專利名稱：：Foxm1肽和包含foxm1肽的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及作為針對(duì)高表達(dá)叉頭框Ml(FOXMl)的癌癥(如膽管癌、肺癌和胰腺癌)的疫苗有用的新肽，和包含這些肽的用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
：在日本，膽管癌(膽囊癌和膽管癌)死亡的數(shù)目正在增加，在2005年，有16，586人死于此癌。在大多數(shù)膽管癌病例中，在早期不存在主觀癥狀。與消化道腔體內(nèi)形成的癌癥(如胃癌和結(jié)腸癌)相比，膽管癌的準(zhǔn)確的顯示和診斷顯影(diagnosticimaging)是困難的。因此，膽管癌難以早期檢測，當(dāng)膽管癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)，癌癥往往已經(jīng)發(fā)展并無法切除。除外科治療之外，還進(jìn)行放療和化療以治療膽管癌，但它們療效不佳，因此亟需建立新的治療方法。在日本，肺癌死亡的數(shù)目也在增加，在2005年，有62，063人死于此癌。目前日本癌癥死亡中肺癌占19.0%，并已成為2000年以來癌癥死亡的首要原因。吸煙被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的最大原因。除吸煙外，吸入石棉或氡氣也被認(rèn)為引起肺癌。作為預(yù)防肺癌的措施，人們倡導(dǎo)戒煙和進(jìn)行健康檢查。然而，盡管吸煙人群在日本正在減少，但2005年仍估計(jì)有大約3千萬人。此外，最近已證明，健康檢查中廣泛進(jìn)行的簡單胸部X-光顯影和痰液測試對(duì)于肺癌的早期檢測無效，而且它們并不導(dǎo)致癌癥死亡的減少?？紤]到上述情況，預(yù)期肺癌死亡的數(shù)目在未來會(huì)持續(xù)增加。肺癌的癥狀包括咳嗽、血痰、呼吸急促和胸痛，但在大多數(shù)情況下，癥狀在早期不存在。在很多病例中當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)癌癥已經(jīng)發(fā)展。為此，當(dāng)最先發(fā)現(xiàn)癌癥時(shí)，一半以上的患者是不能手術(shù)治療的，因此肺癌被看作難治性癌癥中的一種。手術(shù)后恢復(fù)率不像其他癌癥那么好，而且手術(shù)后的總的五年存活率僅不及50%。在近年來，隨著以手術(shù)切除為中心，結(jié)合放療、化療等的多科性治療的進(jìn)步，早期肺癌的五年存活率正在增加；然而，晚期肺癌的治療效果沒有很大的改進(jìn)，而且亟需建立新的治療策略。在日本，胰腺癌死亡的數(shù)目正在增加，在2005年，有22，927人死于此癌。目前，日本癌癥死亡中胰腺癌占7.0%，在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和肝癌后排名第五位。胰腺癌沒有特異性的癥狀，而且在很多病例中，當(dāng)癥狀出現(xiàn)時(shí)，癌癥已經(jīng)發(fā)展。即使是診斷顯影發(fā)展的今天，全日本胰腺癌患者中大約40%屬于具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的晚期病例，而且發(fā)現(xiàn)很多患者具有不能切除的局部發(fā)展的癌癥。因此，患者總的五年存活率是5%以下，而且診斷后的預(yù)后非常差。由于診斷中的難度，胰腺癌發(fā)病作為癌癥死亡的原因特別是發(fā)達(dá)國家中正逐漸增加。當(dāng)先，雖然以手術(shù)切除為中心，結(jié)合放療、化療等的多科性治療正在開展，但是在治療效果方面沒有明顯的改進(jìn)，亟需建立新的治療策略。已顯示胰腺癌的發(fā)病要因涉及多種因素，如生活習(xí)慣(包括吸煙、肥胖、飲食、飲酒和喝咖啡)，以及慢性胰腺炎、糖尿病、遺傳因素等。在另一個(gè)方面，分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的近期發(fā)展闡明，細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞和輔助τ細(xì)胞可識(shí)別癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì)被降解而產(chǎn)生、并經(jīng)由HLA分子被呈遞到癌細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的表面的肽，并引起免疫反應(yīng)以破壞癌細(xì)胞。此外，已經(jīng)鑒定了許多源自這些細(xì)胞的、能刺激這樣的免疫反應(yīng)以攻擊癌癥的腫瘤抗原蛋白質(zhì)和肽，而且抗原特異性腫瘤免疫治療正在得到臨床應(yīng)用。HLAI類分子在身體的所有有核細(xì)胞的表面上表達(dá)。它結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)降解所產(chǎn)生的肽，并表達(dá)在細(xì)胞表面。在正常細(xì)胞的表面，源自正常自體蛋白質(zhì)的肽結(jié)合于HLAI類分子，并且不被免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞識(shí)別和破壞。在另一個(gè)方面，在形成癌癥的過程中，癌細(xì)胞有時(shí)大量表達(dá)在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)或略微表達(dá)的蛋白質(zhì)。此時(shí)HLAI類分子結(jié)合于癌細(xì)胞內(nèi)特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì)胞內(nèi)降解而產(chǎn)生的肽，然后在癌細(xì)胞的表面上表達(dá)肽，于是殺傷T細(xì)胞識(shí)別并僅破壞癌細(xì)胞。通過將所述癌癥-特異性抗原或肽施用于個(gè)體，可破壞癌細(xì)胞且可抑制癌生長而不傷害正常細(xì)胞。這稱為使用癌癥-特異性抗原的癌癥免疫療法。HLAII類分子主要在抗原呈遞細(xì)胞的表面上表達(dá)。所述分子結(jié)合于源自癌癥_特異性抗原的肽，其通過胞內(nèi)降解由細(xì)胞外并入抗原_呈遞細(xì)胞的癌癥_特異性的抗原而產(chǎn)生，然后在細(xì)胞的表面上表達(dá)肽。識(shí)別它們的輔助T細(xì)胞被活化，并通過產(chǎn)生活化其他免疫活性細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞因子來誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。因此，如果開發(fā)靶向在癌癥中特異性高表達(dá)的抗原的免疫療法，這樣的療法可有效地僅僅消滅癌癥，而不引起對(duì)正常自體組織的任何有害事件。還期望的是療法可用于其他治療均無能為力的任何末期癌癥患者。此外，通過將癌癥特異性抗原和肽作為疫苗預(yù)先施用于具有發(fā)生癌癥的高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，可預(yù)防癌癥的發(fā)生。本發(fā)明人首先使用cDNA微陣列對(duì)27，648個(gè)人基因進(jìn)行了全基因組基因表達(dá)分析，以研究這些基因在25個(gè)肝內(nèi)膽管癌病例中和在多個(gè)正常器官(包括它們在胚胎期)的表達(dá)譜(expressionprofile)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)叉頭框Ml(FOXMl)(GenBank登錄號(hào)NM_202003)在許多肝內(nèi)膽管癌病例的組織中非常高度表達(dá)。類似于且除肝內(nèi)膽管癌之外，還發(fā)現(xiàn)FOXMl在幾乎所有的肺癌、膀胱癌和胰腺癌病例中高度表達(dá)。此外，F(xiàn)OXMl的高表達(dá)見于多種癌癥如子宮頸癌(cervicalcancer)、卵巢癌、惡性淋巴瘤(malignantlymphoma)、乳腺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和慢性髓細(xì)胞性白血病的40%以上病例中。這些事實(shí)提示FOXMl可在多種癌癥中作為癌癥-特異性抗原。FOXMl在胚胎肝中并在正常成人器官中表達(dá)，其在消化道如胃、小腸和大腸、胸腺和睪丸中輕微表達(dá)；然而，表達(dá)水平明顯低于癌部分。提示FOXMl與癌癥發(fā)病和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)有關(guān)的文件的實(shí)例包括非專利文件1至10。然而，這些文件都沒有描述FOXMl作為針對(duì)癌癥的疫苗的用途。[非專利文件IjYoshidaY,WangI-C,YoderHM,DavidsonNO,CostaRH.:TheforkheadboxMltranscriptionfactorcontributestothedevelopmentandgrowthofmousecolorectalcancer.Gastroenterology132:1420-1431,2007.[非專利文件2]GusarcovaGA,WangI-C,MajorML,KalinichenkoW,AckersonT,PetroviV,CostaRH.:Acell-penetratingARFpeptideinhibitorofF0XM1inmousehepatocellularcarcinomatreatment.J.Clin.Invest.117:99-lll,2007.[非-專利文件3]RadhakrishnanSK,BhatUG,HughesDE,WangI-C，CostaRH,GartelAL.!IdentificationofachemicalinhibitoroftheoncogenictranscriptionfactorforkheadboxMl.CancerRes.66:9731_9735，2006.[非一專禾Ij文件4]TakahashiK,FurukawaC,TakanoA,IshikawaN,KatoΤ,HamayaS,SuzukiC,YasuiW,InaiK,SoneS,ItoΤ,NishimuraH,TsuchiyaΕ,NakamuraY,DaigoY.:TheneuromedinU-growthhormonesecretagoguereceptorlb/neurotensinreceptor1oncogenicsignalingpathwayasatherapeutictargetforlungcancer.CancerRes.66=9408-9419,2006.[非-專利文件5]KimI-M,AckersonΤ,RamakrishnaS,TretiakovaM，WangI_C，KalinTV,MajorML,GusarovaGA,YoderHM,CostaRH,KalinichenkoVV.:Theforkheadboxmltranscriptionfactorstimulatestheproliferationoftumorcellsduringdevelopmentoflungcancer.CancerRes.66:2153_2161,2006.[非一專禾O文件6]WonseyDR,FolletieΜ.=LossoftheforkheadtranscriptionfactorFoxMlcausescentrosomeamplificationandmitoticcatastrophe.CancerRes.65:5181_5189,2005.[非一專禾Ij文件7]ObamaK，UraK,LiΜ,KatagiriΤ,TsunodaΤ,NomuraΑ,SatohS,NakamuraY,FurukawaY:Genome_wideanalysisofgeneexpressioninhumanintrahepaticcholangiocarcinoma.Hepatology41:1339-1348,2005.[非一專禾Ij文件8]LaoukiIiJ,KooistraMRH,BrasA,KauwJ,KerkhovenRM,MorrisonA,CleversH,MedemaRH.:Foxmlisrequiredforexecutionofthemitoticprogrammeandchromosomestability.NatureCellBiol.7:126_136,2005.[非-專利文件9]KalinichenkoW,MajorΜ,WangX，PetrovicV,KuechleJ,YoderHM,ShinB,DattaA,RaychaudhuriP,CostaRH.:Foxmlbtranscriptionfactorisessentialfordevelopmentofhepatocellularcarcinomasandisnegativelyregulatedbythepl9ARFtumorsuppressor.GenesDev.18:830-850,2004.[非一專禾O文件10]WangX,KiyokawaH,DennewitzMB,CostaRH.=TheforkheadboxmlbtranscriptionfactorisessentialforhepatocyteDNAreplicationandmitosisduringmouseliverregeneration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA9916881-16886,2002.
發(fā)明內(nèi)容[本發(fā)明要解決的問題]本發(fā)明要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)是開發(fā)一種手段，用來實(shí)施通過增強(qiáng)癌癥患者的抗癌免疫力來抑制癌癥生長的免疫治療，作為一種新型治療方法來治療難以通過外科手術(shù)治療、化療和放療等作為膽管癌、肺癌、胰腺癌等的治療方法治療的轉(zhuǎn)移性或難治性癌癥。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒定源自在癌癥中特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì)、并且能誘導(dǎo)癌癥患者中針對(duì)所述癌癥的強(qiáng)免疫反應(yīng)而不導(dǎo)致不良反應(yīng)的肽，并在腫瘤免疫治療中應(yīng)用這些肽。本發(fā)明識(shí)別源自在上述癌癥中特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì)并經(jīng)由HLA-A2呈遞于殺傷T細(xì)胞的肽，從而使免疫治療能夠用于大約30%的患有上述癌癥的日本人患者。[解決問題的手段]在本申請(qǐng)中，本發(fā)明人通過將人⑶8陽性殺傷T細(xì)胞與經(jīng)具有HLA-A2結(jié)合基序的人F0XM1肽沖激(pulsed)的、源自人外周血單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)來體外刺激人CD8陽性殺傷T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)F0XM1肽特異性殺傷T細(xì)胞。是否存在對(duì)每種F0XM1肽特異性的殺傷τ細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，是通過使用ELISPOT測定法檢測由識(shí)別通過HLA-A2呈遞的肽而活化的殺傷T細(xì)胞所產(chǎn)生Y-干擾素(IFN-γ)來檢查的。結(jié)果，鑒定了新型FOXMl肽，它們可以成為免疫治療的潛在候選靶抗原。此外還發(fā)現(xiàn)，使用上述肽誘導(dǎo)的FOXMl-反應(yīng)性CTL針對(duì)表達(dá)內(nèi)源性FOXMl和HLA-A2分子的癌細(xì)胞具有特異性的細(xì)胞毒性。而且所述CTL以HLAI類限制性的方式識(shí)別靶細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明提供了如下[1]下面(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO:1至3中任一氨基酸序列的肽；(B)包含SEQIDNO:1至3中任一氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，并且其中所述肽顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。[2][1]的肽，其中自N末端起第二個(gè)氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。[3][1]的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。[4]誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的試劑，其包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[5]用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑，其包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[6]用于誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[7]用于誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，其中所述藥劑包含編碼[1]的肽的一種或多種多核苷酸作為活性成分。[8]用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種[1]的肽作為活性成分。[9]針對(duì)[1]的肽的抗體。[10]使用[1]的肽誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞群體。[11]抗原呈遞細(xì)胞，其呈遞包含[1]的肽及HLA抗原的復(fù)合物。[12][11]的抗原呈遞細(xì)胞，其是通過[6]或[7]的藥劑誘導(dǎo)的。[13]一種外來體，其呈遞包含[1]的肽及HLA抗原的復(fù)合物。[14][13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A*0201)。[15]誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括將抗原呈遞細(xì)胞與[1]的肽接觸的步驟。[16]誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括將編碼[1]的肽的多核苷酸導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞的步驟。[17]誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞的方法，其包括將T細(xì)胞與[1]的肽接觸的步馬聚ο本發(fā)明還提供如下[18]誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的方法，其包括將[1]的肽施用于受試者的步驟。[19]用于治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其包括將[1]的肽施用于受試者的步驟。[20][1]的肽在制備用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的藥劑中的用途。[21][1]的肽在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑中的用途。[22][1]的肽，用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力。[23][1]的肽，用于治療和/或預(yù)防癌癥。附圖簡述圖1顯示的是ELISP0T測定法和細(xì)胞毒性測試的結(jié)果。從HLA-A2陽性健康個(gè)體和乳腺癌患者的外周血分離⑶8陽性T細(xì)胞。針對(duì)用以每種FOXMl肽沖激過的源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞刺激而獲得的殺傷T細(xì)胞，進(jìn)行ELISP0T測定法檢查，確定它們是否與FOXMl肽特異性反應(yīng)而產(chǎn)生IFN-γ。此外，通過細(xì)胞毒性測試檢查是否表達(dá)FOXMl的細(xì)胞以HLA-A2限制性方式特異性地受到損害。將T2-A2細(xì)胞用作ELISP0T測定法中的靶細(xì)胞。T2-A2細(xì)胞是通過將HLA-A2基因引入TAP基因表達(dá)缺陷的小鼠T2細(xì)胞系而產(chǎn)生的細(xì)胞系。由于T2-A2細(xì)胞中的TAP缺陷，只有當(dāng)外源添加的肽具有與HLA-A2分子結(jié)合的能力時(shí)，該肽與HLA-A2分子形成的復(fù)合物才會(huì)在細(xì)胞表面上表達(dá)。將Panc-I細(xì)胞(其為HLA-A2陽性的且表達(dá)F0XM1)和PK-8細(xì)胞(其為HLA-A2陰性和FOXMl日性的)用于評(píng)價(jià)細(xì)胞毒活性。結(jié)果，來自兩個(gè)健康個(gè)體的使用F0XM1362-370、373-382和640-649肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞識(shí)別結(jié)合于HLA-A2并表達(dá)在T2-A2細(xì)胞上的F0XM1362-370、373_382和640-649肽而產(chǎn)生IFN-γ。此外，來自乳腺癌患者的使用上述肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞，它們顯示針對(duì)panc-Ι細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒活性，但不顯示針對(duì)PK-8細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。因此，發(fā)現(xiàn)被誘導(dǎo)出來的殺傷T細(xì)胞特異性識(shí)別F0XM1，以HLA-A2限制性方式顯示針對(duì)癌細(xì)胞系的強(qiáng)細(xì)胞毒活性。由此可見，F(xiàn)0XM1362-370、373-382和640-649肽可以通過HLA-A2限制性的方式誘導(dǎo)FOXMl-特異性人殺傷T細(xì)胞，而且這樣的殺傷T細(xì)胞可損害表達(dá)FOXMl的癌細(xì)胞。[實(shí)施本發(fā)明的方式]除非另外限定，本申請(qǐng)中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。本發(fā)明的肽是限制于HLA-A2的表位，HLA-A2是一種多見于日本人群和白種人群的HLA等位基因。利用與HLA-A2的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選擇了源自FOXMl的候選HLA-A2結(jié)合肽。來自兩個(gè)健康個(gè)體的使用F0XM1362-370、373-382和640-649肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞識(shí)別結(jié)合于HLA-A2并表達(dá)在T2-A2上的F0XM1362-370肽(YLVPIQFPV(SEQIDNO:1))、F0XM1-373-382肽(SLVLQPSVKV(SEQIDNO:2))和F0XM1-640-649肽(GLMDLSTTPL(SEQIDNO3))而產(chǎn)生IFN-γ。來自乳腺癌患者的使用上述肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞顯示針對(duì)panc-1細(xì)胞的強(qiáng)細(xì)胞毒活性，但不顯示針對(duì)PK-8細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。因此，證實(shí)了所誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞是以HLA-A限制性方式特異性識(shí)別FOXMl，并顯示針對(duì)癌細(xì)胞系的強(qiáng)細(xì)胞毒活性。因此，揭示了F0XM1-362-370(YLVPIQFPV(SEQIDNO1))、F0XM1-373-382(SLVLQPSVKV(SEQIDNO:2))和F0XM1-640-649(GLMDLSTTPL(SEQIDNO3))中任一個(gè)肽均能以HLA-A2限制性方式誘導(dǎo)FOXMl-特異性人殺傷T細(xì)胞，而且這樣的殺傷T細(xì)胞能傷害表達(dá)FOXMl的癌細(xì)胞。除肝內(nèi)膽管癌之外，發(fā)現(xiàn)FOXMl在肺癌、膀胱癌和胰腺癌的幾乎所有病例中也與肝內(nèi)膽管癌類似地高度表達(dá)。此外，F(xiàn)OXMl在多種癌癥如子宮頸癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和慢性髓細(xì)胞性白血病的40%以上病例中高表達(dá)。這些事實(shí)顯示FOXMl作為多種癌癥的免疫治療的靶標(biāo)是有用的。(1)本發(fā)明的肽和包含所述肽的用于誘導(dǎo)抗癌免疫力的試劑本發(fā)明的肽是下述㈧至⑶中的任一個(gè)。(A)包含SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列的肽。(B)包含SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，并且其中所述肽顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞-誘導(dǎo)活性。(C)(B)的肽，其中自N末端起第二個(gè)氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(D)(B)的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。在本申請(qǐng)中，“顯示誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的活性的肽”是指“具有刺激殺傷T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞/CTL)的T細(xì)胞-誘導(dǎo)活性的肽”。本發(fā)明的肽是具有少于40個(gè)氨基酸，優(yōu)選少于20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選少于個(gè)15氨基酸，包括SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列，并顯示誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的活性的肽(表位肽)。或者，本發(fā)明的肽(表位肽)可包括包含SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，只要保留誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的能力即可。被取代、缺失、插入和/或添加的殘基數(shù)目通常為五個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選四個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選三個(gè)氨基酸或更少，甚至更優(yōu)選一個(gè)氨基酸或兩個(gè)氨基酸。已知變體肽(即，包含通過取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基修飾原始氨基酸序列而獲得的氨基酸序列的肽)保留原始生物活性(MarkDF等，(1984)ProcNatlAcadSciUSA81:5662_6；ZollerMJ禾口SmithΜ,(1982)核酸Res106487-500；Dalbadie-McFarlandG等(1982)ProcNatlAcadSciUSA79:6409_13)。氨基酸修飾優(yōu)選保留原始氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的實(shí)例顯示如下疏水氨基酸側(cè)鏈(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；親水氨基酸側(cè)鏈(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；和共同具有如下官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基側(cè)鏈(S、T、Y)；含硫原子側(cè)鏈(C、M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D、N、E、Q)；含堿側(cè)鏈(R、K、H)；和含芳環(huán)側(cè)鏈(H、F、Y、W)。括號(hào)中的字母顯示氨基酸的單字母代碼。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽(免疫源性肽)是九肽(9-聚物)或十肽(10-聚物)。為了獲得具有高結(jié)合親和性和殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽，可通過取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸來修飾天然存在的FOXMl的部分肽的氨基酸序列。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“數(shù)個(gè)”指五個(gè)以下，優(yōu)選三個(gè)以下，更優(yōu)選兩個(gè)以下。此外，由于與HLA抗原具有高親和性的肽序列的規(guī)律性是已知的(KuboRT，等，(1994)J.Immunol.，152,3913-24；RammenseeHG，等，(1995)Immunogenetics.41178-228；KondoA，等(1995)J.Immunol.155:4307_12)，可依據(jù)該規(guī)律性來修飾本發(fā)明的肽(表位肽)，從而增強(qiáng)它們與HLA抗原的親和力。例如，可通過用賴氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起第二個(gè)氨基酸來獲得具有高HLA-A2結(jié)合親和力的肽。類似地，還可通過用纈氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸來獲得具有高HLA-A2結(jié)合親和力的肽。當(dāng)表位肽的序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白的氨基酸序列的部分相同時(shí)，可引起副作用如自身免疫病或針對(duì)特定物質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)癥狀。為了避免這樣的副作用，修飾的表位肽不應(yīng)與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同。為此，需要使用可用的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索以確認(rèn)不存在與修飾的表位肽顯示100%同源性且具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)。通過此步驟，可以避免由上述用于增加與HLA抗原的結(jié)合親和力和/或用于增加殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的氨基酸序列修飾引起的風(fēng)險(xiǎn)。雖然上述與HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽預(yù)期非常有效地作為癌癥疫苗，但需要檢查使用高結(jié)合親和力作為指標(biāo)選擇的候選肽是否實(shí)際上具有殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性可通過如下確認(rèn)誘導(dǎo)具有人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如，B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)，更具體地，誘導(dǎo)源自人外周血單核白細(xì)胞的樹突細(xì)胞；用目標(biāo)肽刺激它們；然后將它們與CD8陽性細(xì)胞混合；再測量對(duì)于靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。反應(yīng)系統(tǒng)可使用表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如在，例如，BenMohamedL，等(2000)Hum.Immunol.61(8):764_79，RelatedArticles,Books，禾口Linkout中所描述的)。例如，可用51Cr等放射標(biāo)記靶細(xì)胞，然后可依據(jù)靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒活性?；蛘?，可通過在具有固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞存在的條件下測量由殺傷T細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的IFN-γ；并使用抗-IFN-γ單克隆抗體在培養(yǎng)基中顯現(xiàn)IFN-γ產(chǎn)生區(qū)，來檢查靶細(xì)胞。如實(shí)施例所示，檢查肽的殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的結(jié)果顯示，與HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽不一定具有高誘導(dǎo)活性。然而，含有F0XMl-362-370(YLVPIQFPV(SEQIDNO:1)),F0XM1-373-382(SLVLQPSVKV(SEQIDNO2))和F0XM1640-649(GLMDLSTTPL(SEQIDNO3))中任一個(gè)的氨基酸序列的九肽顯示特別高的殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。如上所述，本發(fā)明提供顯示殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽，更具體地，包括SEQIDNO1至3中任一個(gè)的氨基酸序列和其變體(即，取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列)的肽。優(yōu)選地，包括SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的九個(gè)氨基酸或其變體的肽的氨基酸序列與其他內(nèi)源蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同。特別地，具有高HLA-A2結(jié)合親和力的肽可通過如下獲得用亮氨酸或甲硫氨酸取代自N末端起的第二個(gè)氨基酸，和/或用纈氨酸或亮氨酸取代C-末端氨基酸。本發(fā)明的肽可包括修飾如糖基化、側(cè)鏈氧化和磷酸化，只要肽不丟失它們的誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞活性。其它修飾包括，例如，D-氨基酸和其它氨基酸類似物，它們可用于增加肽的血清半衰期。用于獲得和產(chǎn)生本發(fā)明的肽的方法沒有特定的限制。它們可以是化學(xué)合成的肽或通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組肽。本發(fā)明的化學(xué)合成的肽可根據(jù)化學(xué)合成方法如Fmoc方法(芴甲氧羰基(fluorenylmethyIoxycarbony1)方法)禾口t_Boc方法(叔丁氧幾基(t-butyloxycarbonyl)方法)來合成。本發(fā)明的肽還可以利用多種商業(yè)上可得到的肽合成儀來合成?？赏ㄟ^獲得具有編碼肽的核苷酸序列的DNA，或其變體或同源物，并將它們引入合適的表達(dá)系統(tǒng)，來以重組蛋白質(zhì)的形式產(chǎn)生本發(fā)明的肽。使用的表達(dá)載體可優(yōu)選為任何能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或可整合入宿主細(xì)胞的染色體，并在合適的位置含有啟動(dòng)子以允許表達(dá)編碼肽的基因的載體。可通過將上述表達(dá)載體引入宿主來產(chǎn)生具有編碼本發(fā)明的肽的基因的轉(zhuǎn)化體。宿主可為任何細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞，且可根據(jù)宿主的不同使用已知技術(shù)將表達(dá)載體引入宿主。在本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)如上所述制備的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累肽，并由培養(yǎng)物收集本發(fā)明的肽，從而分離重組肽。當(dāng)轉(zhuǎn)化體是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)或真核細(xì)胞如酵母時(shí)，用于這些微生物的培養(yǎng)基可為天然或合成培養(yǎng)基，只要它包含碳源、氮源、礦物質(zhì)等，可以被微生物利用，并允許有效率地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)條件可以是常規(guī)用于培養(yǎng)微生物的那些。培養(yǎng)后，可使用常規(guī)的肽分離和純化方法來從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中分離和純化本發(fā)明的肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于關(guān)于編碼SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列的DNA核苷酸序列的信息可適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生或獲得包含在SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列的肽。具體地，編碼包含在SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列并顯示殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽的基因可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生，如化學(xué)合成、遺傳工程技術(shù)和誘變。例如，作為一種遺傳工程技術(shù)，定點(diǎn)誘變方法是有用的，因?yàn)樗蓪⑻囟ǖ耐蛔円胩囟ǖ奈恢谩Ｆ淇筛鶕?jù)MolecularCloning:AlaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.，1989(下文中稱為MolecularCloning，第2版)禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38,JohnWiley&Sons(1987-1997)(下文中稱為CurrentProtocolsinMolecularBiology)等中描述的方法來進(jìn)行。本發(fā)明的上述肽可誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力，如在下面的實(shí)施例中所示。因此，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的一種或多種肽作為活性成分的、用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的試劑。本發(fā)明誘導(dǎo)免疫力的藥劑可制備成將兩種以上表位肽組合的混合制劑。通過組合多種肽而配制的、能誘導(dǎo)免疫力的藥劑，可以是雞尾酒(cocktail)，或者也可以是使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)相互結(jié)合的。要組合的表位肽(印itopepeptides)可以是這樣的肽，它們具有源自同一基因的不同氨基酸序列；或者也可以是這樣的肽，它們具有源自不同基因的氨基酸序列。當(dāng)施用本發(fā)明的肽時(shí)，施用的肽被以高密度呈遞給抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原，隨后，誘導(dǎo)出可與被施用的肽和HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性反應(yīng)的殺傷T細(xì)胞?；蛘撸ㄟ^將由受試者收集的樹突細(xì)胞與本發(fā)明的肽接觸(或通過用本發(fā)明的肽沖激由受試者收集的樹突細(xì)胞)，可獲得將本發(fā)明的肽呈遞于其細(xì)胞表面的抗原呈遞細(xì)胞。通過將這些抗原呈遞細(xì)胞施用回受試者，可在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞，結(jié)果，可增強(qiáng)呈遞本發(fā)明的肽的靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)。當(dāng)體外或體內(nèi)(優(yōu)選體外)使用時(shí)，本發(fā)明用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的試劑可誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包括這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群體，從而提供針對(duì)癌癥的免疫力。(2)本發(fā)明用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑(癌癥疫苗)實(shí)施例中顯示，本發(fā)明的肽可在體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞特異性的殺傷T細(xì)胞。在另一方面，先前的發(fā)明顯示，F(xiàn)0XM1在肺癌、膽管細(xì)胞癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、慢性髓細(xì)胞性白血病、惡性淋巴瘤、宮頸癌、骨肉瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤和結(jié)腸癌等的大多數(shù)病例中高表達(dá)。因此，我們預(yù)期，包括一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分的誘導(dǎo)免疫力的試劑，可以有效地用作治療和/或預(yù)防癌的藥劑。就是說，可以預(yù)期，通過將本發(fā)明的肽連同合適的佐劑注入體內(nèi)，或通過用肽沖激抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞后將它們注入體內(nèi)，可以誘導(dǎo)和活化攻擊腫瘤的殺傷T細(xì)胞。因而，結(jié)果是，可預(yù)期產(chǎn)生抗癌效果。此外，可將編碼本發(fā)明的肽的基因摻入合適的載體。呈遞人抗原的細(xì)胞(樹突細(xì)胞等)和用重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌如BCG結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，或基因組中整合有編碼本發(fā)明的肽的DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作治療和/或預(yù)防人癌癥的活疫苗。用于癌癥疫苗的劑量和施用方法與用于常規(guī)天花疫苗和BCG疫苗的那些相同。在本發(fā)明中，術(shù)語“疫苗”(亦稱為“免疫原性組合物”)指當(dāng)被接種于動(dòng)物時(shí)能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力或抑制多種癌癥的物質(zhì)。本發(fā)明提示，包括SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽，其可誘導(dǎo)針對(duì)FOXMl呈遞細(xì)胞的特異性的強(qiáng)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明也包括用于通過使用包含SEQIDNO:1至3中任一個(gè)的氨基酸序列或其包括取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的變體的肽來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法。通常，抗腫瘤免疫力包括如下免疫應(yīng)答(1)針對(duì)含有FOXMl-表達(dá)細(xì)胞的腫瘤的殺傷T細(xì)胞的誘導(dǎo)，(2)識(shí)別含有FOXMl-表達(dá)細(xì)胞的腫瘤的抗體的誘導(dǎo)，和(3)抗腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生的誘導(dǎo)。當(dāng)特定的肽通過接種動(dòng)物而誘導(dǎo)出這些免疫應(yīng)答中的任一種時(shí)，確定該肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的作用。肽的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的作用可通過觀察宿主中的免疫系統(tǒng)對(duì)于肽的體內(nèi)或體外應(yīng)答來加以檢測。例如，用于檢測誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的方法是熟知的。侵入活體的外源物質(zhì)通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用被呈遞于T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞以抗原特異性的方式應(yīng)答于抗原呈遞細(xì)胞所呈遞的抗原，通過抗原的刺激作用分化成殺傷T細(xì)胞(還稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞或CTL)，然后增殖。在本申請(qǐng)中，此過程被稱為T細(xì)胞的“活化”。特定的肽對(duì)殺傷T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，可通過利用該肽沖激過的抗原呈遞細(xì)胞將肽呈遞于T細(xì)胞，然后檢測殺傷T細(xì)胞的誘導(dǎo)來進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，抗原呈遞細(xì)胞具有活化CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞(eosinophil)和NK細(xì)胞的作用。由于CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中是重要的，因此可將對(duì)于這些細(xì)胞的活化的影響作為指標(biāo)，用來評(píng)價(jià)肽的抗腫瘤免疫力誘導(dǎo)作用。對(duì)于使用樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞而言，評(píng)價(jià)它們的誘導(dǎo)效果的方法是本領(lǐng)域公知的。在抗原呈遞細(xì)胞中，DC具有最強(qiáng)的殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)效果。在此方法中，首先，將測試肽與DC接觸，然后將DC與T細(xì)胞接觸。從與DC接觸過的T細(xì)胞中檢測出對(duì)靶細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞。如果T細(xì)胞顯示針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，則意味著測試肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性。例如，可使用51Cr-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的裂解作為指標(biāo)，檢測殺傷T細(xì)胞針對(duì)靶細(xì)胞如腫瘤的活性。或者，可使用3H-胸腺嘧啶攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞損害的程度。通過這些方法確認(rèn)表現(xiàn)殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的測試肽，是表現(xiàn)DC-活化作用和隨后的殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽。因此，表現(xiàn)誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷T細(xì)胞的活性的肽可用作針對(duì)呈遞FOXMl的癌癥的疫苗。此外，已通過與肽接觸而獲得了誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的殺傷T細(xì)胞之能力(活性)的抗原呈遞細(xì)胞，可用作針對(duì)癌癥的疫苗。此外，通過抗原呈遞細(xì)胞呈遞肽而獲得了細(xì)胞毒性的殺傷T細(xì)胞還可用作針對(duì)癌癥呈遞FOXMl的疫苗。利用抗原呈遞細(xì)胞和殺傷T細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤免疫，使用這樣的抗腫瘤免疫的癌癥治療方法稱為細(xì)胞免疫療法(cytoimmunotherapy)。通常，當(dāng)使用肽進(jìn)行細(xì)胞免疫療法時(shí)，可通過組合具有不同結(jié)構(gòu)的多個(gè)肽來增強(qiáng)誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的效率。因此，當(dāng)用蛋白質(zhì)片段刺激DC時(shí)，使用多個(gè)類型的肽片段的混合物是有利的。肽對(duì)抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)還可通過觀察針對(duì)腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來評(píng)價(jià)。例如，當(dāng)在用肽免疫的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中誘導(dǎo)出針對(duì)肽的抗體，而這些抗體抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和/或轉(zhuǎn)移時(shí)，則確定該肽可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的疫苗來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力，而為治療和/或預(yù)防癌癥提供可能。治療癌癥和/或預(yù)防癌癥發(fā)生的效果可包括抑制癌細(xì)胞生長、癌細(xì)胞的退行(regression)和癌細(xì)胞產(chǎn)生的抑制。患癌癥的個(gè)體的死亡率降低、血中的腫瘤標(biāo)志物減少、和與癌癥有關(guān)的可檢測癥狀的減少也包括在治療和/或預(yù)防癌癥的效果中。優(yōu)選地，疫苗針對(duì)癌癥的治療和/或預(yù)防效果與無疫苗施用的對(duì)照的情況相比是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。例如，優(yōu)選效果是以5%以下的顯著性水平觀察到的。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如Studentt_檢驗(yàn)、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、ANOVA等可用于確定統(tǒng)計(jì)顯著性。在本發(fā)明中，受試者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括人、非人靈長類(non-humanprimate)、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛(cattle)，但不限于此。本發(fā)明的肽可體內(nèi)或回體(exvivo)施用于受試者。此外，為了產(chǎn)生用于治療和/或預(yù)防癌癥的免疫原性組合物，可使用本發(fā)明的免疫原性肽，也就是，選自SEQIDN0:1至3的氨基酸序列的九肽和其突變肽。更具體地，本發(fā)明提供用于治療腫瘤或預(yù)防腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等的藥劑，其包括一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分。本發(fā)明的肽特別有用于治療腫瘤如胰腺癌、膽管細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、子宮頸癌、骨肉瘤和軟組織肉瘤。本發(fā)明的肽可作為通過常規(guī)配制方法配制的藥劑直接施用于受試者。這樣的配制物除了本發(fā)明的肽之外，可根據(jù)需要包含可藥用的載體、賦形劑等。本發(fā)明的藥劑可用于治療和/或預(yù)防多種腫瘤。此外，為了有效地建立細(xì)胞免疫力，包含一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分的用于治療和/或預(yù)防腫瘤的藥劑中可混入佐劑。所述藥劑可與其他活性成分(如抗腫瘤劑)一起共施用。適當(dāng)?shù)闹苿┻€包括顆粒。適當(dāng)?shù)淖魟┟枋鲇谖墨I(xiàn)(JohnsonAG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.,7277-89)中。佐劑的實(shí)例包括弗氏不完全佐劑、BCG、海藻糖二霉酚酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)、脂多糖(LPS)、硫酸鋁鉀佐劑、硅石佐劑、磷酸鋁、氫氧化鋁和明礬(alum)，但不限于此。此外，可方便地使用脂質(zhì)體配制物、其中藥物結(jié)合于具有數(shù)微米直徑的珠子的顆粒制劑和其中脂質(zhì)結(jié)合于上述肽的制劑。施用方法可為口服施用、皮內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射等，并可包括全身施用(systemicadministration)和靶腫瘤附近的局部施用。本發(fā)明的肽的劑量可根據(jù)要治療的疾病、患者的年齡和體重、施用方法等而適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)。劑量通常為0.OOlmg至lOOOmg，優(yōu)選0.Olmg至lOOmg，更優(yōu)選0.Img至10mg。優(yōu)選地，幾天一次到幾個(gè)月一次進(jìn)行施用，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地選擇適當(dāng)?shù)膭┝亢褪┯梅椒?；而且這些參數(shù)的選擇和優(yōu)化完全在常規(guī)技術(shù)的范圍內(nèi)。制劑的形式?jīng)]有特定的限制，可以是為通過加入賦形劑(如糖)而?；幕蚶鋬龈稍锏??？杉尤氡景l(fā)明的藥劑用于增加殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的助劑(auxiliaryagent)包括BCG細(xì)菌等的菌體組分，包括胞壁酰二肽(MDP)；Nature,vol.344,p873(1990)中描述的ISCOMJ.Immunol,vol.148，pl438(1992)中描述的皂苷系列(saponinseries)的QS-21；脂質(zhì)體和氫氧化鋁等。此外，還可使用免疫刺激物(immunostimulant)如香菇多糖(Ientinan)、西佐喃(sizofiran)和溶鏈菌(picibanil)作為助劑。還可以使用增強(qiáng)T細(xì)胞的生長和分化的細(xì)胞因子等，如IL-2、IL-4、IL-12、IL-I、IL-6和TNF，以及活化NK-T細(xì)胞的α“半乳糖基神經(jīng)酰胺，以及通過結(jié)合于Toll-樣受體來活化天然免疫系統(tǒng)的脂多糖(LPS)和CpG，等等，作為助劑。本發(fā)明的疫苗組合物包含引發(fā)殺傷T細(xì)胞的組分。脂質(zhì)已被鑒定為用于針對(duì)病毒抗原進(jìn)行體內(nèi)初次刺激(priming)的物質(zhì)。例如，可將棕櫚酸殘基結(jié)合于賴氨酸殘基的ε-氨基和α-氨基，然后與本發(fā)明的免疫原性肽連接。脂質(zhì)化的肽可通過摻入膠束或顆粒，或封裝入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化來直接施用。脂質(zhì)初次刺激的另一個(gè)實(shí)例是用大腸桿菌脂蛋白如三棕櫚酰-S-甘油基-半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycery1-cysteinyl-seryl-serine)(P3CSS)當(dāng)將其共價(jià)結(jié)合于合適的肽時(shí)進(jìn)行引發(fā)(DeresK.，等，(1989)Nature342:561_4)。本發(fā)明的免疫原性肽可通過病毒載體或細(xì)菌載體表達(dá)。適當(dāng)表達(dá)載體的實(shí)例包括無毒力的病毒宿主如牛痘(vaccinia)和禽痘(fowlpox)。例如，可以使用痘苗病毒作為載體來表達(dá)編碼所述肽的核苷酸序列。將重組牛痘病毒引入宿主細(xì)胞，表達(dá)出免疫原性肽，弓丨發(fā)免疫應(yīng)答。也可以使用例如在美國專利No.4，722，848中描述過的使用牛痘載體的免疫方法。也可以使用卡介苗(BacilleCalmette-Guerin)(BCG)。StoverCK等，(1991)Nature31456-60中描述了BCG載體。其他多種可用于治療性施用或免疫的載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，這些載體包括腺病毒載體和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒樣桿菌(傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi))載體和脫毒的炭疽毒素載體。參見，例如，ShataMT等，(2000)Mol.Med.Today666-71；ShedlockDJ和WeinerDB等，(2000)J.Leukoc.Biol.68793-806；和HippJD等，(2000)InVivo14:571-85?？赏ㄟ^如下方式在患者體內(nèi)有效地誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞在體外將抗原肽添加至從患者收集的細(xì)胞或來自另一個(gè)與之共有部分HLA等位基因的個(gè)體的細(xì)胞(同種異體細(xì)胞(allogeneiccell))，并呈遞抗原，然后將這些細(xì)胞血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處等。或者，通過將肽添加至患者的外周血淋巴細(xì)胞并在體外培養(yǎng)它們而在體外誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞，而后可將這些細(xì)胞可以血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處等。這樣的細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療已經(jīng)被實(shí)施作為癌癥治療，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員中熟知的一種方法。本發(fā)明的癌癥類型無特別限制，具體的例子包括食道癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、惡性黑素瘤(黑素瘤)、惡性淋巴瘤、骨肉瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、腦腫瘤、慢性髓細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、腎癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、肉瘤等。適合應(yīng)用本發(fā)明的癌癥的實(shí)例包括膽管癌、肺癌、胰腺癌和膀胱癌。(3)本發(fā)明的抗體本發(fā)明還涉及能夠識(shí)別作為表位(抗原)的本發(fā)明上述的肽的一部分或完整的肽的抗體，并涉及通過使用該蛋白或該肽體外刺激而誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞。通常，殺傷T細(xì)胞顯示出比抗體更強(qiáng)的抗腫瘤活性。此外，與本發(fā)明的肽相似，本發(fā)明抗體可用作針對(duì)表達(dá)F0XM1的癌癥的預(yù)防劑和/或治療劑，只要這些抗體能抑制F0XM1癌癥抗原的活性。在實(shí)際應(yīng)用中，本發(fā)明的肽或抗體可以按原樣施用，或通過與可藥用載體和/或稀釋劑，視需要加上佐劑，一起注射施用。或者，它們可以通過噴霧方法等經(jīng)粘膜通過透皮吸收施用。更具體地，在本申請(qǐng)中，人血清白蛋白是載體的實(shí)例；而PBS、無菌水等是稀釋劑的實(shí)例。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來生產(chǎn)。例如，多克隆抗體可通過如下獲得用本發(fā)明的肽作為抗原免疫哺乳動(dòng)物或鳥類物種，并從哺乳動(dòng)物或鳥類物種收集血液，從收集的血液中分離和純化抗體。例如，可免疫哺乳動(dòng)物，如小鼠、倉鼠、豚鼠、家禽(Chicken)、大鼠、兔、狗、山羊、綿羊和牛、或鳥類物種。免疫的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，抗原可例如在例如7到30天的間隔施用2到3次。劑量可以是，例如，每次施用約0.05毫克到2毫克的抗原。對(duì)施用途徑?jīng)]有特定限制，且可以合適地選自皮下施用、皮內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用等。此外，抗原可以在溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液，例如，含常規(guī)的佐劑如弗氏完全佐劑或氫氧化鋁的緩沖液后施用。將經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物或鳥類物種飼養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)抗體效價(jià)增加時(shí)，可將另外用例如100微克到1000微克的抗原對(duì)它們進(jìn)行免疫。最后施用后一到兩個(gè)月，可從經(jīng)免疫的哺乳動(dòng)物或鳥類物種收集血液，血液可以通過常規(guī)方法來分離，來獲得識(shí)別本發(fā)明肽的多克隆抗體作為多克隆抗血清，所述的常規(guī)方法如離心、用硫酸銨或聚乙二醇沉淀、層析如凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。在另一方面，單克隆抗體可以通過制備雜交瘤獲得。例如，雜交瘤細(xì)胞可以通過將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞融合而獲得。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以通過細(xì)胞融合方法獲得，如下文所示的方法。使用來自于經(jīng)免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等作為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。將本發(fā)明的肽用作抗原?？捎眯∈蠛痛笫蟮葎?dòng)物作為免疫動(dòng)物，將抗原施用于這些動(dòng)物可通過常規(guī)方法來進(jìn)行。例如，通過將作為抗原的本發(fā)明的肽的懸浮液或乳劑與佐劑如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑以靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)等施用于動(dòng)物幾次來免疫動(dòng)物。從經(jīng)免疫動(dòng)物中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，如脾細(xì)胞，并可以通過已知方法(G.Kohler等，Nature,256，495(1975))將它們與骨髓瘤細(xì)胞融合來產(chǎn)生雜交瘤。對(duì)于小鼠，用于細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系的實(shí)例包括，例如，P3X63Ag8、P3U1、Sp2/0等。將融合促進(jìn)劑如聚乙二醇和仙臺(tái)病毒用于細(xì)胞融合，而且在細(xì)胞融合后將次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基用于通過常規(guī)方法選擇雜交瘤。通過細(xì)胞融合獲得的雜交瘤可以通過有限稀釋法等進(jìn)行克隆。根據(jù)需要，產(chǎn)生特異識(shí)別本發(fā)明肽的單克隆抗體的細(xì)胞系可以通過使用本發(fā)明的肽在以酶免疫測定方法的篩選中獲得。除上述方法之外，可以通過使用本發(fā)明的肽、表達(dá)所述肽的細(xì)胞、或其裂解物體外刺激人淋巴細(xì)胞(如感染了EB病毒的淋巴細(xì)胞)來調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞?？膳c本發(fā)明的肽結(jié)合的人抗體可以通過將經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞與人來源的骨髓瘤細(xì)胞如U266(特開昭63-17688(未審查、已公開的日本專利申請(qǐng)))進(jìn)行融合來獲得。為了從這樣獲得的雜交瘤產(chǎn)生需要的單克隆抗體，可以用常規(guī)培養(yǎng)方法或腹水形成方法培養(yǎng)雜交瘤，并可以從培養(yǎng)物上清液或腹水中純化單克隆抗體。從培養(yǎng)物上清液或腹水中純化單克隆抗體可以通過常規(guī)方法進(jìn)行。例如，可將硫酸銨分級(jí)、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等合適地組合和使用。可以使用本發(fā)明肽，表達(dá)所述肽的細(xì)胞、或其裂解物來免疫具有一組人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？梢詮慕?jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并將它們與上述骨髓瘤細(xì)胞系融合以獲得雜交瘤。然后可以從雜交瘤中產(chǎn)生需要的單克隆抗體(W092/03918;W094/02602；W094/25585；W094/33735；W096/34096)。此外，也可以使用癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞(如經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞)永生化，并用來制備單克隆抗體。這樣獲得的單克隆抗體也可以使用基因操作技術(shù)(Borrbaeck和Larrick，(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies)進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，可通過從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(如雜交瘤和經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞)克隆編碼抗體的DNA，將其插入合適的載體，和將后者引入宿主細(xì)胞來制備重組抗體。本發(fā)明的抗體還可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它們可與本發(fā)明的肽結(jié)合即可?？贵w片段可以是Fab、F(ab，)2、FV、或單鏈Fv(SCFv)，其中其中scFv中源自H和L鏈的Fv片段以合適的接頭連接在一起(Huston等，(1998)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具體地，可通過用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Co等，(1994)JImmunol152:2968-76;Better禾口Horwitz，(1989)MethodsEnzymol178:476_96；Pluckthun禾口Skerra，(1989)MethodsEmzymol178:497_515;Lamoyi(1986)MethodsEnzymol121652-63；Rousseaux等，(1986)MethodsEnzymol121663-9；Bird和Walker,(1991)TrendsBiotech9132-7)處理抗體來制備抗體片段。本發(fā)明的抗體包括通過將抗體與多種分子如聚乙二醇(PEG)結(jié)合而獲得的修飾抗體?？赏ㄟ^本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的常規(guī)的化學(xué)修飾方法來進(jìn)行修飾抗體。本發(fā)明的抗體包括嵌合抗體和人源化抗體，嵌合抗體包含源自非人抗體的可變區(qū)和源自人抗體的恒定區(qū)，人源化抗體包括源自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)和源自人抗體的恒定區(qū)。這樣的抗體可以用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的常規(guī)方法制備。人源化抗體通過用具有需要的結(jié)合活性的嚙齒動(dòng)物的CDR區(qū)取代人抗體的CDR序列區(qū)而獲得(Verhoeyen等，(1988)Science239:1534-6)。因此，與嵌合抗體相比，人源化抗體是其中人抗體的較小區(qū)域被非人來源的相應(yīng)區(qū)域取代而獲得的抗體。還可以制備除人源框架區(qū)和恒定區(qū)外還具有人源可變區(qū)的完整人抗體。例如，在一種體外方法中，可以使用展示人抗體片段的噬菌體重組文庫來進(jìn)行篩選(Hoogenboom和Winter，(1992)JMolBiol227:381-8)。類似地，可以通過將人免疫球蛋白基因座引入內(nèi)源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來產(chǎn)生人抗體(US6，150，584、US5,545，807、US5,545，806、US5,569，825、US5,625，126、US5,633，425和US5,661，016)。如上所述獲得的抗體可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法純化至均質(zhì)。例如，可以使用普通的蛋白質(zhì)分離和純化方法?？赏ㄟ^柱層析法如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等的組合來分離和純化抗體；然而，分離和純化方法不限于此(Antibodies:ALaboratoryManual,EdHarlow禾口DavidLane，(1988)ColdSpringHarborLaboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。蛋白A柱用的實(shí)例包括HyperD、P0R0S禾口SepharoseRF(Pharmacia)0除了親和層析外，層析的實(shí)例包括離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層|1τ>吸附M·(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.等)。液相色譜如HPLC和FPLC也可以用于層析。本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合親和力可使用，例如，吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)和免疫熒光測定法來測量；然而，方法不限于此。對(duì)于ELISA，將本發(fā)明的抗體固定在平板上，加入本發(fā)明的肽，然后加入含有產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化抗體的樣本。隨后，加入可識(shí)別并檢測其抗原結(jié)合親和力待測的抗體的標(biāo)記的第二抗體。洗滌平板后，加入用于檢測第二抗體的標(biāo)記的試劑，并測量吸光度等。例如，酶如堿性磷酸酶可以用作第二抗體的標(biāo)記物，酶底物如磷酸對(duì)硝基苯酯可用作檢測試劑。BIAcOre(Pharmacia)也可以用于評(píng)估抗體活性。本發(fā)明的抗體可檢測包含在樣品中的本發(fā)明的肽。具體地，例如，可通過將癌組織的活檢樣本與本發(fā)明的抗體接觸來確認(rèn)本發(fā)明的肽在癌組織中的存在。在將本發(fā)明肽用于癌癥的治療性和/或預(yù)防性處理之前，可能的是通過使用本發(fā)明的抗體評(píng)價(jià)本發(fā)明肽在將待治療的癌癥中的表達(dá)，在治療開始前預(yù)測效果在測試受試者中是否有希望。此外，由于本發(fā)明抗體識(shí)別FOXMl肽片段，而該肽的表達(dá)在多種癌細(xì)胞中增加，所以預(yù)期它們的應(yīng)用不僅可用于診斷中而且還用于治療。(4)輔助T細(xì)胞，殺傷T細(xì)胞，或包含它們的免疫細(xì)胞群本發(fā)明還涉及通過用本發(fā)明的肽體外刺激誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞，或包含殺傷T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞的免疫細(xì)胞群。例如，當(dāng)使用本發(fā)明肽在體外刺激外周血淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞時(shí)，可誘導(dǎo)出腫瘤反應(yīng)性的活化T細(xì)胞，這些活化T細(xì)胞可有效地用于過繼免疫治療(adoptiveimmimotherapy)，其中將所述細(xì)胞血管內(nèi)施用于癌癥患者、局部施用于腫瘤等?；蛘撸鳛閺?qiáng)力的抗原呈遞細(xì)胞，樹突細(xì)胞也可以用本發(fā)明肽進(jìn)行沖激或經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述肽，并可通過使用這些樹突細(xì)胞在體內(nèi)或體外刺激T細(xì)胞來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。優(yōu)選通過使用本發(fā)明的肽和佐劑進(jìn)行體內(nèi)或體外刺激，來誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞群。本申請(qǐng)使用的佐劑的實(shí)例包括礦物油、氫氧化鋁、結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)制劑、溶血性鏈球菌屬(hemolyticStreptococcus)制劑、多孔菌科(Polyporaceae)制劑、其他佐劑、細(xì)胞生長因子和細(xì)胞因子?？赏ㄟ^輸注由此獲得的輔助T細(xì)胞、殺傷T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞群，包括將它們向癌癥患者血管內(nèi)、向腫瘤局部輸注等，來抑制腫瘤并且預(yù)防和/或治療癌癥。如上所述可抑制腫瘤的殺傷T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞，或包含它們的免疫細(xì)胞群，可使用本發(fā)明的肽來產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供含有本發(fā)明肽的細(xì)胞培養(yǎng)基?？墒褂眉?xì)胞培養(yǎng)基制備能抑制腫瘤的殺傷T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞，或包含它們的免疫細(xì)胞群。此外，本發(fā)明提供用于生成殺傷T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞，或包含它們的免疫細(xì)胞群的細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，包括上述細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)容器。(5)抗原呈遞外來體本發(fā)明進(jìn)一步提供一種稱為“外來體”(exosome)的細(xì)胞內(nèi)小泡，該外來體將由本發(fā)明肽和HLA抗原形成的復(fù)合物呈遞到其表面。外來體可以使用例如在第平11-510507號(hào)(對(duì)應(yīng)于非日語國際公開的未審查的日本國家階段公布)和第2000-512161號(hào)中公開的日語譯文中詳細(xì)描述的方法進(jìn)行制備。優(yōu)選地，可使用從治療和/或預(yù)防的受試者獲得的抗原呈遞細(xì)胞來制備外來體?？蓪⒈景l(fā)明的外來體以與本發(fā)明肽相似的方式作為癌癥疫苗進(jìn)行注射。在本發(fā)明中使用的HLA抗原類型應(yīng)該與需要治療和/或預(yù)防的受試者的HLA抗原類型相匹配。例如HLA抗原類型是HLA-A2，并優(yōu)選為HLA-A2(HLA_A*0201)?！癏LA-A2”表示蛋白，而“(HLA-A*0201)”表示與該蛋白的區(qū)段相對(duì)應(yīng)的基因(因?yàn)槟壳皼]有表示該蛋白區(qū)段的術(shù)語)。(6)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞和殺傷T細(xì)胞的方法本發(fā)明提供使用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法?？赏ㄟ^使一種或多種本發(fā)明的肽接觸由外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞以刺激樹突細(xì)胞，從而誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。當(dāng)對(duì)受試者施用本發(fā)明的肽時(shí)，可以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出在其表面呈遞本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞?；蛘撸墒褂没伢w方法，其中將抗原呈遞細(xì)胞與本發(fā)明的肽接觸(或用本發(fā)明的肽沖激抗原呈遞細(xì)胞)，然后將細(xì)胞作為疫苗施用于受試者。例如，回體施用方法可包括如下步驟(1)從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞；和(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細(xì)胞接觸本發(fā)明的肽(或用本發(fā)明肽沖激步驟(1)的抗原呈遞細(xì)胞)。可將步驟(2)中獲得的抗原呈遞細(xì)胞作為疫苗施用于受試者。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)顯示殺傷T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法。這種方法包括用包含編碼一種或多種本發(fā)明肽的多核苷酸的基因體外轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞的步驟。要轉(zhuǎn)染的基因可以是DNA或RNA。對(duì)于轉(zhuǎn)染，可合適地使用本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行的多種方法，如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔和磷酸鈣方法，但所述方法不限于此。更具體地，轉(zhuǎn)染可如ReevesME等，(1996)CancerRes.,56:5672_7；ButterfieldLH等，(1998)J.Immunol.，161:5607_13；BoczkowskiD等，(1996)JExp.Med.，184465-72；和公開的W02000/509281日語譯文中所述進(jìn)行。當(dāng)基因轉(zhuǎn)染入抗原呈遞細(xì)胞時(shí)，它們在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。隨后所得的蛋白質(zhì)經(jīng)由MHCI類或II類途徑進(jìn)行加工，并經(jīng)過抗原呈遞途徑作為部分肽呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的表面。本發(fā)明還提供使用一種或多種本發(fā)明肽誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞的方法。通過將一種或多種本發(fā)明肽施用于受試者，可在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出殺傷T細(xì)胞，從而加強(qiáng)靶向在腫瘤組織中呈遞FOXMl的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)?；蛘?，可通過在體外使來自受試者的抗原呈遞細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞與一種或多種本發(fā)明肽接觸，并通過在體外使外周血單核白細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞接觸來刺激細(xì)胞，從而誘導(dǎo)活化的殺傷T細(xì)胞。在回體治療方法中，可通過將活化的殺傷T細(xì)胞回輸(return)入受試者體內(nèi)來增強(qiáng)靶向受試者癌組織中呈遞FOXMl的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。例如，此方法包括如下步驟(1)從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞；(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細(xì)胞接觸本發(fā)明的肽(或用本發(fā)明的肽沖激步驟(1)的抗原呈遞細(xì)胞)；(3)將步驟(2)中的抗原呈遞細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞混合并共培養(yǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞；和(4)從步驟(3)的共培養(yǎng)物中收集⑶8+T細(xì)胞。從步驟(4)中獲得的具有細(xì)胞毒活性的CD8+T細(xì)胞可以作為疫苗施用于受試者。本發(fā)明還提供用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的分離的殺傷T細(xì)胞。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞源自接受治療和/或預(yù)防的受試者?？蓪⑺黾?xì)胞與其他包含呈遞本發(fā)明一種或多種肽的抗原呈遞細(xì)胞或外來體的藥劑組合施用。獲得的殺傷T細(xì)胞對(duì)于呈遞與誘導(dǎo)所用的肽相同的肽的靶細(xì)胞是特異性的。靶細(xì)胞是內(nèi)源性表達(dá)FOXMl的細(xì)胞或者是用FOXMl基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過用本發(fā)明的肽進(jìn)行刺激，在其表面呈遞本發(fā)明的肽的細(xì)胞，如來自胰腺癌、膽管細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、子宮頸癌、骨肉瘤和軟組織肉瘤的癌細(xì)胞，可以是攻擊的目標(biāo)。本發(fā)明還提供呈遞以HLA抗原和一種或多種本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞。優(yōu)選從接受治療和/或預(yù)防的受試者收集表達(dá)一種或多種本發(fā)明的肽或編碼這些肽的核苷酸的抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明的肽、呈遞此肽的抗原呈遞細(xì)胞、外來體、或活化的殺傷T細(xì)胞，可以作為疫苗與其他藥劑組合施用。將參考下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明；然而，不應(yīng)理解為受限于這些實(shí)施例。本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)參考文件均通過提述并入本文。實(shí)施例[實(shí)施例1](1)選擇顯示與HLA-A2有親和力的FOXMl肽使用BIMAS系統(tǒng)分析人FOXMl的氨基酸序列，并選擇了預(yù)計(jì)與20種以上HLA-A2具有結(jié)合親和力的23種。[表1-1]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在本發(fā)明中鑒定的HLA-A2限制性人殺傷T細(xì)胞表位加有下劃線。[實(shí)施例2]通過HLA-A2結(jié)合性FOXMl肽誘導(dǎo)人殺傷T細(xì)胞(1)血液收集經(jīng)知情同意從健康個(gè)體和正在熊本大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)院(KumamotoUniversityMedicalSchoolHospital)經(jīng)受治療的HLA-A2陽性乳腺癌患者收集血液樣品(50ml)。然后，根據(jù)先前報(bào)道的方法(Nakatsura,Τ.等，Eur.J.Immunol.32，826-836，2002)使用Ficoll-Conray密度梯度離心方法分離外周血單核細(xì)胞。(2)從外周血單核細(xì)胞分離CD8陽性細(xì)胞和誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞由分離的外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)FOXMl肽特異性殺傷T細(xì)胞。根據(jù)KomorLH.等的報(bào)道(Komori,H.等，Clin.Cancer.Res.12:2689_2697，2006)誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞。首先，使用MACS分離外周血單核細(xì)胞中的CD8陽性細(xì)胞。在GM-CSF(100ng/mL)和IL_4(20ng/mL)存在的條件下將CD8陰性細(xì)胞培養(yǎng)四天用于分化成樹突細(xì)胞。此后，加入0K-432(0.IKE/mL)用于樹突細(xì)胞的成熟。在第七天，加入每種FOXMl肽(1(^10，然后在11^-7(101^/!^)存在的條件下將樹突細(xì)胞與CD8陽性細(xì)胞一起共培養(yǎng)。在與CD8陽性細(xì)胞一起共培養(yǎng)兩天后，加入IL-2(20IU/mL)。用源自自體CD8陰性細(xì)胞的樹突細(xì)胞進(jìn)行的抗原刺激，以一周為間隔重復(fù)三次，來誘導(dǎo)肽特異性殺傷T細(xì)胞。(3)通過ELISP0T測定法檢查FOXMl-特異性殺傷T細(xì)胞活性使用ELISP0T測定，考察由FOXMl肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞是否確實(shí)特異性地與這些源自FOXMl的肽反應(yīng)而產(chǎn)生IFN-γ。ELISP0T測定通過先前報(bào)道的方法(Komori，H.等，Clin.Cancer.Res.12:2689_2697，2006)進(jìn)行。結(jié)果，對(duì)于用F0XM1362-370,373-382和640-649肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞觀察到F0XM1肽特異性的殺傷T細(xì)胞活化(圖1)。圖1顯示分析F0XM1肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞所得到的代表性結(jié)果。(4)通過細(xì)胞毒性測試檢查殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性通過細(xì)胞毒性測試來檢查誘導(dǎo)的F0XM1肽-特異性殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，使用HLA-A2陽性且表達(dá)F0XM1的細(xì)胞系panc-Ι和HLA-A2陰性且表達(dá)F0XM1的胰腺癌細(xì)胞系PK-8作為刺激細(xì)胞。使用細(xì)胞毒性測試通過鉻釋放測定法評(píng)價(jià)殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。使用先前報(bào)道的方法(Monji，M.等，Clin.Cancer.Res.10=6047-6057,2004)進(jìn)行鉻釋放測定。結(jié)果，對(duì)于用F0XM1362-370、373-382和640-649肽誘導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞，觀察到HLA-A2限制性和F0XM1-特異性細(xì)胞毒活性(圖1)。工業(yè)實(shí)用性在本發(fā)明中，通過鑒定可結(jié)合于HLA-A2并活化癌細(xì)胞-損害性殺傷T細(xì)胞的F0XM1肽，開發(fā)了可靶向大約30%的患有高表達(dá)F0XM1的膽管癌、肺癌、胰腺癌等的日本人癌癥患者的癌癥肽疫苗。如果通過HLA-A2呈遞于殺傷T細(xì)胞的F0XM1肽的有效性可以在探索醫(yī)療中證實(shí)，那么可改進(jìn)臨床應(yīng)用于白種人的可能性。通過鑒定由HLA-A2(其在白種人中的陽性頻率很高)呈遞于殺傷T細(xì)胞的肽，可將肽不僅施用于大約30%的患有高表達(dá)F0XM1的癌癥的日本患者，而且還可施用于很多白種人癌癥患者。權(quán)利要求下面(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO1至3中任一氨基酸序列的肽；(B)包含SEQIDNO1至3中任一氨基酸序列的肽，其中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，并且其中所述肽顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。2.權(quán)利要求1的肽，其中自N末端起第二個(gè)氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。3.權(quán)利要求1的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。4.一種用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的試劑，其包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。5.一種用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑，其包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。6.一種用于誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。7.一種用于誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸作為活性成分。8.一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞的藥劑，其中所述藥劑包含一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。9.針對(duì)權(quán)利要求1的肽的抗體。10.使用權(quán)利要求1的肽誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞群體。11.一種抗原呈遞細(xì)胞，其呈遞包含權(quán)利要求1的肽及HLA抗原的復(fù)合物。12.權(quán)利要求11的抗原呈遞細(xì)胞，其是通過權(quán)利要求6或7的藥劑誘導(dǎo)的。13.—種外來體，其呈遞包含權(quán)利要求1的肽及HLA抗原的復(fù)合物。14.權(quán)利要求13的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA_A2*0201)。15.一種誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括將抗原呈遞細(xì)胞與權(quán)利要求1的肽接觸的步驟。16.一種誘導(dǎo)顯示細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括將編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞的步驟。17.一種誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷)T細(xì)胞的方法，其包括將T細(xì)胞與權(quán)利要求1的肽接觸的步驟。18.一種誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的方法，其包括將權(quán)利要求1的肽施用于受試者的步馬聚o19.一種治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其包括將權(quán)利要求1的肽施用于受試者的步驟。20.權(quán)利要求1的肽用于制備誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力的試劑的用途。21.權(quán)利要求1的肽用于制備治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑的用途。22.權(quán)利要求1的肽，其用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫力。23.權(quán)利要求1的肽，其用于治療和/或預(yù)防癌癥。全文摘要本發(fā)明的目的是通過如下提供對(duì)于日本約30％的以高水平表達(dá)叉頭框M1(FOXM1)的各種類型的癌癥患者實(shí)現(xiàn)癌癥免疫治療的手段鑒定可結(jié)合于HLA-A2的源自FOXM1的肽以活化可殺死癌細(xì)胞的人殺傷T細(xì)胞。具體公開的是選自如下(A)或(B)項(xiàng)的肽(A)包括SEQIDNO1至3中任一個(gè)所示的氨基酸序列的肽，和(B)在包括SEQIDNO1至3中任一個(gè)所示的氨基酸序列的肽中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)、兩個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基并且具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒(殺傷)T細(xì)胞的活性的肽。文檔編號(hào)A61K38/00GK101835792SQ20088011238公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2008年8月12日優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日發(fā)明者中村佑輔,橫峰和典,西村泰治,角田卓也申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司