專利名稱：：(e)-1-(4-((1r,2s,3r)-1,2,3,4-四羥基丁基)-1h-咪唑-2-基)乙酮肟的固體形式的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及(￡)-1-(4-((111,23，311)-1,2,3，4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)乙酮后的固體形式，及其它們用于治療、預防和應對各種疾病和病癥的方法。
背景技術：
：I-磷酸鞘氨醇(SIP)是對多種器官系統(tǒng)具有強力影響的生物活性分子。Saba，J.D.和Hla,T.Circ.Res.94:724-734(2004)。盡管一些人相信該化合物是胞內第二信使，但是其作用方式仍是爭論的主題。出處同前。實際上，甚至對其代謝也缺乏了解。Hla，T.,Science309:1682-3(2005)。目前研究人員相信SIP通過鞘氨醇的磷酸化作用形成，通過脫磷酸作用或裂解被降解。據報道，其裂解成為磷酸乙醇胺和長鏈醛是通過SIP裂解酶催化進行的。出處同前；Pyne&Pyne,BiochemJ.349:385-402(2000)。1-磷酸鞘氨醇是集中在內質網膜內的維生素B6依賴性酶。VanVeldhoven禾口Ma謹erts，J.Biol,Chem.266:12502-12507(1991);VanVeldhoven和Mannaerts，Adv.LipidRes.26:69(1993)。在PCT專利申請WO99/16888中描述了人SP1裂解酶及其基因產物的多核苷酸和氨基酸序列。最近，Schwab和coworkers作出結論，焦糖色III組分，即2-乙?；?4-四羥基丁基咪唑(THI)，當對小鼠施用時抑制SIP裂解酶活性。Schwab,S.等人，Science309:1735-1739(2005)。而另外一些人假設THI通過不同的機制發(fā)揮其作用(例如參見，Pyne,S.G.,ACGCChem,Res.Comm.11:108-112(2000))，顯然對大鼠和小鼠給予該化合物誘導淋巴細胞減少并引起胸腺內成熟T細胞積聚。例如參見，Schwab,出處同前；Pyne,S.G.,ACGCChem.Res.Comm.11:108-112(2000);Gugsyan,R.，等人，Immunology93(3):398-404(1998);Halweg，K.M.和Btichi,G.,J,Org.Chem.50:1134-1136(1985):授權給Kroeplien和Rosdorfer的美國專利4,567,194。但是仍然沒有在除了小鼠和大鼠的其它動物中具有免疫學作用的THI的已知報導。盡管美國專利4,567,194宣稱THI和一些相關化合物可用作免疫抑制藥，但是在人中對該化合物的研究沒有發(fā)現免疫學作用。參見Thuvander，A.禾口Oskarsson，A"Fd.Chem.Toxic.32(1):7-13(1994);Houben,G.F.，等人，Fd.Chem.Toxic.30(9):749-757(1992)。新近，報導了化合物^)-1-(4-((1!1,23，311)-1，2,3，4-四羥基丁基)-1^咪唑-2-基)乙酮肟影響1-磷酸鞘氨醇途徑。參見Augeri等人于2007年1月25日提交的美國專利申請11/698,253。據信該化合物可用于治療諸如類風濕性關節(jié)炎和I型糖尿病的疾病。在開發(fā)藥用化合物中，研究人員認識到，同一化合物的不同固體形式可具有本質上不同的性質。例如，無定形藥物與其結晶形式相比可表現出不同的溶出特性和不同的生物利用度，這些性質可影響藥物必須怎樣給用才能實現最佳效果。無定形和結晶形式的藥物還可具有不同的操作性質(例如流動性、壓縮性)、溶出速率、溶解性和穩(wěn)定性，所有這些可影響劑型的生產。因此，由于種種原因需要獲得藥物的多種形式。另夕卜，管理當局(例如美國食品與藥物管理局(theU.S.FoodandDrugAdministration))在批準含有該藥物的產品之前可能要求確認新藥的所有固體(例如多晶型)形式。A.Goho,ScienceNews166(8):122-123(2004)?；衔锟梢砸环N或多種結晶形式存在，但是這些形式的存在和表征不能準確預測。另外，不存在制備化合物的所有可能的多晶型形式的標準規(guī)程。并且甚至在已經確認一種多晶型物之后，只能通過另外的試驗確定其它形式的存在和表征。出處同前。
發(fā)明內容本發(fā)明部分地涉及新型的(E)-1-(4-((1R，2S，3R)-1，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟及其水合物的固體形式固體形式包括無定形和結晶形式。本發(fā)明還涉及包括該固體形式的劑型，和它們用于應對、治療和預防各種疾病和病癥的方法。可參考以下附圖理解本發(fā)明的某些方面。圖1提供了無水(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟的結晶形式的X射線粉末衍射光譜。該光譜使用VANTEC-1檢波器，在使用銅Ka射線的BrukerD8Advancesystem系統(tǒng)上獲得，范圍在2-50°20，步長0.017。2e，每步時間103s。圖2提供了無水(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮后的結晶形式的拉曼光譜。該光譜在使用用于激發(fā)的1064nmNd:YAG激光器(lOmW)和鍺檢測器的BmkerRFS100分光光度計上獲得。該光譜的測量范圍為3500-25cm"，分辨率為2cnT1。圖3提供了(￡)-1-(4-((111，23，311)-1,2,3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)乙酮肟二水合物的結晶形式的X射線粉末衍射光譜。該光譜使用VANTEC-1檢測器，在使用銅Ka射線的BrukerD8Advancesystem系統(tǒng)上獲得，測量范圍2-50°28，步長為0.017°26，每步時間為103s。圖4提供了(￡)-1-(4-((111,23,311)-1,2，3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)乙酮肟二水合物的結晶形式的拉曼光譜。該光譜在使用用于激發(fā)的1064nmNd:YAG激光器(IOmW)和鍺檢測器的BrukerRFS100分光光度計上獲得。該光譜的測量范圍為3500-25cm'1，分辨率為2cnT1。圖5提供了從(￡)-1-(4-((111,28,311)-1,2，3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)乙酮肟二水合物的單晶獲得的晶體結構的分子視圖。非氫原子的各向異性原子位移橢圓面以50Q/。概率度顯示，氫原子在任意的小半徑上顯現。圖6提供了典型的流式細胞術(FACS)點狀圖，其表示媒介物對照(VC)、(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟(化合物l)、和THI對胸腺T細胞組成(CD4+和CD8+)的影響，和所有小鼠的平均值/Sd(n-3)。圖7提供了典型的FACS點狀圖，其表示媒介物對照(VC)、(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟(化合物1)、和THI對小鼠CD4+細胞的子集(新近胸腺遷出細胞)的影響。圖8提供了典型的FACS點狀圖，其表示媒介物對照(VC)、(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟(化合物1)、和THI對小鼠CD8+細胞的子集(新近胸腺遷出細胞)的影響。圖9表示媒介物對照、THI、(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟(化合物1)、和1-(4-甲基-5-((18，211，311)-1，2,3,4-四羥基丁基)噻哇-2-基)乙酮(化合物2)對小鼠全血計數的影響。圖10表示單一口服劑量給藥的(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟對小鼠中膠原蛋白誘導的關節(jié)炎的影響。圖11表示單一口服劑量給藥的(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮后對恒河猴的白細胞和淋巴細胞計數的影響。具體實施方式本發(fā)明部分地涉及新型的(E)-1-(4-((1R，2S,3R》1,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟的固體形式，其是循環(huán)淋巴細胞的強力抑制劑。1.定義除非另有說明，術語"應對"包括預防已經患有疾病或病癥的患者中的特定疾病或病癥的再發(fā)生，和/或延長已經患有疾病或病癥的患者的緩解時間。該術語包括調節(jié)疾病或病癥的閾值、發(fā)展和/或持續(xù)時間，或改變患者對疾病或病癥應答的方式。除非另有說明，術語"預防"包括在患者開始患有特定疾病或病癥之前發(fā)生的行為，該行為抑制或減輕疾病或病癥的嚴重性。換句話說，該術語包括防病。除非另有說明，化合物的"預防有效量"是足以預防疾病或病況、或與該疾病或病況有關的一種或多種癥狀、或防止其再發(fā)生的量。預防有效量的化合物是指一定量的治療劑(其單獨或與其它藥物組合)，在疾病的預防中提供預防性益處。術語"預防有效量"可包括改善總體防病或增強其它預防性藥物的預防性效力的量。除非另有說明，"基本上無定形"的固體基本上不含結晶化合物。基本上無定形的固體化合物的例子含有低于約20、15、10、5、3、或1重量％的結晶化合物。除非另有說明，"基本上結晶"的固體基本上不含無定形化合物?；旧辖Y晶的固體化合物的例子含有低于約20、15、10、5、3、或1重量％的無定形化合物。除非另有說明，化合物的"治療有效量"是在疾病或病況的治療或應對中足以提供治療益處，或足以延遲與該疾病或病況有關的一種或多種癥狀或使其最小化的量。治療有效量的化合物是指一定量的治療劑(其單獨或與其它藥物組合)，在疾病或病況的治療或應對中提供治療益處。術語"治療有效量"可包括改善全面治療、減少或避免疾病或病況的癥狀或病因、或增強其它治療劑的治療效力的量。除非另有說明，術語"包括"與"包括但不限于"具有相同含義，同樣地，術語"諸如"與"諸如但不限于"具有相同含義。除非另有說明，緊挨著一系列名詞之前的一個或多個形容詞被認為適用于每一個名詞。例如，術語"任選被取代的烷基、芳基或雜芳基"與"任選被取代的烷基、任選被取代的芳基、或任選被取代的雜芳基"具有相同含義。應當注意到，構成較大化合物的一部分的化學部分在本文中可使用當其作為單個分子存在時通常采用的名稱或當其作為取代基時通常采用的名稱進行描述。例如，術語"吡啶"和"吡啶基"當用于描述與其它化學部分結合的部分時具有相同含義。因此，兩個詞語"XOH，其中X是吡啶基"和"XOH，其中X是吡啶"具有相同含義，并且包括吡啶-2-醇、吡啶-3-醇和吡啶-4-醇。也應注意，如果某一結構或某一結構的一部分的立體化學沒有用例如粗體線或虛線表示時，則該結構或該結構的一部分可被解釋為包括該結構的所有立體異構體。另外，圖中顯示的具有不飽和原子價的任何原子被假設為與足夠的氫原子結合從而滿足原子價。另外，用與一條虛線平行的一條實線描述的化學鍵，如果原子價允許的話，包括單鍵和雙鍵(例如芳族)。固體形式本發(fā)明包括@)-1-(4-((111,23,310-1，2,3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)乙酮肟的固體形式。本發(fā)明的一個實施方案包括無水(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟。在特定實施方案中，化合物是無定形形式。在另一個實施方案中，化合物是結晶形式。特定的結晶形式提供了在約4.7、8.2、12.5、17.1、19.9、20.8、29.3、32.0、和/或33.1。26具有峰的X射線粉末衍射(XRPD)圖形。本領域的技術人員充分了解XRPD圖形的相對強度可根據樣品制備方式和數據收集方式的不同而改變。懷著這個目的，在圖1中提供了該結晶形式的XRPD圖形的例子。在圖2中提供了該結晶形式的拉曼光譜的例子。本發(fā)明的另一實施方案包括(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮月虧一水合物。在特定的實施方案中，化合物是無定形形式。在另一個實施方案中，化合物是結晶形式。通過差示掃描量熱法(DSC)測量的特定結晶形式的熔點為約153'C(寬峰)。本發(fā)明的另一實施方案包括(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟二水合物。在特定的實施方案中，化合物是無定形形式。在另一個實施方案中，化合物是結晶形式。特定形式提供了在約12.5、14.1、16.9、20.4、25.2、和/或27.0°20具有峰的XRPD圖形。在圖3中提供了該結晶形式的XRPD圖形的例子。在圖4中提供了該結晶形式的拉曼光譜的例子。本發(fā)明包括本文公開的化合物的結晶和無定形形式的混合物(例如，混合物含有低于約50、40、30、20、10、5或1重量％的無定形物質)。本發(fā)明還包括無水(￡)-1-(4-((111,23，311)-1,2，3，4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)乙酮肟、其一水合物和二水合物的混合物(例如，混合物含有低于約50、40、30、20、10、5或1重量％的無水、一水合物或二水合物)。使用方法本發(fā)明包括調節(jié)(例如增加)有需要的患者(例如小鼠、大鼠、狗、貓或人)中S1P的量的方法，該方法包括對患者給用有效量的本發(fā)明的化合物(即本文公開的化合物)。另一個實施方案包括減少患者血液中T細胞數目的方法，該方法包括對患者給用有效量的本發(fā)明的化合物。另一個實施方案包括治療、應對或預防受S1P水平影響(或具有受S1P水平影響的癥狀)的疾病的方法，該方法包括對有需要的患者給用治療或預防有效量的本發(fā)明的化合物。另一個實施方案包括抑制患者的免疫應答的方法，該方法包括對患者給用有效量的本發(fā)明的化合物。另一個實施方案包括治療、應對或預防自身免疫性或炎性疾病或病癥的方法，該方法包括對有需要的患者給用治療或預防有效量的本發(fā)明的化合物。疾病和病癥的例子包括強直性脊椎炎、哮喘(例如支氣管哮喘)、特應性皮炎、貝赫切特病、移植抗宿主病、川崎綜合征、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、花粉癥、牛皮癬、牛皮癬性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、移植排斥(例如器官、細胞或骨髓的移植排斥)、l型糖尿病、和葡萄膜炎。其它的疾病和病癥包括阿狄森氏病、抗磷脂綜合征、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性胃酸缺乏(achlorhydriaautoimmune)、乳糜瀉、克隆病、庫欣綜合征、皮肌炎、古德帕斯丘綜合征、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性腎上腺萎縮、特發(fā)性血小板減少、蘭-伊綜合征、類天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、結節(jié)性多動脈炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷諾病、萊特爾綜合征、復發(fā)性多軟骨炎、施密特綜合征、舍格倫綜合征、交感性眼炎、高安動脈炎、顳動脈炎、甲狀腺毒癥、潰瘍性結腸炎、和韋格納肉芽腫病?；衔锏牧俊⒔o藥途徑和按劑量給藥方案將根據各種因素而定，如待治療、預防或應對的特定適應癥、患者的年齡、性別和狀況。這些因素所起的作用是本領域公知的，并且可通過常規(guī)試驗進行調整。在特定的實施方案，對人患者給用的化合物的量為約0.5、1、2.5或5mpk。藥物制劑本發(fā)明包括含本發(fā)明的一種或多種化合物的藥物組合物。某些藥物組合物是適于對患者經口、粘膜(例如經鼻、舌下、陰道、面頰、或直腸)、非腸道(例如皮下、靜脈內、快速濃注、肌內或動脈內)或透皮給藥的單一單位劑型。劑型的例子包括但是不限于片劑；薄膜衣片(caplet);膠囊，如軟彈性明膠膠囊；扁囊劑；錠劑(troche);菱形劑；分散劑；栓劑；膏劑；泥罨劑(泥劑)；糊劑；粉劑；敷料；霜劑；膏藥；溶液劑；貼片；氣霧劑(例如鼻噴入劑或吸入劑)；凝膠劑；適于對患者經口或粘膜給藥的液體劑型，包括懸浮劑(例如水性或非水性液體懸浮劑，水包油乳劑，或油包水液體乳劑)，溶液劑，和酏劑；適于對患者非腸道給藥的液體劑型；和可重新構建以提供適于對患者非腸道給藥的液體劑型的無菌固體(例如結晶或無定形固體)。制劑應該適合給藥方式。例如，口服給藥要求腸溶衣以避免本發(fā)明化合物在胃腸道內降解。類似地，制劑可含有促進活性成分向起效部位遞送的成分。例如，化合物可以脂質體制劑形式給予，目的是避免它們被降解酶降解，促進在循環(huán)系統(tǒng)內的轉運，和實現穿過細胞膜到達胞內部位的遞送。劑型的組成、形狀和類型將根據起用途而定。例如，在緊急治療疾病中使用的劑型，與該疾病長期治療中使用的劑型相比，可含有更大量的一種或多種活性成分。同樣地，非腸道劑型，與治療該疾病所使用的口服劑型相比，可包含更少量的一種或多種活性成分。本發(fā)明所包括的特定劑型彼此有差異的這些和其它方式對于本領域技術人員是顯而易見的。例如參見，Remington'sPharmaceuticalSciences,18thed.MackPublishing,EasternPA(1990)?？诜┬瓦m于口服給藥的本發(fā)明的藥物組合物的存在形式可以是離散劑型，諸如但不限于片劑(例如咀嚼片)、薄膜衣片、膠囊、和液體劑(例如調味糖漿劑)。這些劑型含有預定量的活性成分，并且可通過本領域技術人員公知的藥學方法制備。例如參見，Remington'sPharmaceuticalSciences,l她ed.,MackPublishing,EasternPA(1990)。典型的口服劑型通過將活性成分與至少一種賦形劑根據常規(guī)的制藥技術密切混合制備。賦形劑根據用于給藥所需的制劑形式的不同可采取不同形式。因為片劑和膠囊的易于給用，它們代表了最有利的口服劑量單位形式。如果需要，可通過標準的水性或非水性技術對片劑包衣。這些劑型可通過常規(guī)的制藥方法制備。通常，藥物組合物和劑型可通過使活性成分均一地和密切地與液體載體、細粉形式的固體載體、或兩者結合，然后如有必要使產品成形為所需形式而制備?？蓪⒈澜鈩┙Y合進固體劑型內以促進迅速的溶出。還可結合潤滑劑以促進劑型(例如片劑)的生產。非腸道劑型非腸道劑型可通過各種途徑對患者給藥，所述途徑包括但不限于皮下、靜脈內(包括快速濃注)、肌內和動脈內途徑。因為非腸道劑型的給藥通常繞過患者對抗外來物質的天然屏障，因此非腸道劑型特別是無菌的或能夠在對患者給用之前進行滅菌處理。非腸道劑型的例子包括但是不限于準備好用于注射劑的溶液劑、準備溶解在或懸浮在注射用的可藥用媒介物中的干燥產品、準備好用于注射的懸浮劑、和乳劑?？捎糜讷@得本發(fā)明的非腸道劑型的適當的媒介物是本領域技術人員公知的。例子包括但是不限于USP注射用水；水性媒介物，諸如但不限于氯化鈉注射液、林格注射液(Ringer，sInjection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、以及乳酸化林格注射液；可與水混溶的媒介物，諸如但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及非水性媒介物，諸如但不限于玉米油、棉子油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、和苯甲酸芐酯。透皮、局部和經粘膜劑型透皮、局部和經粘膜劑型包括但不限于眼用溶液劑、噴霧劑、氣霧劑、霜劑、洗液、膏劑、凝膠劑、溶液劑、乳劑、懸浮劑，或本領域技術人員公知的其它形式。例如參見，Remington'sPharmaceuticalSciences,16thandl她eds"MackPublishing,EastonPA(1980&1990);禾口IntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,4thed.，Lea&Febiger，Philadelphia(1985)。透皮劑型包括"儲庫型"或"基質型"貼片，起可施用于皮膚并佩戴特定時間，從而可滲透釋放希望量的活性成分。可用于獲得透皮、局部和經粘膜劑型的適當的賦形劑(例如載體和稀釋劑)和其它材料是制藥領域技術人員公知的，并且根據所給出的藥物組合物或劑型要施用的特定組織的不同而不同。根據待治療的特定組織的不同，可在使用本發(fā)明的活性成分治療之前、同時、或之后使用其它組分。例如，可使用滲透增強劑來幫助遞送活性成分到組織。還可調節(jié)藥物組合物或劑型的pH，或藥物組合物或劑型所施用組織的pH以改善一種或多種活性成分的遞送。同樣地，可調節(jié)溶劑載體的極性、其離子強度、或張力以改善遞送。還可向藥物組合物或劑型中添加化合物如硬脂酸鹽，從而有利地改變一種或多種活性成分的親水性或親油性以便改善遞送。在這點上，硬脂酸鹽可作用制劑的脂質媒介物，作為乳化劑或表面活性劑，并且作為遞送增強劑或滲透增強劑?？墒褂没钚猿煞值牟煌柠}、水合物或溶劑化物以進一步調節(jié)得到的組合物的性質。實施例可從以下實施例了解本發(fā)明的各方面，其對本發(fā)明的范圍不構成限制。實施例1:結晶(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮躬二水合物的制備向配備有機械攪拌器、溫度控制器和冷凝器的3L三口圓底燒瓶中加入l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮(100.0g,434.4mmol)、羥胺鹽酸鹽(45.2g,1.5當量)、乙酸鈉(53.4g，1.5當量)和甲醇(HPLC級，l.OL,IOX)。上述溶液在65。C攪拌加熱2小時。然后在15分鐘內向混合物中添加在異丙醇中的HC1溶液(通過在(TC將92.7mlAcCl慢慢加入到200ml異丙醇中新制備的)，得到的混合物在65'C攪拌3小時。將混合物用MeOH(l.OL，IOX)稀釋，并冷卻到室溫，過濾除去沉淀的氯化鈉，固體用甲醇洗滌(IOOml,1X)，溶液在40。C真空濃縮直到開始形成固體(200ml)。然后添加水(l.OL，IOX)，在40'C真空除去殘余的有機溶劑。進行簡單(polish)過濾得到透明的黃色溶液。在室溫下向該溶液中慢慢地添加50。/。的NaOH水溶液，使得混合物的溫度不超過4(TC，直到pH達到7.2(7.0-7.5)。然后將得到的溶液加熱到65'C形成均一溶液，在65'C(60-70'C)真空濃縮直到溶液達到500ml(5X)的總體積。然后將混合物慢慢地冷卻到室溫，在(TC攪拌1小時，過濾收集固體，用水洗滌(0。C,100ml,IXx2)，得到白色結晶固體。向上述的濕固體中添加水(400ml)，得到的混合物在70-80。C加熱直到溶解。將溶液冷卻到室溫然后在0'C攪拌1小時，過濾收集固體，并用水洗滌((TC,100ml,IXx2)，然后在30。C真空干燥過夜，得到99.4g的標題化合物。實施例2:無水結晶(￡)-1-(4-((111,23,311)-1,2,3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟的制備將實施例1的固體與EtOH成淤漿(800ml,8X)，并在75'C加熱1小時，將得到的混合物冷卻到0'C并在0'C攪拌1小時，過濾收集白色固體，用乙醇洗漆(0。C,100ml，IX,x2)，在50'C真空干燥至恒重，得到標題化合物。實施例3:結晶(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物的制備通過將得自實施例1的結晶二水合物在50'C真空干燥約2天得到標題化合物。實施例4:(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物的單晶結構使用具有細焦密封管MoKa作為輻射源的SMARTIKCCD區(qū)域檢測器獲得(E)小(4-((lR,2S，3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物的單晶結構。使用SHELXS-97(Sheldrick，19卯)軟件，并使用SHELXL-97(Sheldrick，1997)作為修訂程序獲得結構溶液。修正技術是對FZ的全矩陣最小二乘法(full-matrixleast-squares)。對？2的擬合優(yōu)度為1.037。單晶形式表現出的特征列于下表1中。表1.樣品和結晶數據<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表3.選擇鍵角(°)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例5:在小鼠中測量對淋巴細胞的影響通過經口管飼法或在飲用水中的方式給用化合物。對于口服給藥實驗，將結晶以10mg/ml懸浮在媒介物(例如水)中使化合物懸浮。用單一劑量100mg/kg的化合物(相當于每種化合物的100mpk的游離堿)和僅僅含媒介物的對照對小鼠(129/B6株的雜交第一代)進行管飼，然后送返回它們的籠子中。在劑量給藥之后18小時使用異氟烷將小鼠麻醉，收集組織用于如下所述的分析。關于飲用水研究試驗，以50mg/L將化合物溶解在含10g/L葡萄糖的酸化水(pH=2.8)中。使小鼠自由攝取含化合物的水(或作為對照的葡萄糖溶液)達72小時。在72小時末，收集組織用于分析。如下獲得CBC測量數據。使用異氟烷將小鼠麻醉，從眼眶后叢收集血液進入EDTA血液收集管(Capiject-MQK，TerumoMedicalCorp.,Elkton，MD)。使用Cell-Dyn3500(AbbottDiagnostics,AbbottPark,IL)或HemaVet850(DrewScientific,Inc.,Oxford,CT)儀器進行自動CBC分析。如下獲得流式細胞術(FACS)測量數據。通過低滲休克將25^1的全血進行溶胞，在2ml的FACS洗滌緩沖液(FWB:PBS/0.1%BSA/0.1%NaN3/2mMEDTA)中洗滌一次，并在黑暗中使用在50|ilFWB中稀釋的與熒光染料結合的抗體的組合在4。C染色30分鐘。染色后，用2ml的FWB洗滌細胞一次，然后將細胞懸浮在300^1FWB中用于收獲。進行脾和胸腺的非無菌摘除的標準程序。通過使組織強迫通過70|im細胞過濾器(Falcon，BectonDickinsonLabware，Bedford,MA)將器官分散為單細胞懸浮液中。對于FACS分析，通過低滲溶胞對RBC進行溶胞，洗滌，使用抗-CD16/CD32(FcBlock,BD-PharMingen,SanDiego，CA)(在FWB中以1/10稀釋)在4。C培養(yǎng)lxl(^細胞達15分鐘。使用在50-100^FWB中稀釋的與熒光染料結合的抗體的組合直接加入到在FcBlock中的細胞上對細胞染色，在黑暗中在4'C染色30分鐘。染色后將細胞用1ml的FWB洗滌一次，并將細胞再懸浮在300)Lil的FWB中用于收獲。除非另作說明，否則所有的抗體購自BD-PharMingen,SanDiego,CA。使用FACSCalibur流式細胞儀禾卩CellQuestPro軟件軟4牛(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose，CA)分析樣品。用于胸腺的抗體混合物是TCRbAPCCy7;CD4APC;CD8PerCP;CD69FITC;和CD62LPE1。用于脾和血液的抗體混合物是B220PerCP;TCRbAPC;CD4APCCy7;CD8PECy7;CD69FITC;和CD62LPE。實施例6:測量在小鼠中對S1P水平的影響使用由Murata，N.，等人在Anal.Biochem.282:115-120(2000)中描述的放射受體結合試驗的改進法測量小鼠(129/B6株的雜交第一代)脾中的S1P水平。該方法采用了過度表達Edg-l(—種S1P受體亞型)的HEK293F細胞，并基于在給定樣品中標記S1P與未標記S1P的競爭。用pEFneoS1P受體(Edg-l)-表達載體轉染HEK293F細胞，并選擇G418抗性細胞克隆。在濕潤的空氣:C02(19:1)氣氛中在含5%(v/v)FBS的DMEM中在12個微孔板(multiplates)上培養(yǎng)表達Edg-l的HEK293F細胞。在實驗前24小時，將培養(yǎng)基改成含有0.1%(w/v)BSA的新鮮DMEM(不含血清)。給予受試化合物之后十八小時，處死小鼠，取出它們的脾并冷凍。使用已知的方法從冷凍組織獲得S1P。例如參見，Yatomi,Y.,等人，FEBSLett.404:173-174(1997)。具體地，在冰上，以1分鐘為間隔，將在1ml的用冰冷卻的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)(含有1mMEGTA、lmMDTT和Roche完全蛋白酶抑制劑)中的IO個小鼠脾均化三次。將所得物質以2500rpm在4。C離心IO分鐘以除去細胞碎片。然后將上清液以45000rpm在4'C在70Ti旋轉器中超離心1小時，以除去與膜結合的蛋白質。棄去上清液，將沉淀再懸浮在最小體積(lml)的用冰冷卻的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)(含有1mMEGTA、1mMDTT和33%甘油，并存在Roche完全蛋白酶抑制劑)中。使用Bradford測定法測量總蛋白質濃度。將SlP提取到氯仿/KCl/NH40H(pH12)中，保留上面的水相。然后在氯仿/甲醇/HCl(pH<l)中提取，保留下層的有機相并蒸發(fā)得到S1P，其在使用前冷凍保存。臨到試驗之前，通過超聲處理將干燥樣品溶解在結合劑緩沖液中，該緩沖液由20mMTris-HCl(pH7.5)、100mMNaCl、15mMNaF和0.4°/。(w/v)BSA組成。通過放射受體-結合試驗，在Edg-l表達細胞上，基于樣品中[33P]S1P與SIP的競爭性結合，測量樣品的SIP含量。采用用冰冷卻的結合緩沖液將鋪滿的12個微孔板中的Edg-1表達HEK293F細胞洗滌兩次，然后使用含有1nM["P]S1P(每孔約18,00dpm)和增加劑量的可靠SIP或者試樣的最終體積為0.4ml的相同緩沖液培養(yǎng)。將板在冰上保留30分鐘，使用相同的用冰冷卻的結合緩沖液洗滌細胞兩次以除去未結合的配體。使用由0.1%SDS、0.4%NaOH和2%Na2C03組成的溶液使細胞增溶，通過液體閃爍計數器計數放射性。通過從標準位移曲線外推推定試驗孔中的SIP含量。通過將標準曲線獲得的值乘以S1P提取回收率和稀釋因子來計算初始試驗樣品中的S1P含量。實施例7:對小鼠中的淋巴細胞的影響使用上面描述的方法，確定各種化合物的體內效果。如圖6-8所示，當在飲用水中對小鼠(129/B6株的雜交第一代)給予時，THI和(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟(化合物l)都減少淋巴細胞從胸腺溢出。圖9表示媒介物對照(飲用水)、THI、(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟(化合物1)、和l-(4-甲基-5-((18,211，311)-1,2,3，4-四羥基丁基)噻唑-2-基)乙酮(化合物2)對全血計數的效果。有趣的是，沒有觀察到化合物2具有由Pyne(WO97/46543)報告的體內效果。實施例8:膠原蛋白誘導的關節(jié)炎模型膠原蛋白誘導的關節(jié)炎(CIA)是廣泛使用的類風濕性關節(jié)炎(RA)的模型，類風濕性關節(jié)炎是一種由自身免疫性和炎性過程引起的關節(jié)疾病?？偟貐⒁姡琖ooleyP.H.等人，J.Immunol.135(4):2443國2451:A.Persidis,NatureBiotechnology17:726-728;CurrentProtocolsinImmunologv(JohnWiley&Son,Inc.1996)。早期研究確立了與某些H-2單模標本連接的CIA的反應序位。新近，Campbell和同事在C57BL/129sv(H-2b)小鼠中再次評價了CIA并發(fā)現C57B6背景由來的小鼠可以發(fā)展成CI八。CampbellI.K，etal.Eur.J.Immunol.30:1568-1575(2000)。在本發(fā)明中，通過在4'C攪拌過夜，將注射用膠原蛋白，即，2mg/ml的小雞膠原蛋白II型(CII)(Sigma)溶于10mM乙酸中。完全弗氏佐劑(CFA)在購買時是制好的(Sigma)。使用玻璃注射器，臨在免疫注射前將CII在等體積CFA中乳化。為了對小鼠進行免疫注射，使用玻璃注射器和26G針，在尾巴根部對小鼠皮內注射CII/CFA乳液。每次注射使用CFA和在總體積50lU的CFA中的100ug的小雞CII。在初次免疫注射之后2周通過相同途徑強化免疫注射在CFA中乳化的lOOug的cn。注射膠原蛋白導致小鼠爪墊和關節(jié)腫脹，每2-3天檢査小鼠的關節(jié)炎發(fā)病，其通過用卡鉗測量后爪爪墊的厚度與視覺評價后腿受影響的關節(jié)相組合進行評價。在所述疾病初次發(fā)作后的10周跟蹤CIA的進展，之后通過關節(jié)的組織學評價疾病。如果小鼠在II型膠原蛋白免疫注射150天內沒有發(fā)展成CIA則認為它們是關節(jié)炎陰性的。通過己確立的視覺評分系統(tǒng)測定小鼠有無關節(jié)炎。在小鼠CIA中，可影響到任一個爪或影響到四個爪。炎癥在其最高峰時從踝延伸直至趾并且以極度腫脹和發(fā)紅為特征。一旦出現關節(jié)炎，一周檢查各爪2到3次。為了評價炎癥的嚴重程度，使用了廣泛采用的0到4分的視覺評分系統(tǒng)，其中0=正常，沒有發(fā)紅和腫脹；1-發(fā)紅和輕微腫脹限于爪中部或踝關節(jié)或單個趾；2-發(fā)紅和輕微腫脹延伸到踝和爪中部或者在超過一個趾內腫脹；3=發(fā)紅和中度腫脹從踝延伸至跖骨關節(jié)；和4=發(fā)紅和嚴重腫脹，包括踝、爪和趾。實施例9:在膠原蛋白誘導的關節(jié)炎模型中的效果在上述模型中使用30只小鼠(129/B6株的雜交第一代)測定(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟在CIA模型中的效果。將小鼠隨機分成兩個盲組，其接受0mpk(媒介物對照)或者100mpk的化合物。媒介物是無菌的蒸餾水。媒介物對照的劑量為10iU/g體重。劑量給藥為經口管飼每天一次。在CIA實驗開始前三天開始，并延續(xù)整個試驗。圖IO表示化合物對CIA隨時間的效果，其中累積分數是前肢和踝得分的總和。實施例10:在猴中的效果通過CovanceResearchProductsInc.(Alice,TX)研究(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟在20只非本土(ncm-iiaiVe)雄性恒河猴中的作用。使用分別用數字標記的紋身確定每只動物。在劑量給藥之前使動物適應約ll天，在劑量給藥時，認為動物是年輕的成年/適齡成年。在適應和試驗期間，將動物圈養(yǎng)在單獨的籠子中，在劑量給藥后的至少48小時不將動物攙和，從而監(jiān)控任何與媒介物和受試物質有關的效果。動物可隨意獲取未認證的靈長類動物飲食，除了關于劑量給藥而特意指出之外。在非禁食期間還酌情提供了水果和其它治療。隨意獲取水。受試化合物在環(huán)境條件(近似于室溫)下避光保存在有干燥劑的密封容器中。在媒介物對照組中口服給用由Covance提供的蒸餾水。在給藥當天制備試驗所用的受試物質劑量制劑。對于每個組，稱重適當量的受試物和適當體積的蒸餾水。在劑量給予之前使所有動物禁食一夜并持續(xù)到劑量給予后大約4小時。根據劑量給予當天取得的體重計算個體劑量。通過鼻胃插管給予口服劑量。在撤離管飼用管之前，用大約5ml的水沖刷管，對于血液學分析，收集每只動物劑量給用前(-7天)，劑量給用前(-3天)，和劑量給用后8、16、24、32和48小時的血液(大約0.5ml)。使用采血當天獲得的新鮮樣品進行全血血液學試驗。如圖11所示，單一口服劑量的(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)乙酮肟在劑量給予后的32小時測量時，對猴子的白細胞和淋巴細胞計數具有顯著影響。上面引用的所有文獻(例如專利和專利申請)作為參考以全文并入本文。權利要求1.(E)-1-(4-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-基)-乙酮肟或其水合物的基本上無定形的固體形式。2.權利要求1所述的固體形式，其中(￡)-1-(4-((111,23，311)-1,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟是無水形式。3.權利要求l所述的固體形式，其中水合物是一水合物。4.權利要求l所述的固體形式，其中水合物是二水合物。5.(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟或其水合物的基本上結晶的固體形式。6.權利要求5所述的固體形式，其中(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟是無水形式。7.權利要求5所述的固體形式，其中水合物是一水合物。8.權利要求5所述的固體形式，其中水合物是二水合物。9.結晶無水(￡)-1-(4-((111，23,311)-1，2，3，4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟。10.權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟，其X射線粉末衍射光譜包括在約4.7、8.2和12.5°29的峰。11.權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮月虧，其X射線粉末衍射光譜包括在約17.1、19.9禾Q20.8。20的峰。12.權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟，其X射線粉末衍射光譜包括在約29.3、32.0禾卩33.1°20的峰。13.權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟，其具有的X射線粉末衍射光譜與圖1所示的X射線粉末衍射光譜基本上相同。14.權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟，其具有的拉曼光譜與圖2所示的拉曼光譜基本上相同。15.結晶(￡)-1-(4-((111,28,311)-1，2,3，4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物。16.結晶(￡)-1-(4-((111,28,311)-1,2，3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物。17.權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物，其X射線粉末衍射光譜包括在約12.5、14.1和16.9。20的峰。18.權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物，其X射線粉末衍射光譜包括在約20.4、25.2和27.01的峰。19.權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物，其具有的X射線粉末衍射光譜與圖3所示的X射線粉末衍射光譜基本上相同。20.權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物，其具有的拉曼光譜與圖4所示的拉曼光譜基本上相同。21.權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物，其是三斜晶并占據P1空間群。22.包括權利要求1或5所述的固體形式和可藥用賦形劑的組合物。23.包括權利要求9所述的結晶無水(￡)-1-(4-((111,23,311)-1,2,3，4-四羥基丁基HH-咪唑-2-基)-乙酮肟和可藥用賦形劑的組合物。24.包括權利要求15所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物和可藥用賦形劑的組合物。25.包括權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物和可藥用賦形劑的組合物。26.包括權利要求1或5所述的固體形式的單一單位劑型。27.包括權利要求9所述的結晶無水(￡)-1-(4-((111,23,311)-1,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟的單一單位劑型。28.包括權利要求15所述的結晶(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l,2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物的單一單位劑型。29.包括權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物的單一單位劑型。30.減少患者的循環(huán)淋巴細胞數目的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求1或5所述的固體形式。31.減少患者的循環(huán)淋巴細胞數目的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟。32.減少患者的循環(huán)淋巴細胞數目的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求15所述的結晶(E)-l-(4-((lR,2S，3R)-l，2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物。33.減少患者的循環(huán)淋巴細胞數目的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l，2,3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物。34.調節(jié)患者的S1P量的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求1或5所述的固體形式。35.調節(jié)患者的S1P量的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2，3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟。36.調節(jié)患者的S1P量的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求15所述的結晶(￡)-1-(4-((111,28，311)-1，2，3,4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物。37.調節(jié)患者的S1P量的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求16所述的結晶(￡)-1-(4-((111,23，3^-1,2，3，4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物。38.抑制患者免疫應答的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求1或5所述的固體形式。39.抑制患者免疫應答的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟。40.抑制患者免疫應答的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求15所述的結晶@)-1-(4-((111,23,311)-1，2,3，4-四羥基丁基)-111-咪唑_2_基)_乙酮肟一水合物。41.抑制患者免疫應答的方法，該方法包括對患者給用有效量的權利要求16所述的結晶(￡)-1-(4-((111,23，311)-1，2,3，4-四羥基丁基)-111-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物。42.治療、應對或預防自身免疫性或炎性疾病或病癥的方法，該方法包括對有需要的患者給用治療或預防有效量的權利要求1或5所述的固體形式。43.治療、應對或預防自身免疫性或炎性疾病或病癥的方法，該方法包括對有需要的患者給甩治療或預防有效量的權利要求9所述的結晶無水(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟。44.治療、應對或預防自身免疫性或炎性疾病或病癥的方法，該方法包括對有需要的患者給用治療或預防有效量的權利要求15所述的結晶(E)-l-(4-((lR，2S,3R)-l,2,3,4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟一水合物。45.治療、應對或預防自身免疫性或炎性疾病或病癥的方法，該方法包括對有需要的患者給用治療或預防有效量的權利要求16所述的結晶(E)-l-(4-((lR，2S，3R)-l，2，3，4-四羥基丁基)-lH-咪唑-2-基)-乙酮肟二水合物。46.權利要求42-45中任一項的方法，其中自身免疫性或炎性疾病或病癥是類風濕性關節(jié)炎、移植抗宿主病、I型糖尿病或葡萄膜炎。全文摘要本發(fā)明公開了(E)-1-(4-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羥基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮肟的固體形式，包含其的組合物，及其用法。文檔編號A61K31/4164GK101284818SQ20081008709公開日2008年10月15日申請日期2008年4月11日優(yōu)先權日2007年4月12日發(fā)明者吳文學,張海明申請人:萊西肯醫(yī)藥有限公司