專利名稱：一種治療疾病的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自身免疫性疾病的治療。本發(fā)明涉及可以以低于此前已知的劑量施 用于患者的諸如人源化單克隆抗體等高效試劑。本發(fā)明對具有有效治療需要低劑量的疾 病或病癥(characteristics)的患者尤其有效。本發(fā)明設(shè)想到包含有效濃度的所述抗體的藥 物組合物及其應(yīng)用，以及采用包含所述抗體的組合物和藥物的治療方法。
自身免疫是指生物體不能將其自身構(gòu)成部分(低至亞分子水平)識別為“自 己”，這導(dǎo)致針對其自身細(xì)胞和組織的免疫反應(yīng)。任何由這種異常免疫應(yīng)答造成的疾 病都稱為自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (RA)、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性腸炎、克羅恩病、重癥肌無力(MG)、II型自 身免疫性多腺體綜合征(APS-II)、橋本甲狀腺炎(HT)、I型糖尿病(TlD)、系統(tǒng)性紅斑 狼瘡(SLE)和自身免疫性淋巴增生綜合征(ALS)。
自身免疫性疾病在T細(xì)胞識別“自身”分子(即，由宿主的細(xì)胞產(chǎn)生的分子) 并對“自身”分子產(chǎn)生反應(yīng)的時候發(fā)生。由抗原呈遞細(xì)胞(APC)加工的自體抗原的呈 遞對“自體反應(yīng)性” T細(xì)胞的激活導(dǎo)致它們的克隆擴(kuò)增并遷移到特定組織，在這樣的組 織中它們弓I發(fā)發(fā)炎和組織破壞。
一般而言，自體組織對T細(xì)胞具有耐受性，并且T細(xì)胞只對異源結(jié)構(gòu)的呈遞產(chǎn)生 反應(yīng)。中央耐受和外周耐受包括兩種機(jī)制，免疫系統(tǒng)通過所述機(jī)制阻止自體反應(yīng)性T細(xì) 胞誘導(dǎo)它們的有害功能。中央耐受通過負(fù)選擇介導(dǎo)。該過程在胸腺中在個體生成發(fā)育過 程中負(fù)責(zé)通過自身反應(yīng)性T細(xì)胞的克隆刪除來進(jìn)行消除。
外周耐受是如果中央耐受失敗并且自體反應(yīng)性細(xì)胞逃避胸腺時可以采用的備用 方式。這種耐受機(jī)制在整個生命過程中持續(xù)發(fā)生，通過免疫忽視(免疫無能)、外周刪除 和主動抑制對自體反應(yīng)性細(xì)胞進(jìn)行檢查。
作為主動抑制的一部分的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，此前也稱為“抑制細(xì) 胞”)保持外周耐受并調(diào)節(jié)自身免疫(Suri-Payer等，J Immunol. 157 1799-1805(1996)； Asano 等，J Exp.Med.184 387-396 (1996) ； Bonomo 等，J.Immunol. 154 6602-6611 (1995) ； Willerford 等，Immunity 3 521-530(1995) ； Takahashi 等，hit. ImmunoLlO 1969-1980(1998) ； Salomon 等，Immunity 12 431-440(2000) ； Read 等，J Exp.Med.192 295-302 (2000)) 通常，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制1型T輔助細(xì)胞(THl)和 TH2效應(yīng)細(xì)胞的活化和/或功能。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞頻率或功能的調(diào)節(jié)異常能夠?qū)е伦陨?免疫性疾病減弱(Baecher-Allan 等，ImmunoLReview 212 203-216(2006) ； Shevach, Annu.Rev.Immunol.18 423-449(2000) ； Salomon 等，Immunity 12 431-440(2000)； Sakaguchi 等，Immunol.Rev.182 18-32(2001))。
已經(jīng)有若干個調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞組得到表征。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞家族由2個主要亞組組 成天然產(chǎn)生的例如CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，和外周誘導(dǎo)的和 3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 而且，NK調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在人類和嚙齒類動物中已有描述(Fehervari 等，J.Clin.Investigationll4 1209-1217(2004))。
胸腺來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(天然產(chǎn)生的CD4tD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)是所涉及的 主要調(diào)節(jié)性細(xì)胞，其利用被靶向自身抗原識別以維持外周免疫內(nèi)平衡并調(diào)節(jié)自身免疫和 病原性免疫應(yīng)答的的一系列TCR。
天然產(chǎn)生的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要特征是
i)它們是CD4+T細(xì)胞并占外周CD4+T細(xì)胞的5%至10%
ii)它們在胸腺中成熟
iii)它們一般具有如下特征IL-2受體(CD25)的聯(lián)合表達(dá)、CD45分子的低分 子同工型、CD152(CTLA_4)、和轉(zhuǎn)錄因子FoxP3。
能夠最好地示例調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用的實驗是CD4+細(xì)胞的缺乏CD25+細(xì) 胞的免疫缺陷裸小鼠的重構(gòu)。CD4tD25_重構(gòu)裸小鼠發(fā)生各種器官特異性自身免疫 性疾病(如胃炎、卵巢炎、睪丸炎和甲狀腺炎)Muri-Payeret al. ； J.Immunol. 160 1212-1218(1998))。
將CD4+CD25+亞組包含在裸小鼠中可防止這些疾病的發(fā)作Makaguchi等，J Immunol. 155 1151-1164(1995))。在若干種其他由出生后3天進(jìn)行新生胸腺摘除術(shù) (d3Tx)造成的自身免疫性模型(如自身免疫性胃炎、前列腺炎、卵巢炎、腎小球腎炎、 附睪炎和甲狀腺炎)或通過CD45RBhigh，CD4+CD25T細(xì)胞的SCID小鼠重構(gòu)造成的炎性 腸病中也證明了抗器官特異性自身免疫的CD4tD25+細(xì)胞的保護(hù)價值。在小鼠中體內(nèi)施 用抗CD25抗體還誘導(dǎo)器官局部性自身免疫性疾病。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FoxP3在小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能中的重要性的發(fā)現(xiàn) 和患有IPEX綜合征(免疫調(diào)節(jié)異常、多發(fā)內(nèi)分泌病、腸下垂和X連鎖遺傳病)(類似于 CD4tD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞缺陷小鼠中見到的嚴(yán)重炎性疾病)的患者在FoxP3中具有突變的觀 察結(jié)果提供了在自身免疫動物模型(小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)和人類自身免疫性疾病之間的直 接關(guān)系 Makaguchi 等，J Immunol. 155 1151-1164(1995))。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的藥學(xué)機(jī)制尚不完全清楚。CD4tD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制多克隆 和抗原特異性T細(xì)胞活化。抑制由細(xì)胞接觸依賴性機(jī)制所介導(dǎo)，其要求通過TCR活化 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，但是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在TCR活化或促有絲分裂抗體刺激時沒有 顯示出增殖性應(yīng)答(無反應(yīng)性)Mhevach，Nature Rev.Immunol 2 389 (2002))。一旦受 到刺激，它們能夠以不依賴抗原的方式抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，并抑制B 細(xì)胞活化和克隆擴(kuò)增。
有另外的數(shù)據(jù)表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制子活性還部分地依賴于抗炎 性細(xì)胞因子如 TGF-β (Kingsley 等，J Immunol.168 108(^2002) ； Nakamura 等，JExp.Med. 194 629-644(2001)) 0 TGF-β分泌的功能重要性得到如下發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步支持 TGF-β缺陷小鼠出現(xiàn)自身免疫性疾病并且在一些模型中施用抗TGF-β的中和抗體體內(nèi) 消除了對CD4+T細(xì)胞的自身免疫性或耐受性誘導(dǎo)活性的預(yù)防作用。
在CD4+T細(xì)胞亞組中，可能存在至少兩種類型更加不同的在接觸特異性外源性 抗原后受被誘導(dǎo)的具有抑制功能的細(xì)胞(稱為“稱為適應(yīng)性或誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞”)1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CTrl)和Th3細(xì)胞。根據(jù)其細(xì)胞因子生成曲線，這些細(xì)胞類型似乎與 CD4tD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不同。然而，這些不同細(xì)胞類型之間的關(guān)系還不清楚并且作用 模式重疊。
Trl細(xì)胞在IL-10存在的情況下受到TCR的反復(fù)刺激所誘導(dǎo)，并顯示出通過生 成高水平的IL-10和適量的TGF-β來主要下調(diào)免疫應(yīng)答(Chen等，J.Immunol.171 733-744(2003))ο
ι3細(xì)胞(在口服抗原后在EAE模型中鑒定到)生成高水平的TGF-β和不同量 的IL-4和IL-10。IL-4被證明是Th3細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子(和細(xì)胞相反)(Chen等， Science 265 1237-1240(1994))。
通過使用免疫抑制性藥物抑制T細(xì)胞的功能是已經(jīng)成功用來治療自身免疫性疾 病的基本治療策略。然而，這些藥物由于它們選擇性差，誘導(dǎo)了普遍的免疫抑制，從而 不僅抑制免疫系統(tǒng)的有害功能，還抑制了免疫系統(tǒng)的有用功能。結(jié)果，可能出現(xiàn)若干種 風(fēng)險如感染、腫瘤和藥物毒性。
對于各種自身免疫性疾病，干擾T細(xì)胞功能的試劑是治療的主要部分。
使用旨在活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的用于自身免疫性疾病治療的方法如今已經(jīng)被證 明極具難度。使用競爭性Agonistic)抗CD3抗體OKT-3通過TCR活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Abramowicz 等，N EnglJ Med. 1992 Sep 3 ； 327(10) 736)或者使用超競爭性抗 CD^ 抗 體TGN 1412通過共刺激分子CD^活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞將導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群以及其他常 規(guī)T細(xì)胞的完全缺失和過量促炎細(xì)胞因子(包括IFN-Y、TNF-a、IL_I和IL_2)的全身 誘導(dǎo)和釋放，從而在人中導(dǎo)致臨床上明顯的細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS) (Suntharalingam 等，N EnglJ Med.2006 Sep 7 ； 355(10) 1018-28)。
在前2至3次注射5mg單克隆抗體OKT3后，大多數(shù)患者出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合 征，在1至2小時內(nèi)在腎移植接受者的循環(huán)中出現(xiàn)高水平的腫瘤壞死因子α、白介素2、 Y -干擾素(Abramowicz 等，Transplantation. 1989 Apr ； 47 (4) 606-8)。這種導(dǎo)致治療 窗狹窄，限制了這種抗體在自身免疫性疾病治療中的用途。
用5mg至IOmg總劑量的TGN1412 (O.lmg抗CD28/kg體重)進(jìn)行治療導(dǎo) 致系統(tǒng)性炎性應(yīng)答，在接受單靜脈內(nèi)劑量的TGN 1412后90分鐘內(nèi)出現(xiàn)多器官衰竭 (Suntharalingam 等，N Engl.J Med.2006 年 9 月 7 日；355(10) 1018-28)。
公認(rèn)的是，CD4+T細(xì)胞在引發(fā)和保持自身免疫方面起著重要作用。因此，曾提 出使用抗CD4 T細(xì)胞表面分子的單克隆抗體(mAb)尤其是抗CD4單克隆抗體作為免疫抑 制試劑。盡管很多臨床研究證實了這種方法的潛在益處，但是它們也舉出了若干種有待 解決的問題以使抗CD4單克隆抗體更加適合于用在常規(guī)的臨床實踐中。
已經(jīng)提出的CD4單克隆抗體的數(shù)種不同作用機(jī)制包括(1)CD4-MHCII相互 作用的拮抗導(dǎo)致T細(xì)胞活化的抑制，(2)由CD4的細(xì)胞表面表達(dá)下降決定的CD4受體調(diào) 控，( 在沒有T細(xì)胞受體交聯(lián)(可以抑制隨后的T細(xì)胞活化并觸發(fā)CD4 T細(xì)胞凋亡性死 亡)的情況下通過CD4受體的部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(4)Fc介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) 或抗體依賴性的細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)導(dǎo)致CD4T細(xì)胞消耗，和(5)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的 刺激。
已經(jīng)有若干種靶向T細(xì)胞的抗CD4抗體處在臨床開發(fā)中Mchulze-Koops等， J Rheumatol.25 (11) 2065-76(1998) ； Mason 等，J Rheumatol.29 (2) 220-9 (2002)； Choy 等，Rheumatology 39(10) 1139-46(2000) ； Herzyk 等，hifect Immun.69 (2) 1032-43(2001) ； Kon 等，Eur Respir J. 18 (1) 45-52(2001) ； Mourad 等，Transplantation65(5) 632-41(1998) ； Skov 等，ArchDermatol. 139 (11) 1433-9(2003) ； Jabado 等，J Immunol. 158(1) 94-103(1997))，主要針對的是CD4細(xì)胞消減，只有少數(shù)CD4抗體歸 屬于其他機(jī)制，如 TRX-1、TNX-355、IDEC-15U 0KTcdr4A。
自身免疫性疾病中的臨床應(yīng)答與常規(guī)CD4+T細(xì)胞直接在炎癥部位的CD4阻斷 (而不是外周血中CD4+T細(xì)胞的作用)有關(guān)。因此，必須使用單循環(huán)或多循環(huán)的高達(dá) IOOOmg,優(yōu)選使用單循環(huán)或多循環(huán)的高達(dá)IOmg至450mg范圍內(nèi)的高抗體濃度的劑量來 獲得臨床益處(Schulze-Koops 等，J Rheumatol.25 (11) 2065-76 (1998) ； Mason 等， JRheumatol.29 (2) 220-9(2002) ； Choy 等，Rheumatology 39 (10) 1139-46(2000)； Choy 等，Rheumatology 41 1142-1148 (2002) ； Kon 等，Eur Respir J. 18 (1) 45-52(2001) ； Skov 等，Arch Dermatol.139 (11) 1433-9(2003) ； Kuritzkes 等，JInfect Dis 2004，189 286-91(2004) ； Hepburn 等，Rheumatology 42 (1) 54-61(2003))。
在不同的自身免疫性疾病中檢測到B-F5抗體(鼠^Gl抗人CD4)。
對少數(shù)患有嚴(yán)重銀屑病的患者使用鼠B-F5抗體進(jìn)行了治療并且描述了一些積極 效果(Robinet 等，Eur J Dermatol 1996 6 141-6，和 Robinet 等，JAmAcadDermatol 1997 ； 36 582-8)。
在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，使用B-F5的日劑量進(jìn)行的安慰劑對照試驗中所觀察到 的結(jié)果沒有顯示出重大改善(Wendling 等.JRheumatol ； 25(8) 1457-61，1998)。
在多發(fā)性硬化癥(MS)患者中，在復(fù)發(fā)-緩解型患者中治療10天后觀察到一 些陽性效果，所述患者中的其中一些患者在治療后第6個月仍未復(fù)發(fā)(Racadot等，J Autoimmun, 6(6) 771-86，1993)。Rumbach 觀察到類似的效果(Mult Scler ； 1(4) 207-12， 1996)。
在嚴(yán)重克羅恩病中，連續(xù)7天接受B-F5的患者中沒有觀察到顯著的改善 (Canva-Delcambre 等，Aliment Pharmacol Ther 10 (5) 721-7，1996)。
據(jù)報道，在同種異體移植物排斥的防止中，B-F5的生物利用度不足以使其用 于同種異體移植物排斥的預(yù)防中(Dantal等，Transplantation，27; 62(10) 1502-6， 1996)。
在人類中使用單克隆抗體治療的另一個缺點是這些抗體一般獲自小鼠細(xì)胞，并 在人類接受者中引起抗小鼠應(yīng)答。這不僅導(dǎo)致治療功效低，甚至以后需要小鼠單克隆抗 體進(jìn)行更多的治療，而且還造成過敏反應(yīng)風(fēng)險增加。
從原理上來看，這種缺點可以通過使用人源化抗體來避免，所述人源化抗體通 過將小鼠單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR，其決定抗原結(jié)合的特異性)移植到人類免疫球 蛋白分子的框架區(qū)(FR)上來獲得。人源化的目的是獲得具有與CDR序列所來源的小鼠 的單克隆抗體相同的抗原結(jié)合性能并且在人類中很少產(chǎn)生免疫原性的重組抗體。
在一些情況中，用小鼠抗體中的CDR替代人類框架中的人CDR足以轉(zhuǎn)移抗原結(jié) 合性(不僅包括特異性，還包括對抗原的親和力)。然而，在很多抗體中，一些FR殘基 對抗原結(jié)合比較重要，這是因為它們在抗原抗體復(fù)合物中直接接觸抗原，或者它們影響 CDR的構(gòu)型，進(jìn)而影響其抗原結(jié)合性。
因此，在很多情況中，還需要用小鼠抗體中的一個或若干個框架殘基替代人類 相應(yīng)的FR殘基。由于取代殘基的數(shù)目必須盡可能小以防止抗小鼠反應(yīng)，所以問題是確定哪些氨基酸殘基對保持抗原結(jié)合性是關(guān)鍵的。已經(jīng)提出過用于預(yù)測更適合的取代位點的 各種方法。雖然它們提供了可以在人源化的前些步驟中有一些幫助的一般原則，但是最 終結(jié)果卻因抗體而異。因此，對于給定的抗體，非常難以預(yù)言哪些取代將提供所需的結(jié)合。

此前曾經(jīng)嘗試過小鼠B-F5的人源化，并在生成具有與親本小鼠B-F5類似的 CD4結(jié)合性能的人源化B-F5 (后文稱為hB_F5)中獲得了成功。
因此，在WO 2004/083247中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人源化抗體BT061 (人源化B_F5或簡稱 為hB_F5)可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。該專利申請公開了用于腸胃外施用O.lmg至10mg， 優(yōu)選為Img至5mg的組合物。所設(shè)想的劑量方案是對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，在10天 的周期內(nèi)，靜脈內(nèi)Img/天，并且隔日劑量為5mg。
Wijdenes等在EULAR會議(2005年6月)的摘要和海報上也描述了所述研究。 他們描述了患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的11名患者的治療，所述患者用每隔一天5mg的BT061進(jìn) 行5次靜脈輸注，并結(jié)合150mg的雙氯芬酸的治療(Wijdenes等，Abstract and poster, EULAR conference, June 2005)。
該研究中所述的抗體沒有公開為適合于較低劑量施用，并且仍然希望找到以較 低劑量進(jìn)行的治療，從而治療更多的患者。發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是治療患有自身免疫性疾病的對現(xiàn)有治療沒 有滿意應(yīng)答的患者。特別地，本發(fā)明的一個目的是找到可以以較低劑量施用于患者的自 身免疫治療，以針對不能耐受目前劑量的患者來改善治療應(yīng)答。
因此，本發(fā)明提供了一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組 合物包含藥用載體和能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物以 0.2mg至30mg的所述試劑的劑量施用于受試對象。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組 合物包含藥用載體和能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物以 0.10mg/m2至20mg/m2的所述試劑的劑量施用于受試對象。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組 合物包含藥用載體和能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物以 1 μ g/kg至500 μ g/kg的所述試劑的劑量施用于受試對象。
另外，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用載體和能夠激 活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述試劑以10 μ μ g/ml至150mg/ml的濃度存在。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，所述試劑是人源化抗CD4抗體或者其片段或衍生 物。
尤其是，本發(fā)明還提供了上文所限定的試劑在制備用于治療自身免疫性疾病的 藥物中的應(yīng)用，其中所述試劑以上文所限定的劑量施用于受試對象。本發(fā)明還提供用于 治療自身免疫性疾病的上文所限定的試劑，其中所述試劑以上文所限定的劑量施用于受試對象。
從以上劑量中可以理解的是，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，低劑量的抗體 BT061提供了對天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4tD25+Treg)的有效的特異性的激活，從 而以遠(yuǎn)低于先前使用的那些抗體(例如在W02004/083247中所公開的那些抗體)的劑量 提供了體內(nèi)臨床效果。另外，本發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，與其他T細(xì)胞相互作用抗體例如 抗CD3抗體相比，人源化抗體BT061既沒有顯著調(diào)節(jié)促炎癥細(xì)胞因子的水平也沒有誘導(dǎo) 促炎癥細(xì)胞因子的釋放。另外，所述抗體沒有引起CD4+淋巴細(xì)胞的足夠長時間的消減。
所述試劑的濃度沒有特別的限制，只要該試劑以比已知濃度低的濃度存在即 可。然而，優(yōu)選的是，所述試劑的濃度為O.lyg/ml至30mg/ml或O.lyg/ml至IOOOyg/ ml,更優(yōu)選的是lyg/ml至SOOyg/ml以及2μβ/ιη1至250μβ/ιη1。最優(yōu)選的是，所述試 劑的濃度為(約)15yg/ml、25 μ g/ml> 125yg/ml> 250 μ g/ml> 500 μ g/ml> lmg/ml、 12.5mg/ml或25mg/ml中的任意一種濃度。
施用于使用所述組合物的受試對象的劑量體積沒有特別限制，只要所述劑量體 積輸送低于已知劑量的總劑量即可，因此，由于更低水平的副作用而適用于所有患者， 尤其是適用于治療無法耐受如W02004/083247中所公開的劑量的個體。特別是，在所述 劑量體積內(nèi)所述試劑的濃度可以改變以提供在本申請中所述的需要劑量。
劑量體積因施用方法而異。優(yōu)選的是腸胃外施用。腸胃外施用的實例有肌肉內(nèi) 施用、靜脈內(nèi)施用或皮下施用。在所述組合物擬通過靜脈輸注施用的情況下，所述劑量 體積可以是0.1ml或0.5ml至500ml，優(yōu)選為15ml至25ml，通常為約20ml。在所述組合 物擬通過皮下或肌肉注射施用的情況下，所述劑量體積可以是0.1ml至3ml，優(yōu)選為0.5ml 至1.5ml，通常為約1ml。
然而，在一些實施方式中，所述組合物可以以濃縮形式提供，并稀釋到所涉及 的個體所需要的濃度。優(yōu)選的是，在這些情況中，所述組合物以約lml、2ml、3ml、4ml 或5ml的相對較小體積提供。在替代性的實施方式中，所述組合物以上述的所需要的濃 度和劑量體積提供(即，即用)。在一個具體的實施方式中，用于皮下施用的藥物組合物 以不需要稀釋的即用形式提供，因此它們可以易于由非醫(yī)療人員施用。
如上所述，此前未知的是，能夠治療自身免疫性疾病的試劑可以以本發(fā)明所設(shè) 想的低劑量施用。雖然能夠治療自身免疫性疾病的試劑的已知劑量在一些個體或疾病類 型中有效，但是以低得多的劑量就可以有效實現(xiàn)則開創(chuàng)了對一些自身免疫性疾病和患者 類型進(jìn)行更為有效的治療的方法。


參考以下附圖，僅通過舉例方式來說明本發(fā)明，其中
圖1示出了與人外周淋巴細(xì)胞結(jié)合的BT061的劑量依賴性。稀釋系列的BT061 的結(jié)合用熒光染料標(biāo)記的抗人:tgG抗體進(jìn)行檢測。平均熒光強(qiáng)度通過流式細(xì)胞分析進(jìn)行 測定。
圖2示出了通過結(jié)合陽性和陰性選擇步驟進(jìn)行的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和 CD4+CD25"效應(yīng)細(xì)胞的純化方案。
圖3示出編碼小鼠B_F5Vh區(qū)的核苷酸序列6EQ ID No 5)。
圖4示出編碼小鼠B_F5Vk區(qū)的核苷酸序列6EQ ID No 6)。
圖5示 出編碼人源化B-F5的Vh區(qū)的質(zhì)粒片段的核苷酸序列(SEQ IDNo : 3)。編 碼V區(qū)的序列帶有下劃線，在核苷酸序列下方示出相應(yīng)的多肽序列(SEQ ID No: 17)。圖6示出編碼人源化B-F5的Vk區(qū)的質(zhì)粒片段的核苷酸序列(SEQ IDNo 4)。 編碼V區(qū)的序列帶有下劃線，在核苷酸序列下方示出相應(yīng)的多肽序列(SEQ ID No: 2)。圖7示出了來自在不同抗CD4mAb (單克隆抗體)存在/不存在的情況下，在放 射性PBMC(供體A)存在下培養(yǎng)的新分離的CD25+Treg(供體A)和CD8+T細(xì)胞(供體 B)的數(shù)據(jù)。同種異體反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的增殖在通過添加37kBq/孔的3H-Tdr培養(yǎng)4 天后進(jìn)行測定。示出了 Cpm(3次重復(fù))的平均值。圖8A至H部分提供了顯示來自如在實施例3所述的劑量組I的銀屑病患者的臨 床試驗的數(shù)據(jù)的圖，其中患者用0.5mg的BT061靜脈內(nèi)注射液或安慰劑進(jìn)行處理。圖8 的部分A至H分別提供了劑量組I的患者1至8的PASI評分的圖。圖9A至H部分提供了顯示來自如在實施例3所述的劑量組II的銀屑病患者的臨 床試驗的數(shù)據(jù)的圖，其中患者用2.5mg的BT061靜脈內(nèi)注射液或安慰劑進(jìn)行處理。圖9 的部分A至H分別提供了劑量組II的患者1至8的PASI評分的圖。圖IOA和IOB分別示出在健康志愿者中用BT061(單靜脈輸注或皮下注射) 的臨床試驗中所觀察到的TFNa和IL-6釋放(與抗CD3單克隆抗體所報道的水平比 較)。圖中包括劑量水平和恢復(fù)的時間。TRX4的結(jié)果在圖中標(biāo)為“2)”(由Keymeulen 等報道(2005 N.Engl.J.Med.Type IDiabetes patients))。Teplizumab 的結(jié)果在圖中標(biāo)為
“ 3) ”(由 Herold 等報道(2002 N.Engl.J.Med.Type I Diabetes patients))。標(biāo)準(zhǔn)值在圖中 標(biāo)為 “4)”(由 Straub 等報道(2007，Athr.&Rheumat))。 “*)” 表示單劑量，“_)” 表示達(dá)到峰濃度所注射的累積劑量。圖11示出了在健康志愿者中施用單靜脈內(nèi)或皮下劑量的BT061后的IL_2和 IFN- Y血漿水平。ULN =標(biāo)準(zhǔn)上限(根據(jù)在39個健康受試對象中測得的細(xì)胞因子水平 計算得到)；ULN =平均值+2 X標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖12示出了用單靜脈內(nèi)劑量的BT061處理的志愿者中的CD4細(xì)胞計數(shù)(細(xì)胞/ ml血漿)的動力學(xué)。所示的是每個劑量組3位患者的平均值。虛線表示標(biāo)準(zhǔn)上限(ULN) 和標(biāo)準(zhǔn)下限(LLN)。圖13示出了用單皮下劑量的BT061處理的志愿者中的CD4細(xì)胞計數(shù)(細(xì)胞/ml 血漿)的動力學(xué)。所示的是每個劑量組3位患者的平均值。虛線表示標(biāo)準(zhǔn)上限(ULN) 和標(biāo)準(zhǔn)下限(LLN)，均根據(jù)在15位健康受試對象中測得的CD4細(xì)胞計數(shù)來計算，采用平 均給藥前值+ (或減去)2 X標(biāo)準(zhǔn)偏差形式。圖14的A和B部分提供了示出來自如實施例3中所述的銀屑病患者的臨床試驗 的照片。所述照片是作為劑量組II成員之一的同一名患者的照片。A部分中顯示的照片 在處理前拍攝。B部分中顯示的照片在處理后28天拍攝。圖15提供了如實施例5中所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床試驗結(jié)果。該圖示出 至少獲得ACR20應(yīng)答的來自接受1.25mg、6.25mg、12.5mg和25mg的皮下BT061的劑量 組的患者的百分比的柱狀圖。各組中有6名患者接受所述抗體劑量同時有2名患者接受 安慰劑。圖16A和16B提供了如實施例5中所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床試驗結(jié)果。圖16A示出來自接受25mg皮下BT061的劑量組的患者的觸痛關(guān)節(jié)數(shù)的柱狀圖。圖16B 示出來自同一劑量組的患者的腫脹關(guān)節(jié)數(shù)的柱狀圖。各組中有6名患者接受所述抗體劑 量同時有2名患者接受安慰劑。圖17A和17B提供了如實施例5中所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床試驗結(jié)果。 所述圖示出了來自25mg皮下劑量組的一名應(yīng)答者(圖17A)和一名非應(yīng)答者(圖17B)的 個體參數(shù)(％)的變化。在所述圖中，“Pat' s GA"和“Phy' s GA"分別指患者綜 合評價和醫(yī)師綜合評價。術(shù)語“疼痛的PA”是指疼痛的患者評價。圖18A和18B進(jìn)一步提供了如實施例5中所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床試驗 結(jié)果。所述圖示出了來自1.25mg皮下劑量組(圖18A)和來自6.25mg皮下劑量組(圖 18B)的患者的觸痛關(guān)節(jié)數(shù)。圖19A和19B進(jìn)一步提供了如實施例5中所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的臨床試驗 結(jié)果。所述圖示出了來自50mg皮下劑量組(圖19A)和來自6.25mg靜脈內(nèi)劑量組(圖 19B)的患者的觸痛關(guān)節(jié)數(shù)。圖20示出了 B-F5人源化形式(即BT061)設(shè)計中的鼠B_F5VK(SEQIDNo 8)、 FK-001 (SEQ ID No 9、10、11 禾口 12)、 L4L (SEQ ID No 18)禾口 L4M (SEQ ID No 2)
的多肽序列的比對。圖21示出了 B-F5人源化形式設(shè)計中的鼠B-F5 Vh (SEQ ID No 7)、M26 (SEQ ID No 13、14、15 和 16)、H37L (SEQ ID No 1)和 H37V(SEQID No 17)的多肽序列
的比對。
具體實施例方式下文將對本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。適用于本發(fā)明的試劑是能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的那些試劑。所述試 劑可以是多肽、蛋白或抗體。在所述試劑是抗體的情況下，其可以是單克隆抗體。優(yōu)選 的是，所述抗體是單克隆抗CD4抗體。所述抗體還可以優(yōu)選為IgGl抗體，并且可以是 未修飾的IgGl抗體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，與施用抗CD3抗體后見到的水平相比，所述試劑在 施用后不引起受試對象血漿中促炎性細(xì)胞因子水平的大量上升。尤其是，在施用所述試 劑后，IFN-Y、TNF-a、IL_6和/或IL_2的水平與健康受試對象中測得的血漿水平相比 沒有大量上升(見表Al)。特別是，如果表Al中給定的具體細(xì)胞因子的ULN當(dāng)作X， 那么在施用本發(fā)明的所述試劑后96小時內(nèi)，X可以增加小于20倍。優(yōu)選的是，X可以 增加小于10倍。更優(yōu)選的是，這些水平出現(xiàn)在開始施用后10分鐘至施用結(jié)束后96小時 的時期內(nèi)。在自身免疫性疾病患者中 可能是，施用所述試劑前的細(xì)胞因子水平由于免疫細(xì) 胞的修飾活化情況(與健康受試對象中的細(xì)胞的活化情況相對而言)的原因而已經(jīng)高過在 健康受試對象中所觀察到的那些水平(在表Al中給出的ULN)。在那些情況下，將在剛 要施用所述試劑前的具體細(xì)胞因子的濃度當(dāng)作X，并且在施用本發(fā)明的所述試劑后96小 時內(nèi)，X可以增加小于20倍。優(yōu)選的是，X可以增加小于10倍。更優(yōu)選的是，這些水 平出現(xiàn)在開始施用后10分鐘至施用結(jié)束后96小時的時期內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用載體和能 夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物以所述試劑為0.2mg至30mg 的劑量施用于受試對象。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述試劑以0.2mg至20mg的量施用于受試對象。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中，所述試劑以0.3mg至5mg的量施用于受試對象。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中，所述試劑以0.3mg至Img的量施用于受試對象。
5.一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用載體和能 夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物以所述試劑為O.lOmg/m2受 試對象體表面積至20mg/m2受試對象體表面積的劑量施用于受試對象。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，所述組合物以所述試劑為0.12mg/m2受試 對象體表面積至15mg/m2受試對象體表面積的劑量施用于受試對象。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中，所述組合物以所述試劑為0.20mg/m2受試 對象體表面積至lOmg/m2受試對象體表面積的劑量施用于受試對象。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述組合物以所述試劑為0.30mg/m2受試 對象體表面積至0.50mg/m2受試對象體表面積的劑量施用于受試對象。
9.一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用載體和能 夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物以所述試劑為Iy g/kg至 500 μ g/kg的劑量施用于受試對象。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述組合物以所述試劑為2μ g/kg至 400 μ g/kg的劑量施用于受試對象。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述組合物以所述試劑為2μ g/kg至 250 μ g/kg的劑量施用于受試對象。
12.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述組合物以所述試劑為2.5μ g/kg至 20 μ g/kg的劑量施用于受試對象。
13.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述自身免疫性疾病選自銀 屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、炎性腸病、克羅恩病、自身免疫性甲 狀腺炎、自身免疫性重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和諸如移植物抗宿主或一般器官耐受 問題等移植有關(guān)疾病。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中，所述疾病是銀屑病。
15.如權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中，所述組合物能夠通過使患者的銀屑病面 積與嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評分改善至少40%來治療銀屑病。
16.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中，所述組合物能夠通過使患者的銀屑病面 積與嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評分改善至少50%來治療銀屑病。
17.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中，所述疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
18.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，所述組合物用于腸胃外施用。
19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中，所述組合物用于肌肉內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施 用或皮下施用。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中，所述組合物用于靜脈內(nèi)施用并以0.5ml 至500ml的劑量體積提供或者以用于稀釋至0.5ml至500ml的劑量體積的形式提供。
21.如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中，所述劑量體積為15ml至25ml。
22.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中，所述組合物用于皮下施用并以0.1ml至 3ml的劑量體積提供。
23.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中，所述劑量體積為0.5ml至1.5ml。
24.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中，所述組合物用于肌肉內(nèi)施用并以0.1ml 至3ml的劑量體積提供。
25.如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中，所述組合物以0.5ml至1.5ml的劑量體 積提供。
26.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，所述組合物作為單劑量使用 或者作為多劑量的一部分使用。
27.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中，所述組合物為多劑量的一部分，并且各 劑量每天、每2天、每周、每2周、每4周、每8周、每12周、每24周、每48周、每 6個月或每年施用。
28.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中，所述自身免疫性疾病是銀屑病并且所述 劑量每2周施用1次。
29.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中，所述自身免疫性疾病是銀屑病并且所述 劑量每4周施用1次。
30.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中，所述自身免疫性疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎并 且所述劑量每2周施用1次。
31.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中，所述自身免疫性疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎并 且所述劑量每4周施用1次。
32.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用載體和能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的試劑，其中，所述試劑以lOyg/ml至150mg/ml的濃度存在。
33.如權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中，所述試劑以0.5mg/ml至75mg/ml的濃 度存在。
34.如權(quán)利要求32或33所述的藥物組合物，其中，所述組合物的體積為0.5ml至 500ml。
35.如權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其中，所述組合物的體積為15ml至25ml。
36.如權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中，所述試劑以10mg/ml至28mg/ml的濃度存在。
37.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其中，所述組合物的體積為0.1ml至3ml。
38.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中，所述組合物的體積為0.5ml至1.5ml。
39.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，在施用開始后10分鐘至施用 結(jié)束后96小時的時間內(nèi)，所述受試對象的血漿中的細(xì)胞因子水平比即將施用前的水平增 加小于20倍，并且其中所述細(xì)胞因子選自IFN-Y、TNF-a、IL_6和IL_2。
40.如權(quán)利要求1至38中任一項所述的藥物組合物，其中，在施用開始后10分鐘至 施用結(jié)束后96小時的時間內(nèi)，所述受試對象的血漿中的細(xì)胞因子水平比標(biāo)準(zhǔn)上限(ULN) 值增加小于20倍，其中所述細(xì)胞因子選自IFN-Y、TNF-α、IL_6和IL_2，并且其中所 述 ULN 值分別為 3.8pg/ml、2.8pg/ml、4.4pg/ml 和 19.4pg/ml。
41.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，在施用后72小時至96小時 的時間內(nèi)，所述受試對象的血漿中的CD4+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞計數(shù)為至少250個細(xì)胞/ μ 1。
42.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，所述試劑是人源化單克隆抗 體或者其片段或衍生物。
43.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其中，所述試劑是抗CD4抗體或者其片段或 衍生物。
44.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，所述試劑是具有由以下多肽 序列限定的V域的人源化抗CD4抗體或者其片段或衍生物-H鏈V域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKS ENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 1)-L鏈V域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASI LESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (SEQ IDNO 2)，或者包含與SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2具有至少80%的序列同一性的多肽序列的V域。
45.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，所述試劑是衍生自小鼠單克 隆抗CD4抗體B-F5的人源化抗CD4抗體。
46.—種自身免疫性疾病的治療方法，所述方法包括對受試對象施用藥物組合物，其 中，所述組合物包含能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，并且其中所述試劑以權(quán) 利要求1至12中任一項所限定的劑量施用于所述受試對象。
47.如權(quán)利要求46所述的治療方法，其中，所述自身免疫性疾病如權(quán)利要求13、權(quán) 利要求14或權(quán)利要求17所述。
48.如權(quán)利要求46或權(quán)利要求47所述的治療方法，其中，所述試劑是衍生自小鼠單 克隆抗CD4抗體B-F5的人源化抗CD4抗體或者其片段或衍生物。
49.如權(quán)利要求46至48中任一項所述的治療方法，其中，所述試劑是具有由以下肽 序列限定的V域的人源化抗CD4抗體或者其片段或衍生物-H鏈V域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKS ENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 1)-L鏈V域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (SEQ IDNO 2)，或者包含與SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2具有至少80%的序列同一性的多肽序列的V域。
50.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中，所述自身免疫性疾病是銀屑病并且所述 劑量每周施用1次。
51.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中，所述自身免疫性疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎并 且所述劑量每周施用1次。
52.如前述權(quán)利要求中任一項所述的藥物組合物，其中，在施用后3小時至6小時的 時間內(nèi)，所述受試對象的血漿中的CD4+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞計數(shù)低于250個細(xì)胞/ μ 1。
53.如權(quán)利要求1至52中任一項所述的藥物組合物，其中，在施用后72小時至96小 時的時間內(nèi)，所述受試對象的血漿中的CD4+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞計數(shù)等于或大于即將施用前 所述受試對象的細(xì)胞計數(shù)的50%。
54.如權(quán)利要求15或16所述的藥物組合物，其中，所述改善在施用單劑量所述組合 物后的56天可見。
55.如權(quán)利要求15或16所述的藥物組合物，其中，所述改善在施用單劑量所述組合 物后的75天可見。
56.如權(quán)利要求15、16、54或55所述的藥物組合物，其中，所述試劑的劑量為 0.5mg。
57.如權(quán)利要求15、16、54或55所述的藥物組合物，其中，所述試劑的劑量為 2.5mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥用載體和能夠激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的試劑，其中，所述組合物擬以0.2mg至30mg的所述試劑的劑量施用于受試對象。
文檔編號A61P37/06GK102027017SQ200980117317
公開日2011年4月20日 申請日期2009年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者于爾根·林德內(nèi)爾, 克里斯托夫·尤爾克, 克里斯托夫·布魯切爾, 埃爾瑪·克勞澤, 安德里亞·瓦滕貝格-德曼特, 弗蘭克·奧斯特羅斯, 本杰明·德爾肯, 西爾克·艾格納, 西比勒·凱瑟, 達(dá)尼埃萊·沃爾夫, 馬蒂亞斯·杰默 申請人:生物測試股份公司