賦形劑配制。本發(fā)明還涉及對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的方法和免疫接種試劑盒。附圖簡(jiǎn)述
圖IHVT特異性PCR的結(jié)果(樣品在免疫接種后4周收集)。使用的縮寫CA_用細(xì)胞結(jié)合的HVT疫苗免疫接種的鴨；FD-用冷凍干燥的HVT疫苗免疫接種的鴨。樣品被鑒定為疫苗縮寫/取樣器官。圖2A-2D對(duì)應(yīng)于同源質(zhì)粒p45CMVH5HUNMod4999的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。圖3A顯示了火雞皰疹病毒(HVT)基因組的示意圖，并標(biāo)出了長(zhǎng)獨(dú)特序列(Unique Long) (UL)44、UL 45和UL 46基因的位置。供體基因被插入到HVT基因組中UL 45與UL 46之間通過(guò)PCR產(chǎn)生的Sf i I位點(diǎn)中。圖3B顯示了 UL 44的一部分、完整UL 45、和UL 46的一部分，其可以在HVT基因組的1. 9千堿基(kb)的EcoRV-XhoI片段上分離到。加框部分顯示了在Southern印跡中，被設(shè)計(jì)與插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列結(jié)合的探針(插入位點(diǎn)探針或45/46探針)與1.0-kb PvuI-PvuI 片段退火的位置。圖3C顯示了分離插入位點(diǎn)序列的策略。圖4A顯示了在由8個(gè)單鏈負(fù)股RNA區(qū)段構(gòu)成的禽流感病毒H5亞型基因組中分離紅細(xì)胞凝集素(HA)基因。還顯示了從每個(gè)區(qū)段表達(dá)的蛋白和這些蛋白的功能。圖4B顯示了使用分別向5’和3’末端添加BamHI和SalI限制性酶位點(diǎn)的正向引物和反向引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶_聚合酶鏈反應(yīng)從禽流感病毒RNA基因組擴(kuò)增的HA基因。HA 基因的切割位點(diǎn)被改變成低致病性禽流感病毒毒株的典型的切割位點(diǎn)序列。切割位點(diǎn)的修飾通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。圖5顯示了中間質(zhì)粒pGICMVpA的構(gòu)建。將巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子)和SV40 polyA信號(hào)序列插入到pUC18載體中。圖6顯示了同源質(zhì)粒p45CMVH5HU匪od4999的構(gòu)建。圖7顯示了受調(diào)控的禽流感_馬立克氏病疫苗H5亞型血清型3型活馬立克氏病載體的制備。圖8顯示了受調(diào)控的禽流感_馬立克氏病疫苗H5亞型血清型3型活馬立克氏病載體的生產(chǎn)。圖9顯示了當(dāng)用H5m高致病性禽流感病毒進(jìn)化枝2A/DuCk/Hungary/l 180/2006 激惹時(shí)，從重組rHVT-AI/H5疫苗在番鴨中與未免疫接種的對(duì)照鳥類相比的效能測(cè)試獲得的對(duì)比結(jié)果。^JL在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“重組”是指重組DNA技術(shù)，也稱基因克隆或分子克隆，是指將 DNA從一種生物體轉(zhuǎn)移到另一種生物體的技術(shù)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“火雞重組皰疹病毒”(rHVT)和/或“重組馬立克氏病病毒”(rMDV) 是指現(xiàn)有的火雞皰疹病毒，其基因組已通過(guò)插入至少一種異源核酸序列進(jìn)行修飾，所述異源核酸序列是指對(duì)應(yīng)于與HVT或MDV中天然存在的基因的核酸序列不一致的基因或其一部分的DNA?？蛇x地，rHVT或rMDV可以通過(guò)在病毒基因組中引入同源核酸序列進(jìn)行遺傳修飾，所述同源核酸序列是指對(duì)應(yīng)于與HVT或MDV中天然存在的基因同一的基因或其一部分的DNA。應(yīng)該理解，得到的重組HVT (rHVT)和/或重組MDV (rMDV)可以通過(guò)各種方法來(lái)制造，并且一旦制成后，可以不使用其他重組DNA技術(shù)來(lái)繁殖。因此，“火雞重組皰疹病毒”的結(jié)構(gòu)根據(jù)DNA插入片段來(lái)描述。根據(jù)本發(fā)明，“水禽”物種打算是指適應(yīng)于游泳、漂浮在水表面上并且在某些情況下在淺水中潛泳的鳥類。更準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)，水禽物種包含雁形目鴨科的鳥類，例如鴨、鵝和天鵝， 并屬于鴨亞科、雁亞科、斑鴨亞科、麻鴨亞科或樹鴨亞科。例如，雁形目包含約170種鳥類物種，分成三個(gè)科叫鴨科(叫鴨)、鵲雁科(鵲鵝)和包括超過(guò)160種水禽的鴨科。該目中的所有物種都高度適應(yīng)于在水表面處的水棲生活方式。全都在腳趾間有蹼，用于高效游泳 (盡管一些物種隨后已變成主要陸生)。本發(fā)明的范圍被擴(kuò)展到這些寬泛的科下所覆蓋的所有鳥類。術(shù)語(yǔ)“佐劑”被定義為引起免疫系統(tǒng)刺激的一種或多種物質(zhì)。佐劑是非特異性增加對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答，從而減少在任何給定疫苗中所需的抗原量和/或?yàn)榱水a(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)抗原的足夠的免疫應(yīng)答所需的給藥頻率的藥劑。在本文中，佐劑被用于增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的疫苗的免疫應(yīng)答。佐劑可以在疫苗給藥之前、與疫苗聯(lián)合或在疫苗給藥之后給藥于目標(biāo)動(dòng)物。當(dāng)在本文中使用時(shí)，單詞“致病的”是指由疾病或病害的生物因子對(duì)其宿主、在本發(fā)明的情況下具體為水禽宿主造成的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“非翻譯區(qū)”是指不具有ORF或不定義通過(guò)翻譯進(jìn)行表達(dá)的蛋白的氨基酸序列的核苷酸區(qū)域，以及其中ORF不參與任何轉(zhuǎn)錄、翻譯或蛋白表達(dá)的核苷酸區(qū)域。該區(qū)域中包含的核苷酸序列可能是具有堿基取代、缺失或添加的核苷酸序列，除非它們包含0RF。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明提供了用于免疫接種水禽物種的重組馬立克氏病病毒(rMDV)、具體為火雞重組皰疹病毒(rHVT)，其包含插入到病毒基因組中，能夠編碼并在水禽物種細(xì)胞中表達(dá)病原體的至少一種抗原性肽，并且還能在水禽中誘導(dǎo)針對(duì)引起感染的病原體的穩(wěn)定和長(zhǎng)期持續(xù)的免疫應(yīng)答的一種或多種異源或同源的核苷酸序列。只要對(duì)水禽是非致病的，任何馬立克氏病病毒(MDV)(例如血清型1、2、3型、 CVI988、SB1等)或具體的火雞皰疹病毒(HVT)都可以使用在本發(fā)明中。因此，用于本發(fā)明的MDV和HVT可以包括但不限于天然存在的或可以從保藏中心例如ATCC、CNCM等獲得的， 例如 FC126 (ATCC VR-584B)、PB-THVU H_2、YT-7、WTHV-I 或 EPRS-26 毒株適合用作骨架病毒。其中，由于在禽類中使用安全，F(xiàn)C126最優(yōu)選用于本發(fā)明中。用于插入到HVT或MDV基因組中的目標(biāo)基因，可以是從能夠在水禽物種中引起感染的任何致病性生物體獲得的同源或異源核苷酸序列。典型情況下，目標(biāo)基因可以源自于引起對(duì)家禽工業(yè)具有經(jīng)濟(jì)影響的疾病的病原體。目標(biāo)基因也可以源自于在水禽中維持并通過(guò)水禽宿主傳播到其他家禽和非家禽物種的病原體?；蜻€可以源自于已存在現(xiàn)有疫苗， 但是由于載體化技術(shù)的新優(yōu)勢(shì)而使源自HVT或MDV的疫苗對(duì)其更優(yōu)越的生物體。此外，目標(biāo)基因可以源自于目前還不存在針對(duì)其的疫苗，但是為了控制疾病而存在需求的病原體。 典型情況下，目標(biāo)基因編碼病原體的免疫原性肽，并且優(yōu)選為表面蛋白、分泌蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。因此，用于插入到MDV或HVT基因組中的同源或異源核苷酸序列可以是編碼水禽病原體的抗原性肽的任何序列。本發(fā)明的核酸序列可以源自于任何來(lái)源，例如病毒、原核生物、真核生物或合成來(lái)源。所述核酸序列可以源自于在插入到病毒基因組中之后能夠穩(wěn)定表達(dá)以誘導(dǎo)針對(duì)水禽疾病的免疫力的病原體，優(yōu)選為水禽物種的病原體。異源或同源核苷酸序列可以編碼例如源自下列物種的抗原性肽禽流感病毒、1 型禽副粘病毒(新城疫病毒，NDV)、禽偏肺病毒、馬立克氏病病毒、禽腎病病毒(傳染性法氏囊病病毒IBDV)、鵝和番鴨細(xì)小病毒、鴨病毒性腸炎皰疹病毒、鵝皰疹病毒、鴨甲型、乙型和丙型肝炎病毒、鵝出血性多瘤病毒、鴨和鵝腺病毒、鵝和鴨圓環(huán)病毒、西尼羅病毒、鵝和番鴨呼腸孤病毒、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)物種、多殺巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer)、鼻氣管 Hflii (Ornithobacterium rhinotracheale) ^Χ^^^Ι .' Φ (Mycoplasma gallisepticum)、 雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae)、感染水禽物種的支原體微生物或球蟲。在第一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的異源或同源核苷酸序列可以是例如流感病毒的表面蛋白紅細(xì)胞凝集素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)、馬立克氏病病毒的蛋白、特別是gB、gC、 gD、gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鵝和番鴨細(xì)小病毒的VP1、VP2和/ 或VP3蛋白、鵝和番鴨呼腸孤病毒的任何結(jié)構(gòu)蛋白、鵝出血性多瘤病毒的VPl蛋白、鵝和番鴨病毒性腸炎皰疹病毒的抗原、鴨和鵝腺病毒的抗原、圓環(huán)病毒的衣殼蛋白或IBDV的VP2 蛋白。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，這樣的異源或同源核苷酸可以編碼US6，936，707中所述的未糖基化的NXB氨基酸序列，其中N是天冬酰胺，X是脯氨酸之外的任何氨基酸，B是蘇氨酸，并且其能夠表現(xiàn)出高免疫原性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，異源或同源核苷酸序列也可以是融合蛋白，其包含具有雞毒支原體的抗原性的肽和源自于皰疹病毒外膜蛋白的肽，如US 7, 348, 422中所述。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，rHVT或rMDV還可以包含第二個(gè)異源核苷酸序列，其編碼第二種抗原或免疫調(diào)節(jié)劑例如淋巴因子、干擾素或禽類細(xì)胞因子。為了構(gòu)建本發(fā)明的重組MDV或HVT病毒，首先將上述病毒在適合的宿主細(xì)胞中繁殖，然后獲得基因組DNA。用于繁殖病毒的宿主和條件根據(jù)需要來(lái)選擇。作為宿主細(xì)胞，源自于雞的細(xì)胞是優(yōu)選的，并且可以使用CEF(雞胚成纖維細(xì)胞)、雞腎細(xì)胞等。它可以在培養(yǎng)基例如 Eagle' s MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1 1 混合物)培養(yǎng)基中，在約 37°CT 培養(yǎng)3至4天。按照常規(guī)方法從如上培養(yǎng)的病毒感染的細(xì)胞中提取DNA。因此，將單層生長(zhǎng)的細(xì)胞刮下，然后離心以收獲上清液。在將蛋白在裂解緩沖液中變性并移除后，使用苯酚和乙醇提取 DNA。基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建對(duì)于本領(lǐng)域的普通專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是公知的，并可以基本上通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Molecular Cloning A Laboratory Manual.)第三片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Woodbury, N. Y. 2001)。用于插入到病毒中的序列可以源自于任何適合的質(zhì)粒、粘?；蚴删w，質(zhì)粒是最優(yōu)選的，并且含有至少一種異源或同源核酸序列，其如果需要，與啟動(dòng)子可操作連接。所使用的啟動(dòng)子可以是合成或天然的、內(nèi)源或異源的啟動(dòng)子，對(duì)此沒有限制，只要它能夠在用rHVT或rMDV感染的水禽細(xì)胞中有效發(fā)揮作用即可。因此，啟動(dòng)子的選擇擴(kuò)展到被重組HVT或MDV感染的水禽細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的任何真核、原核或病毒啟動(dòng)子?？梢允褂酶鞣N啟動(dòng)子，例如雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、US 6，866，852中所述的修改的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、CMV(巨細(xì)胞病毒)立即早期啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、假狂犬病病毒立即早期啟動(dòng)子(PRV IE)、胸苷激酶(TK)或糖蛋白X(gX)啟動(dòng)子、單純性皰疹病毒α-4啟動(dòng)子、 馬立克氏病病毒的gB蛋白啟動(dòng)子、源自于RSV病毒(勞斯肉瘤病毒)LTR序列的啟動(dòng)子和 MDV或HVT啟動(dòng)子例如gB、gC、TK、RR2的啟動(dòng)子，或其保留啟動(dòng)子活性的任何片段。在所提到的啟動(dòng)子中，優(yōu)選的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，例如已顯示出一定程度的效能的雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、CMV(巨細(xì)胞病毒)立即早期啟動(dòng)子和SV40早期啟動(dòng)子，以及屬于馬立克氏病病毒、特別是血清型3型的一些基因的啟動(dòng)子。因此，編碼所述水禽疾病的目標(biāo)抗原的同源或異源核苷酸序列，可以與上述啟動(dòng)子可操作連接，并進(jìn)一步插入到病毒基因組的插入?yún)^(qū)中。插入?yún)^(qū)具體來(lái)說(shuō)被理解為是指對(duì)于基因間區(qū)域來(lái)說(shuō)沒有缺失或具有幾個(gè)堿基缺失，并且對(duì)于ORF來(lái)說(shuō)具有完全或部分缺失或沒有缺失的插入?？梢詫⑼椿虍愒春塑账岷蛦?dòng)子序列插入到例如TK區(qū)域中，如Ross L.等Gen. Virol. ,74:371-377(1993)所述。優(yōu)選情況下，將核苷酸和啟動(dòng)子序列插入到病毒基因組的非翻譯區(qū)中。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)基因組DNA的非翻譯區(qū)進(jìn)行鑒定，然后將上述的同源或異源核苷酸序列插入到區(qū)域中。插入位點(diǎn)的實(shí)例選自UL44與UL45之間、UL45與UL46之間、UL41與UL42之間、 UL40與UL41之間、位于gB基因下游的區(qū)域、UL53與UL54之間或UL36與UL37之間。在第 16 寸mi (Proceedings of the 16th Herpes Virus Workshop) (1991 年7月7-12日在美國(guó)加利福尼亞的Pacific Grove舉辦)中，它們被描述用于HSV-1。其中，由于同源性，優(yōu)選的位點(diǎn)在UL45與UL46之間和位于gB基因下游的區(qū)域中，更優(yōu)選在 UL45與UL46之間。將所述核酸序列和啟動(dòng)子導(dǎo)入到基因組HVT或MDV DNA片段中，所述片段含有亞克隆在重組DNA分子中的本文中所定義的插入?yún)^(qū)序列。位于異源或同源核酸序列兩側(cè)的插入?yún)^(qū)序列一般具有適合的長(zhǎng)度，以允許與病毒基因組進(jìn)行體內(nèi)同源重組。如果需要，可以制造含有例如源自于相同或不同病原體的兩個(gè)或多個(gè)不同異源或同源核酸序列的構(gòu)建物，所述序列兩側(cè)帶有本文中所定義的HVT或MDV的插入?yún)^(qū)序列。這樣的重組DNA分子可用于生產(chǎn)表達(dá)兩種或多種不同抗原性肽的重組HVT或MDV，以提供多價(jià)疫苗。其次，可以在含有兩側(cè)帶有適合的HVT序列的異源或同源核酸序列的重組DNA分子存在下，將細(xì)胞用病毒DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，由此在重組DNA分子的插入?yún)^(qū)序列與HVT中的插入?yún)^(qū)序列之間發(fā)生重組。通過(guò)用含有兩側(cè)帶有適合的側(cè)翼插入?yún)^(qū)序列的異源或同源核酸序列而沒有重組DNA分子序列的核酸序列轉(zhuǎn)染被感染的細(xì)胞，也可以產(chǎn)生重組。為了在HVT或MDV的非翻譯區(qū)中插入外來(lái)基因，需要將含有非翻譯區(qū)的序列事先克隆到載體中，但是對(duì)質(zhì)粒沒有限制。例如，可以提到的質(zhì)粒是例如PBR322、pBR325、 pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8 和 pUC9,以及噬菌體例如 λ 噬菌體和 Μ13 噬菌體，和粘粒例如pHC79。將如上所述獲得的非翻譯區(qū)按照常規(guī)方法整合到這些質(zhì)粒中。為了將一種或多種異源或同源核苷酸序列插入到如上整合的非翻譯區(qū)中，可以在如上所述克隆到質(zhì)粒中的非翻譯區(qū)的特定位點(diǎn)處進(jìn)行突變，以制造新的限制性酶切割位點(diǎn)，然后將外來(lái)基因插入到位點(diǎn)中。執(zhí)行突變的方法可以是常規(guī)方法，并且可以使用本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員公知的方法例如體外誘變和PCR。因此，在PCR方法中，在PCR引物中進(jìn)行突變，例如1至2個(gè)核苷酸的缺失、取代或添加，然后將引物用于產(chǎn)生突變。將如上所述獲得的已將一種或多種異源或同源核苷酸序列插入到HVT或MDV非翻譯區(qū)中的質(zhì)粒，使用電穿孔、磷酸鈣、基于Iipofectin的方法、基因槍方法等導(dǎo)入到HVT感染的細(xì)胞中。因?yàn)閷?dǎo)入效率高，電穿孔或使用Iipofectin的方法是優(yōu)選的。當(dāng)待導(dǎo)入的質(zhì)粒的量在0. 1至1000 μ g范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞中通過(guò)HVT-DNA與質(zhì)粒的同源區(qū)之間的重組而產(chǎn)
生重組病毒的效率變高。然后在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組病毒后代，并可以使用已知的篩選技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因型或表型上的篩選，例如通過(guò)雜交，檢測(cè)與異源或同源核酸序列一起共整合的基因所編碼的酶活性，或免疫學(xué)檢測(cè)由重組HVT或MDV表達(dá)的抗原性肽?？梢詫⑺x的重組HVT或 MDV在細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模培養(yǎng)，隨后可以收集含有肽的重組HVT或MDV。為了能夠篩選rHVT或rMDV，可以將幾種標(biāo)志物整合在質(zhì)粒的非翻譯區(qū)中。這樣的酶基因的實(shí)例包括半乳糖苷酶基因。因此，通過(guò)將用整合有這種基因的病毒感染的細(xì)胞在增補(bǔ)有特定底物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，能夠篩選病毒感染的細(xì)胞。通過(guò)重復(fù)這個(gè)程序， 可以純化重組病毒。得到的本發(fā)明的重組病毒，可以在所述重組病毒能夠繁殖和生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中繁殖。在獲得所需的病毒生長(zhǎng)之后，使用刮刀或用胰蛋白酶將細(xì)胞與孔分開，并通過(guò)離心將被感染的細(xì)胞與上清液分離開。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用CEF、孵化卵、雞腎細(xì)胞等作為繁殖 rHVT或rMDV的宿主細(xì)胞?？梢詫⒈景l(fā)明的重組病毒在培養(yǎng)基例如Eagle ‘ s MEM、 Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1 1混合物)培養(yǎng)基中，在約37°C下培養(yǎng)3至4天。將由此獲得的被感染細(xì)胞懸浮在含有10%二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基中，并在液氮下冷凍保存。為了用作疫苗，可以在使用前將上述冷凍制品溶解在100倍體積的磷酸鹽緩沖液中。對(duì)于用于在液氮下儲(chǔ)存所述被感染細(xì)胞的穩(wěn)定劑和其他組分沒有限制，只要它們能夠允許病毒感染的細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)并且它們是可藥用的即可。本發(fā)明還提供了用于對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的疫苗，所述疫苗包含有效量的重組MDV或HVT，其在基因組中帶有編碼并在水禽物種細(xì)胞中表達(dá)至少一種上述抗原性蛋白的至少一種異源或同源核苷酸序列。本發(fā)明的重組HVT或MDV優(yōu)選可以用作活疫苗，盡管其他可選方案例如滅活疫苗或減毒疫苗也在本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。正如本申請(qǐng)人所證實(shí)的，rHVT或rMDV載體引發(fā)了針對(duì)水禽疾病的長(zhǎng)期持續(xù)的保護(hù)性免疫力。具體來(lái)說(shuō)，正如在實(shí)施例中所證實(shí)的，重組病毒載體能夠在法氏囊、脾臟、胸腺和羽囊中的水禽細(xì)胞中感染和復(fù)制。具體來(lái)說(shuō)，rHVT或rMDV具有在被免疫接種的水禽體內(nèi)以潛伏感染狀態(tài)永久存活的性質(zhì)，因此在免疫接種的水禽的整個(gè)生命期內(nèi)產(chǎn)生長(zhǎng)期持續(xù)的保護(hù)作用。本發(fā)明的重組HVT或MDV可以含有并表達(dá)一種或多種不同異源肽或蛋白，可以用作單價(jià)或多價(jià)疫苗。它們也可以與其他病毒或細(xì)菌混合，以便構(gòu)成多價(jià)免疫原性制劑或多價(jià)疫苗。病毒或細(xì)菌選自待免疫接種的水禽物種特征性的禽病原體。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及多價(jià)疫苗，其作為混合物或待混合物包含至少兩種如上所定義的活rHVT疫苗，所述疫苗包含不同的插入序列，特別是來(lái)自不同病原體的插入序列。例如，本發(fā)明的疫苗可以引入源自于一種以上水禽病原體的一種以上的抗原，例如源自于禽流感(Al)病毒和源自于新城疫病毒的抗原?；蛘撸鄡r(jià)疫苗可以包含rHVT或rMDV載體，其攜帶例如在雙向啟動(dòng)子控制之下的編碼抗原性肽或蛋白的一種以上異源或同源核苷酸序列。本發(fā)明的疫苗還可以包含適合的溶劑，例如水性緩沖液或磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選情況下，疫苗還包含佐劑。本發(fā)明的佐劑可以從多種來(lái)源的任一種獲得，包括來(lái)自天然來(lái)源、 重組來(lái)源和/或通過(guò)化學(xué)合成等。佐劑的實(shí)例包括增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的應(yīng)答的化學(xué)和多肽免疫刺激劑。這樣的佐劑可以包括例如弗氏完全佐劑或不完全佐劑、無(wú)機(jī)凝膠、鋁化合物例如氫氧化鋁、磷酸鋁和明礬；表面活性劑，例如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基雙十八烷基溴化銨、N，N-雙十八烷基-N' ,N'-雙(2-羥甲基)丙二胺、甲氧基十六基甘油和pluronic多元醇；聚陰離子，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸；肽類，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬素(tuftsin)；以及油乳液、植物和動(dòng)物油以及礦物油、油包水乳液、細(xì)菌毒素、幾丁質(zhì)衍生物和殼聚糖、聚合物、ISCOM' s (免疫刺激復(fù)合物)、維生素和礦物質(zhì)(包括但不限于維生素E、維生素A、硒和維生素B12)、Quil A (皂草苷類)、與聚烯基醚或二乙烯基二醇交聯(lián)的丙烯酸聚合物、細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁組分(例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、0-1，3/1，6-葡聚糖)、源自植物的各種復(fù)合糖類(例如聚糖、乙?；事毒厶?acemarman))、源自于動(dòng)物的各種蛋白和肽類(例如激素、細(xì)胞因子、輔助刺激因子)以及源自于病毒和其他來(lái)源的新型核酸(例如雙鏈RNA、CpG)等，其可以與疫苗一起以足以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的量給藥。本發(fā)明的優(yōu)選佐劑是殼聚糖。此外，上面提到的物質(zhì)的任何數(shù)量的組合可以提供佐劑效果，因此可以形成本發(fā)明的佐劑。本發(fā)明的疫苗還可以與一種或多種其他添加劑一起配制，以維持等滲性、生理pH 和穩(wěn)定性，例如緩沖劑如生理鹽水(0. 85%)、磷酸緩沖鹽水(PBQ、檸檬酸緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、Tris緩沖鹽水等，和/或防腐劑例如硫柳汞、福爾馬林、戊二醛，或抗生素例如新霉素或鏈霉素等。給藥方法可以由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行選擇。本發(fā)明的水禽疫苗容易通過(guò)任何途徑給藥，包括口腔、眼(例如通過(guò)滴眼液)、使用氣溶膠的眼-鼻給藥、鼻內(nèi)、泄殖腔、飼料中、飲水中、或通過(guò)噴霧、卵內(nèi)、局部或通過(guò)注射(例如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、眼框內(nèi)、眼內(nèi)、真皮內(nèi)和/或腹膜內(nèi))免疫接種。專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，疫苗組合物優(yōu)選被適合地配制以用于每種類型的給藥途徑。例如，疫苗組合物可以通過(guò)飲用水、噴霧或滴眼液給藥于孵化后的幼鳥(幾日至幾周齡)。本文中也考慮到了卵內(nèi)給藥。例如，胚胎可以在孵化前的適合時(shí)間接種。每種疫苗藥劑可以含有足以在水禽物種中弓I發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的適合劑量。這種劑量的優(yōu)化在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。每種藥劑的抗原量可以通過(guò)已知方法，使用抗原/ 抗體反應(yīng)例如通過(guò)ELISA方法來(lái)確定。用于免疫或接種水禽的程序具體來(lái)說(shuō)可以包含向水禽一次或兩次給藥。也可以提供加強(qiáng)給藥。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員具備精確確定用于每種免疫接種方案的每種疫苗的注射次數(shù)和劑量所需的能力。本發(fā)明的疫苗的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，在于通過(guò)以沒有任何副作用的非常低的劑量對(duì)小至1日齡的鳥進(jìn)行免疫接種，它們可用于確保為水禽提供針對(duì)各種疾病的完全保護(hù)。更具體來(lái)說(shuō)，疫苗在免疫接種2周后，賦予水禽物種針對(duì)傳染病激惹的至少20% 至30%的保護(hù)作用，并且在免疫接種5至6周后，賦予水禽物種針對(duì)傳染病激惹的至少 50%至60%的保護(hù)作用。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的疫苗在免疫接種5至6周后，賦予水禽物種針對(duì)傳染病激惹的高達(dá)80%至100%的保護(hù)作用。上述的針對(duì)特定病原體的主動(dòng)免疫接種方案，可以適用于在水禽物種中引發(fā)保護(hù)性免疫力。此外，已經(jīng)被特定病原體感染的水禽也可以用包含抗體的抗血清治療，所述抗體由本發(fā)明的攜帶編碼致病抗原的異源或同源基因的重組HVT或MDV引發(fā)?？梢酝ㄟ^(guò)用有效量的所述重組HVT對(duì)水禽進(jìn)行免疫接種以便引發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，來(lái)制備針對(duì)本發(fā)明的重組HVT或MDV的抗血清。然后從動(dòng)物取血，并且可以制備抗血清。因此，本發(fā)明包含了將可以通過(guò)用有效量的rHVT或rMDV對(duì)水禽進(jìn)行免疫接種并通過(guò)從水禽取血而獲得的針對(duì)rHVT 或rMDV的抗血清，用作獸藥。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，rHVT或rMDV攜帶并表達(dá)在內(nèi)源或異源啟動(dòng)子控制之下的編碼禽流感病毒的紅細(xì)胞凝集素(HA)糖蛋白的核苷酸序列。因此，這種含有編碼HA 的異源核苷酸序列的rHVT或rMDV，對(duì)于用作獸藥保護(hù)水禽對(duì)抗流感來(lái)說(shuō)特別有用。感染鳥類的流感病毒被稱為禽流感病毒或甲型流感病毒。只有甲型流感病毒感染鳥類，并且甲型流感病毒的所有已知亞型都能感染鳥類。禽流感病毒在全世界鳥類中流通。某些鳥類、特別是水禽，通過(guò)在腸道中攜帶病毒并排泄它而作為流感病毒的宿主。被感染的鳥類在唾液、鼻分泌物和糞便中排泄病毒。易感鳥類當(dāng)與來(lái)自被感染鳥類的污染的鼻、 呼吸道或糞便物質(zhì)接觸時(shí)，可以被禽流感病毒感染。糞-口傳播是鳥類之間最常見的傳播方式。最通常情況下，作為病毒宿主的野生鳥類不患病，但是它們能夠?qū)⒘鞲袀鞑ソo其他鳥類。某些甲型禽流感病毒(例如某些H5和H7毒株)感染可能在某些馴養(yǎng)鳥類物種中引起大面積疾病和死亡。馴養(yǎng)鳥類通過(guò)與被感染水禽或其他被感染家禽的直接接觸，或通過(guò)與被病毒污染的表面(例如污物或籠子)或物質(zhì)(例如水或飼料)接觸，可能被禽流感病毒感染。人、運(yùn)輸工具和其他無(wú)生命物體例如籠子，可能是流感病毒從一個(gè)農(nóng)場(chǎng)傳播到另一個(gè)農(nóng)場(chǎng)的媒介。當(dāng)發(fā)生這種情況時(shí)，可能在家禽中出現(xiàn)禽流感爆發(fā)。甲型流感病毒也能感染人類以及其他宿主，例如豬、鯨、馬、海豹等。禽流感病毒分類在正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、甲型流感病毒屬中。禽流感病毒的基因組由8區(qū)段單鏈負(fù)股RNA構(gòu)成。病毒基因組編碼10種蛋白，其中8種蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白，包括HA和神經(jīng)氨酸酶(NA)，兩種蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白。甲型流感病毒根據(jù)HA和NA 蛋白的抗原性分成不同亞型。已識(shí)別到16種HA抗原和9種NA抗原。HA被認(rèn)為是能夠在鳥類中引發(fā)保護(hù)性抗體的主要抗原。禽甲型流感病毒根據(jù)其致病性分成兩種致病型高致病性禽流感(HPAI)病毒和低致病性禽流感(LPAI)病毒。大多數(shù)禽流感病毒具有低毒力，但是幾種H5和H7亞型能夠引起導(dǎo)致高死亡率的嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病。紅細(xì)胞凝集素基因可以從禽流感病毒的任何亞型或任何毒株獲得。優(yōu)選情況下， HA基因從H5亞型的禽流感病毒獲得。更優(yōu)選情況下，HA基因從H5W亞型的禽流感病毒獲得。最優(yōu)選情況下，HA基因從流感病毒H5m(SWan/Hungary/4999/2006)毒株獲得。核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列提供在圖2C中。
或者，HA基因從禽流感病毒A/Turkey/Wi scons in/68 (H5N9)毒株獲得。來(lái)自A/Turkey/Wi scons in/68 (H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列描述在美國(guó)專利申請(qǐng) 2008/0241188中。該序列與已發(fā)表的A/Turkey/Wisconsin/68 (H5N9)毒株的HA基因的核苷酸序列(M. Garcia 等，1997，Virus Res. 51 :115-124，GenBank 登記號(hào) U79456)有幾個(gè)堿
基的差別。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在病毒基因組中啟動(dòng)子與HA基因可操作連接， 典型位于HA基因的5’區(qū)域，以控制HA基因的表達(dá)和HA蛋白的產(chǎn)生。優(yōu)選情況下，HA基因在巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子)、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(T.A.Kost等， 1983，Nucleic Acids Res. 11 :8287-8301)或修飾的雞 β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(U.S.Pat. No. 6，866，852)的控制之下。CMV啟動(dòng)子的核苷酸序列描述在文獻(xiàn)中(M. Boshart等，1985， Cell 41 :521-530,GenBank登記號(hào)K03104)?；蛘?，CMV啟動(dòng)子可以具有如US 2008/0241188 中所示的從原始序列略微修飾的序列。此外，如上所述，插入?yún)^(qū)域可以是病毒基因組中對(duì)于病毒生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)非必需的區(qū)域。 換句話說(shuō)，非必需區(qū)域可以被定義為其中修飾或插入外來(lái)基因不阻止病毒在體外或體內(nèi)成功復(fù)制的區(qū)域。已經(jīng)報(bào)道了 HVT基因組中幾個(gè)非必需區(qū)域。如上所述，HA基因和CMV啟動(dòng)子可以插入到例如但不限于UL43 (W0 89/01040)、US2 (W0 93/25665)或UL44與UL46之間的ORF間區(qū)域(W0 99/18215)中。最優(yōu)選情況下，HA基因和CMV啟動(dòng)子被插入到UL45與 UL46之間的OFR間區(qū)域中。因?yàn)镠A蛋白是禽流感病毒的保護(hù)性抗原，并且骨架HVT是活馬立克氏病疫苗，因此含有本發(fā)明的HA基因的重組HVT可以用作對(duì)抗禽流感和馬立克氏病的雙價(jià)疫苗，或作為對(duì)抗禽流感的單價(jià)疫苗。此外，本發(fā)明的疫苗可以使用在與任何重組或非重組病毒例如MDV 血清型1型或血清型2型疫苗毒株的混合物中。本發(fā)明的表達(dá)特定病原體的一種或多種不同的異源或同源肽的重組HVT或MDV以及疫苗，對(duì)于免疫接種對(duì)這些病原體易感的上述水禽物種、特別是雁形目包括鴨科的水禽物種例如鴨、鵝和天鵝，以及鴨亞科、麻鴨亞科或樹鴨亞科的水禽物種來(lái)說(shuō)，特別有用。正如在下面的實(shí)施例中所證實(shí)的，使用這樣的活載體疫苗免疫接種后，重組HVT 在被接種的宿主內(nèi)復(fù)制，在水禽細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)異源或同源肽或蛋白。然后，異源或同源免疫原性肽或蛋白引發(fā)穩(wěn)定的、長(zhǎng)期持續(xù)的免疫應(yīng)答。如果源自于特定病原體的抗原性肽或蛋白能夠刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答，那么用本發(fā)明的重組HVT接種的水禽將對(duì)隨后該病原體的感染以及MDV的感染免疫。因此，本發(fā)明的引入到HVT基因組插入?yún)^(qū)中的異源或同源核酸序列可以在體內(nèi)連續(xù)表達(dá)，提供了對(duì)病原體的穩(wěn)定、安全和長(zhǎng)期持續(xù)的免疫力。本發(fā)明還涉及上述疫苗在免疫接種水禽物種中的應(yīng)用，以及通過(guò)給藥免疫有效量的本發(fā)明的疫苗對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的方法。疫苗可以通過(guò)真皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口腔、卵內(nèi)、通過(guò)粘膜給藥或經(jīng)眼-鼻給藥，有利地給藥于水禽物種。最后，本發(fā)明涉及用于免疫接種水禽物種的免疫接種試劑盒，所述試劑盒包含有效量的如上所述的rHVT或MDV疫苗，以及用于將所述組分給藥于所述物種的工具。這樣的試劑盒可以包含裝填有本發(fā)明的rHVT或rMDV疫苗的注射裝置，以及用于真皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或卵內(nèi)注射的說(shuō)明書。可選地，試劑盒包含裝填有本發(fā)明的rHVT或rMDV疫苗的噴霧劑/氣溶膠或滴眼液裝置，以及用于眼-鼻、口腔或粘膜給藥的說(shuō)明書。
下面的實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明的說(shuō)明性方法和技術(shù)。 實(shí)施例實(shí)施例1 :HVT疫苗測(cè)試了兩種可商購(gòu)HVT (火雞皰疹病毒，MDV血清型3型)疫苗細(xì)胞結(jié)合的HVT 疫苗(Marek HVT血清型3型活病毒，Wineland)和冷凍干燥的HVT疫苗(Bio Marek HVT, Fatro)ο實(shí)施例2 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)中使用32日齡雄性鴨(無(wú)菌的，北京鴨與番鴨的屬間雜交)。將16只鴨用細(xì)胞結(jié)合疫苗免疫接種，另外16只鴨用冷凍干燥疫苗免疫接種。兩種疫苗都在第1日皮下給藥。實(shí)施例3 通過(guò)PCR檢測(cè)HVT病毒每周取樣來(lái)自每個(gè)組的四只鴨(在免疫接種后第7、14、21和觀日)。在每個(gè)日期收集法氏囊、脾臟、胸腺和羽尖樣品(羽尖只從免疫接種后第14日起收集)，并測(cè)試HVT疫苗病毒的存在。將器官樣品在無(wú)菌PBS中勻漿，以獲得10m/V%懸液。使用QIAmp DNA小提試劑盒OlIAGEN，Hilden，德國(guó))按照制造商的說(shuō)明書純化DNA。使用特異性針對(duì)HVT病毒的引物進(jìn)行PCR。按照Handberg等(Avian pathol. (2001)pp 243-249)描述的方法，擴(kuò)增505個(gè)核苷酸長(zhǎng)的US3基因區(qū)段(第4245-4227位)。PCR產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上在溴化乙錠染色后進(jìn)行分析。在所有試驗(yàn)中包含了 HVT陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。實(shí)施例4 水禽物種的預(yù)防接種從接種后第7日(內(nèi)部器官)或第14日(羽毛)起，從使用細(xì)胞結(jié)合或冷凍干燥疫苗免疫接種的所有鳥類檢測(cè)疫苗病毒。結(jié)果概述在下表中并顯示在

圖1中。表1 在用細(xì)胞結(jié)合疫苗免疫接種后的鴨的不同器官中通過(guò)PCR檢測(cè)HVT疫苗病
權(quán)利要求
1.一種用于免疫接種水禽物種的疫苗，所述疫苗包含免疫接種有效量的重組馬立克氏病病毒(rMDV)，其包含插入到病毒基因組中、編碼并在水禽物種細(xì)胞中表達(dá)至少一種抗原性肽的至少一種異源或同源的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中重組馬立克氏病病毒是血清型1型、血清型2型或血清型3 型病毒。
3.權(quán)利要求1或2的疫苗，其中重組馬立克氏病病毒是火雞重組皰疹病毒(rHVT)血清型3型。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中核苷酸序列編碼來(lái)自下列物種的抗原性肽禽流感病毒、1型禽副粘病毒(新城疫病毒，NDV)、禽偏肺病毒、馬立克氏病病毒、禽腎病病毒(傳染性法氏囊病病毒IBDV)、鵝和番鴨細(xì)小病毒、鴨病毒性腸炎皰疹病毒、鵝皰疹病毒、鴨甲型、乙型和丙型肝炎病毒、鵝出血性多瘤病毒、鴨和鵝腺病毒、鵝和鴨圓環(huán)病毒、西尼羅病毒、鵝和番鴨呼腸孤病毒、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)物種、多殺巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、鴨疫里默氏桿菌 (Riemerella anatipestifer)、鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、雞毒支原體(Mycoplasma gallis印ticum)、雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae)、能夠感染水禽物種的支原體微生物或球蟲。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中編碼抗原性肽的核苷酸序列選自禽流感病毒的表面蛋白紅細(xì)胞凝集素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)、馬立克氏病病毒的蛋白、特別是gB、gC、 gD、gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鵝和番鴨細(xì)小病毒的VP1、VP2和/ 或VP3蛋白、鵝和番鴨呼腸孤病毒的任何結(jié)構(gòu)蛋白、鵝出血性多瘤病毒的VPl蛋白、鵝和番鴨病毒性腸炎皰疹病毒的抗原、鴨和鵝腺病毒的抗原、圓環(huán)病毒的衣殼蛋白、鵝出血性多瘤病毒的VPl蛋白或IBDV的VP2蛋白。
6.權(quán)利要求5的rHVT或rMDV，其包含編碼流感病毒紅細(xì)胞凝集素(HA)的異源核酸序列，其用作獸藥保護(hù)水禽對(duì)抗流感。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中水禽物種屬于雁形目。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中水禽物種屬于鴨科。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中水禽物種屬于鴨亞科、雁亞科、斑鴨亞科、麻鴨亞科或樹鴨亞科。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中rMDV或rHVT還包含一種或多種其他同源或異源核苷酸序列。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中rHVT還包含編碼免疫調(diào)節(jié)劑的另一種核苷酸序列。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中免疫調(diào)節(jié)劑是淋巴因子、干擾素或禽細(xì)胞因子。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中核苷酸序列被插入到骨架病毒基因組的非編碼區(qū)或ORF之間的區(qū)域中。
14.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中核苷酸序列被插入到HVT病毒基因組的非翻譯區(qū)中。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中核苷酸序列被插入到位于UL44與UL45之間、 UL45與UL46之間、UL41與UL42之間、UL40與UL41之間的非翻譯區(qū)、位于gB基因下游、位于UL53與UL54之間或UL36與UL37之間的的區(qū)域。
16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中核苷酸序列被插入到位于病毒基因組的UL45與 UL46之間的非編碼區(qū)中。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中核苷酸序列在內(nèi)源或異源啟動(dòng)子的控制之下。
18.權(quán)利要求17的疫苗，其中啟動(dòng)子是雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子或其保留啟動(dòng)子活性的任何片段。
19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中所述被感染的細(xì)胞是水禽物種的法氏囊、脾臟、 胸腺和羽囊細(xì)胞。
20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中所述水禽物種在至少1日齡時(shí)免疫接種。
21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其通過(guò)真皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、卵內(nèi)注射、口腔給藥、粘膜給藥或經(jīng)眼_鼻給藥來(lái)給藥。
22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其還包含適合的溶劑。
23.權(quán)利要求22的疫苗，其中適合的溶劑包含水性緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
24.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其還包含佐劑。
25.權(quán)利要求24的疫苗，其中佐劑是殼聚糖。
26.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗在免疫接種2周后，賦予水禽物種針對(duì)傳染病激惹的至少20%至30%的保護(hù)作用。
27.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗在免疫接種5至6周后，賦予水禽物種針對(duì)傳染病激惹的至少50%至60%的保護(hù)作用。
28.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗在免疫接種5至6周后，賦予水禽物種針對(duì)傳染病激惹的高達(dá)80%至100%的保護(hù)作用。
29.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其是多價(jià)疫苗并包含至少兩種疫苗的混合物，所述至少兩種疫苗之一是前述權(quán)利要求任一項(xiàng)中限定的重組HVT或MDV疫苗。
30.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其是多價(jià)疫苗，并包含表達(dá)單一或不同免疫接種蛋白抗原的兩種或多種重組HVT或MDV。
31.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗在免疫接種水禽物種中的應(yīng)用。
32.權(quán)利要求31的疫苗的應(yīng)用，其中疫苗通過(guò)真皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、卵內(nèi)注射、口腔給藥、粘膜給藥或經(jīng)眼_鼻給藥來(lái)給藥于水禽物種。
33.一種針對(duì)rHVT或rMDV的抗血清，所述抗血清通過(guò)用有效量的權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)中限定的rHVT或rMDV對(duì)水禽進(jìn)行免疫接種，并在從水禽取血后回收抗血清來(lái)獲得。
34.一種對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的方法，所述方法包含向所述物種給藥免疫接種有效量的權(quán)利要求1至30任一項(xiàng)的疫苗。
35.權(quán)利要求34的對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的方法，其中給藥通過(guò)真皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、卵內(nèi)注射、口腔給藥、粘膜給藥或經(jīng)眼-鼻給藥來(lái)進(jìn)行。
36.一種用于對(duì)水禽物種進(jìn)行免疫接種的免疫接種試劑盒，所述試劑盒包含下列組分(a)有效量的權(quán)利要求1至30任一項(xiàng)的疫苗，以及(b)將所述組分給藥于所述物種的工具。
37.權(quán)利要求34的試劑盒，其包含裝填有權(quán)利要求1至30任一項(xiàng)的疫苗的注射裝置，以及用于真皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或卵內(nèi)注射的說(shuō)明書。
38.權(quán)利要求34的試劑盒，其包含裝填有權(quán)利要求1至30任一項(xiàng)的疫苗的噴霧劑、氣溶膠或滴眼液裝置，以及用于眼_鼻、口腔或粘膜給藥的說(shuō)明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于水禽免疫接種的疫苗，所述疫苗基于活的重組馬立克氏病病毒(在后文中稱為rMDV)、更具體為火雞重組皰疹病毒(在后文中稱為rHVT病毒)，其包含編碼并表達(dá)水禽病原體的抗原性肽的至少一種核苷酸序列。還提供了免疫接種的方法。
文檔編號(hào)A61K39/255GK102405058SQ201080017170
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者彥尼克·賈丁, 維爾莫斯·帕爾亞 申請(qǐng)人:法國(guó)詩(shī)華大藥廠