專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于治療癌癥的涉及mda-7的組合物和方法
背景技術(shù)：
：本申請(qǐng)涉及2005年2月8日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/650,807，2005年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/661,679，2005年4月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/676,096，2005年12月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/749,372，其各自以引用參考方式全文并入本文。政府依據(jù)國(guó)立衛(wèi)生研究院的基金號(hào)CA16672、CA78778和CA102716可擁有本發(fā)明的權(quán)益。A.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地說(shuō)來(lái)涉及分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更特別地，其涉及包含腫瘤抑制劑例如MDA-7和一種或多種COX-2抑制劑的用于治療癌癥的方法和組合物。該治療組合比單獨(dú)的各組分更有效且超過(guò)其預(yù)計(jì)的累加效應(yīng)。在其他某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用腫瘤抑制劑例如MDA-7和Hsp90抑制劑(例如格爾德霉素及其類(lèi)似物和衍生物)治療癌癥的方法和組合物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含MDA-7和維生素E化合物的用于治療癌癥的方法和組合物。本發(fā)明也涉及包含腫瘤抑制劑例如MDA-7和腫瘤壞死因子(TNF)的用于治療癌癥的方法和組合物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含MDA-7和VEGF抑制劑的用于治療癌癥的方法和組合物。本發(fā)明也涉及包含MDA-7和IL-10抑制劑的治療癌癥的方法和組合物。B.相關(guān)領(lǐng)域的描述1.MDA-7黑素瘤分化相關(guān)基因7(mda-7)編碼24kDa的蛋白并且是最近描述的腫瘤抑制基因，該基因選擇性地誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡，但正常細(xì)胞幸免(Mhashilkar等人，2001；Mhashilkar等人，2003；Pataer等人，2002)。MDA-7的腺病毒超表達(dá)導(dǎo)致多種腫瘤類(lèi)型的腫瘤選擇性生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，所述腫瘤類(lèi)型包括結(jié)腸直腸癌(Sarkar等人，2002)、乳腺癌(Mhashilkar等人，2003)、前列腺癌(Mhashilkar等人，2001)和肺癌(Chada等人，2004)。最近顯示mda-7(Ad-mda7)和曲妥單抗的腺病毒介導(dǎo)的遞送的組合通過(guò)減少Akt和β連環(huán)蛋白的磷酸化在超表達(dá)HER-2/neu(c-erbB2)的乳腺癌細(xì)胞中增加抗腫瘤活性。(McKenzie等人，2004)。也證明了腺病毒介導(dǎo)的mda-7的超表達(dá)導(dǎo)致人肺癌細(xì)胞中PKR的快速誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致eIF-2α、其他PKR靶底物的磷酸化和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(Pataer等人，2002)。PKR是干擾素誘導(dǎo)的且為雙鏈RNA激活的蛋白激酶。盡管對(duì)其在介導(dǎo)干擾素(IFN)的抗病毒和抗增殖效應(yīng)中的功能是其最好特征，但PKR也參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤抑制(Taylor等人，1999)。很清楚PKR參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化的調(diào)控(Williams，2001；Barber，2001；Jagus等人，1999)。也顯示PKR受熱激蛋白90(Hsp90)分子伴侶復(fù)合物的調(diào)節(jié)(Donze等人，2001)。Hsp90和其共伴侶分子(co-chaperone)p23通過(guò)PKR的N末端雙鏈(ds)RNA結(jié)合區(qū)域以及通過(guò)其激酶結(jié)構(gòu)域與PKR結(jié)合(Donze等人，2001)。dsRNA和格爾德霉素(此后稱(chēng)為GA)都誘導(dǎo)Hsp90和p23從成熟PKR的快速解離；在體內(nèi)和體外激活PKR(Donze等人，2001)。Hsp90是暴露于環(huán)境應(yīng)激的細(xì)胞中的蛋白重折疊和幾個(gè)關(guān)鍵調(diào)控蛋白的構(gòu)象成熟所需的伴侶分子(Maloney和Workman，2002)。2.NSAIDS不斷增加的實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明阿司匹林和一些其他的非甾體抗炎藥(NSAID)對(duì)結(jié)腸直腸癌產(chǎn)生化學(xué)預(yù)防作用且也可能對(duì)胃、食道(Thun等人，1991)甚至膀胱(Earnest等人，1992)癌產(chǎn)生該作用。阿司匹林、布洛芬、吡羅昔康(Reddy等人，1990；Singh等人，1994)、吲哚美辛(Narisawa，1981)和舒林酸(Piazza等人，1997；Rao等人，1995)在經(jīng)AOM處理的大鼠模型中有效地抑制結(jié)腸致癌作用，而氟吡洛芬在APC(Min)+小鼠模型中具有已證明的抗腫瘤效應(yīng)(Wechter等人，1997)。NSAID也抑制具有被激活的Ki-ras的腫瘤的發(fā)展(Singh和Reddy，1995)。NSAID似乎通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制致癌作用(Bedi等人，1995；Lupulescu，1996；Piazza等人，1995；Piazza等人，1997b)。許多研究表明NSAID的化學(xué)預(yù)防特性，包括細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，是其抑制前列腺素合成的能力的功能(綜述于DuBois等人，1996；Lupulescu，1996；Vane和Botting，1997)。有人假設(shè)這可通過(guò)抑制環(huán)氧合酶(COX)活性來(lái)實(shí)現(xiàn)，這樣就抑制促炎前列腺素的合成(Hinz等人，1999)。P4-15流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究表明結(jié)腸致癌作用至少部分通過(guò)COX同工酶(COX-1和2)調(diào)節(jié)前列腺素的產(chǎn)量來(lái)介導(dǎo)(Kawamori等人，1998)。然而近年來(lái)的研究表明，NSAID可通過(guò)前列腺素依賴(lài)性和非依賴(lài)性機(jī)制抑制致癌作用(Alberts等人，1995；Piazza等人，1997a；Thompson等人，1995；Hanif，1996)。舒林酸砜(Sulindacsulfone)(NSAID舒林酸的代謝物)缺乏COX抑制性活性但在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Piazza等人，1995；Piazza等人，1997b)且在幾種致癌作用的嚙齒目動(dòng)物模型中抑制腫瘤的發(fā)展(Thompson等人，1995；Piazza等人，1995，1997a)。有人猜測(cè)舒林酸活性的潛在機(jī)制可能是酪氨酸激酶的直接或間接抑制(Winde等人，1998)，而不是其他NSAID試劑的COX抑制作用。已就其在人臨床試驗(yàn)中的效果檢查了幾種NSAID。已完成布洛芬的IIa期試驗(yàn)(一個(gè)月)，甚至在300mg/天的劑量上也觀察到平粘膜(flatmucosa)中前列腺素E2(PGE2)水平的顯著減少。300mg劑量的布洛芬是非常低的劑量(治療劑量范圍在1200-3000mg/天或更多)，因此甚至在很長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)不可能看到毒性。然而，在動(dòng)物化學(xué)預(yù)防模型中，布洛芬不如其他NSAID有效。研究已顯示了NSAID、阿司匹林對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生率的有益作用，只有在每周總共1000mg或更高的劑量下效果才明顯(Giovannucci等人，1994)。然而，三個(gè)大群組研究對(duì)阿司匹林的有益作用產(chǎn)生了矛盾的報(bào)導(dǎo)(Gann等人，1993；Giovannucci等人，1996；Greenberg等人，1993)。一組研究人員最近顯示在80和160mg/天的劑量之間可減少PGE2α。相反地，另一組研究人員已顯示這些低劑量的阿司匹林對(duì)結(jié)腸粘膜前列腺素沒(méi)有這樣的作用，盡管證明了上胃腸道粘膜中前列腺素的本質(zhì)性知識(shí)。這些研究的結(jié)果表明80mg的阿司匹林的劑量是該試劑對(duì)結(jié)腸粘膜的效應(yīng)的閾值。因此，由于關(guān)于其功效與嚴(yán)重腦血管和胃腸副作用(和長(zhǎng)期使用阿司匹林相關(guān)的)的明顯的風(fēng)險(xiǎn)偶聯(lián)(Singh，1998)的問(wèn)題，通常不推薦阿司匹林用于普通人群的結(jié)腸直腸癌的最初化學(xué)預(yù)防。NSAID吡羅昔康是動(dòng)物模型中最有效的化學(xué)預(yù)防劑(Pollard和Luckert，1989；Reddy等人，1987；Ritland和Gendler，1999)，盡管其在最近的IIb試驗(yàn)中顯示了副作用。NSAID的副作用的大薈萃分析也表明吡羅昔康比其他NSAID具有更多的副作用(Lanza等人，1995)。此外，至少在一個(gè)研究中有人認(rèn)為雖然上胃腸道的腫瘤對(duì)吡羅昔康治療易感，但十二指腸和結(jié)腸的腫瘤對(duì)其具有相對(duì)的抗性(Ritland和Gendler，1999)。已顯示舒林酸在家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者中使腺癌產(chǎn)生退化(Muscat等人，1994)，盡管至少一個(gè)關(guān)于散發(fā)性腺瘤的研究已顯示沒(méi)有這樣的效果(Ladenheim等人，1995).得益于新的分子技術(shù)學(xué)的快速發(fā)展和人類(lèi)基因組計(jì)算的完成，新的治療靶正被開(kāi)發(fā)用于抗癌癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。最近根據(jù)原理設(shè)計(jì)的藥物是塞來(lái)考昔-選擇性環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑，其已顯示作為抗炎藥的活性(Garner等人，2002)和在化學(xué)預(yù)防背景中的活性(Kismet等人，2004)。環(huán)氧化酶2(以前稱(chēng)為前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物H合酶)是環(huán)氧合酶的兩種同工型中的一種。與組成型表達(dá)的環(huán)氧合酶1不同，COX-2是誘導(dǎo)型酶且在許多腫瘤類(lèi)型(包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和胃癌)中顯示高度增加的表達(dá)，表明COX-2在致癌作用中起著原因作用(Koehne和Dubois，2004；Howe等人，2001)。最近，已顯示塞來(lái)考昔促進(jìn)生長(zhǎng)停止和通過(guò)下調(diào)促存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶、蛋白激酶B(PKB)/Akt來(lái)誘導(dǎo)多種癌癥(包括乳腺癌)的細(xì)胞凋亡(Basu等人，2004；Kulp等人，2004；El-Rayes等人，2004；Leng等人，2003)。HER-2/neu的超表達(dá)是攻擊性、侵襲性乳腺癌的標(biāo)志(Ross等人，2003)。近年來(lái)的研究已表明COX-2的超表達(dá)可以是攻擊性乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志且似乎與低存活率相關(guān)(Denkert等人，2004)。在HER-2/neu陽(yáng)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)高水平的COX-2，已有人提出正反饋回路存在于這些標(biāo)記之間(Benoit等人，2004)。COX-2的表達(dá)增加HER-2/neu基因的轉(zhuǎn)錄而COX-2的抑制導(dǎo)致減少的HER-2/neu水平。增加的HER-2/neu的表達(dá)導(dǎo)致經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)至Akt/蛋白激酶B(PKB)的組成型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Le等人，2005)。這些絲氨酸/蘇氨酸激酶的激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖和存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Craven等人，2003)。之前顯示Ad-mda7在乳腺癌細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)Akt存活途徑(McKenzie等人，2004)。3.Hsp90抑制劑格爾德霉素(GA)和17-烯丙基-氨基-格爾德霉素(17AAG)可特異性結(jié)合Hsp90的NH2末端部分中的ATP結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制其功能。Hsp90功能的抑制導(dǎo)致其保護(hù)的蛋白(clientprotein)(包括類(lèi)固醇類(lèi)受體、HER2和Raf、PDK1、Akt和cdk4激酶)降解(Sausville等人，2003)。相反地，以前的研究已顯示GA可誘導(dǎo)Hsp90和p23從成熟的PKR快速分離，在體內(nèi)和體外都激活PKR(Donze等人，2001)。格爾德霉素(GA)是天然存在的具有顯著抗癌特性的安沙霉素抗生素。17-烯丙基氨基，17-脫甲氧基格爾德霉素(17AAG)、格爾德霉素衍生物在臨床前模型中顯示良好的活性和腫瘤選擇性且現(xiàn)已進(jìn)行至癌癥患者的I期、II期臨床試驗(yàn)，并具有鼓舞人心的初步結(jié)果(Kamal等人，2003)。使用17AAG和急性照射的組合療法在人前列腺癌中產(chǎn)生了超累加(supra-additive)生長(zhǎng)抑制效應(yīng)(Enmon等人，2003)。發(fā)現(xiàn)使用低水平的17AAG的組合治療增強(qiáng)紫杉醇和阿霉素對(duì)超表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞系的效應(yīng)(Solit等人，2003)。以前的研究表明17AAG在乳腺癌細(xì)胞中在破壞PI3K/AKT途徑，而AKT的下調(diào)與結(jié)腸腫瘤細(xì)胞對(duì)丁氯倍他松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)的易感性相關(guān)(Rahmani等人，2003)。4.維生素E化合物已公布了描述維生素E琥珀酸酯(VES)的抗腫瘤活性的研究(Prasad等人，1982)。近年來(lái)的研究已表明腹膜內(nèi)施用的VES在動(dòng)物異種移植物和同種異體移植物模型中具有抗腫瘤活性(Malafa等人，2000；Malafa等人，2002)。研究顯示VES通過(guò)阻斷DNA合成、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制(Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2001；You等人，2001；You等人，2002；Yu等人，2001)。5.癌癥幾乎半數(shù)所有男性和超過(guò)三分之一的所有女性在其一生中都將遭受癌癥。每年有超過(guò)一百萬(wàn)人被診斷患有癌癥。盡管癌癥死亡率總體在降低，但每年有許多人繼續(xù)死于一些類(lèi)型的癌癥。肺癌、結(jié)腸/直腸癌、前列腺癌和乳腺癌是造成最多死亡的癌癥。在威脅女性健康的各種癌癥中，乳腺癌是造成女性中癌癥相關(guān)性死亡的第二大病因。據(jù)報(bào)導(dǎo)女性中所有癌癥死亡的大約15％是由乳腺癌造成的，其發(fā)生率只稍微落后于肺癌(Jel等人，2002)。此外，乳腺癌是世界范圍內(nèi)大多數(shù)發(fā)達(dá)和發(fā)展中國(guó)家癌死亡率的頭號(hào)原因之一(Pisani等人，1999)。盡管在整個(gè)新藥和治療模型的發(fā)展過(guò)程中已取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，但仍存在對(duì)提高治療結(jié)果同時(shí)減少治療相關(guān)的毒性的急迫需要(Peto等人，2000)。對(duì)于其他癌癥也是這樣。本發(fā)明解決了對(duì)于癌癥的新的和改進(jìn)的療法的需求。發(fā)明概述本發(fā)明總地說(shuō)來(lái)提供了使用MDA-7聯(lián)合一種或多種另外的治療劑來(lái)治療癌癥的方法和組合物。所述另外的治療劑包括COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物、TNF、VEGF抑制劑或IL-10抑制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用MDA-7和COX-2抑制劑的組合治療癌癥的方法和組合物。本發(fā)明也提供了使用MDA-7和Hsp90抑制劑的組合治療癌癥的方法和組合物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用MDA-7和維生素E化合物的組合治療癌癥的方法和組合物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用MDA-7和腫瘤壞死因子(TNF)的組合治療癌癥的方法和組合物。本發(fā)明也涉及使用MDA-7和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑的組合治療癌癥的方法和組合物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用MDA-7和IL-10抑制劑治療癌癥的方法和組合物。本發(fā)明的方法具體地包括用于在患者中治療癌癥的方法，其包括給患者提供MDA-7聯(lián)合i)COX-2抑制劑、ii)Hsp90抑制劑、iii)維生素E化合物、iv)TNF、v)VEGF抑制劑、vi)IL-10抑制劑或vii)i)、ii)、iii)、iv)、v)和vi)中一個(gè)或多個(gè)的組合。當(dāng)這些化合物i)、ii)、iii)、iv)、v)或vi)用于MDA-7的上下文中時(shí)，可將其總地稱(chēng)為“MDA-7聯(lián)合劑(conjunctiveagent)”，而使用MDA-7和i)、ii)、iii)、iv)、v)或vi)的任何聯(lián)合療法可稱(chēng)為“MDA-7聯(lián)合療法(conjunctivetherapy)”。在某些實(shí)施方案中提供的量可視為“有效量”。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)給細(xì)胞施用編碼MDA-7的表達(dá)構(gòu)建體，然后所述構(gòu)建體在細(xì)胞中表達(dá)MDA-7來(lái)給細(xì)胞提供MDA-7。在特定的實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體是包含編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體。在一些實(shí)施方案中，MDA-7核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。例如，所述組合物可包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，在施用MDA-7之前、期間或之后施用抗炎劑?？赏ㄟ^(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給患者提供MDA-7。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使患者接受放射療法、化學(xué)療法和/或惡化前期病損或惡性病損的手術(shù)切除術(shù)。在某些實(shí)施方案中，也涉及用于通過(guò)給細(xì)胞提供MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑來(lái)治療乳腺癌細(xì)胞的方法和組合物，所述MDA-7聯(lián)合劑是針對(duì)所述細(xì)胞的COX-2抑制劑。一些實(shí)施方案涉及用于在患者中輻射敏化癌細(xì)胞的方法，該方法包括給所述細(xì)胞提供MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑。術(shù)語(yǔ)“輻射敏化”是指使細(xì)胞對(duì)輻射的破壞效果更易感。要理解“有效量”是指以產(chǎn)生治療益處的量為患者提供1)MDA-7和2)i)COX-2抑制劑、ii)Hsp90抑制劑、iii)維生素E化合物、iv)TNF、v)VEGF抑制劑或vi)IL-10抑制劑或與MDA-7療法一起使用的其他試劑中的任何試劑。要理解給患者提供一定量的MDA-7和一定量的i)COX-2抑制劑、ii)Hsp90抑制劑、iii)維生素E化合物、iv)TNF、v)VEGF抑制劑或vi)IL-10抑制劑，所述兩種量據(jù)信都促成治療有益處。在其中將多于兩種不同的物質(zhì)(例如維生素E化合物的組合或維生素E化合物和COX-2抑制劑的組合)與MDA-7一起提供的實(shí)施方案中，要理解術(shù)語(yǔ)“有效量”是指給患者提供這樣的量，該量作為提供給患者的物質(zhì)的組合的量的結(jié)果提供了治療有益方面。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含MDA-7多肽和另一種抗癌劑，例如COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物或其他MDA-7聯(lián)合劑例如VEGF抑制劑、TNF或IL-10抑制劑。因此，在本發(fā)明的一些方法中，給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物。術(shù)語(yǔ)“純化的”是指先前將MDA-7蛋白與其他蛋白分離開(kāi)和指在被配制在組合物中之前該蛋白純度至少為大約95％。在某些實(shí)施方案中，純化的MDA-7蛋白具大約或至少大約95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5％或更高或其中可衍生的任何范圍的純度。此外，預(yù)期純化的MDA-7蛋白是有活性的，即其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。也可根據(jù)活性驗(yàn)證所述純化的MDA-7蛋白是合格的，這樣其活性至少是等量的未純化的MDA-7(例如通過(guò)重組方法制備的)的活性(通過(guò)細(xì)胞凋亡活性測(cè)量)的大約、至少大約或至多大約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更多(或其中可衍生的任何范圍)。在其他實(shí)施方案中，其包含可在患者中或患者的細(xì)胞中產(chǎn)生MDA-7多肽、COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E、VEGF抑制劑、TNF多肽或IL-10抑制劑的化合物。患者是在接受治療的患有癌癥的任何動(dòng)物。在本發(fā)明的許多實(shí)施方案中，患者是哺乳動(dòng)物，特別是人。所述癌癥可以是任何類(lèi)型的癌癥。例如，所述癌癥可以是黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥包括上皮癌細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，所述癌癥是乳腺癌、肺癌或前列腺癌。受試者可以是在施用相關(guān)的預(yù)防劑時(shí)已知或懷疑無(wú)特定疾病或健康相關(guān)性狀況的受試者。受試者可以是例如無(wú)已知疾病或健康相關(guān)性狀況的受試者(即，健康受試者)。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是處于發(fā)生特定疾病或健康相關(guān)性狀況的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。例如，所述受試者可具有已在過(guò)去進(jìn)行治療的癌癥的歷史，其處于發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)中。所述受試者可以是因?yàn)檫z傳易感性或因?yàn)檫^(guò)去的化學(xué)治療的原因而處于發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。可選擇地，所述受試者可以是具有被成功治療的癌癥的歷史，目前無(wú)疾病，但處于發(fā)生第二原發(fā)性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。例如，該風(fēng)險(xiǎn)可以是過(guò)去用作第一原發(fā)性腫瘤的療法的放射療法或化學(xué)療法造成的。在一些實(shí)施方案中，所述受試者可以是具有第一疾病或健康相關(guān)性狀況的受試者，所述受試者處于發(fā)生第二疾病或健康相關(guān)性狀況的風(fēng)險(xiǎn)中。“治療”和“醫(yī)治”是指為獲得疾病或健康相關(guān)性狀況的治療性益處對(duì)受試者施用或使用藥劑、藥物或藥物治療劑或?qū)κ茉囌邔?shí)施治療方法或方案?！凹膊　被颉敖】迪嚓P(guān)性狀況”可以是由于任何原因例如感染、遺傳缺陷和/或環(huán)境應(yīng)激造成的身體部分、器官或系統(tǒng)的任何病理狀況。所述原因可以是已知的或可以是未知的。這些狀況的實(shí)例包括，但不限于，惡化前狀態(tài)、發(fā)育異常、癌癥和其他過(guò)度增生性疾病。所述癌癥可以是例如復(fù)發(fā)的癌癥或已知或懷疑對(duì)常規(guī)治療方案和標(biāo)準(zhǔn)療法具有抗性的癌癥。在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)“治療性益處”是指在受試者的狀況的醫(yī)學(xué)治療方面提高或增強(qiáng)其健康的任何事件，其包括，但不限于，初癌(pre-cancer)、發(fā)育異常、癌癥和其他過(guò)度增生性疾病的治療。治療性益處的非窮舉性實(shí)例包括延長(zhǎng)受試者的壽命任何時(shí)間、減少或延遲疾病的瘤形成發(fā)展、減少過(guò)度增生、減少腫瘤生長(zhǎng)、延遲轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移或減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目、降低癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞增殖速度、減少或延遲從惡化前狀態(tài)至瘤形成發(fā)展的進(jìn)程以及減輕受試者的因受試者的病癥產(chǎn)生的疼痛?！邦A(yù)防”和“防止”根據(jù)其通過(guò)和平常的意思使用，表示“在......之前起作用”或這樣的作用。在特定疾病或健康相關(guān)性狀況的背景中，這些術(shù)語(yǔ)是指為了阻止疾病或健康相關(guān)性狀況的發(fā)生給受試者施用或使用藥劑、藥物或治療劑或?qū)κ茉囌邔?shí)施治療方法或方案。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，這些方法包括遞送MDA-7蛋白或編碼該蛋白的核酸以在受試者中預(yù)防疾病或健康相關(guān)性狀況。適合預(yù)防疾病或病癥的藥物組合物的量是已知或懷疑阻止疾病或健康相關(guān)性狀況發(fā)生的量。本發(fā)明考慮到，除了至少一種其他藥劑例如COX-2抑制劑或任何其他MDA-7聯(lián)合劑外，還可給受試者提供MDA-7。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，方法包括鑒定需要治療的患者?？苫诶绔@得患者病史、進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)檢驗(yàn)以確定患者具有癌癥或腫瘤、對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)或進(jìn)行活組織檢查來(lái)鑒定患者。因此，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)給患者施用包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供MDA-7，其中該MDA-7多肽在患者中表達(dá)。涉及編碼MDA-7的核酸序列處在能夠在患者中提供表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下。所述啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、阻抑啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是CMVIE啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中，其包含增強(qiáng)子?？稍诒景l(fā)明的方法中使用包含表達(dá)構(gòu)建體的載體來(lái)將MDA-7提供給患者。在某些實(shí)施方案中，所述載體是病毒載體。如果使用病毒載體，在一些實(shí)施方案中用魚(yú)精蛋白配制所述載體。在某些實(shí)施方案中，用一種或多種脂質(zhì)配制載體。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)制劑是DOTAP膽固醇(或其衍生物)(DOTAPchol)制劑?？紤]到給患者施用的組合物可以存在于藥物可接受的制劑中?？墒褂玫牟《据d體是腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和痘苗病毒。在特定的實(shí)施方案中，所述載體是腺病毒載體，其可以是復(fù)制缺陷型。在該情況下，每施用(患者/施用)或每日(平均日劑量)給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒(cp)或噬斑形成單位(pfu)。這些劑量包括大約、至少大約，或至多大約109、1010、1011、1012或1013個(gè)vp或pfu(或其中可衍生的任何范圍)，所述劑量可以是每次施用或每日或每個(gè)治療周期提供的量。事實(shí)上，本發(fā)明的實(shí)施方案闡明了MDA-7和COX-2抑制劑的組合在促進(jìn)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。本發(fā)明的實(shí)施方案也闡明了MDA-7和TNFα的組合在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，方法涉及MDA-7和Hsp90抑制劑的組合，所述組合在促進(jìn)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案闡明了MDA-7和一種或多種維生素E化合物的組合在促進(jìn)癌細(xì)胞的抑制方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案闡明了MDA-7和VEGF抑制劑的組合在腫瘤生長(zhǎng)的抑制方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。本發(fā)明的實(shí)施方案闡明了MDA-7和TNF多肽的組合在癌癥的治療方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。此外，在一些實(shí)施方案中，MDA-7和IL-10抑制劑的組合在癌癥的治療方面提供了協(xié)同治療效應(yīng)。“協(xié)同”表示治療效果比基于用作單一療法的各試劑的累加效應(yīng)預(yù)期的治療效果大。在本發(fā)明的方法中給患者提供MDA-7和COX-2抑制劑。在其他方法中，給患者提供MDA-7和Hsp90抑制劑。在其他方法中，給患者提供MDA-7和至少一種維生素E化合物。在其他實(shí)施方案中，給患者提供MDA-7和VEGF抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，給患者提供MDA-7和TNF多肽。在其他實(shí)施方案中，給患者提供MDA-7和IL-10抑制劑。術(shù)語(yǔ)“提供”按照其普通和平常的意思使用，表示“供應(yīng)或供給以用于使用”(牛津英語(yǔ)詞典)。在本發(fā)明的方法中將患者的癌細(xì)胞或與患者的癌細(xì)胞相鄰的細(xì)胞暴露于MDA-7和COX-2、Hsp90抑制劑、維生素E化合物、VEGF抑制劑和/或TNF。MDA-7產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)，結(jié)果與癌細(xì)胞相鄰的細(xì)胞可表達(dá)MDA-7并將其提供給癌細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，給患者施用組合物以給該患者提供MDA-7和/或COX-2抑制劑。在其他實(shí)施方案中，給患者施用組合物以給患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制劑。在其他實(shí)施方案中，給患者施用組合物以給患者提供MDA-7和/或一種或多種維生素E化合物。特別地可在所述組合物中包含維生素E化合物的酯化形式。此外，在一些實(shí)施方案中，給患者施用組合物以給患者提供MDA-7和/或VEGF抑制劑。在其他實(shí)施方案中，給患者施用組合物以給患者提供MDA-7和/或TNF多肽。此外，給患者施用組合物以給患者提供MDA-7和/或IL-10抑制劑。可通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)施用化合物和組合物?？墒褂檬┯猛緩降慕M合。例如，可通過(guò)一個(gè)途徑提供MDA-7而通過(guò)另一個(gè)途徑提供MDA-7聯(lián)合劑?？蛇x擇地，給患者施用一種劑量的a)MDA-7或b)COX-2、Hsp90抑制劑、維生素E化合物、VEGF抑制劑、TNF或IL-10抑制劑(MDA-7聯(lián)合劑)，同時(shí)以不同的方式給患者施用另一種劑量。在某些實(shí)施方案中，將化合物或組合物直接注射入或注射至腫瘤?？蛇x擇地或另外地，可將化合物或組合物用于或施用至殘留的瘤床。此外，在特定的實(shí)施方案中，患者通過(guò)口服攝入COX-2抑制劑或?qū)⑵渫ㄟ^(guò)靜脈內(nèi)途徑給患者施用。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)口服攝入Hsp90抑制劑或通過(guò)輸注或注射將其提供給患者。在特定的實(shí)施方案中，通過(guò)口服攝入維生素E化合物或通過(guò)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑施用其。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)輸注例如靜脈內(nèi)輸注施用VEGF抑制劑或IL-10抑制劑。在特定的實(shí)施方案中，將TNF直接施入或施至腫瘤。也可通過(guò)瘤內(nèi)途徑提供任何MDA-7聯(lián)合劑。作為治療的部分，可按照下列次數(shù)或至少下列次數(shù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多次給患者提供MDA-7、COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物、VEGF抑制劑、TNF或IL-10抑制劑。特別地考慮到作為對(duì)患者的癌癥治療的部分多次給患者提供MDA-7和COX-2抑制劑。特別地考慮到在其他實(shí)施方案中，作為對(duì)患者的癌癥治療的部分，多次給患者提供MDA-7和Hsp90抑制劑。在其他實(shí)施方案中，作為對(duì)患者的癌癥治療的部分，多次給患者提供MDA-7和維生素E化合物。此外，可存在處方療程，如果需要可重復(fù)該療程。這同樣適用于使用任何其他MDA-7聯(lián)合劑的療法?？稍谑┯肕DA-7聯(lián)合劑之前、同時(shí)或之后給患者施用MDA-7。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉施用多種治療劑的治療方案。例如，可在提供MDA-7聯(lián)合劑前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。在一些實(shí)施方案中，可在提供MDA-7聯(lián)合劑前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。在其他實(shí)施方案中，可在提供MDA-7聯(lián)合劑之前給患者提供MDA-7。在其他實(shí)施方案中，可在提供MDA-7之前給患者提供MDA-7聯(lián)合劑。本發(fā)明可用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其可用于治療癌癥的方法和組合物。所述癌癥可以是下列類(lèi)型的癌癥中的任何一種黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥包括上皮癌細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，所述癌癥是乳腺癌。在乳腺癌的情況下，患者可以是HER-2/neu陰性或患者可以是HER-2/neu陽(yáng)性。因此，治療可不依賴(lài)于患者的HER-2/neu的狀況。此外，本發(fā)明可用于預(yù)防癌癥或治療初癌或惡化前期細(xì)胞，包括組織轉(zhuǎn)化、發(fā)育異常和超常增生。其也可用于抑制不想要的但良性的細(xì)胞，例如鱗狀化生細(xì)胞、發(fā)育異常細(xì)胞、良性前列腺超常增生細(xì)胞、增生性病損等。可通過(guò)本領(lǐng)域的方法(包括此處描述的MDA-7聯(lián)合療法)中止、中斷或延遲至癌癥或至更嚴(yán)重的癌癥形式的進(jìn)展。此外，所述癌癥可包括不能切除的或可切除的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥表現(xiàn)出對(duì)放射療法、化學(xué)療法和/或免疫療法(例如曲妥單抗)或?qū)Υ颂幟枋龅牡鳛閱我化煼ǖ娜魏卧噭?與MDA-7聯(lián)合療法相比)的抗性。此外，所述癌癥可包括轉(zhuǎn)移癌或第二腫瘤，盡管在一些實(shí)施方案中，其只涉及一種或多種原發(fā)性腫瘤。還可進(jìn)行本發(fā)明的方法和組合物以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移或預(yù)防腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)以及減少或消除腫瘤或癌癥。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，在所述方法中給癌癥患者提供MDA-7和COX-2抑制劑。本發(fā)明的其他方法涉及治療患者的乳腺癌，包括給患者施用i)包含編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體，其中所述核酸序列處在能夠在患者中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下；和ii)COX-2抑制劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)直接給患者施用COX-2抑制劑來(lái)給患者提供COX-2抑制劑。在其他實(shí)施方案中，給患者施用COX-2抑制劑的前體藥物，當(dāng)其在患者體內(nèi)時(shí)，其轉(zhuǎn)化成COX-2抑制劑的活性形式。在本發(fā)明中，COX-2抑制劑選自塞來(lái)考昔、羅非考昔、伐地考昔、lumiracoxib和艾托考昔。此外，可使用多種COX-2抑制劑，例如2、3或4種這些抑制劑(和/或其相關(guān)的前體藥物)的組合。在更特定的實(shí)施方案中，所述MDA-7聯(lián)合劑是COX-2抑制劑。使用MDA-7和COX-2抑制劑進(jìn)行的輻射敏化作用通過(guò)將腫瘤細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期中對(duì)輻射敏感的G2/M期而發(fā)生。因此，在進(jìn)行輻射敏化后可降低或減少癌細(xì)胞通常暴露的輻射量?？蛇x擇地，輻射期的次數(shù)或輻射期的長(zhǎng)度可減少。在某些實(shí)施方案中，任何單一量、總量、輻射期的次數(shù)或輻射期的長(zhǎng)度的減少為大約、至少大約或至多大約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000％或更多，或其中可衍生的任何范圍。本發(fā)明也可涉及用于治療癌癥的方法，在所述方法中，給癌癥患者提供MDA-7和Hsp90抑制劑。在某些實(shí)施方案中，方法包括通過(guò)提供i)包含編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體，其中所述核酸處在能夠在患者中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下；和ii)Hsp-90抑制劑來(lái)治療癌癥。術(shù)語(yǔ)“Hsp-90抑制劑”是指特異性地和直接抑制Hsp90功能的物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，Hsp-90抑制劑結(jié)合Hsp90多肽。在某些實(shí)施方案中，方法包括通過(guò)提供i)包含編碼MDA-7的核酸的腺病毒載體，其中所述核酸處在能夠在患者中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下；和ii)Hsp-90抑制劑來(lái)治療癌癥。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)直接給患者施用Hsp90抑制劑來(lái)給患者提供Hsp90抑制劑。在其他實(shí)施方案中，給患者施用Hsp90抑制劑的前體藥物，當(dāng)其在患者體內(nèi)時(shí)，其轉(zhuǎn)化成Hsp90抑制劑的活性形式。在本發(fā)明中所述Hsp90抑制劑在一些實(shí)施方案中是格爾德霉素或格爾德霉素的衍生物或類(lèi)似物。術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指直接或通過(guò)修飾或部分取代從另一種物質(zhì)產(chǎn)生的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指結(jié)構(gòu)與另一種分子相似或共有相似或?qū)?yīng)的屬性的物質(zhì)(例如，能夠特異性結(jié)合Hsp90的格爾德霉素)。此外，可使用多種Hsp90抑制劑，例如2、3或4種這些抑制劑(和/或其相應(yīng)的前體藥物)的組合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療癌癥的方法，在該方法中，給患者提供MDA-7和維生素E的組合。術(shù)語(yǔ)“維生素E化合物”是指為生育酚和生育三烯酸亞家族中的脂溶性、抗氧化的化合物的天然和合成的物質(zhì)，以及這些物質(zhì)的酯化形式和綴合形式。生育酚和生育三烯酸家族各自具有alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)和delta(δ)同效維生素(vitamer)作為成員。酯化形式包括醋酸酯和琥珀酸酯形式。在某些實(shí)施方案中，所述維生素E化合物是合成的，而在其他實(shí)施方案中其是特定同效維生素的天然存在形式。在特定的實(shí)施方案中，維生素E化合物是維生素E琥珀酸酯(VES)，也稱(chēng)為α-生育酚琥珀酸酯。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，通過(guò)直接給患者施用維生素E來(lái)給患者提供維生素E化合物。術(shù)語(yǔ)“維生素E”理解為八種脂溶性、抗氧化生育酚和生育三烯酸化合物中的任一種。在其他實(shí)施方案中，給患者施用維生素E的前體藥物，當(dāng)其在患者體內(nèi)時(shí)，其轉(zhuǎn)變成維生素E的活性形式。在某些實(shí)施方案中，所述前體藥物是維生素E的酯化形式，例如醋酸酯或琥珀酸酯形式。本發(fā)明涉及，所述維生素E化合物在一些實(shí)施方案中是α生育酚或α生育酚的酯化形式，例如α生育酚琥珀酸酯或α生育酚醋酸酯。術(shù)語(yǔ)“酯化形式”是指具有酯基的物質(zhì)形式。在某些其他實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法和組合物中使用維生素E化合物的類(lèi)似物而不使用維生素E化合物。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指與另一種分子結(jié)合相似或共有相似或?qū)?yīng)的屬性的物質(zhì)(例如，TroloxC)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物使用維生素E綴合物。此外，可使用多種維生素E化合物，例如2、3或4種這些同效維生素和/或酯化形式的組合。本發(fā)明也涉及在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括給患者提供MDA-7和TNF。所述TNF可以是任何TNF，例如TNF-α、TNF-β、TNF-γ、TNF-δ或TNF-ε。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，TNF是TNF-α。所述TNF可包含全長(zhǎng)氨基酸序列或部分長(zhǎng)度的序列，只要所述部分長(zhǎng)度的序列能夠發(fā)揮TNF的功能。也包括在TNF的定義中的是TNF的全長(zhǎng)和部分長(zhǎng)度序列的氨基酸序列變體，只要這些序列變體能夠如同TNF發(fā)揮功能。此外，本發(fā)明涉及用于在患者中治療癌癥的方法，該方法包括給患者提供MDA-7和VEGF抑制劑。在癌癥治療的背景中，抗血管生成因子可依賴(lài)于抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和其受體之間的相互作用。腫瘤VEGF的表達(dá)在臨床上與許多種惡性腫瘤的疾病進(jìn)展相關(guān)。這些相關(guān)性據(jù)認(rèn)為促成了VEGF誘導(dǎo)腫瘤血管發(fā)生的能力，其通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的趨化性和致有絲分裂作用以及增加內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性蛋白酶的活性和提高微血管細(xì)胞中的整聯(lián)蛋白的表達(dá)以提高細(xì)胞外基因的相互作用來(lái)誘導(dǎo)腫瘤血管發(fā)生。已在人血管內(nèi)皮上鑒定了與酪氨酸激酶活性相關(guān)的VEGF的兩個(gè)高親和力受體Flt-1和KDR。VEGF對(duì)這些受體的結(jié)合據(jù)認(rèn)為引起受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的二聚化和隨后的激活。所述VEGF抑制劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何VEGF抑制劑。例如，所述抑制劑可以是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽、抗體、寡糖或小分子。在特定的實(shí)施方案中，所述VEGF抑制劑是抗體，例如針對(duì)VEGF或VEGF受體的抗體。在更特定的實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體，例如特異性結(jié)合VEGF或VEGF受體的單克隆抗體。在更特定的實(shí)施方案中，所述VEGF抑制劑是貝伐單抗(Avastin)。在一些實(shí)施方案中，所述VEGF抑制劑是小分子。這些小分子的實(shí)例包括VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑。在特定的實(shí)施方案中，所述VEGF抑制劑是核酶，例如特異性靶向VEGFmRNA或VEGF受體mRNA的核酶。在更特定的實(shí)施方案中，所述VEGF抑制劑是可溶性VEGF受體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，涉及抑制VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。在某些實(shí)施方案中，可通過(guò)受體酪氨酸激酶抑制劑抑制VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?？墒褂玫氖荏w酪氨酸激酶抑制劑包括，但不限于ZD4190、ZD6474和AZD2171(Astra-Zeneca，Wilmington，DE)、CEP-7055(Cephalon，F(xiàn)razer，PA)、PTK787(Novartis，Basel，Switzerland)和SU5416(Sugen，SouthSanFrancisco，CA)。本發(fā)明也涉及通過(guò)給患者提供MDA-7和IL-10抑制劑來(lái)治療患者的癌癥的方法。IL-10抑制劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何IL-10抑制劑。例如，所述抑制劑可以是DNA、RNA、核酶、寡核苷酸、蛋白、多肽、肽、抗體或小分子。在特定的實(shí)施方案中，所述IL-10抑制劑是抗體，例如抗IL-10的抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。如上所示，可通過(guò)給患者施用包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表達(dá)。在特定的實(shí)施方案中，所述組合物是藥物可接受的組合物?？蛇x擇地，可通過(guò)給患者施用上述純化的MDA-7蛋白來(lái)給患者提供MDA-7。在某些特定的實(shí)施方案中，所述組合物是藥物可接受的組合物。在本發(fā)明的涉及提供MDA-7和TNF的方法中，可通過(guò)給患者施用包含具有編碼TNF的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供TNF，其中TNF多肽在患者中表達(dá)。在本發(fā)明的涉及提供MDA-7和VEGF抑制劑的方法中，可通過(guò)給患者施用包含具有編碼VEGF抑制劑的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供VEGF抑制劑，其中VEGF抑制劑在患者中表達(dá)。在本發(fā)明的涉及提供MDA-7和IL-10抑制劑的方法中，可通過(guò)給患者施用包含具有編碼IL-10抑制劑的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供IL-10抑制劑。在一些實(shí)施方案中使用單一組合物給患者提供MDA-7和COX-2抑制劑。給患者施用的組合物包括此處公開(kāi)的本發(fā)明的組合物。此外，在一些實(shí)施方案中，可為患者提供包含COX-2抑制劑和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。可選擇地，所述組合物可包含COX-2抑制劑的前體藥物而不包含COX-2抑制劑。在本發(fā)明的其他方法中，在一些實(shí)施方案中通過(guò)施用單一組合物來(lái)給患者提供MDA-7和Hsp90抑制劑。給患者施用的組合物包括此處公開(kāi)的本發(fā)明的組合物。此外，在一些實(shí)施方案中，給患者提供包含Hsp90抑制劑和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。可選擇地，所述組合物可包含Hsp90抑制劑前體藥物而不包含Hsp90抑制劑。在一些實(shí)施方案中通過(guò)施用單一組合物來(lái)給患者提供MDA-7和維生素E化合物。給患者施用的組合物包括此處公開(kāi)的本發(fā)明的組合物。此外，在一些實(shí)施方案中，給患者提供包含COX-2抑制劑和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物?？蛇x擇地，所述組合物可包含維生素E的酯化形式、維生素E類(lèi)似物或維生素E綴合物而不包含維生素E。上述關(guān)于單一組合物的實(shí)施方案也適用于其他MDA-7聯(lián)合劑例如VEGF抑制劑、TNF或IL-10抑制劑。在其他實(shí)施方案中，將MDA-7和COX-2抑制劑或其他MDA-7聯(lián)合劑分開(kāi)地提供給患者。類(lèi)似地，在某些實(shí)施方案中分開(kāi)地將MDA-7和Hsp90抑制劑提供給患者。此外，在其他實(shí)施方案中，分開(kāi)地將MDA-7和一種或多種維生素E化合物提供給患者。在這些情況下，給患者提供一種藥物且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時(shí)和/或1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周內(nèi)或其中可衍生的任何范圍內(nèi)提供或施用另一種藥物。在某些實(shí)施方案中，在提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑或維生素E化合物或MDA-7聯(lián)合劑前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。在其他實(shí)施方案中，在提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物或其他MDA-7聯(lián)合劑前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。在一些實(shí)施方案中，在提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物或其他MDA-7聯(lián)合劑之前給患者提供MDA-7，而在其他實(shí)施方案中，在提供MDA-7之前提供所述試劑。此外，患者可在整個(gè)使用MDA-7的治療過(guò)程中服用或施用MDA-7聯(lián)合劑。例如，患者可接受為期6周的MDA-7治療。在該期間內(nèi)，患者可以在整個(gè)六周的時(shí)期內(nèi)以例如至少每天一次或每周一次的基礎(chǔ)服用例如COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑或維生素E化合物。因此，可在提供MDA-7前后24小時(shí)內(nèi)(或上面指定的任何時(shí)段)給患者服用或提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物或其他MDA-7聯(lián)合劑，且可多次提供MDA-7。因此，可在每次給患者提供(以蛋白或編碼該蛋白的核酸的形式)MDA-7前后24小時(shí)之內(nèi)給患者服用或提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物、VEGF抑制劑、TNF或IL-10抑制劑。此外，在上面指定的任何時(shí)段內(nèi)，可多次給患者服用或提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑或維生素E化合物或其他MDA-7聯(lián)合劑。例如，患者可在提供MDA-7前后24小時(shí)以內(nèi)服用三劑COX-2抑制劑。因此，在提供MDA-7前后的指定的時(shí)段內(nèi)，可給患者服用或提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次或其中可衍生的任何范圍內(nèi)次數(shù)的MDA-7聯(lián)合劑。可選擇地，可在使用MDA-7的治療期間或整個(gè)治療過(guò)程中全身性地提供COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物或其他MDA-7聯(lián)合劑。在一些實(shí)施方案中，在提供MDA-7和COX-2抑制劑(或其他MDA-7聯(lián)合劑)各自至少一次后使患者接受放射療法。在其他實(shí)施方案中，使患者接受亞致死劑量的放射療法。術(shù)語(yǔ)“亞致死劑量”是指在單個(gè)輻射期提供給患者的輻射的量，該量低于暴露于輻射的患者細(xì)胞的致死量(即，使細(xì)胞死亡的量)。亞致死劑量低于目前提供給具有相似特征(指，例如，癌癥的分期、腫瘤大小、預(yù)后等)、未首先接受輻射敏化治療的癌癥患者的劑量?？稍诒┞队谳椛浯蠹s、至少大約或至多大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分鐘和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小時(shí)和/或1、2、3、4、5、6、7天或更長(zhǎng)時(shí)間或其中可衍生的任何范圍之前進(jìn)行輻射敏化治療。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，方法也包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。在其他實(shí)施方案中，患者接受免疫療法。在其他特定的實(shí)施方案中，方法也包括切除患者的腫瘤的全部或部分?？沙ザ鄠€(gè)腫瘤(整個(gè)的或部分的)。在這些情況的各情況下，可在其他癌癥療法之前、期間或之后提供MDA-7和/或COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑、維生素E化合物、VEGF抑制劑、TNF和/或IL-10抑制劑。在某些實(shí)施方案中，在腫瘤切除之后至少通過(guò)例如向所得的瘤床施用具有一種或多種試劑的組合物來(lái)提供MDA-7和/或MDA-7聯(lián)合劑。在其他實(shí)施方案中，使患者接受切除患者腫瘤的全部或部分。可在切除患者腫瘤的全部或部分之前、期間或之后施用MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑。在一些實(shí)施方案中，在切除患者腫瘤的全部或部分后提供MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑。在一些實(shí)施方案中，至少通過(guò)給所得的瘤床施用組合物來(lái)給患者提供MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑?？梢淮位蚨啻问┯肕DA-7和MDA-7聯(lián)合劑。在其中MDA-7或MDA-7是腺病毒載體的特定的實(shí)施方案中，可一次或多次給患者施用腺病毒載體。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括提供不同的腫瘤抑制劑以取代本發(fā)明的實(shí)施方案中的MDA-7。其他腫瘤抑制劑包括，但不限于p53、FUS1、C-CAM、FHIT、DCC、Rb和PTEN。這樣，可如上所述使用所述蛋白或編碼該腫瘤抑制劑的核酸。本發(fā)明也涉及藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，存在包含a)COX-2抑制劑或COX-2抑制劑的前體藥物；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。在包括編碼MDA-7的核酸的實(shí)施方案中，所述核酸可以是腺病毒載體。藥物組合物可包含塞來(lái)考昔、羅非考昔、伐地考昔、lumiracoxib和艾托考昔中的一種或多種藥物。在某些實(shí)施方案中，其包含塞來(lái)考昔。其他藥物組合物包含a)Hsp90抑制劑或Hsp90抑制劑的前體藥物；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或編碼MDA-7多肽的序列的核酸。在包含編碼MDA-7的核酸的實(shí)施方案中，所述核酸可以是腺病毒載體。在特定的實(shí)施方案中所述組合物包含GA或17-GAA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥物組合物包含格爾德霉素或格爾德霉素衍生物或其類(lèi)似物或前體藥物。本發(fā)明也涉及包含a)至少一種維生素E化合物；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸的藥物組合物。在包括編碼MDA-7的核酸的實(shí)施方案中，所述核酸可以是腺病毒載體。在特定的實(shí)施方案中，所述組合物包含VES。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)給患者施用包含純化的TNF的組合物來(lái)給患者提供TNF。如上所示，該TNF可以是全長(zhǎng)TNF氨基酸序列或保持作為T(mén)NF的生物學(xué)功能的部分長(zhǎng)度序列或全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度的TNF序列變體，只要該序列保持一些生物學(xué)活性水平。類(lèi)似地，在涉及MDA-7和VEGF抑制劑施用的實(shí)施方案中，當(dāng)其為蛋白時(shí)，可以以純化的蛋白施用。類(lèi)似地，在涉及MDA-7和IL-10抑制劑的施用的實(shí)施方案中，當(dāng)IL-10抑制劑為氨基酸序列時(shí)，可以包含該純化的蛋白的組合物的形式將其提供給患者。在特定的實(shí)施方案中，給患者提供包含純化的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7的序列的核酸和純化的TNF氨基酸序列的組合物。在其他特定的實(shí)施方案中，給患者提供包含TNF和純化的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。在更特定的實(shí)施方案中，所述TNF是TNFα蛋白。在其他實(shí)施方案中，給患者提供至少下列物質(zhì)(a)純化的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7蛋白的序列的核酸；和(b)特異性結(jié)合VEGF的單克隆抗體。在某些特定的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是貝伐單抗。在其他實(shí)施方案中，給患者提供組合物，所述組合物包含(a)純化的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7蛋白的序列的核酸；和(b)特異性結(jié)合IL-10的抗體或具有編碼特異性結(jié)合IL-10的抗體的序列的核酸。在某些特定的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是貝伐單抗。本發(fā)明總地說(shuō)來(lái)也涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含(a)純化的且有活性的TNF或具有編碼TNF的序列的核酸；和(b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。在特定的實(shí)施方案中，所述純化的且有活性的TNF是純化的且有活性的TNFα。在其他特定的實(shí)施方案中，具有編碼TNF的序列的核酸是具有編碼TNFα多肽的序列的核酸。在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。在特定的實(shí)施方案中，所述編碼MDA-7多肽的核酸是腺病毒載體。所述藥物組合物可包含具有編碼TNF多肽例如TNFα多肽的序列的核酸。編碼TNF多肽的核酸可以是腺病毒載體。在特定的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含(a)具有編碼MDA-7的核酸序列的第一腺病毒載體，其中所述核酸有效偶聯(lián)至第一啟動(dòng)子序列；和(b)具有編碼TNF多肽的序列的第二腺病毒載體，其中所述編碼TNF多肽的核酸序列有效連接至第二啟動(dòng)子。所述TNF多肽可以是例如TNFα多肽。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含具有編碼MDA-7的第一核酸序列和編碼TNF多肽的第二核酸序列的腺病毒載體。在更特定的實(shí)施方案中，編碼TNF多肽的第二核酸序列是編碼TNFα多肽的核酸序列。第一核酸序列和第二核酸序列可有效連接或不連接至一個(gè)或多個(gè)共同的啟動(dòng)子。本發(fā)明也涉及在患者中治療和預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括給患者施用藥物可接受的組合物，該組合物包含編碼MDA-7蛋白的多核苷酸和脂質(zhì)。所述癌癥可以是上面所示的癌癥中的任何癌癥。在某些實(shí)施方案中，所述患者是肺癌患者。例如，所述肺癌可以是非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌或轉(zhuǎn)移性肺癌(具有擴(kuò)散至肺界線外部的癌癥)。除了治療來(lái)自肺癌的繼發(fā)性腫瘤外，還可進(jìn)行對(duì)原發(fā)肺癌的治療。在其他實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步定義為治療受試者的轉(zhuǎn)移性肺癌的方法。本發(fā)明考慮到適合用于藥物施用的任何脂質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步定義為包含脂質(zhì)體?？紤]本發(fā)明的方法包括適合于藥物施用的任何脂質(zhì)體。在某些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體是DOTAP膽固醇納米顆粒。在下面在說(shuō)明書(shū)中更詳細(xì)地描述脂質(zhì)體和納米顆粒。施用的方法/途徑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如靜脈內(nèi)，皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞的施用。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及治療患者的癌癥的方法，其包括給受試者提供MDA-7和泰索帝(多西他奇)。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法給患者提供MDA-7。例如，可通過(guò)給患者施用包含具有編碼多肽的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給患者提供MDA-7。所述組合物可包含一種或多種另外的抗癌劑，例如其他化學(xué)治療劑或MDA-7聯(lián)合劑。示例性化學(xué)治療劑示于下面的說(shuō)明書(shū)中。在其他實(shí)施方案中，患者正接受一種或多種其他抗癌療法的治療。這些療法的實(shí)例包括放射療法、另外的化學(xué)療法、免疫療法、其他形式的基因療法和手術(shù)療法。在某些實(shí)施方案中，給患者提供包含泰索帝和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。可在泰索帝施用之前、期間或之后提供MDA-7。在一些實(shí)施方案中，例如，在提供泰索帝前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。更特別地，可在提供泰索帝前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。可在提供泰索帝之前給患者提供MDA-7，或可在提供MDA-7之前給患者提供泰索帝。某些實(shí)施方案中，通過(guò)給患者施用泰索帝來(lái)給患者提供泰索帝。所述癌癥可以是上述這些癌癥中的任何一種。在某些特定的實(shí)施方案中，所述方法還包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。例如，可在提供MDA-7和泰索帝各自至少一次后使患者接受放射療法。在一些實(shí)施方案中，使患者接受亞致死劑量的放射治療。在一些實(shí)施方案中，使患者接受其腫瘤的全部或部分的切除?？稍谀[瘤切除之前、期間或之后提供泰索帝。在一些實(shí)施方案中，至少通過(guò)給所得瘤床施用組合物來(lái)給患者提供MDA-7和/或泰索帝。可一次或多次施用泰索帝。在其中所述組合物包含核酸的實(shí)施方案中，所述核酸可以存在于載體中。例如，所述載體可以是病毒載體。在特定的實(shí)施方案中，所述病毒載體是腺病毒載體。在一些實(shí)施方案中，用魚(yú)精蛋白配制腺病毒。每次施用可給患者施用一定量的病毒顆粒。在某些實(shí)施方案中，每次給藥對(duì)患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。在本發(fā)明的一些其中施用核酸組合物的實(shí)施方案中，所述核酸組合物可包含一種或多種脂質(zhì)。這些脂質(zhì)-核酸組合物包含上述脂質(zhì)中的任一種。這些脂質(zhì)的實(shí)例包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。本發(fā)明總地說(shuō)來(lái)也涉及在受試者中預(yù)測(cè)MDA-7癌癥療法的功效的方法，其包括(a)測(cè)定來(lái)自受試者的包含細(xì)胞的生物樣品中的IL-10表達(dá)水平，和(b)根據(jù)IL-10表達(dá)水平是否與MDA-7抗性細(xì)胞或MDA敏感細(xì)胞相關(guān)，施用或不施用MDA-7癌癥療法。在一些實(shí)施方案中，所述受試者是已接受化學(xué)療法、放射療法或一些其他形式抗癌療法治療的受試者。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測(cè)定生物樣品中的IL-10表達(dá)水平。例如，在一些實(shí)施方案中，使用特異性識(shí)別IL-10的抗體測(cè)定IL-10的表達(dá)水平。在其他實(shí)施方案中，使用與IL-10轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)或同一的核酸引物或探針測(cè)定IL-10的表達(dá)水平。包含癌細(xì)胞的生物樣品可以是任何類(lèi)型的生物樣品，只要其包含一個(gè)或多個(gè)癌細(xì)胞。例如，所述生物樣品可以是體液樣品，例如血漿樣品、血清樣品、血液樣品、腦脊液樣品或尿液樣品。在特定的實(shí)施方案中，所述生物樣品是組織樣品，例如來(lái)自受試者的腫瘤組織樣品。在其他實(shí)施方案中，如果所述受試者表達(dá)與MDA-7抗性細(xì)胞相關(guān)的IL-10水平，那么在受試者中預(yù)測(cè)MDA-7癌癥療法的功效的方法進(jìn)一步包括給受試者提供IL-10抑制劑。上面所示的方法中的任一方法可用于將IL-10抑制劑給受試者施用。此外，基于上面所示的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定由受試者表達(dá)的IL-10水平是否與MDA-7抗性細(xì)胞相關(guān)。本發(fā)明總體上也涉及用于在患者中預(yù)防疾病或健康相關(guān)性狀況的方法，其包括給患者提供MDA-7，其中所述MDA-7足以在受試者中預(yù)防癌癥。疾病或健康相關(guān)性狀況可以是例如惡化前病損或癌癥。所述癌癥可以是上述癌癥中的任一種癌癥。如上所述，受試者可以是處于發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。例如，受試者可具有遺傳易感性或可具有成功治療的癌癥的歷史。給受試者提供MDA-7以預(yù)防疾病或健康相關(guān)性狀況的方法包括上面所示的方法中的任一種方法。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)給患者施用包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸的組合物來(lái)給患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表達(dá)。所述組合物可以是藥物可接受的組合物。如上所述，本部分包含對(duì)此的討論，所述核酸可以是載體例如病毒載體?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法例如上述方法中的任一種方法進(jìn)行施用。本發(fā)明也涉及在受試者中預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給受試者施用包含編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體，其中所述核酸序列處在能夠在患者中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下。上面對(duì)腺病毒載體進(jìn)行了詳細(xì)的描述，本部分包含了對(duì)此的討論。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法(包括上述方法)進(jìn)行施用。在一些實(shí)施方案中，患者具有已用化學(xué)療法、放射療法、免疫療法和/或基因療法成功治療的癌癥的歷史。在一些更特定的實(shí)施方案中，患者接受放射療法。例如，可在提供MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑至少一次后，使患者接受放射療法。放射療法的劑量可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何劑量。例如，在一些實(shí)施方案中，所述劑量是放射療法的亞致死劑量。本發(fā)明總體說(shuō)來(lái)也涉及用于在患者中治療惡化前病損的方法，該方法包括給患者提供MDA-7。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法例如通過(guò)給患者施用包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸的組合物來(lái)提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表達(dá)。所述組合物可以是上述藥物可接受的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述核酸是載體。載體如上所述，本部分包含對(duì)此的討論?？膳渲朴糜诖颂幟枋龅氖┯?包括組合物的口服、靜脈內(nèi)和直接注射施用)的組合物。關(guān)于本發(fā)明的一個(gè)方面所描述的任何實(shí)施方案同樣可用于本發(fā)明的其他方面。例如，在一種MDA-7聯(lián)合劑的背景中所描述的任何實(shí)施方案可用于任何其他MDA-7聯(lián)合劑。實(shí)施例部分中的實(shí)施方案理解為可用于本發(fā)明的所有方面的本發(fā)明的實(shí)施方案。盡管本公開(kāi)內(nèi)容支持表示唯一選擇和“和/或”的定義，但除非明確地指出表示唯一選擇或選擇是相互排除的，權(quán)利要求中使用術(shù)語(yǔ)“或”用于表示“和/或”的意思。在本申請(qǐng)全文中，術(shù)語(yǔ)“大約”用于表示值包含用于確定該值的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。遵循多年的專(zhuān)利法，除非明確指出，術(shù)語(yǔ)“一種”和“一個(gè)”，當(dāng)在權(quán)利要求或說(shuō)明書(shū)中與詞語(yǔ)“包含”結(jié)合使用時(shí)，是指一個(gè)或多個(gè)。通過(guò)下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目的、特征和有利方面將變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解詳細(xì)的描述和特定的實(shí)施例，當(dāng)表示本發(fā)明的特定實(shí)施方案時(shí)，僅以舉例說(shuō)明的方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)該詳細(xì)描述，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得更加明顯。附圖概述下面的附圖形成了本說(shuō)明書(shū)的部分，其用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考與此處提供的特定實(shí)施方案詳細(xì)描述結(jié)合的這些附圖中的一或多幅，可更好地理解本發(fā)明。圖1A-B.在塞來(lái)考昔、Ad-mda7或Ad-mda7+塞來(lái)考昔處理72小時(shí)后細(xì)胞的生存力。用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)(作為對(duì)照)、Ad-luc(螢光素酶)(作為報(bào)告蛋白)、Ad-mda7、塞來(lái)考昔以及Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合(M+C)處理HER2-(MDA-MB-436)(a)和HER2+(MCF7/Her18)(b)乳腺癌細(xì)胞。與對(duì)照(PBS)相比，所述組合顯示最顯著減少的存活分?jǐn)?shù)。通過(guò)MTT測(cè)定法測(cè)量存活力。將吸光度作為相對(duì)對(duì)照的百分比生存力作圖。(*p＜0.05)圖2.在72小時(shí)處理后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法(trypanblueexclusion)確定細(xì)胞死亡。用Ad-mda7、Ad-luc、塞來(lái)考昔或Ad-mda7和塞來(lái)考昔(M+C)處理Her2-(MDA-MB-436)和Her2+(MCF7/Her18)乳腺癌細(xì)胞3天，然后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法測(cè)定細(xì)胞的生存力。與對(duì)照(PBS)相比，在聯(lián)合組(M+C)中兩種細(xì)胞系都顯示了顯著增加的死亡細(xì)胞群。將數(shù)據(jù)以細(xì)胞死亡百分比相對(duì)處理作圖。(*p＜0.05)圖3A-B.75小時(shí)處理后的細(xì)胞周期分析。用Ad-mda7、Ad-luc、塞來(lái)考昔或Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合處理Her2-(MDA-MB-436)(a)和Her2+(MCF7/Her18)(b)乳腺癌細(xì)胞3天，然后收集漂懸的和貼壁的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析。與對(duì)照(PBS)相比，組合(M+C)中的MCF7/Her18細(xì)胞顯示顯著增加的細(xì)胞周期的G1期。圖4A-B.通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/FITC和TUNEL測(cè)定法進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)。在72小時(shí)的處理后收獲7MDA-MB-436(a)和MCF7/Her18(b)細(xì)胞，然后按照廠商的方案進(jìn)行染色。根據(jù)膜聯(lián)蛋白V/FITC測(cè)定，塞來(lái)考昔和mda7處理顯示增加的細(xì)胞凋亡(p＜0.05)，Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合處理(M+C)在所有組中顯示最多增加的細(xì)胞凋亡百分比(p＜0.05)。根據(jù)TUNEL測(cè)定，與對(duì)照(PBS)相比，聯(lián)合塞來(lái)考昔處理顯示顯著增加的細(xì)胞凋亡(p＜0.05)。(*p＜0.05)圖5A-B.格爾德霉素(GA)在人肺癌細(xì)胞中增強(qiáng)腺病毒mda-7介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。(A)用不同劑量的格爾德霉素處理后，A549和H460細(xì)胞中的細(xì)胞死亡的百分比。在處理后48小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。對(duì)各細(xì)胞系進(jìn)行三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(B)在Ad-mda7、Ad-luc、GA、Ad-mda7+GA和Ad-luc+GA處理后對(duì)A549和H460細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)各細(xì)胞系進(jìn)行三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)。圖6A-B.Ad-mda7和GA抑制肺細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。(A)在PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Ad-mda7+GA、Ad-luc+GA和GA處理后，A549和H460細(xì)胞中的表面E-鈣粘蛋白水平的流式細(xì)胞分析。每種細(xì)胞系進(jìn)行三份重復(fù)試驗(yàn)。(B)如“材料和方法”中所述確定肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。Ad-mda7+GA顯著地減少A549和H460肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。顯示的數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖7.17AAG在人肺癌細(xì)胞中增強(qiáng)腺病毒mda-7介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。在Ad-mda7、Ad-luc、17AAG、Ad-mda7+17AAG和Ad-luc+17AAG處理后，A549和H460細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞分析。對(duì)于各細(xì)胞系進(jìn)行三份重復(fù)實(shí)驗(yàn)。圖8A-B.Ad-mda7與維生素E琥珀酸酯聯(lián)合的處理抑制人卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)但不抑制正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。(A)用Ad-luc(載體對(duì)照)、生育酚(維生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(2000vp/細(xì)胞)或其組合處理人卵巢癌細(xì)胞(MDAH2774)或(B)人正常成纖維細(xì)胞(MRC-9)。圖9.對(duì)用Ad-luc(載體對(duì)照)、生育酚(維生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(1000vp/細(xì)胞)或其組合處理的MDAH2774細(xì)胞進(jìn)行使用抗Fas抗體的Western印跡分析。將各處理?xiàng)l件下存在的Fas蛋白的水平定量標(biāo)繪在Y軸上，作為與未處理細(xì)胞相比Fas蛋白的百分比增加。圖10A-C.DOTAPChol-mda-7復(fù)合物抑制皮下腫瘤的生長(zhǎng)。將具有皮下腫瘤(A549或UV223m)的裸鼠和C3H小鼠分組，如下每天對(duì)其進(jìn)行處理，進(jìn)行總共6個(gè)劑量(50μg/劑)無(wú)處理、PBS、DOTAPChol-LacZ復(fù)合物或DOTAPChol-CAT復(fù)合物和DOTAPChol-mda-7復(fù)合物。(A)A549。(B)UV2237m。各時(shí)間點(diǎn)表示各組的平均腫瘤體積。條柱表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。(C)在處理后48小時(shí)采集皮下腫瘤并就MDA-7蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。在用DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理的腫瘤中，18％的A549腫瘤細(xì)胞和13％的UV2237m腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDA-7蛋白，而對(duì)照腫瘤細(xì)胞不產(chǎn)生MDA-7蛋白。圖11.在用DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理后，MDA-7誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。采集來(lái)自不接受處理、接受PBS、DOTAPChol-LacZ或DOTAPChol-CAT復(fù)合物或DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理的動(dòng)物的皮下腫瘤(A549，和UV2237m)，然后通過(guò)TUNEL染色就凋亡性細(xì)胞死亡進(jìn)行分析。在用DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理的腫瘤中經(jīng)歷凋亡性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的百分比(對(duì)于A549為13％和對(duì)于UV2237m為9％)顯著高于其他處理組中的百分比(P＝0.001)。條柱表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖12.DOTAPChol-mda-7復(fù)合物抑制腫瘤血管化作用。就CD31對(duì)未處理的或用PBS、DOTAPChol-LacZ或DOTAPChol-CAT復(fù)合物或DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理的皮下腫瘤(A549和UV2237m)進(jìn)行CD31染色和進(jìn)行半定量分析。在DOTAPChol-mda7處理的腫瘤中CD31陽(yáng)性內(nèi)皮染色顯著低于其他處理組的腫瘤中的染色(P＝0.01)。條柱表示標(biāo)準(zhǔn)偏差圖13.DOTAPChol-mda-7復(fù)合物抑制實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移。每天用PBS、DOTAPChol-CAT復(fù)合物或DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理具有肺腫瘤(A549，UV2237m)的nu/nu或C3H小鼠，總共進(jìn)行6個(gè)劑量(50g/劑)。與兩個(gè)對(duì)照組中的腫瘤生長(zhǎng)相比，在用DOTAPChol-mda-7復(fù)合物處理的裸鼠和C3H小鼠中，轉(zhuǎn)移性腫瘤生長(zhǎng)都被顯著抑制(P＝＜0.05)。條柱表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14.卵巢癌細(xì)胞的化學(xué)敏化作用。與其他處理組相比，用Ad-luc和紫杉醇或Ad-mda7和紫杉醇處理的細(xì)胞顯示生長(zhǎng)抑制。然而，只在用Ad-mda7和紫杉醇處理的細(xì)胞中觀察到顯著的表現(xiàn)出累加至協(xié)同的生長(zhǎng)抑制(P＝＜0.05)。在三份重復(fù)小孔中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為兩個(gè)分開(kāi)實(shí)驗(yàn)的平均值。條柱表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖15.Ad-mda7選擇性抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)但不抑制正常細(xì)胞。顯示與對(duì)照載體(*Ad-luc或空Ad)相比，對(duì)于Ad-mda7的細(xì)胞系、p53突變狀態(tài)(m突變的；wt野生型)和IC50(通過(guò)氚化胸苷測(cè)定法測(cè)定的產(chǎn)生50％生長(zhǎng)抑制所需的濃度)值的概述。#.以Ad-mda7的IC50除以Ad-對(duì)照的IC50的比率估計(jì)選擇性指數(shù)(S.I)。圖16A-E.MDA-7誘導(dǎo)PKR且對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。(A)通過(guò)2000vp/細(xì)胞的MOI用Ad-mda7(mda-7)或Ad-luc(luc)處理的MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞的Western印跡分析。MDA-7蛋白存在于Ad-mda7-處理的細(xì)胞中但不存于對(duì)照處理的細(xì)胞中。用MDA-7誘導(dǎo)PKR蛋白。β-肌動(dòng)蛋白是顯示等量蛋白上樣的對(duì)照。(B)使用Ad-mda7處理乳腺癌在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。在T47D、MDA-MB-361、MCF-7、BT-20中進(jìn)行氚化胸苷測(cè)定；用Ad-mda7或Ad-luc(0-10,000vp/細(xì)胞；0-500pfu/細(xì)胞)處理細(xì)胞4天，然后通過(guò)3H-胸苷攝取來(lái)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)表示為平均值+SD。(C)MDA-7誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞停止(箭頭)。使用PI和流式細(xì)胞術(shù)就細(xì)胞周期分析用Ad-mda7、Ad-luc或載體對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞。(D)Ad-mda7以劑量和時(shí)間依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。用Ad-mda7或Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)MDA-MB-453細(xì)胞且在轉(zhuǎn)導(dǎo)后24-72小時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行分析。結(jié)果表示為細(xì)胞死亡百分比對(duì)載體劑量和時(shí)間。將數(shù)據(jù)表示為平均值+SD并作圖。(E)Ad-mda7在HMEC細(xì)胞中不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。用Ad-mda7和Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞并在4天后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行分析。結(jié)果表示為細(xì)胞死亡的百分比對(duì)劑量(0-10,000vp/細(xì)胞)。將數(shù)據(jù)表示為平均值+SD作圖。圖17A-C.Ad-mda7誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。(A)用Ad-mda7或Ad-luc處理乳腫瘤系3天，然后使用膜聯(lián)蛋白V分析細(xì)胞凋亡。*p＜0.01。將數(shù)據(jù)表示為平均值+SD作圖。(B)MDA-7在T47D細(xì)胞中誘導(dǎo)BAX。用2000vp/細(xì)胞的Ad-luc或Ad-mda7處理T47D細(xì)胞，然后就MDA-7和BAX的表達(dá)評(píng)估裂解物。使用ZVAD的處理減少細(xì)胞凋亡但MDA-7或BAX不減少細(xì)胞凋亡。(C)MDA-7在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白。用Ad-mda7、Ad-luc或無(wú)處理(UT)處理MDA-MB-468細(xì)胞。用抗胱天蛋白酶3、PARP和MDA-7的抗體探測(cè)細(xì)胞裂解物。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)對(duì)照以顯示等量蛋白上樣。圖18A-D.Ad-mda7抑制乳腺腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)。使用乳腺癌細(xì)胞MCF-7(A)、MDA-MB-468(B)和MDA-MB-361(C)在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤形成。然后用Ad-mda7、Ad-luc或PBS注射所述腫瘤，然后讓其生長(zhǎng)。結(jié)果表示為腫瘤體積(以mm3表示)對(duì)時(shí)間(以天表示)。對(duì)于MCF-7和MB-361，*p＜0.002；對(duì)于MB-468，p＜0.004。(D)Ad-mda7在8個(gè)MDA-MB-46乳腺癌異種移植物中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在裸鼠中產(chǎn)生腫瘤，然后用PBS、Ad-Lu或Ad-mda7注射腫瘤，24小時(shí)后采集腫瘤，將其固定在福爾馬林中。使用抗MDA-7蛋白或PKR蛋白的抗體對(duì)石蠟包埋的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在Ad-mda7處理的腫瘤中，觀察到MDA-7和PKR表達(dá)(藍(lán)色染色的細(xì)胞)顯著增加。Ad-mda7處理的腫瘤也顯示高水平的TUNEL信號(hào)(箭頭)。對(duì)照腫瘤未顯示MDA-7表達(dá)、PKR的誘導(dǎo)或細(xì)胞凋亡。圖19.Ad-mda7在多種模型中顯著抑制乳腺癌生長(zhǎng)。顯示腫瘤模型和p53狀態(tài)。圖20A-B.當(dāng)與他莫昔芬組合時(shí)，Ad-mda7表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。(A)用Ad-mda7和他莫昔芬或空Ad和他莫昔芬處理的T47D細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。用Ad載體(0-1000vp/細(xì)胞)和不斷增加的他莫昔芬(0-2ng/mL)處理細(xì)胞3天，就細(xì)胞增殖對(duì)其進(jìn)行分析。(B)用Ad-mda7或Ad-luc作為單一療法或與1μg/ml他莫昔芬的組合處理MCF-7和T47D。數(shù)據(jù)表示為平均值+SD。圖21A-B.使用他莫昔芬和Ad-mda7的組合處理抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。如所顯示的，用Ad-mda7或Ad-luc(0-2000vp/細(xì)胞)和他莫昔芬(0-2ng/mL)處理乳腺癌細(xì)胞系(A)T47D和(B)MCF-7。3天后，使用3H胸苷吸收測(cè)定增殖。數(shù)據(jù)表示為平均值+SD。圖22A-D.Ad-mda7和阿霉素或赫賽汀的組合處理抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。如所顯示的，用Ad-mda7或Ad-luc與阿霉素(0-1ng/mL)處理(A)T47D和(B)MCF-7乳腺癌細(xì)胞系。3天后，使用3H胸苷吸收測(cè)定增殖。數(shù)據(jù)表示為平均值+SD。(C)MDA-MB-453細(xì)胞的裂解物的Western分析，所述細(xì)胞用作為單一療法(對(duì)照)的Ad-mda7(M)或Ad-luc(L)進(jìn)行處理，或用Ad-mda7(M)或Ad-luc(L)與他莫昔芬、阿霉素或赫賽汀的組合進(jìn)行處理。使用抗p53和BCL-2家族成員的抗體探測(cè)印跡。使用微管蛋白染色驗(yàn)證等量上樣。(D)Ad-mda7與赫賽汀在Her2+細(xì)胞中協(xié)同作用。如所顯示的，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色在用對(duì)照(UT)、1μg/ml赫賽汀(H)、2000vp/細(xì)胞的Ad-luc(L)、Ad-mda7(M)或組合處理3天后的MDA-MB-453(Her2+)和MCF-7(Her2-)乳腺腫瘤細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞死亡。數(shù)據(jù)表示為平均值+SD.圖23.當(dāng)與化學(xué)療法組合時(shí)，Ad-mda7調(diào)節(jié)不同細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑。用Ad-mda7、Ad-luc(2000vp/細(xì)胞)或載體和指定的治療劑一起處理MDA-MB-453細(xì)胞。使用抗p53、BCL-2、BCL-XL、BAX的抗體免疫印跡細(xì)胞裂解物并使用微管蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。將Ad-mda7裂解物中的信號(hào)與對(duì)應(yīng)的Ad-luc處理進(jìn)行比較。↓與Ad-luc對(duì)照相比減少的表達(dá)；↑與Ad-luc對(duì)照相比增加的表達(dá)；-Ad-mda7或Ad-luc之間無(wú)變化；n.s.無(wú)信號(hào)。圖24A-B.使用Ad-mda7與放射療法的組合研究。(A)Ad-mda7+放射(RT)的組合在克隆形成細(xì)胞中減少細(xì)胞的存活。以2000vp/細(xì)胞用RT、空Ad或Ad-mda7處理MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞；在感染48小時(shí)后，刺激細(xì)胞(0、2或4Gy)，然后通過(guò)克隆形成測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。與對(duì)照處理相比，Ad-mda7+放射療法的組合協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞中的集落形成。(B)放射療法(RT)和Ad-mda7的組合在體內(nèi)顯著減少了乳腺癌生長(zhǎng)。當(dāng)MDA-MB-468乳腺癌腫瘤達(dá)到大約100mm3時(shí)，將動(dòng)物分成6個(gè)處理組(各組中的動(dòng)物為n＝5)；PBS、Ad-luc、Ad-luc+RT、RT、Ad-mda7和Ad-mda7+RT。每隔一天以2×1010vp/ml的劑量通過(guò)瘤內(nèi)注射遞送重組腺病毒，進(jìn)行總共3次注射。在第3次注射24小時(shí)后，將5Gy的單劑量遞送至后肢。通過(guò)兩維測(cè)量估量腫瘤的生長(zhǎng)并記錄腫瘤體積。處理組之間在腫瘤的大小上存在顯著的差異。Ad-mda7單一療法比單獨(dú)的RT或Ad-luc/RT產(chǎn)生更大的腫瘤生長(zhǎng)抑制。在接受XRT和Ad-mda7的組合的動(dòng)物中觀察到最顯著的生長(zhǎng)抑制。*p＜0.002圖25.Ad-mda7載體感染的乳腺癌細(xì)胞表達(dá)IL-24蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞的殺傷。如所顯示的用不同量的Ad-mda7或Ad-luc處理MDA-MB231和MDA-MB453，進(jìn)行72小時(shí)。將通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果表示為使用三份重復(fù)樣品的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD并作圖。**p＜0.01，與Ad-luc相比。圖26.Ad-mda7誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。(A)如所顯示的，用Ad-mda7或Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)MDA-MB453細(xì)胞。在72小時(shí)的溫育后用FACS測(cè)定法分析細(xì)胞。圖中顯示PI染色的細(xì)胞的分布。箭頭標(biāo)示顯著高于對(duì)照或Ad-luc處理的細(xì)胞的G2/M細(xì)胞群體(p＜0.05)。將結(jié)果表示為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD并作圖。(B)向MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞中加入5000vp/細(xì)胞的Ad-mda7或Ad-luc進(jìn)行3天，然后通過(guò)膜聯(lián)蛋白V分析定量凋亡細(xì)胞的百分比。*表示顯著高于對(duì)照(p＜0.05)的凋亡細(xì)胞群體。將結(jié)果表示為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD并作圖。圖27.IL-24蛋白激活磷酸STAT3且在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷。用3000vp/細(xì)胞Ad-mda7+指定濃度的正常小鼠IgG或抗IL24單克隆抗體處理MDA-MB231和MDA-MB453乳腺癌細(xì)胞以及MeWo黑素瘤細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)。3天的溫育后，將細(xì)胞死亡對(duì)處理作圖。將數(shù)據(jù)表示為使用三份重復(fù)樣品的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD并作圖。與Ad-mda7介導(dǎo)的殺傷相比，*p＜0.01。圖28A-B.IL-24介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的殺傷通過(guò)IL-20R1發(fā)生。(A)單獨(dú)地使用30ng/mlIL-24或與500ng/ml指定的抗體(抗-MDA7、抗IL-20R1、抗IL-22R1或正常小鼠IgG)一起處理MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞，進(jìn)行96小時(shí)。與IL-24介導(dǎo)的殺傷相比，*p＜0.01。數(shù)據(jù)表示為三份重復(fù)樣品的平均值+SD。(B)IL-24蛋白誘導(dǎo)MDA-MB453細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。向MDA-MB453細(xì)胞培養(yǎng)基中加入各種稀釋度的人IL-24蛋白。IL-24的Western印跡示于上圖中。在96小時(shí)的處理后，收集細(xì)胞，然后使用TUNEL染色確定凋亡細(xì)胞群體。圖29.IL-10阻斷IL-24的殺傷活性。(A)使用30ng/mlIL-10、IL-19、IL-20、IL-22或IL-24處理MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞96小時(shí)。將通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果表示為使用三份重復(fù)樣品的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD并作圖。與IL-10相比，*p＜0.01。用30ng/mlIL-24、或IL-24與濃度不斷增加的IL-10(0-300ng/ml)或與煮沸變性的IL-10一起處理(B)MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞。*p＜0.05表示與單獨(dú)的IL-24相比，顯著的細(xì)胞死亡抑制。數(shù)據(jù)表示為使用三份重復(fù)樣品的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD。圖30A-B.MDA-7/IL-24抑制肺腫瘤細(xì)胞中的VEGF。用PBS、Ad-Luc或Ad-mda7處理肺腫瘤細(xì)胞。在處理后72小時(shí)收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，然后通過(guò)印跡法分析外源MDA-7蛋白的表達(dá)和來(lái)自細(xì)胞裂解物的VEGF以及通過(guò)ELISA分析上清液中的VEGF。(A)MDA-7和VEGF在PBS-Ad-luc-和Ad-mda7-處理的細(xì)胞中的表達(dá)。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部上樣對(duì)照。(B)通過(guò)ELISA測(cè)定VEGF表達(dá)并表示為相對(duì)于PBS的百分比抑制。圖31A-B.MDA-7-介導(dǎo)的VEGF抑制不依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞殺傷。用PBS、Ad-Luc或Ad-mda7(1000vp/細(xì)胞)處理腫瘤細(xì)胞。(A)在處理后不同的時(shí)間點(diǎn)上收集細(xì)胞并確定細(xì)胞的生存力。在24至72小時(shí)期間，在這三種處理組中未觀察到顯著的腫瘤細(xì)胞抑制。(B)在處理后48小時(shí)和第72小時(shí)，培養(yǎng)上清液的分析顯示，與Ad-luc處理相比，Ad-mda7處理的上清液中的VEGF水平減少。如在細(xì)胞生存力測(cè)定中觀察到的，觀察到Ad-mda7對(duì)VEGF的抑制不依賴(lài)于細(xì)胞的殺傷。圖32.MDA-7介導(dǎo)的VEGF抑制通過(guò)抑制Src發(fā)生。如實(shí)施例8中所述，用PBS、Ad-Luc或Ad-mda7處理腫瘤細(xì)胞，收集該細(xì)胞并就Src激酶活性的表達(dá)對(duì)其進(jìn)行分析。與PBS和Ad-luc處理的細(xì)胞中的Src活性相比，Ad-mda7對(duì)Src激酶的抑制顯著增加。圖33.腫瘤細(xì)胞中MDA-7介導(dǎo)的VEGF抑制影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(A)在處理后48小時(shí)收集來(lái)自用BS、Ad-luc或Ad-mda7處理的H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，然后在過(guò)量的抗MDA7中和抗體(10μg/ml)或重組VEGF165蛋白(50ng/ml)存在或不存在的情況下加入HUVEC中。如實(shí)施例8中所述，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定法就細(xì)胞增殖分析細(xì)胞，通過(guò)western印跡法就VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析細(xì)胞。與來(lái)自PBS和Ad-luc處理的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相比，來(lái)自Ad-mda7處理的H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯著抑制HUVEC增殖。(B)VEGFR2和pAKT(HUVEC中的VEGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶)在第5、10和60分鐘的分析顯示VEGFR2和AKT在用來(lái)自PBS和Ad-luc處理的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的HUVEC中被激活。然而在用培養(yǎng)基處理的HUVEC中未觀察到VEGFR2和AKT的激活，所述培養(yǎng)基來(lái)自在抗MDA7中和抗體存在或不存在的情況下用Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞。當(dāng)向來(lái)自Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中加入rhVEGF蛋白時(shí)，HUVEC中的VEGFR2和AKT的激活恢復(fù)。圖34.貝伐單抗而非MDA-7抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Avastin、Ad-luc+Avastin或Ad-mda7+Avastin處理腫瘤(H1299)細(xì)胞和內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞。檢測(cè)與Ad-luc或Ad-mda7組合的三種不同濃度的Avastin。在處理后48小時(shí)和72小時(shí)收集細(xì)胞并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞生存力。在腫瘤細(xì)胞中，在任何處理組中未觀察到顯著的抑制。然而，在內(nèi)皮細(xì)胞中，在使用Avastin、Ad-luc+Avastin和Ad-mda7+Avastin處理的細(xì)胞中觀察到顯著的抑制。然而，當(dāng)以劑量依賴(lài)性的方式用Ad-mda7和Avastin處理內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，觀察到最顯著的抑制。圖35.腫瘤細(xì)胞中MDA-7和Avastin的組合對(duì)VEGF的抑制影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在處理后48小時(shí)收集來(lái)自用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Avastin、Ad-luc+Avastin或Ad-mda7+Avastin進(jìn)行處理的H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)基并將其加入至HUVEC。通過(guò)“材料和方法”中的臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定法就細(xì)胞增殖分析細(xì)胞。與來(lái)自PBS和Ad-luc處理的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相比，來(lái)自Ad-mda7-、Avastin-、Ad-luc+Avastin-和Ad-mda7+Avastin處理的H1299細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯著抑制HUVEC增殖。然而，當(dāng)用來(lái)自Ad-mda7+Avastin處理的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理HUVEC時(shí)，抑制效果最顯著。圖36.Ad-mda7+Avastin在體內(nèi)顯著地減少VEGF。圖37.MDA-7+Avastin在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)注射H1299腫瘤細(xì)胞(5×106)在裸鼠中產(chǎn)生皮下H1299腫瘤細(xì)胞。將動(dòng)物分組(n＝8只/組)并如下進(jìn)行處理PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Avastin、Ad-luc+Avastin和Ad-mda7+Avastin。瘤內(nèi)注射Ad-mda7或Ad-luc(1×1010vp/注射)和腹膜內(nèi)注射Avastin(5mg/Kg)。每周進(jìn)行二次處理，進(jìn)行四周，每周測(cè)量腫瘤大小三次。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，然后分離腫瘤并將其接受免疫組織化學(xué)分析和western印跡分析。與其他處理組相比，用Ad-mda7+Avastin處理的小鼠中觀察到顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制。與來(lái)自用PBS或Ad-luc處理的小鼠中的腫瘤相比，在Ad-mda7、Avastin和Ad-luc+Avastin處理的小鼠中也觀察到腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制。在任何處理組中未觀察到顯著的體重減輕(測(cè)量至第28天)。圖37.Ad-mda7+TNFα處理抑制腫瘤細(xì)胞增殖。用PBS(P)、TNFα(T)、Ad-Luc(L)、Ad-mda7(M)、Ad-luc+TNF(L+T)或Ad-mda7+TNF(M+T)處理前列腺腫瘤(LNCaP)腫瘤細(xì)胞。以1500vp/細(xì)胞進(jìn)行病毒處理和以5ng/ml進(jìn)行TNF處理。在處理后48小時(shí)和72小時(shí)將細(xì)胞接受XTT測(cè)定以確定細(xì)胞生存力。與其他處理組相比，用Ad-mda7+TNF處理的細(xì)胞顯示顯著的生長(zhǎng)抑制。圖38.TNFα增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在TNFα(10ng/ml)存在或不存在的情況下用100、300、600和1200vp/細(xì)胞的Ad-GFP處理腫瘤(LNCaP)細(xì)胞。未接受處理的細(xì)胞用作對(duì)照。在TNFα處理后24小時(shí)，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，重懸浮于500ulPBS并接受FACS分析。用單獨(dú)的Ad-GFP處理的細(xì)胞顯示了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(所述轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對(duì)于100vp/細(xì)胞的Ad-GFP始于73.5％)的劑量依賴(lài)性增加。然而，在TNFα存在的情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增加且對(duì)于100vp/細(xì)胞的Ad-GFP觀察到轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為92.8％。在TNFα存在的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)的增加從300vp/細(xì)胞的Ad-GFP開(kāi)始似乎達(dá)到了飽和。圖39.Ad-mda7+TNFα處理導(dǎo)致增加的SubG0/G1期的細(xì)胞數(shù)目。用PBS(P)、TNFα(T；10ng/ml)、Ad-Luc(L；1500vp/細(xì)胞)、Ad-mda7(M；1500vp/細(xì)胞)、Ad-luc+TNF(L+T)、Ad-mda7+TNF(M+T)、Ad-luc+抗TNF抗體(L+A；lug/ml)或Ad-mda7+抗TNF抗體(M+A)處理腫瘤(LNCaP)細(xì)胞。在處理后48小時(shí)收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，重懸浮于500ul包含碘化丙啶(0.5ug/ml)的PBS中。將細(xì)胞接受FACS分析。與范圍在0.45％至26.3％之間的其他處理組相比，觀察到用Ad-mda7和TNF處理的大量細(xì)胞處于標(biāo)志凋亡細(xì)胞的SubG0/G1期(70％)。舉例說(shuō)明性實(shí)施方案的描述A.MDA-7組合物本發(fā)明的組合物和方法使用MDA-7多肽和編碼該多肽的核酸。MDA-7是已顯示抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的腫瘤抑制劑，所述癌細(xì)胞為p53野生型、p53-無(wú)效型和p53突變型。此外，觀察到的p53無(wú)效細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡相關(guān)性B基因的上調(diào)表明MDA-7能夠使用非p53依賴(lài)性機(jī)制誘導(dǎo)癌細(xì)胞的破壞。B.MDA-7已在人PBMC中鑒定了Mda-7mRNA(Ekmekcioglu等人，2001)，但未報(bào)導(dǎo)過(guò)人MDA-7蛋白的細(xì)胞因子功能?；诨蚝偷鞍仔蛄械奶卣?NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索號(hào)XM_001405)將MDA-7稱(chēng)為IL-24。鼠類(lèi)MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4誘導(dǎo)的分泌蛋白)被報(bào)導(dǎo)為T(mén)h2特異性細(xì)胞因子(Schaefer等人，2001)。如由基因敲除研究所證明的，F(xiàn)ISP的轉(zhuǎn)錄是通過(guò)TCR和IL-4受體結(jié)合，然后激活PKC和STAT6誘導(dǎo)的。已表征了FISP的表達(dá)但對(duì)于該假定的細(xì)胞因子仍未賦予功能(Denkert等人，2004)。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)具有與mda-7基因78％的同源性且與傷口愈合相關(guān)(Soo等人1999；Zhang等人，2000)。也顯示Mob-5為分泌蛋白，且在大鼠轉(zhuǎn)化細(xì)胞上鑒定了假定的細(xì)胞表面受體(Zhang等人，2000)。因此，MDA-7基因和分泌的MDA-7蛋白的同源物在不同物種中表達(dá)和分泌。然而，沒(méi)有數(shù)據(jù)顯示MDA-7具有細(xì)胞因子活性。這些活性具有通過(guò)增強(qiáng)抗原的免疫原性治療多種疾病和感染的另外的功能。人mda-7cDNA(SEQIDNO1)編碼進(jìn)化上保守的、206個(gè)氨基酸(SEQIDNO2)的蛋白，預(yù)測(cè)大小為23.8kDa。推導(dǎo)的氨基酸序列包含從大約氨基酸26至45的疏水片段，該片段具有信號(hào)序列的特征。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、對(duì)已知細(xì)胞因子的同源性、染色體定位、預(yù)測(cè)的N末端分泌信號(hào)肽和其調(diào)控細(xì)胞因子分泌的證據(jù)的綜合都支持MDA-7/IL-24作主IL-10家族細(xì)胞因子的分類(lèi)(參見(jiàn)Chada等人，2004綜述)。49個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列鑒定其為分泌蛋白；最近的研究確認(rèn)了這點(diǎn)并且還報(bào)導(dǎo)Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞釋放高水平的40kDa的MDA-7蛋白形式，該蛋白可結(jié)合異源二聚體受體IL-20R1/IL-20R2和IL-22R2/IL-20R1。在其釋放入細(xì)胞外區(qū)室之前，所述蛋白的細(xì)胞內(nèi)形式(23-30kDa)被切割和被廣泛修飾(主要通過(guò)糖基化修飾)(參見(jiàn)Chada等人，2004綜述，其以參考引用方式并入本文)。如由正常的黑色素細(xì)胞中增加的mRNA水平(與原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤相比)和早期垂直生長(zhǎng)期黑素瘤細(xì)胞(所述細(xì)胞選擇為在裸鼠中增強(qiáng)腫瘤形成)中減少的MDA-7表達(dá)所證明的，MDA-7的表達(dá)與黑素瘤的進(jìn)展呈反相關(guān)。報(bào)導(dǎo)指出MDA-7是具有腫瘤細(xì)胞凋亡活性的IL-10家族細(xì)胞因子且其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效果對(duì)于腫瘤細(xì)胞是特異性的(參見(jiàn)Chada等人，2004綜述)。幾個(gè)研究小組已研究了介導(dǎo)mda-7的細(xì)胞凋亡活性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些途徑表現(xiàn)為多條途徑，細(xì)胞類(lèi)型特異性，且包括由蛋白的細(xì)胞內(nèi)形式和分泌形式(旁觀者效應(yīng))誘導(dǎo)的效應(yīng)(參見(jiàn)USN10/791,692，其以參考引用方式并入本文)。關(guān)于MDA-7的其他信息和數(shù)據(jù)可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)09/615,154、10/017,472、10/378,590和10/791,692，其全部以引用參考方式全文并入本文。其他研究已顯示MDA-7的提高的表達(dá)在體外抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)且誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡以及在裸鼠中抑制腫瘤生長(zhǎng)(Jiang等人，1996和Su等人，1998)。Jiang等人(1996)報(bào)導(dǎo)了發(fā)現(xiàn)，即MDA-7在各種來(lái)源(包括乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮頸、結(jié)腸、前列腺和結(jié)締組織)的癌細(xì)胞中是有效的生長(zhǎng)抑制基因。使用集落抑制測(cè)定法證明提高的MDA-7的表達(dá)在人宮頸癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、結(jié)腸癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑素瘤(HO-1和C8161)、惡性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM-18和T98G)和骨肉瘤(Saos-2)中增強(qiáng)生長(zhǎng)抑制性。MDA-7在正常細(xì)胞(HMEC、HBL-100和CREF-Trans6)中的過(guò)度表達(dá)顯示有限的生長(zhǎng)抑制作用，表明mda-7轉(zhuǎn)基因效應(yīng)在正常細(xì)胞中是不明顯的?？傊?，所述數(shù)據(jù)表明在體外由提高的MDA-7表達(dá)引起的生長(zhǎng)抑制作用在癌細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中更有效。Su等人(1998)報(bào)導(dǎo)了對(duì)MDA-7抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制的研究。該研究報(bào)導(dǎo)MDA-7在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中的異位表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(如可通過(guò)細(xì)胞周期分析和TUNEL測(cè)定檢測(cè)到的)但對(duì)正常HBL-100細(xì)胞無(wú)影響。來(lái)自用腺病毒mda-7(“Ad-mda7”)感染的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物的Western印跡分析顯示細(xì)胞凋亡刺激蛋白BAX的上調(diào)。Ad-mda7感染只在MCF-7和T47D細(xì)胞而不在正常HBL-100或HMEC細(xì)胞中提高BAX蛋白的水平。這些數(shù)據(jù)導(dǎo)致研究人員評(píng)估離體Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞的異種移植物腫瘤形成的影響。離體轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤異種移植物模型中導(dǎo)致對(duì)瘤形成和進(jìn)展的抑制。使用基因療法治療癌癥的主要方法是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這可通過(guò)使癌細(xì)胞對(duì)其他試劑產(chǎn)生敏感或通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)途徑直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。其他癌癥療法利用腫瘤對(duì)誘導(dǎo)血管發(fā)生從而為不斷生長(zhǎng)的腫瘤提供必需營(yíng)養(yǎng)物的需要。內(nèi)皮他丁和血管他丁是兩種這樣的療法的實(shí)例(WO00/05356和WO00/26368)。盡管不依附關(guān)于這些構(gòu)建體的可操作性的特定理論，但在位于C末端的參與受體結(jié)合的D螺旋區(qū)域存在跨物種的mda-7與IL-10的顯著的氨基酸序列同源性。因此，優(yōu)選地包含該30-35個(gè)氨基酸的區(qū)域的分子是特別優(yōu)選的。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，血管發(fā)生相關(guān)性疾病的治療包括施用治療性肽或多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療包括給靶(包括疾病細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞)施用編碼mda-7的核酸表達(dá)構(gòu)建體。所述靶細(xì)胞攝取構(gòu)建體，然后表達(dá)由核酸編碼的治療性多肽，從而抑制靶細(xì)胞的分化。表達(dá)MDA-7的細(xì)胞反過(guò)來(lái)可分泌可與相鄰的未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的或未被表達(dá)構(gòu)建體感染的細(xì)胞相互作用的蛋白。這樣，建立新脈管系統(tǒng)所需的復(fù)合物相互作用被抑制了，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤的治療。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可用MDA-7或表達(dá)該蛋白的構(gòu)建體治療血管發(fā)生相關(guān)性疾病。適合本發(fā)明中的治療法的一些血管發(fā)生相關(guān)性疾病是牛皮癬、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病(IBD)、骨關(guān)節(jié)炎(OA)和肺中的瘤前病損。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)許多種癌癥狀態(tài)的治療在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤，白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤，頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述血管發(fā)生相關(guān)性疾病是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、瘤前病損、原位癌，口毛狀白斑或牛皮癬可以是治療的對(duì)象。在特定的實(shí)施方案中，所述癌癥包括可以或不可以切除的腫瘤。此外，所述癌癥可包括轉(zhuǎn)移性腫瘤或可能能夠轉(zhuǎn)移的腫瘤?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法和組合物治療的癌細(xì)胞也包括來(lái)自膀胱、血、骨、骨髓、腦、乳腺、結(jié)腸、食道、胃腸，牙齦，頭部、腎、肝、肺臟、鼻咽、頸、卵巢、前列腺、皮膚、胃、睪丸、舌或子宮的細(xì)胞。此外，所述癌癥可具體地是下列組織學(xué)類(lèi)型，盡管其不限于這些類(lèi)型贅生物、惡性腫瘤、癌瘤、未分化的癌瘤、巨細(xì)胞癌和梭形細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、乳頭狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、淋巴上皮癌、基底細(xì)胞癌、毛基質(zhì)癌、移行細(xì)胞癌、乳頭狀移行細(xì)胞癌、腺癌、惡性胃泌素瘤，、膽管癌、肝細(xì)胞癌、混合肝細(xì)胞癌和膽管癌、小梁性腺癌、腺樣囊性癌、腺瘤性息肉內(nèi)腺癌、腺癌、家族性結(jié)腸息肉病、實(shí)體癌、惡性類(lèi)癌瘤、支氣管肺泡乳頭狀腺癌、乳頭狀腺癌、嫌色細(xì)胞癌、嗜酸細(xì)胞癌、嗜酸性腺癌、嗜堿細(xì)胞癌、透明細(xì)胞腺癌、顆粒細(xì)胞腺癌、濾泡腺癌、乳頭狀和濾泡狀腺癌、非包囊硬化性癌、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜樣癌、皮膚附屬器癌、大汗腺腺癌、皮脂腺癌、皮脂腺癌、粘液表皮樣癌、囊腺癌、乳頭狀囊腺癌、乳頭狀漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、髓樣癌、小葉癌、炎性癌；柏哲德氏癥、乳腺癌、腺泡細(xì)胞癌、腺鱗癌、腺癌w/鱗狀組織轉(zhuǎn)化、惡性胸腺瘤，、惡性卵巢間質(zhì)腫瘤、惡性泡膜細(xì)胞瘤、惡性粒層細(xì)胞瘤、惡性男性細(xì)胞瘤、支持細(xì)胞癌；惡性睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤、惡性脂質(zhì)細(xì)胞瘤、惡性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、惡性乳房外的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、血管球肉瘤、惡性黑素瘤、無(wú)黑色素性惡性黑素瘤、淺表擴(kuò)展性黑素瘤、巨色素痣中的惡性黑素瘤、上皮樣細(xì)胞黑素瘤、惡性藍(lán)痣、肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、小泡型橫紋肌肉瘤、間質(zhì)肉瘤、惡性混合瘤、牟勒氏管混合瘤、腎胚細(xì)胞瘤、肝毒細(xì)胞瘤、癌肉瘤、惡性間葉瘤、惡性布倫納瘤、惡性葉狀腫瘤、滑膜肉瘤、惡性間皮瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤；胚胎性癌、惡性畸胎瘤、惡性卵巢甲狀腺腫樣瘤、絨毛膜癌、惡性中腎瘤、血管肉瘤、惡性血管內(nèi)皮瘤、卡波西肉瘤、惡性血管外皮細(xì)胞瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、皮質(zhì)旁骨肉瘤、軟骨肉瘤、惡性成軟骨細(xì)胞瘤、間質(zhì)軟骨肉瘤、骨巨細(xì)胞瘤、尤因氏肉瘤、惡性牙源性腫瘤、成釉細(xì)胞牙肉瘤、惡性成釉細(xì)胞瘤、成釉細(xì)胞纖維肉瘤、惡性松果體瘤、脊索瘤、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、星形細(xì)胞瘤、原漿性星形細(xì)胞瘤、纖維性星形細(xì)胞瘤、星形母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤；原始神經(jīng)外胚層腫瘤、小腦肉瘤、神經(jīng)節(jié)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、嗅神經(jīng)源性腫瘤、惡性腦膜瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤；惡性顆粒細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤、何杰金氏病、何杰金氏副肉芽腫、小淋巴細(xì)胞惡性淋巴瘤、大細(xì)胞惡性淋巴瘤、彌漫性惡性淋巴瘤、濾泡惡性淋巴瘤；蕈樣肉芽腫病、其他特定的非何杰金氏淋巴瘤、惡性組織細(xì)胞增多癥；多發(fā)性骨髓瘤、肥大細(xì)胞肉瘤、免疫增生性小腸疾??；白血病、淋巴系白血病、漿細(xì)胞性白血病、紅白血病、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞性白血病、嗜堿細(xì)胞性白血病、嗜酸細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病、巨核母細(xì)胞白血病、巨核母細(xì)胞白血病、髓樣肉瘤和毛細(xì)胞性白血病。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，以表達(dá)MDA-7多肽的核酸形式提供mda-7。在特定的實(shí)施方案中，所述核酸是病毒載體，其中所述病毒載體劑量是或至少是103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015或更高的pfu或病毒顆粒。在某些實(shí)施方案中，所述病毒載體是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、α病毒載體、彈狀病毒載體或皰疹病毒載體。最優(yōu)選地，所述病毒載體是腺病毒載體。在其他特定的實(shí)施方案中，所述核酸是非病毒載體。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)該多肽的核酸有效連接至啟動(dòng)子。適合于本發(fā)明的啟動(dòng)子的非限定性實(shí)施例包括CMVIE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22或MHCII類(lèi)啟動(dòng)子，然而，用于驅(qū)動(dòng)mda-7基因或本發(fā)明的免疫基因表達(dá)的任何其他啟動(dòng)子，例如此處提供的啟動(dòng)子，據(jù)認(rèn)為可用于本發(fā)明的實(shí)施。優(yōu)選地，通過(guò)注射施用本發(fā)明的核酸。其他實(shí)施方案包括通過(guò)多次注射施用核酸。在某些實(shí)施方案中，在疾病或腫瘤的位置上、區(qū)域中或遠(yuǎn)側(cè)進(jìn)行注射。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)連續(xù)輸注、瘤內(nèi)注射、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射施用核酸。在其他實(shí)施方案中，在腫瘤切除前或之后或切除前和切除后者施用核酸?？蛇x擇地，在化學(xué)療法、生物療法、免疫療法、手術(shù)或放射療法之前、期間或之后施用核酸。優(yōu)選地所述患者是人。在其他實(shí)施方案中，所述患者是癌癥患者。C.核酸、載體和調(diào)控信號(hào)本發(fā)明涉及與mda-7基因和其基因產(chǎn)物MDA-7相關(guān)的多核苷酸或核酸分子。此外，本發(fā)明涉及與免疫原分子相關(guān)的多核苷酸或核酸分子。可從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離和純化這些多核苷酸或核酸分子。分離的和純化的MDA-7核酸分子(其為與mda-7基因產(chǎn)物相關(guān)的核酸分子)，分泌形式或全長(zhǎng)形式，可采取RNA或DNA的形式。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“RNA轉(zhuǎn)錄物”是指為從DNA核酸分子轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的RNA分子。這樣的轉(zhuǎn)錄物可編碼一種或多種多肽。如本申請(qǐng)中所用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指已從總基因組核酸分離出來(lái)的核酸分子，RNA或DNA。因此“編碼MDA-7的多核苷酸”是指包含MDA-7編碼序列的，而且從總基因組DNA和蛋白中分離或純化從而不含總基因組DNA和蛋白的核酸片段。當(dāng)本申請(qǐng)涉及編碼MDA-7的多核苷酸或核酸的功能或活性時(shí)，其是指多核苷酸編碼具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的能力的分子。術(shù)語(yǔ)“cDNA”是指使用RNA為模板制備的DNA。與基因組DNA或RNA轉(zhuǎn)錄物相反，使用cDNA的有利方面是使用重組DNA技術(shù)(參見(jiàn)Sambrook，2001；Ausubel，1996)操作序列的穩(wěn)定性和能力。也可有使用全長(zhǎng)或部分基因序列的時(shí)候?？蛇x擇地，cDNA可以是有利的因?yàn)槠浯矶嚯牡木幋a區(qū)且消除了內(nèi)含子和其他調(diào)控區(qū)。來(lái)自給定的細(xì)胞的給定的MDA-7編碼核酸或mda-7基因可由天然變體或株系代表，所述變體或株系具有稍許不同但仍編碼MDA-7多肽的核酸序列。在特定的情況下，人MDA-7多肽是個(gè)特定的實(shí)施方案。因此，本發(fā)明也包含具有最少氨基酸改變但具有相同活性的MDA-7的衍生物。術(shù)語(yǔ)“基因”簡(jiǎn)單用于指編碼功能性蛋白、多肽或及肽的核酸單位。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，該功能性術(shù)語(yǔ)包括基因組序列、cDNA序列和更小的經(jīng)基因工程改造的基因片段，所述序列和片段表達(dá)或經(jīng)改造從而可表達(dá)蛋白、多肽、結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白和突變體。編碼MDA-7的核酸分子可包含下列長(zhǎng)度或至少下列長(zhǎng)度的連續(xù)核酸序列5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多核苷酸、核苷或堿基對(duì)。這些序列可以與SEQIDNO1(MDA-7編碼序列)是同一的或互補(bǔ)的?！皩?shí)質(zhì)上從其他編碼序列分離的”是指目的基因形成核酸片段的編碼區(qū)的部分，和指所述片段不包含天然發(fā)生的核酸的大的部分例如大的染色質(zhì)片段或其他功能性基因或cDNA編碼區(qū)。當(dāng)然，這是指原始分離的核酸片段，且不排除通過(guò)人工操作后來(lái)加至所述片段的基因或編碼區(qū)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA片段和包含了DNA序列的重組載體，所述DNA片段和序列編碼在其氨基酸序列中包含與SEQIDNO2所示的序列一致或基本上一致的連續(xù)氨基酸序列的MDA-7蛋白、多肽或肽(對(duì)應(yīng)于稱(chēng)為“人MDA-7”或“MDA-7多肽”的MDA-7)。術(shù)語(yǔ)“基本上如SEQIDNO2中所示的序列”是指序列基本上對(duì)應(yīng)于SEQIDNO2的一部分但具有相對(duì)少量的與SEQIDNO2的氨基酸不同的氨基酸或生物學(xué)功能與其等同的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)功能等同”在本領(lǐng)域中是容易理解的且在此處被進(jìn)一步詳細(xì)地定義。因此，具有大約70％、大約71％、大約72％、大約73％、大約74％、大約75％、大約76％、大約77％、大約78％、大約79％、大約80％、大約81％、大約82％、大約83％、大約84％、大約85％、大約86％、大約87％、大約88％、大約89％、大約90％、大約91％、大約92％、大約93％、大約94％、大約95％、大約96％、大約97％、大約98％或大約99％和其中可衍生的任何范圍內(nèi)例如大約70％至大約80％，和更優(yōu)選地大約81％至大約90％，更優(yōu)選地大約91％至99％的與SEQIDNO2的氨基酸相同或功能等同的氨基酸的序列是作為“基本上如SEQIDNO2所示的序列”的序列，只要所述蛋白保留誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性。在特定的實(shí)施方案中，MDA-7蛋白、多肽或肽或生物學(xué)功能等同物的生物學(xué)活性包括增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其序列中包含基本上如SEQIDNO1所示的核酸序列的分離的DNA片段和重組載體。術(shù)語(yǔ)“基本上如SEQIDNO1所示的”以上述相同的意思使用且是指所述核酸序列基本上對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的部分但具有相對(duì)少數(shù)與SEQIDNO2的密碼子不同或功能上等同于其的密碼子。同樣，編碼展示MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段可用于本發(fā)明的實(shí)施方案。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼MDA-7多肽或肽的分離的核酸片段和重組載體，所述多肽或肽在其氨基酸序列中包含與MDA-7多肽一致或基本上對(duì)應(yīng)于其的連續(xù)氨基酸序列。本發(fā)明的載體主要設(shè)計(jì)用于用在真核啟動(dòng)子(即，組成型、誘導(dǎo)型、阻抑型、組織特異性啟動(dòng)子)控制之下的治療性mda-7基因或編碼MDA-7的核酸序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞。另外，所述載體可包含有助于其體外操作(如果不是因?yàn)槠渌?的選擇標(biāo)記。然而，選擇標(biāo)記可在產(chǎn)生重組細(xì)胞中起著重要作用。下面的表1和2列出了用于本發(fā)明的應(yīng)用的多種調(diào)控信號(hào)。表1-誘導(dǎo)型元件表2-其他啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件真核細(xì)胞中控制編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子由多個(gè)基因元件組成。細(xì)胞裝置能夠收集和整合由各元件輸送的調(diào)控信息，從而使得不同基因演化出不同的、通常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”此處用于表示成簇圍繞RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄控制模塊組。許多關(guān)于啟動(dòng)子組織的機(jī)制的構(gòu)想源于幾個(gè)病毒啟動(dòng)子(包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子)的分析。獲得最近工作充實(shí)的這些研究已顯示啟動(dòng)子由分開(kāi)的功能性模塊組成，各模塊由大約7-20bp的DNA組成，且包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。各啟動(dòng)子中至少一個(gè)模塊用作RNA合成的起始位置。該位置最為熟知的實(shí)例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的啟動(dòng)子例如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和SV40晚期基因的啟動(dòng)子中，與其自身起始位置交疊的分開(kāi)的元件幫助固定起始位置。另外的啟動(dòng)子元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。一般地，這些元件位于起始位點(diǎn)上游30至110bp的區(qū)域，盡管最近已顯示許多啟動(dòng)子也在起始位點(diǎn)下游包含功能性元件。元件之間的間隔是可變的，這樣當(dāng)元件相對(duì)另一個(gè)元件倒轉(zhuǎn)或移動(dòng)時(shí)啟動(dòng)子功能仍得到保存。在tk啟動(dòng)子中，元件之間的間隔可在活性開(kāi)始下降之前增加至50bp的距離。依賴(lài)于啟動(dòng)子，單個(gè)元件似乎可共同協(xié)作或獨(dú)立地激活轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子最初作為增加位于相同DNA分子的較遠(yuǎn)的位置上的從啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的基因元件被發(fā)現(xiàn)的。在較長(zhǎng)距離上發(fā)揮作用的該能力在原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的經(jīng)典研究中鮮有先例。隨后的工作顯示具有增強(qiáng)子活性的DNA區(qū)域的組織與啟動(dòng)子非常相似。即，其由許多單個(gè)的元件組成，各個(gè)元件與一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白。增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的基本區(qū)別是可操作性。啟動(dòng)子區(qū)域作為整體必須能以一定距離刺激轉(zhuǎn)錄；啟動(dòng)子區(qū)域或其組成元件則不一定需要這樣。在另一方面，啟動(dòng)子必須具有一個(gè)或多個(gè)在特定的位點(diǎn)和以特定的方向指導(dǎo)RNA合成起始的元件，而增強(qiáng)子缺少這些特異性。除了該可操作的區(qū)別外，增強(qiáng)子和啟動(dòng)子是非常相似的實(shí)體。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在細(xì)胞中具有激活轉(zhuǎn)錄的相同的一般功能。其通常交疊和鄰接，通常似乎具有非常相似的模塊組織?？傊?，這些原因暗示著增強(qiáng)子和啟動(dòng)子是同源實(shí)體且結(jié)合至這些序列的轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白可以以基本相同的方式與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用。在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以以存在于載體pcDNAIII中的形式從Invitrogen商購(gòu)獲得，其可用于本發(fā)明。dectin-1和dectin-2啟動(dòng)子也用于本發(fā)明。下面是可與本發(fā)明一起使用的其他病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的目錄。此外任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(按照真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)EPDB)也可用于驅(qū)動(dòng)編碼寡核酸加工酶、蛋白折疊輔助蛋白、選擇標(biāo)記蛋白或目的異源蛋白的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。可證明有用的另一個(gè)信號(hào)是多腺苷酸化信號(hào)。這些信號(hào)可從人生長(zhǎng)激素(hGH)基因、牛生長(zhǎng)激素(BGH)基因或SV40獲得。內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元件可用于產(chǎn)生多個(gè)基因或多順?lè)醋有攀筊NA。IRES元件能夠繞過(guò)5’甲基化帽依賴(lài)性翻譯的核酸體掃描模型并在內(nèi)部位點(diǎn)開(kāi)始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了來(lái)自小核糖核酸病毒科的兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌)的IRES(Pelletier和Sonenberg，1988)和來(lái)自哺乳動(dòng)物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)?？蓪RES元件連接至異源可讀框?？梢黄疝D(zhuǎn)錄多個(gè)可讀框，各可讀框被IRES分隔，產(chǎn)生了多順?lè)醋有攀筊NA。依靠IRES元件，核糖體可接近各可讀框進(jìn)行有效翻譯。可使用單個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄單個(gè)信使RNA來(lái)有效地表達(dá)多個(gè)基因。無(wú)論如何，要理解啟動(dòng)子是當(dāng)功能性地置于基因的上游時(shí)導(dǎo)致該基因表達(dá)的DNA元件。本發(fā)明的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體功能性地置于啟動(dòng)子元件的下游。提供本發(fā)明的組合物和用于給患者施用本發(fā)明的組合物的方法D.載體MDA-7多肽可由載體中包含的核酸分子編碼。這樣，可通過(guò)施用該載體給患者提供MDA-7多肽，只要所述多肽在患者中表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“載體”是指可將核酸序列插入其中以轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的載體核酸分子，所述載體分子可在所述細(xì)胞中復(fù)制。核酸序列可以是“外源的”，這表示所述核酸對(duì)于向其中導(dǎo)入載體的細(xì)胞是外源的或該序列與細(xì)胞中的序列是同源的但位于通常未在其中發(fā)現(xiàn)該序列的宿主細(xì)胞核酸內(nèi)的位置。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)以及人工染色體(例如，YAC)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)有良好的裝備通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)建載體，所述重組技術(shù)描述于Sambrook等人，(2001)和Ausubel等人，1996，兩者以參考引用方式并入本文。除了編碼修飾的多肽例如修飾的白樹(shù)毒素外，載體可編碼非修飾性多肽序列例如標(biāo)簽或靶向分子。有用的編碼這些整合蛋白的載體包括pIN載體(Inouye等人，1985)、編碼組蛋白片段的載體和用于產(chǎn)生谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)可溶性整合蛋白以進(jìn)行后期純化和分離或切割的pGEX載體。靶向分子是引導(dǎo)修飾的多肽至對(duì)象身體中的特定器官、組織、細(xì)胞或其他位置的分子。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指包含編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物的至少部分核酸序列的載體。在一些情況下，然后將RNA分子翻譯成蛋白、多肽或肽。表達(dá)載體可包含多種“控制序列”，所述控制序列是指有效連接的編碼序列在特定宿主生物中轉(zhuǎn)錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列外，載體和表達(dá)載體還可包含發(fā)揮其他功能的序列和在下文中描述的核酸序列。1.病毒載體a.腺病毒感染遞送重組DNA的一個(gè)方法包括使用腺病毒表達(dá)載體。盡管已知腺病毒載體具有很低的整合入基因組DNA的能力，但該特征被由這些載體提供的基因轉(zhuǎn)移的高效率所抵銷(xiāo)?！跋俨《颈磉_(dá)載體”是指包含含有足以(a)支持構(gòu)建體包裝和(b)支持最終表達(dá)已克隆至其中的重組基因構(gòu)建體的腺病毒序列的構(gòu)建體。所述腺病毒載體可以是復(fù)制缺陷型的，或至少條件缺陷型，腺病毒載體的性質(zhì)據(jù)認(rèn)為對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施不是至關(guān)重要的。所述腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞型A-F的任一種。亞組C中的腺病毒5型是為獲得用于本發(fā)明的條件復(fù)制缺陷型載體的起始材料。這是因?yàn)橄俨《?型是關(guān)于其的大量生物化學(xué)和遺傳學(xué)信息都已知的人腺病毒，且其其歷史上一直用于大多數(shù)使用腺病毒作為載體的構(gòu)建體。如上所述，本發(fā)明的常用載體是復(fù)制缺陷型載體且不具有腺病毒E1區(qū)域。因此，將轉(zhuǎn)化構(gòu)建體導(dǎo)入在E1編碼序列已被除去的位置上是最方便的。然而，構(gòu)建體在腺病毒序列內(nèi)插入的位置對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的。編碼目的基因的多核苷酸也可插入如由Karlsson等人(1986)描述的E3置換型載體的缺失的E3區(qū)域位置，或其中輔助細(xì)胞系或輔助病毒能互補(bǔ)E4缺陷的E4區(qū)域中。腺病毒的生長(zhǎng)和操作對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，且其在體外和體內(nèi)展示廣譜宿主性?？梢愿叩味壤缑縨l109-1011個(gè)噬斑形成單位獲得該組病毒，且其具有高感染性。腺病毒的生活周期不需要整合入宿主細(xì)胞基因組。通過(guò)腺病毒載體遞送的外源基因是附加體，因此具有較低的對(duì)宿主細(xì)胞的遺傳毒性。b.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征在于其通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程在感染的細(xì)胞中將其RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA的能力(Coffin，1990)。然后將所得的DNA作為前病毒穩(wěn)定地整合入細(xì)胞染色體并指導(dǎo)病毒蛋白的合成。所述整合導(dǎo)致病毒基因序列保留在受體細(xì)胞和其后代中。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼目的基因的核酸插入病毒的基因組以取代某些病毒的序列，從而產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。為了產(chǎn)生病毒體，可構(gòu)建包含gag、pol和env基因但不包含LTR和包裝組分的包裝細(xì)胞系(Mann等人，1983)。當(dāng)將包含cDNA的重組質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起導(dǎo)入(例如通過(guò)磷酸鈣沉淀法)該細(xì)胞系時(shí)，所述包裝序列允許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物被包裝入病毒顆粒，然后所述病毒顆粒被分泌入培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集包含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選地對(duì)其進(jìn)行濃縮，然后用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染許多細(xì)胞類(lèi)型。然而，整合和穩(wěn)定的表達(dá)需要宿主細(xì)胞的分裂(Paskind等人，1975)。c.AAV載體腺伴隨病毒(AAV)是吸引人的用于本發(fā)明的載體系統(tǒng)，因?yàn)槠渚哂懈哒项l率且其可感染非分裂細(xì)胞，從而使其能夠在組織培養(yǎng)中用于將基因遞送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Muzyczka，1992)。AAV在傳染性方面具有廣譜宿主性(Tratschin等人，1984；Laughlin等人，1986；Lebkowski等人，1988；McLaughlin等人，1988)，這意味著其可用于本發(fā)明。關(guān)于rAAV載體的產(chǎn)生和用途的詳細(xì)內(nèi)容描述于美國(guó)專(zhuān)利5,139,941和美國(guó)專(zhuān)利4,797,368，各自以參考引用方式并入本文。顯示AAV在基因遞送中的應(yīng)用的研究包括LaFace等人(1988)；Zhou等人(1993)；Flotte等人(1993)；和Walsh等人(1994)。重組AAV載體已成功地用于標(biāo)記基因(Kaplitt等人，1994；Lebkowski等人，1988；Samulski等人，1989；Shelling和Smith，1994；Yoder等人，1994；Zhou等人，1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等人，1985；McLaughlin等人，1988)和參與人疾病的基因(Flotte等人，1992；Ohi等人，1990；Walsh等人，1994；Wei等人，1994)的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。最近，已批準(zhǔn)AAV載體用于進(jìn)行囊性纖維化的治療的I期人試驗(yàn)。一般地，通過(guò)共轉(zhuǎn)染包含側(cè)翼連接兩個(gè)AAV末端重復(fù)的目的基因的質(zhì)粒(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989；各自以參考引用方式并入本文)和包含無(wú)末端重復(fù)的野生型AAV編碼序列的質(zhì)粒例如pIM45(McCarty等人，1991；以參考引用方式并入本文)來(lái)產(chǎn)生重組AAV(rAAV)病毒。也用攜帶AAV輔助功能所需的腺病毒基因的腺病毒或質(zhì)粒感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用腺病毒污染以該方式產(chǎn)生的rAAV病毒貯液，所述腺病毒在物理上必須與所述rAAV顆粒分開(kāi)(例如，通過(guò)氯化銫密度離心)?？蛇x擇地，可使用包含AAV編碼區(qū)的腺病毒載體或包含AAV編碼區(qū)和腺病毒輔助者基因中的一些或所有基因的的細(xì)胞系(Yang等人，1994；Clark等人，1995)。也可使用具有作為整合的前病毒的rAAVDNA的細(xì)胞系(Flotte等人，1995).d.魚(yú)精蛋白魚(yú)精蛋白也可用于與表達(dá)構(gòu)建體形成復(fù)合物。然后可用上述脂質(zhì)組合物配制這些復(fù)合物以給細(xì)胞施用。魚(yú)精蛋白是與DNA結(jié)合的小的高堿性的核蛋白。其在核酸遞送中的應(yīng)用描述于美國(guó)專(zhuān)利5,187,260，其以參考引用方式并入本文。涉及用于通過(guò)將病毒載體與魚(yú)精蛋白分子復(fù)合來(lái)增加病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法和組合物的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)10/391,068(2003年3月24日提交)具體地以參考引用方式并入本文。2.非病毒遞送除了編碼MDA-7蛋白的核酸的病毒遞送外，下面是將重組基因遞送入給定的宿主細(xì)胞的其他方法，因此這方法也被認(rèn)為在本發(fā)明內(nèi)。a.脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，表達(dá)載體可被捕獲在脂質(zhì)體或脂質(zhì)制劑中。脂質(zhì)體是特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有多個(gè)由水性介質(zhì)分開(kāi)的脂層。當(dāng)磷脂懸浮在過(guò)量的水溶液中時(shí)其自發(fā)地形成。在封閉的結(jié)構(gòu)形成之前脂質(zhì)組分進(jìn)行自我重排并將水和溶解的溶質(zhì)包含在脂雙層之間(Ghosh和Bachhawat，1991)。也涉及與Lipofectamine(GibcoBRL)復(fù)合的基因構(gòu)建體。脂質(zhì)體制劑的最新進(jìn)展已提高了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的功效(WO98/07408)。由等摩爾比例的1，2-雙(油酰氧)-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)和膽固醇組成的新脂質(zhì)體制劑顯著增強(qiáng)了體內(nèi)全身性基因遞送，大約150倍。據(jù)認(rèn)為DOTAP膽固醇脂質(zhì)制劑形成了稱(chēng)為“三明治脂質(zhì)體”的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)導(dǎo)該制劑將DNA“夾”在內(nèi)陷的雙層或‘花瓶’結(jié)構(gòu)之間。這些脂質(zhì)體的有益特征包括通過(guò)膽固醇產(chǎn)生的膠體穩(wěn)定性、二維DNA包裝和增加的血清穩(wěn)定性。在09/575,473中提供了用于治療癌癥的這些制劑的生產(chǎn)和用途，所述參考資料以參考引用方式并入本文。在其他實(shí)施方案中，脂質(zhì)體進(jìn)一步定義為納米顆粒。此處定義的“納米”顆粒是指亞微米顆粒。所述亞微米顆粒可以是任何大小。例如，所述納米顆?？删哂写蠹s0.1、1、10、100、300、500、700、1000納米或更大的直徑。給患者施用的納米顆?？梢允遣恢挂环N大小。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法可用于產(chǎn)生納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，在生產(chǎn)過(guò)程中擠出納米顆粒。關(guān)于納米顆粒的生產(chǎn)的示例性信息可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20050143336、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030223938、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20030147966和U.S.S.N.60/661,680，其各自具體地在該部分引用作為參考。在某些實(shí)施方案中，在施用脂質(zhì)核酸復(fù)合物后，將抗炎劑與脂質(zhì)一起施用以預(yù)防或減少炎癥。例如，抗炎劑可以是非甾體抗炎劑、水楊酸、抗風(fēng)濕劑、類(lèi)固醇或免疫抑制劑。關(guān)于將抗炎劑與脂質(zhì)-核酸復(fù)合物一起施用的信息可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20050143336，其具體地以參考引用方式并入本文?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法合成DOTAP膽固醇納米顆粒。例如，所述方法可與Chada等人，2003或Templeton等人，1997中所示的方法相同，其兩者具體地以參考引用方式并入本文。在小鼠中進(jìn)行注射之前2至3小時(shí)新鮮配制DOTAPChol-DNA復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉使用脂質(zhì)體或脂質(zhì)制劑捕獲核酸序列的應(yīng)用。脂質(zhì)體是特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的泡狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有多個(gè)由水性介質(zhì)分開(kāi)的脂層。當(dāng)磷脂懸浮在過(guò)量的水溶液中時(shí)其自發(fā)地形成。在封閉的結(jié)構(gòu)形成之前脂質(zhì)組分進(jìn)行自我重排并將水和溶解的溶質(zhì)包含在脂雙層之間(Ghosh和Bachhawat，1991)。也涉及與Lipofectamine(GibcoBRL)復(fù)合的基因構(gòu)建體。脂質(zhì)介導(dǎo)的核酸遞送和外源DNA在體外的表達(dá)已經(jīng)非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。Wong等人(1980)證明了在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行脂質(zhì)介導(dǎo)的遞送和外源DNA的表達(dá)的可行性?；谥|(zhì)的非病毒制劑提供了腺病毒基因療法的另一種選擇。盡管許多細(xì)胞培養(yǎng)研究已證明基于脂質(zhì)的非病毒基因轉(zhuǎn)移，但通過(guò)基于脂質(zhì)的制劑進(jìn)行的全身性基因遞送受到限制?；诜遣《局|(zhì)的基因遞送的主要限制是包含所述非病毒遞送載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)的毒性。脂質(zhì)體的體內(nèi)毒性部分地解釋了體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移結(jié)果之間的差異。促成該矛盾的數(shù)據(jù)的另一個(gè)因素是在血清蛋白存在和不存在的情況下脂質(zhì)體穩(wěn)定性的差別。脂質(zhì)體和血清蛋白之間的相互作用對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性質(zhì)具有很大的影響(Yang和Huang，1997)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體吸引和結(jié)合帶負(fù)電荷的血清蛋白。被血清蛋白包被的脂質(zhì)體溶解或被巨噬細(xì)胞吸收，從而導(dǎo)致其從循環(huán)中清除。目前的體內(nèi)脂質(zhì)體遞送方法使用皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)或顱內(nèi)注射以避免與循環(huán)中的陽(yáng)離子脂質(zhì)相關(guān)的毒性和穩(wěn)定性問(wèn)題。脂質(zhì)體和血漿蛋白的相互作用解釋了體外基因轉(zhuǎn)移(Felgner等人，1987)和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移(Zhu等人，1993；Solodin等人，1995；Liu等人，1995；Thierry等人，1995；Tsukamoto等人，1995；Aksentijevich等人，1996)的功效之間的差異。脂質(zhì)體制劑的最新進(jìn)展已提高了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的功效(WO98/07408)。由等摩爾比例的1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)和膽固醇組成的新脂質(zhì)體制劑顯著增強(qiáng)了體內(nèi)全身性基因遞送，大約150倍。據(jù)認(rèn)為DOTAP膽固醇脂質(zhì)制劑形成了稱(chēng)為“三明治脂質(zhì)體”的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)導(dǎo)該制劑將DNA“夾”在內(nèi)陷的雙層或‘花瓶’結(jié)構(gòu)之間。這些脂質(zhì)體的有益特征包括通過(guò)膽固醇產(chǎn)生的膠體穩(wěn)定性、二維DNA包裝和增加的血清穩(wěn)定性。通常在(I)反相蒸發(fā)法(II)脫水-再水化(III)去污劑透析和(IV)薄膜水合作用后通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體混合物的超聲處理或系列擠出(serialextrusion)進(jìn)行脂質(zhì)體制劑的制備。在制備后，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可用于封裝當(dāng)在循環(huán)中時(shí)有毒的(化療劑)或不穩(wěn)定的(核酸)化合物。脂質(zhì)體封裝已導(dǎo)致這些化合物的更低的毒性和更長(zhǎng)的血清半衰期(Gabizon等人，1990)。許多疾病療法正使用基于脂質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移策略來(lái)增強(qiáng)常規(guī)療法或建立新療法，特別是用于治療過(guò)度增生性疾病的療法?？蓪⒅|(zhì)體與血凝病毒(HVJ)復(fù)合。已顯示這有利于與細(xì)胞膜的融合，從而促進(jìn)脂質(zhì)體封裝的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等人，1989)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將脂質(zhì)體與細(xì)胞核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)復(fù)合或與其一起使用(Kato等人，1991)。在其他實(shí)施方案中，可將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-1兩者復(fù)合或與其聯(lián)合使用?？赏ㄟ^(guò)聚丙烯酰胺凝膠、氯化銫梯度離心、柱層析或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法(參見(jiàn)例如，Sambrook等人，2001，以參考引用方式并入本文)純化用于非病毒遞送的核酸。在某些方面，本發(fā)明涉及作為分離的核酸的核酸。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”是指已分離的不含大量細(xì)胞組分或體外反應(yīng)組分，和/或一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的大量總基因組核酸和轉(zhuǎn)錄的核酸的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)。用于分離核酸的方法(例如平衡密度離心沉淀法、電泳分離、柱層析)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。E.蛋白、肽和多肽本發(fā)明涉及MDA-7多肽的方法和組合物。在某些實(shí)施方案中，MDA多肽用于癌癥的治療。在某些實(shí)施方案中，直接提供MDA-7多肽。術(shù)語(yǔ)“蛋白”和“多肽”在此處可互換使用。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括包含MDA-7蛋白和缺少其內(nèi)源信號(hào)序列的MDA-7的截短形式或具有異源信號(hào)序列的MDA-7多肽的純化蛋白組合物的應(yīng)用。截短的MDA-7分子包括，例如，大致始于MDA-7氨基酸殘基46-49和更靠近N末端截短的分子。具體地包括始于殘基46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182且終止于殘基206的分子。在其他實(shí)施方案中，包括殘基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48與SEQIDNO2中所示的MDA-7的其他連續(xù)殘基。本發(fā)明也涉及MDA-7或編碼MDA-7的核酸和一種或多種下列物質(zhì)(a)TNF、(b)VEGF抑制劑或(c)IL-10抑制劑組合的方法和組合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述TNF、VEGF抑制劑或IL-10抑制劑是蛋白、多肽或肽。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可在MDA-7多肽或肽、TNF多肽或肽、VEGF抑制劑多肽或肽或IL-10抑制劑的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾和改變但仍能產(chǎn)生具有相似或想要的特征的分子。例如，某些氨基酸可被其他氨基酸置換或在蛋白質(zhì)序列中包含缺失、添加或截短而不顯著喪失與結(jié)構(gòu)相互作用的結(jié)合能力。因?yàn)槠涫谴_定該蛋白的生物學(xué)功能活性的蛋白的相互作用能力和性質(zhì)，因此可在蛋白序列(當(dāng)然，或其基礎(chǔ)的DNA編碼序列)中產(chǎn)生某些氨基酸序列置換，但獲得具有相似的腫瘤抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗原性或細(xì)胞因子特性的蛋白。因此本發(fā)明者認(rèn)識(shí)到可在MDA-7多肽或肽(或其基礎(chǔ)的DNA)的序列中產(chǎn)生許多改變而不顯著喪失其生物學(xué)用途或活性。TNFα的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列在此處分別示于SEQIDNO3和SEQIDNO4。TNFβ的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列在此處分別示于SEQIDNO5和SEQIDNO6。VEGF-A以通過(guò)選擇剪接從單個(gè)基因產(chǎn)生的幾種同種型存在。VEGF-A的同種型121的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO7和SEQIDNO8。VEGF-A的同種型165的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO9和SEQIDNO10。VEGF-A的同種型189的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO11和SEQIDNO12。VEGF-A的同種型206的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO13和SEQIDNO14。VEGF-B的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO15和SEQIDNO16。VEGF-C的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO17和SEQIDNO18。VEGF-D的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO19和SEQIDNO20。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(VEGF家族的成員)的全長(zhǎng)氨基酸序列和核酸序列此處分別示于SEQIDNO21和SEQIDNO22。在功能等同物方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員也理解，生物學(xué)功能等同蛋白或肽的定義的內(nèi)涵是對(duì)可在分子的確定部分內(nèi)產(chǎn)生的改變的數(shù)目的限制的概念，所述改變?nèi)詫?dǎo)致具有可接受水平的等同生物學(xué)活性的分子。因此生物學(xué)功能等同肽此處定義為其中某些但非大部分或所有氨基酸可被置換的肽。特別地，涉及小肽時(shí)，較少的氨基酸可被改變。當(dāng)然，可根據(jù)本發(fā)明容易地制備和使用許多具有不同置換的蛋白/肽。也很好地理解，當(dāng)某些殘基(例如酶的活性位點(diǎn)中的殘基或RNA聚合酶II結(jié)合區(qū)域中的殘基)顯示對(duì)于蛋白或肽的生物學(xué)或結(jié)構(gòu)特性特別重要時(shí)，這些殘基通常不可以改變。氨基酸置換通?；诎被醾?cè)取代基的相對(duì)相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等。氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類(lèi)型的分析顯示精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸都具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有總體相似的形狀。因此，基于這些考慮，下列亞組在此處定義為生物學(xué)功能等同物精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。為產(chǎn)生更為定量的改變，可考慮氨基酸的親水性指數(shù)?；谄涫杷院碗姾商卣鹘o每個(gè)氨基酸賦予親水性指數(shù)，這些指數(shù)是異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/甘氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴(lài)氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用生物學(xué)功能中的重要性在本領(lǐng)域內(nèi)是廣為理解的(Kyte&Doolittle，1982，以參考引用方式并入本文)。已知某些氨基酸可被具有相似親水性指數(shù)或評(píng)分的其他氨基酸置換但仍保持相似的生物學(xué)活性。在基于親水性指數(shù)產(chǎn)生改變的過(guò)程中，其親水性指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸的置換是優(yōu)選的，其親水性指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸的置換是特別優(yōu)選的，其親水性指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸的置換是更優(yōu)選的。在本領(lǐng)域也理解可基于親水性有效地進(jìn)行相似氨基酸的置換，特別是當(dāng)由此產(chǎn)生的生物學(xué)功能等蛋白或肽用于免疫實(shí)施方案時(shí)，如在本發(fā)明的情況下，特別有效。美國(guó)專(zhuān)利4,554,101，此處引用作為參考，指出蛋白的最大局部平均親水性(如由其相鄰氨基酸的親水性控制的)與其免疫原性和抗原性(即與該蛋白的生物學(xué)特性)相關(guān)。如美國(guó)專(zhuān)利4,554,101中所述，已將下列親水性值分配至氨基酸殘基精氨酸(+3.0)、賴(lài)氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。在基于相似的親水性值進(jìn)行改變時(shí)，其親水性在±2內(nèi)的氨基酸的置換是優(yōu)選的，其親水性在±1內(nèi)的氨基酸的置換是特別優(yōu)選的，其親水性在±0.5內(nèi)的氨基酸的置換是更特別優(yōu)選的。盡管描述已集中在由氨基酸改變產(chǎn)生的功能等同多肽上，但要認(rèn)識(shí)到這些改變可通過(guò)改變編碼DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)，也要考慮遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性以及兩個(gè)或更多密碼子可編碼相同的氨基酸。1.體外蛋白產(chǎn)生除了實(shí)施例中提供的純化方法外，描述了用于體外產(chǎn)生蛋白的一般方法。在用本發(fā)明的一些實(shí)施方案中的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，可用多種方法制備原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。為了使細(xì)胞在體外和與表達(dá)構(gòu)建體接觸時(shí)保持活力，必需確保細(xì)胞保持與恰當(dāng)比例的氧和二氧化碳以及營(yíng)養(yǎng)物接觸，同時(shí)保護(hù)其免受微生物污染。此處參考資料詳盡地描述和公開(kāi)了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(Freshney，1992)。上述的一個(gè)實(shí)施方案包括使用基因轉(zhuǎn)移使細(xì)胞永生化從而用于產(chǎn)生和/或提供蛋白。可如上所述將目的蛋白的基因轉(zhuǎn)移入合適的宿主細(xì)胞中，然后在合適的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。事實(shí)上可以該方式使用任何多肽的基因。上面描述了重組表達(dá)載體和其中包含的元件的產(chǎn)生?？蛇x擇地，要產(chǎn)生的蛋白可以是通常由所述細(xì)胞合成的內(nèi)源蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案使用用表達(dá)免疫基因產(chǎn)物(更具體地具有免疫原活性的蛋白)的病毒載體轉(zhuǎn)染的自體B淋巴細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其他實(shí)例包括Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞、其他B細(xì)胞和T細(xì)胞系例如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji等以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的細(xì)胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞。此外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以想要的方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞系。蛋白產(chǎn)物的這些修飾(例如，糖基化)和加工(例如，切割)對(duì)于蛋白的功能可以是非常重要的。不同的宿主細(xì)胞具有對(duì)于蛋白的翻譯后加工和修飾是特征性和特異性的機(jī)制。可選擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工?？墒褂枚喾N選擇系統(tǒng)，包括，但不限于分別存在于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中的HSV胸苷激酶、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因。同樣，抗代謝物抗性可用作選擇的基礎(chǔ)對(duì)于dhfr，其提供對(duì)二氫葉酸的抗性；gpt，其提供對(duì)霉酚酸的抗性；neo，其提供對(duì)氨基葡糖苷G418的抗性；和hygro，其提供對(duì)潮霉素的抗性?？梢詢煞N模式在體外繁殖動(dòng)物細(xì)胞作為在整個(gè)培養(yǎng)物中懸浮生長(zhǎng)的非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞或作為需要附著至固體基質(zhì)以進(jìn)行其增殖的貼壁依賴(lài)性細(xì)胞(即，單層類(lèi)型的細(xì)胞生長(zhǎng))。來(lái)自連續(xù)的已建立的細(xì)胞系的非貼壁依賴(lài)性或懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物的最為廣泛使用的方法。然而，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞具有局限性，例如致瘤潛能和比貼壁細(xì)胞低的蛋白產(chǎn)量。2.ER靶向序列本發(fā)明的多肽包括一種或多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列。細(xì)胞內(nèi)蛋白的最終定位依賴(lài)于蛋白序列內(nèi)的編碼的靶向序列。在最簡(jiǎn)單的情況下，信號(hào)的缺乏指導(dǎo)蛋白進(jìn)入缺省途徑，即細(xì)胞質(zhì)。注定保留在ER中的蛋白必須具有特定的信號(hào)肽以使蛋白保留在ER中。本發(fā)明的多肽可以在或可以不在N末端或C末端包含額外的氨基酸殘基。ER是從細(xì)胞核膜延伸至整個(gè)細(xì)胞質(zhì)的膜包圍的管和囊(潴泡)。蛋白的分泌途徑如下粗面型ER→高爾基體→分泌小泡→細(xì)胞外部。對(duì)于待分泌的蛋白，所述蛋白通常必須從ER運(yùn)輸至高爾基體。然而，某些蛋白必需要保留在ER內(nèi)，例如BiP、信號(hào)肽酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。特定的定位信號(hào)將蛋白靶向ER。某些蛋白因?yàn)樵谄漪然┒舜嬖贓R靶向序列Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL，以單字母密碼子表示)而保留在ER腔中。如果該序列不是蛋白的部分，則蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體中并被分泌出細(xì)胞。在羧基末端上存在KDEL序列或KKXX序列(KKXX序列)導(dǎo)致蛋白保留在ER中。這些序列的存在導(dǎo)致所述蛋白對(duì)這些區(qū)室的膜中的特定循環(huán)受體的結(jié)合，從而被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)回ER。蛋白從ER輸出不僅通過(guò)宏觀流動(dòng)發(fā)生，而且通過(guò)受調(diào)控的途徑發(fā)生，所述途徑特異性地識(shí)別介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體的靶向信號(hào)。16至30個(gè)殘基的ER信號(hào)序列的存在指導(dǎo)核糖體至ER膜并起始蛋白穿過(guò)ER膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。ER信號(hào)序列通常位于蛋白的N末端。這些靶向序列通常包含一個(gè)或多個(gè)帶正荷的氨基酸，之后是6-12個(gè)疏水性殘基的連續(xù)片段。信號(hào)序列通常在蛋白仍然在核糖體中生長(zhǎng)時(shí)從蛋白切除。來(lái)自在信號(hào)序列的幾個(gè)疏水氨基酸的特定缺失或其中一個(gè)突變成帶電荷的氨基酸都可導(dǎo)致蛋白不能穿過(guò)ER膜進(jìn)入腔內(nèi)。隨機(jī)N末端氨基酸序列的添加將使胞質(zhì)蛋白被轉(zhuǎn)移至ER腔，表明疏水殘基形成了對(duì)于ER靶向是至關(guān)重要的結(jié)合位點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列可包含任何數(shù)目的氨基酸殘基，只要這些氨基酸殘基將多肽的目的地靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。本發(fā)明的多肽可包含單個(gè)ER靶向序列或多個(gè)ER靶向序列。關(guān)于ER靶向信號(hào)的其他信息可見(jiàn)于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)invitrogen.com/content/sfs/manuals/pshooter_pef_man.pdf上的Invitrogen目錄號(hào)V890-20、V891-20、V892-20和V893-20，“pShooterVectorManualI(pEF/mycvectors)，”，其以引用參考方式全文并入本文。信號(hào)序列識(shí)別和靶向ER的蛋白的綜述也可見(jiàn)于Walter和Johnson，1994；Koch等人，2003；和Kabat等人，1987，其也具體地以參考引用方式并入本文。3.MDA-7純化的方法本發(fā)明在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中使用純化的MDA-7?？墒褂孟铝蟹椒ê捅绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似的方法實(shí)施此處公開(kāi)的MDA-7的純化方法。這些方法公開(kāi)于10/791,692，其以參考引用方式并入本文。下面提供該公開(kāi)內(nèi)容的部分(無(wú)圖)。F.抗體的產(chǎn)生1.結(jié)合MDA-7的抗體在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生重組的組氨酸標(biāo)記的MDA-7蛋白并在鎳螯合NTA瓊脂糖柱上進(jìn)行純化。將材料以分批的模式結(jié)合至鎳螯合樹(shù)脂進(jìn)行45分鐘，然后倒入柱中并使洗脫液流過(guò)柱床。用含有0.5％chap的10mMTrispH8.0洗滌材料，最后用10mMTrispH8.0+400mM咪唑?qū)⑵湎疵摮鲋?。?duì)10mMTrispH8.0透析洗脫的MDA-7。終產(chǎn)物顯示為具有大約23kDa的分子量的單一條帶。氨基末端蛋白序列顯示為正確的蛋白且純度估計(jì)為大于90％。使用下列方案將該材料注射入兔子皮下注射400mgMDA-7蛋白和IFA以及100mgMDP，3周后，注射200μgMDA-7蛋白和IFA，之后再靜脈內(nèi)注射100mgMDA-7蛋白?；贓LISA測(cè)定，抗血清的滴度顯示為大于1/100,000。需要時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。通過(guò)巰基鍵將MDA-7蛋白偶聯(lián)至固體支持樹(shù)脂。充分洗滌樹(shù)脂和結(jié)合的蛋白。使用該清洗的材料制備用于抗體純化的MDA-7柱。用20mMTris緩沖液pH8.0以1∶1的稀釋度稀釋兔多克隆血清，然后在泵入MDA-7柱之前通過(guò)0.2微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。然后用相同的20mMTris緩沖液pH8.0洗滌柱子直至吸光度返回至基線。用0.1M醋酸將抗體洗脫出柱子。立即將包含抗體洗脫劑調(diào)節(jié)回pH8.0。然后對(duì)10mMTrispH8.0透析親和純化的抗體并進(jìn)行濃縮。2.結(jié)合IL-10和VEGF的抗體本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含MDA-7和IL-10抑制劑的方法和組合物，其中所述抑制劑是抗體。本發(fā)明也涉及包含MDA-7和VEGF抑制劑的方法和組合物，其中VEGF抑制劑是結(jié)合VEGF的抗體。涉及結(jié)合免疫調(diào)節(jié)劑例如IL-10的抗體的信息可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利6,168,791，其具體地以參考引用方式并入本文。美國(guó)專(zhuān)利6,168,791教導(dǎo)抗體和用于產(chǎn)生結(jié)合免疫調(diào)節(jié)劑例如IL-10或IL-10的激動(dòng)劑的抗體和用于產(chǎn)生抗體的方法。關(guān)于IL-10抗體的產(chǎn)生的其他信息可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利6,407,218和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20050101770，其各自具體地以參考引用方式并入本文。此外，在下面在VEGF或IL-10特異性抗體的上下文中描述關(guān)于用于MDA-7純化的抗體。IL-10抗體序列的實(shí)例包括結(jié)合IL-10的抗體分子或其結(jié)合片段，包括至少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，其包含具有至少一個(gè)選自CDR1(SEQIDNO23)、CDR2的SEQIDNO24和CDR3的SEQIDNO25的氨基酸序列的多肽；和構(gòu)架區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列是全部或基本上全部人免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，其包含具有至少一個(gè)選自互補(bǔ)性決定區(qū)1(CDR1)的SEQIDNO26、CDR2的SEQIDNO27和CDR3的SEQIDNO28的氨基酸序列的多肽；和構(gòu)架區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列是全部或基本上全部人免疫球蛋白氨基酸序列。所述抗體還可包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包括γ1、γ2、γ3或γ4人重鏈恒定區(qū)或其變體。所述抗體還可包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包括λ或κ人輕鏈恒定區(qū)。關(guān)于抗人IL-10抗體的其他信息可見(jiàn)于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/i5020dat.pdf，其以參考引用方式并入本文。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指展示想要的生物學(xué)活性的任何形式的抗體或其片段。因此，其在廣義上進(jìn)行使用且具體地包括單克隆抗(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要其展示想要的生物學(xué)活性。包含在結(jié)合IL-10的抗體的定義內(nèi)的是IL-10抗體結(jié)合片段。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“IL-10結(jié)合片段”或“其結(jié)合片段”包括仍然基本上保持其抑制IL-10活性的生物學(xué)活性的抗體片段或衍生物。因此，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”或IL-10結(jié)合片段是指全長(zhǎng)抗體的部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙特異性抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如，sc-Fv；和從抗體片段形成的多特異性抗體。一般地，結(jié)合片段或衍生物保持其IL-10抑制活性的至少50％。優(yōu)選地，結(jié)合片段或衍生物保持其IL-10抑制劑活性的至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。IL-10結(jié)合片段也可包含基本上不改變其生物學(xué)活性的保守性氨基酸置換。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”，如此處所用的，是指從基本上均一的抗體群體獲得的抗體，即構(gòu)成所述群體的各個(gè)抗體除了可能可少量存在的天然發(fā)生的突變外是完全相同的。單克隆抗體是高度特異性的，是抗單一抗原表位的。相反地，常規(guī)(多克隆)抗體制劑通常包括多個(gè)抗(或?qū)τ?.....是特異性的)不同表位的抗體。修飾詞“單克隆”表示從基本上均一的抗體群體獲得的抗體的特征，但不能解釋為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過(guò)首先由Kohler等人，Nature256495(1975)等人描述的雜交瘤方法制備，或可通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,816,567)制備。也可使用例如Clackson等人，Nature352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離“單克隆抗體”。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指包含來(lái)自非人(例如，鼠類(lèi))抗體和人抗體的序列的抗體形式。這些抗體是包含來(lái)源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。一般地，人源化抗體將包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)基本上完整的可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)的高變環(huán)和所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的高變環(huán)和FR區(qū)。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少部分，通常為人免疫球蛋白的部分。可使用產(chǎn)生單克隆抗體的任何合適的方法。例如，可用IL-10或其片段免疫受體?？墒褂萌魏魏线m的免疫方法。這些方法可包括使用其他免疫刺激劑、重復(fù)的加強(qiáng)免疫和一種或多種免疫途徑的使用?？蓪L-10或VEGF的任何合適來(lái)源用作產(chǎn)生此處公開(kāi)的組合物和方法的非人抗體的免疫原。這些形式包括，但不限于通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的重組、合成、化學(xué)或酶降解方法產(chǎn)生完整的蛋白、肽和表位?？墒褂米阋援a(chǎn)生具有生物學(xué)活性的抗體的抗原的任何形式產(chǎn)生抗體。因此，引發(fā)抗原可以是單一表位、多個(gè)表位或單獨(dú)的整個(gè)蛋白或與本領(lǐng)域內(nèi)已知的一種或多種免疫原性增強(qiáng)劑組合的蛋白。引發(fā)抗原可以是分離的全長(zhǎng)蛋白、細(xì)胞表面蛋白(例如，使用所述抗原的至少部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行免疫)或可溶性蛋白(例如，只使用蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域部分進(jìn)行免疫)。可在經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中產(chǎn)生抗原。編碼抗原的DNA可以是基因組或非基因組DNA(例如cDNA)且編碼細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的至少部分。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“部分”是指組成目的抗原的免疫原性表位的最小數(shù)目的氨基酸或核酸(根據(jù)適宜的情況)?？墒褂眠m合轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞的任何基因載體，包括但不限于腺病毒載體、質(zhì)粒和非病毒載體例如陽(yáng)離子脂質(zhì)。G.使用多克隆抗體純化和表征分泌的MDA-71.親和柱產(chǎn)生首先純化來(lái)自兔血清的不同抗人MDA-7多克隆抗體。將冷凍的兔血清樣品解凍，然后用無(wú)菌1XPBS緩沖液1∶1的稀釋度稀釋。將稀釋的樣品各自在4℃下暴露于水浴中過(guò)夜，然后輕微搖動(dòng)加入至2mlProteinA-Sepharose(SIGMA)。產(chǎn)生4個(gè)不同的柱。用10倍體積的20mM磷酸氫二鈉(61ml)洗滌樹(shù)脂以產(chǎn)生pH7.0。用3倍柱體積的0.15MNaCl(pH3.0)以三等份洗脫柱子，然后用0.5MHEPES中和。使用Bradford蛋白測(cè)定法(BioRad)定量洗脫的抗體。然后通過(guò)在10,000MWCO透析盒中透析過(guò)夜將抗體交換入包含0.5MNaCl的0.1MNaHCO3(pH8.3)中。為了活化干的CNBr-Sepharose，用10-15倍柱體積的1mM冷HCl洗滌1克無(wú)水溴化氰葡聚糖。使用5ml的系列體積以確保除去蔗糖。然后通過(guò)1倍體積的系列洗滌用10倍體積洗滌活化的CNBr-Sepharose，從而將其交換入0.1MNaHCO3，pH8.3中。在各情況下，在純化和緩沖液交換后回收大約80-90毫克的抗體。然后在溫和的旋轉(zhuǎn)條件下，將5ml溶脹活化的CNBr-Sepharose與80-90毫克在0.1MNaHCO3，pH8.3中配制的純化的抗體一起在室溫下溫育4小時(shí)。通過(guò)Bradford蛋白測(cè)定法確定抗體結(jié)合效率，在各情況下大于95％的抗體結(jié)合至活化的CNBr-Sepharose。在偶聯(lián)后，通過(guò)在0.1MTris，pH8.0中用25-30倍柱體積洗滌來(lái)封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。然后通過(guò)0.1MTris，pH8.0，0.5MNaCl的系列洗滌，用5X柱體積的系列洗滌洗滌柱5次，交替用0.1M醋酸緩沖液，pH4.0，0.5MNaCl進(jìn)行洗滌。對(duì)洗滌液進(jìn)行蛋白估量，未檢測(cè)到蛋白。2.親和層析純化獲得分泌可溶性、糖基化的MDA-7的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞并將其在RPMI中保持高度匯合，所述RPMI含有5％胎牛血清和1∶100L谷氨酰胺、1∶100青霉素/鏈霉素和1∶100HEPES。每2至3天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分盤(pán)，交替地每7天保持在1∶1000稀釋的潮霉素(20mg/ml母液)中。然后每2至3天收集400ml上清液，然后使用AMICON超濾杯(AMICONstirredcell)通過(guò)10,000分子量截?cái)嘀档哪みM(jìn)行濃縮。在水浴方法中，在輕微搖動(dòng)的條件下將50ml濃縮的上清液在4℃下暴露于5ml床體積的抗體-CNBr-sepharose(親和樹(shù)脂)中進(jìn)行2天。然后將親和樹(shù)脂置于PharmaciaXK26柱中，將上清液通過(guò)3次以確保抗原對(duì)抗體的最大結(jié)合。通過(guò)重力作用流動(dòng)用5×20ml0.1MTrispH8.0洗滌親和樹(shù)脂。用3×5ml1MNaCl，0.1M甘氨酸，pH3.0洗脫MDA-7，然后立即用0.5mlHEPES緩沖液中和。在洗脫和中和后立即加入2mg人血白蛋白以保護(hù)蛋白免受損失。然后通過(guò)10,000分子量截?cái)嘀档男D(zhuǎn)柱(spincolumn)(AMICON)濃縮所述洗脫的蛋白，然后將其交換入無(wú)菌1XPBS中。然后在室溫下在旋轉(zhuǎn)的條件下將1至1.5ml1XPBS交換的親和純化的蛋白暴露于200微升3x洗滌的Protein-ASepharose(SIGMA)中，進(jìn)行2小時(shí)，或在旋轉(zhuǎn)的條件下在4℃下過(guò)夜。A蛋白的暴露吸收滲漏入洗脫級(jí)分的抗體。在親和純化中檢測(cè)4種不同的多克隆抗體(此處描述了所述抗體的產(chǎn)生)。在親和純化之前使用大小分辨純化(參見(jiàn)大小排阻)除去大量污染蛋白，所述染染蛋白中最豐富的是牛血清白蛋白(BSA)。然而，以該方式分離的MDA-7的暴露未能允許柱上的抗體保留MDA-7。這可能是因?yàn)锽SA封閉了在BSA不存在時(shí)可保留MDA-7的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。MDA-7是高度糖基化的蛋白，因此認(rèn)為其能夠很容易地粘附至塑料或其他表面。從包含MDA-7的上清液中除去BSA抑制了通過(guò)親和層析對(duì)MDA-7的純化。大部分蛋白存在于流出液中。直至洗脫時(shí)無(wú)MDA-7蛋白保留在親和柱上。包含顯著量BSA(2-3mg/ml，通過(guò)銀染)的親和純化物保持生物學(xué)功能的時(shí)間比其中BSA污染顯著較少的純化物更長(zhǎng)。在BSA存在的情況下的親和純化產(chǎn)物允許MDA-7保留在親和柱上直至用高摩爾NaCl和低pH洗脫。通過(guò)多克隆親和樹(shù)脂進(jìn)行的親和純化導(dǎo)致具有相對(duì)相似量的MDA-7的多批純化物?？捡R斯分析顯示相對(duì)少量的污染蛋白。觀察到超過(guò)大約20％均一度的MDA-7純化。親和純化是可重復(fù)的且富集MDA-7至相對(duì)純度(通過(guò)對(duì)12％的聚丙烯酰胺凝膠的考馬斯染色分析測(cè)得)。根據(jù)Western印跡上檢測(cè)到的條帶的強(qiáng)度，抗原暴露于親和樹(shù)脂的時(shí)間越長(zhǎng)，保留的MDA-7越多。當(dāng)比較透析盒和離心柱時(shí)，交換入1XPBS的方法之間沒(méi)有顯著差異。3.陰離子交換純化合并兩到三批親和純化的MDA-7并將其在室溫下交換入10,000MWCO透析盒中的50mMMES，pH5.0中2至12小時(shí)。然后將蛋白以1ml/分鐘的流速加入5ml床體積的陰離子交換柱上。收集10ml的流出液并用不連續(xù)梯度的50mMMES，pH5.0中配制的1MNaCl洗脫結(jié)合的蛋白。洗脫程序始于以2ml/分鐘的流速進(jìn)行的10ml50mMMES，pH5.0的洗滌。第一步洗脫為在5分鐘內(nèi)從0M至0.25MNaCl和在50mMMES，0.25MNaCl，pH5.0下洗滌5分鐘。第二梯度步驟為在5分鐘內(nèi)從0.25MNaCl至0.5MNaCl，然后進(jìn)行5分鐘洗滌。終洗脫從0.5MNaCl至1MNaCl。將MDA-7保留在柱上直至用0.9-1.0MNaCl洗脫；MDA-7被純化至大約90％-95％的均一性。18KDa未糖基化的蛋白在pH5.0下不結(jié)合陰離子交換柱。對(duì)來(lái)自MDA-7的親和陰離子交換后的級(jí)分的銀染分析顯示MDA-7的未糖基化形式不與共純化的糖基化蛋白結(jié)合。天然的MDA-7復(fù)合物似乎包含至少三種分子量為21、28和27/26的蛋白。以前，嘗試使用一步驟陰離子交換純化法以純化MDA-7，其中將包含MDA-7的上清液交換入50mMMES，pH6.0中。一步陰離子交換純化證明來(lái)自陰離子交換柱的各個(gè)峰包含通過(guò)多克隆抗MDA-7在western印跡上檢測(cè)到的MDA-7。通過(guò)該方法進(jìn)行的純化不能在任何范圍的離子強(qiáng)度上顯著地富集MDA-7，因?yàn)镸DA-7在所有使用的NaCl摩爾濃度上從柱上滲出。4.大小排阻層析使用注入XK261米柱(Pharmacia)中的S200Sephadex(Pharmacia)產(chǎn)生200ml床體積大小的排阻層析柱。通過(guò)重力使柱子穩(wěn)定平衡，然后用BioRadBioLogicWorkstation以3.5ml/分鐘的速率填充柱子。為確定由293t細(xì)胞分泌的MDA-7的表觀摩爾重量，組合蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(小鼠IgG5mg、堿性磷酸酯酶3mg、BSA10mg和人β2微管蛋白3mg)確定相對(duì)保留時(shí)間。將純化的蛋白的洗脫時(shí)間對(duì)分子量作圖，然后推導(dǎo)出0.97的R2值。將包含MDA-7的200ml293t上清液通過(guò)AMICON超濾裝置中的10,000MWCO過(guò)濾器濃縮至10ml，然后在1XPBS中以2ml/分鐘裝入大小分辨柱中。每5ml收集級(jí)分。通過(guò)連續(xù)樣品的Western印跡分析，然后與從已知的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的線比較來(lái)確定相對(duì)保留時(shí)間。將80-100kDa的表觀分子量賦予結(jié)合的MDA-7。發(fā)現(xiàn)低于0.1％的總的存在的MDA-7以31kDa單體的形式存在。圖15顯示保留時(shí)間對(duì)分子量的比較。MDA-7復(fù)合物在大約85-95kDa的分子量之間洗脫。5.大小、陰離子和凝集素純化嘗試使用通過(guò)伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱的凝激素純化來(lái)純化MDA-7。然而，未獲得相對(duì)純度的凈增加。使用組合純化(其中將大小排阻、陰離子和凝集素純化法全部組合使用)富集MDA-7。然而，這些方法的組合沒(méi)有一個(gè)提供比通過(guò)親和層析，然后進(jìn)行陰離子層析獲得的MDA-7的純度更高。這些結(jié)果顯示通過(guò)親和層析和陰離子交換層析可將MDA-7純化至至少90-95％的均一性。H.使用單克隆抗體純化和表征分泌的MDA-71.抗體的產(chǎn)生指定為7G11F.2(單克隆抗體)的雜交瘤克隆經(jīng)確定產(chǎn)生抗體，該抗體在通過(guò)對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞(所述細(xì)胞已用布雷菲德菌素A處理)的細(xì)胞內(nèi)FACS分析檢測(cè)IL-24/mda-7陽(yáng)性細(xì)胞中是最有效的。基于這些初步數(shù)據(jù)，將該克隆用于產(chǎn)生5升上清液。簡(jiǎn)而言之，以1×106個(gè)細(xì)胞/ml將細(xì)胞(7G11F.2)接種在50ml含有10％胎牛血清和1∶100L谷氨酰胺、1∶100青霉素/鏈霉素和1∶100HEPES的DMEM中。接種細(xì)胞并培養(yǎng)10天，然后收集上清液。2.抗體的純化通過(guò)以2000rpm離心10分鐘沉淀細(xì)胞以使上清液澄清，然后輕輕倒出上清液。然后將澄清的上清液通過(guò)0.22醋酸纖維素薄膜過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，之后通過(guò)YMCO30kDa膜在氮?dú)夥障掠肁micon超濾裝置濃縮至50ml。將濃縮的上清液在4℃下暴露于交聯(lián)至sepharose的重組G蛋白，(Sigma)。用3倍柱體積的1MNaClpH3.0以3等分洗脫抗體，然后用0.5MHEPES中和。為除去污染的牛IgG，將所得的洗脫物通過(guò)透析盒(Pierce/Endogen，YMCO30kDa)交換入包含0.4MNaCl(總的)的1XPBS中。將蛋白在4℃下暴露于交聯(lián)至sepharose的重組A蛋白(Sigma)。收集從柱流過(guò)的流出物，因?yàn)锳蛋白以比小鼠IgGla更高的親和力結(jié)合牛IgG。通過(guò)SDSPAGE上的分析確定相對(duì)純度，相對(duì)純度達(dá)到90％的純度，對(duì)于(7G11F.2)，污染蛋白主要由牛IgG組成。使用Bradford蛋白測(cè)定法(BioRad)定量洗脫的抗體。然后通過(guò)在10,000MWCO透析盒中透析過(guò)夜來(lái)將抗體交換入含有0.5MNaCl的0.1MNaHCO3，pH8.3中。3.親和柱的產(chǎn)生為激活干的CNBr-Sepharose，用10-15柱體積的1mM冷HCl洗滌1克CNBr-Sepharose。使用系列5ml的體積以確保除去蔗糖。然后通過(guò)系列1倍柱體積的洗滌用10倍柱體積洗滌活化的CNBr-Sepharose從而交換入0.1MNaHCO3，pH8.3中。在純化和緩沖液交換后回收25mg抗體(7G11F.2)。在輕微旋轉(zhuǎn)的條件下，將2ml溶脹活化的CNBr-Sepharose在室溫下與純化的抗體在0.1MNaHCO3，pH8.3中溫育4小時(shí)。通過(guò)Bradford蛋白測(cè)定法確定抗體結(jié)合效率；大于95％的抗體結(jié)合至活化的CNBr-Sepharose。在偶聯(lián)后，用25-30倍柱體積的0.1MTrispH8.0洗滌封閉未反應(yīng)基團(tuán)。最后用5X柱體積的0.1MTrispH8.0，0.5MNaCl的系列洗滌洗滌柱5次，其間交替用0.1M醋酸緩沖液，pH4.0，0.5MNaCl進(jìn)行洗滌。對(duì)洗液進(jìn)行蛋白質(zhì)評(píng)估，未檢測(cè)到蛋白質(zhì)。4.親和純化分泌可溶性、糖基化IL-24的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞獲自Introgen，Inc，且將所述細(xì)胞以高匯合度保持在包含10％胎牛血清和1∶100L谷氨酰胺、1∶100青霉素/鏈霉素和1∶100HEPES的RPMI中。每2-3天分離細(xì)胞，其間交替地每7天將細(xì)胞保持在1∶1000稀釋的潮霉素(20mg/ml母液)中。每2-3天收集400ml的上清液并使用Amicon超濾裝置將其通過(guò)10,000分子量截?cái)嘀档哪みM(jìn)行濃縮。在分批法(batchmethod)中，在輕微搖動(dòng)的條件下，將50ml濃縮的上清液在4℃下暴露于5ml床體積的抗體-CNBr-Sepharose(親和樹(shù)脂)。將所述親和樹(shù)脂置于PharmaciaXK26柱中，使上清液通過(guò)3次以確保抗原對(duì)抗體的最大結(jié)合。用5×20ml0.1MTrispH8.0通過(guò)重力作用流出洗脫IL-24，然后立即用0.5mlHEPES緩沖液中和。在洗脫和中和后立即加入2mg人血清白蛋白以保護(hù)蛋白免受蛋白損失。然后通過(guò)10,000分子量截?cái)嘀档碾x心柱(Amicon)濃縮洗脫的蛋白，然后將其交換入無(wú)菌1XPBS中。在旋轉(zhuǎn)的條件下，將1-1.5ml1XPBS交換親和純化的蛋白在室溫下暴露于200微升3x洗滌的重組A蛋白-Sepharose(Sigma)中進(jìn)行2小時(shí)，或在4℃下在旋轉(zhuǎn)的條件下過(guò)夜。A蛋白暴露吸附滲入洗脫液中的抗體且其去除對(duì)于保持IL-24功能是至關(guān)重要的。IL-24/mda-7在7G11F.2單克隆抗體柱上保留量與先前部分的多克隆抗體柱的保留量相似。下面的一般技術(shù)也是熟知的且可用于實(shí)施純化方法。a.凝膠電泳凝膠電泳是可用于純化方法的熟知技術(shù)。可將使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，2001)進(jìn)行的瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝膠電泳用于純化方法。b.層析技術(shù)可選擇地，可使用層析技術(shù)進(jìn)行MDA-7的分離和純化。存在許多種可用于本發(fā)明的層析法吸附、親和、分配、離子交換和分子篩，和許多使用其的專(zhuān)門(mén)技術(shù)，包括柱層析、紙層析、薄層層析和氣相層析術(shù)(Freifelder，1982)。c.免疫試劑本發(fā)明的某些方面包括使用免疫試劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將免疫試劑用于MDA-7制劑的純化?？蓪⒖贵w與純化方法一起使用。這些抗體可容易地產(chǎn)生和/或容易地獲得。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”廣義地是指任何免疫結(jié)合劑例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般地，IgG和/或IgM是優(yōu)選的，因?yàn)槠湓谏頎顩r下是最常見(jiàn)的抗體且因?yàn)槠湓趯?shí)驗(yàn)室條件下最容易制備。術(shù)語(yǔ)“抗體”用于表示具有抗原結(jié)合區(qū)的任何抗體樣分子，且其包括抗體片段例如Fab′、Fab、F(ab′)2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DABs)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。用于制備和使用基于各種抗體的結(jié)構(gòu)和片段的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。用于制備和表征抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見(jiàn)，例如，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988；以參考引用方式并入本文)。認(rèn)識(shí)到單克隆抗體(MAb)具有某些有利方面，例如，重現(xiàn)性和大規(guī)模生產(chǎn)性，因而其用途通常是優(yōu)選的。因此本發(fā)明提供了人、鼠類(lèi)、猴子、大鼠、倉(cāng)鼠、兔子和甚至雞來(lái)源的單克隆抗體。由于試劑的容易制備和容易獲得的原因，鼠類(lèi)單克隆抗體通常是優(yōu)選的。然而，也考慮“人源化”抗體，以及來(lái)自小鼠、大鼠或其他物種、具有人恒定和/或可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體、雙特異性抗體、重組和基因工程產(chǎn)生的抗體和其片段。用于產(chǎn)生針對(duì)患者的牙疾病而“客戶定制的”抗體的方法也是已知的且也考慮這些客戶定制的抗體。用于產(chǎn)生單克隆抗(MAb)的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是熟知的。I.NSAID和COX-2抑制劑NSAID是非甾體抗炎藥。除了抗炎作用外，其具有止痛、退熱和血小板抑制作用。其主要用于治療慢性關(guān)節(jié)炎癥狀和某些與疼痛和炎癥相關(guān)的軟組織病癥。其可通過(guò)抑制環(huán)氧合酶從而阻斷前列腺素的合成來(lái)起作用，所述環(huán)氧合酶將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成環(huán)式內(nèi)氧化物，即前列腺素的前體。本發(fā)明考慮使用這些選擇性抑制酶COX-2的NSAIDS。NSAID在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且表現(xiàn)在腫瘤中抑制Ki-ras的激活；然而，仍未查明Ki-ras的激活為NSAID介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的機(jī)制。該細(xì)胞毒性是否依賴(lài)于NSAID的抗炎特性也還不清楚。也抑制Ki-ras激活的NSAID舒林酸被代謝成兩種不同的分子，所述分子的差異在于其抑制COX的能力不同，但兩者都能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生化學(xué)預(yù)防性效應(yīng)。然而，舒林酸砜缺少COX抑制活性，且其最可能以不依賴(lài)于前列腺素合成的方式促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，本發(fā)明涉及COX-2選擇性抑制劑，所述抑制劑是指特異性地和直接抑制環(huán)氧合酶的化合物或試劑。COX-2選擇性抑制劑包括塞來(lái)考昔(CELEBREXTM)、羅非考昔(VIOXXTM)、伐地考昔(BEXTRATM)、lumiracoxib(PREXIGETM)或艾托考昔(ARCOXIATM)。因?yàn)槠鋵?duì)心血管系統(tǒng)的作用和認(rèn)識(shí)的增加的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，塞來(lái)考昔和羅非考昔的商業(yè)形式最近已退出市場(chǎng)。PREXIGE和ARCOXIA仍未獲得FDA批準(zhǔn)在美國(guó)使用，盡管其在其他國(guó)家獲得批準(zhǔn)。1.塞來(lái)考昔在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及COX-2抑制劑塞來(lái)考昔。由Searle以商品名CELEBREXTM銷(xiāo)售的塞來(lái)考昔的化學(xué)名稱(chēng)4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺。經(jīng)驗(yàn)式為C17H14F3N3O2S，分子量為381.38。CELEBREXTM以100或200mg的口服膠囊進(jìn)行銷(xiāo)售。塞來(lái)考昔在動(dòng)物模型中展現(xiàn)抗炎、止痛和解熱活性。作用機(jī)制據(jù)認(rèn)為是抑制前列腺素合成的結(jié)果。酶環(huán)氧合酶-2(或“COX-2”)是該途徑中重要的酶。COX-2的選擇性抑制(相關(guān)酶COX-1不被抑制)是塞來(lái)考昔的特征，且據(jù)認(rèn)為該選擇性抑制減少了潛在的與COX-1的抑制相關(guān)的胃腸細(xì)胞毒性。a.藥物動(dòng)力學(xué)在口服給藥后大約3小時(shí)達(dá)到塞來(lái)考昔的血漿峰值水平。當(dāng)與高脂肪餐一起服用時(shí)，血漿水平延遲大約1至2小時(shí)，總吸收量增加10-20％。包含鋁或鎂的抗酸劑導(dǎo)致血漿濃度的減少。塞來(lái)考昔在臨床劑量范圍內(nèi)高度結(jié)合蛋白，體外研究表明白蛋白和α1-酸性糖蛋白是主要的結(jié)合蛋白。細(xì)胞色素P4502C9是塞來(lái)考昔的主要代謝酶。三種主要的代謝產(chǎn)物是醇、對(duì)應(yīng)的羧酸和其葡萄糖醛酸苷綴合物；這些代謝物不具有COX-1和COX-2抑制劑的活性。在服用單劑后，57％的劑量隨糞便排泄，27％隨尿液排出。在禁食的條件下有效半衰期是大約11小時(shí)。b.患者群體老年患者具有最高的血清濃度，且老年男性比老年女性具有更高的濃度。對(duì)于體重小于50kg的老年患者，開(kāi)始時(shí)應(yīng)當(dāng)使用更低的劑量。黑人顯示具有比高加索人更高的血清濃度。肝功能不全增加血清濃度，而腎功能不全減少濃度。c.藥物相互作用關(guān)于抑制細(xì)胞色素P4502C9的藥物的應(yīng)用應(yīng)當(dāng)詢問(wèn)患者。特定的潛在藥物相互作用包括氟康唑和鋰以及可能地呋塞米和ACE抑制劑的相互作用。d.副作用和禁忌癥NSAID的副作用通常包括胃十二指腸刺激和胃腸刺激。然而，塞來(lái)考昔比其他NSAID顯示低得多的這些效應(yīng)。其他可能的副作用包括類(lèi)過(guò)敏性反應(yīng)，盡管還未報(bào)道過(guò)塞來(lái)考昔的該副作用。也應(yīng)當(dāng)避免給患有晚期腎臟病的患者和孕婦施用所述藥物。e.NSAID的組合也可將多種COX-2抑制劑的組合用于本發(fā)明。例如，通過(guò)使用更低劑量的多種COX-2抑制劑和MDA-7，可能減少與更高劑量的單種化合物相關(guān)的副作用或毒性。特別地對(duì)于本發(fā)明概述的目的，可以該方式將塞來(lái)考昔和其他COX-2抑制劑一起使用。2.VIOXXTM在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及COX-2抑制劑羅非考昔。由Merck以商品名VIOXXTM銷(xiāo)售的羅非考昔的化學(xué)名稱(chēng)為4-[4-(甲磺酰)苯基]-3-苯基-2-(5H)呋喃酮。經(jīng)驗(yàn)式為C17H14O4S，分子量為314.36。VIOXXTM以12.5、25或50mg口服膠囊的形式或作為濃度為12.5或5mg/5ml的口服懸浮劑銷(xiāo)售。塞來(lái)考昔在動(dòng)物模型中展示抗炎、止痛和解熱活性。作用機(jī)制據(jù)認(rèn)為是通過(guò)選擇性抑制COX-2(而非COX-1)來(lái)抑制前列腺素的合成的結(jié)果。a.藥物動(dòng)力學(xué)在口服給藥后2-3小時(shí)羅非考昔達(dá)到血漿峰值水平。食物不影響血漿水平，除了在脂肪餐后峰值水平延遲1-2小時(shí)。其主要通過(guò)胞質(zhì)酶還原代謝。b.藥物相互作用特定的潛在藥物相互作用包括利福平、茶堿和華法林。c.副作用和禁忌癥在患者中觀察到判定(adjudicated)為嚴(yán)重心血管血栓癥的高發(fā)病率。3.伐地考昔在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及COX-2的抑制劑伐地考昔。由Pfizer以商品名BEXTRA銷(xiāo)售的伐地考昔的化學(xué)名稱(chēng)為4-(5-甲基-3-苯基-4-異噁唑基)苯磺酰胺。經(jīng)驗(yàn)式為C16H14N2O3S，分子量為314.36。BEXTRA以10或20mg的口服膠囊銷(xiāo)售。塞來(lái)考昔具有抗炎、止痛和解熱活性。據(jù)認(rèn)為其以血漿中發(fā)現(xiàn)的量選擇性地抑制COX-2，但不抑制COX-1。a.藥物動(dòng)力學(xué)在大約3小時(shí)后可獲得伐地考昔的血漿峰值水平。食物不會(huì)造成顯著的影響，但當(dāng)食用高脂肪餐時(shí)，血漿水平延遲大約1-2小時(shí)。伐地考昔由P450同功酶3A4和2C9以及非-P450酶通過(guò)葡萄苷酸化代謝。抑制3A4和/或2C9的藥物，例如氟康唑和酮康唑可增加血漿濃度。b.患者群體差異未鑒定或未研究。c.藥物相互作用關(guān)于抑制細(xì)胞色素P4502C9和3A4的藥物的應(yīng)用應(yīng)當(dāng)詢問(wèn)患者。特定的潛在藥物相互作用包括氟康唑和酮康唑。此外，人血漿中存在伐地考昔的活性代謝產(chǎn)物，其濃度為伐地考昔濃度的大約10％。d.副作用和禁忌癥已證明嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)。也已觀察到胃腸毒性。J.Hsp90抑制劑本發(fā)明涉及Hsp90抑制劑，其是指直接結(jié)合Hsp90且具有抗腫瘤活性的化合物。Hsp90是對(duì)于多種突變的和超表達(dá)的信號(hào)蛋白(所述蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或存活)的折疊、裝配和活性至關(guān)重要的分子伴侶。Hsp90保護(hù)之蛋白(Hsp90clientprotein)包括突變的p53、Raf-1、Akt、ErbB2和缺氧誘導(dǎo)型因子1α(HIF-1)(Neckers，2002)。在某些實(shí)施方案中，所述化合物是天然和合成的小分子，例如苯醌安沙霉素類(lèi)和其類(lèi)似物。在特定的實(shí)施方案中，Hsp90抑制劑是格爾德霉素和其類(lèi)似物和衍生物。格爾德霉素(GA)是由吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)產(chǎn)生的苯醌安沙霉素抗生素。已顯示其具有抗腫瘤特性，該特性據(jù)認(rèn)為是由其特異性結(jié)合熱激蛋白Hsp90從而導(dǎo)致其保護(hù)之蛋白的脫穩(wěn)定化和降解的能力產(chǎn)生的(Whitesell等人，1994；Neckers等人，1999)。臨床試驗(yàn)中的GA類(lèi)似物是17-烯丙基氨基-17-脫甲氧基格爾德霉素(17AAG)，其是毒性較低且更穩(wěn)定的格爾德霉素的類(lèi)似物(GA)(Schulte等人，1998)。盡管17AAG對(duì)Hsp90的結(jié)合比GA弱，但17AAG與GA相比展示相似的抗腫瘤效應(yīng)且具有更好的毒性特征。來(lái)自I期臨床試驗(yàn)的信息證明17AAG具有在低于最大耐受劑量的濃度上獲得的抗腫瘤活性(Agnew等人，2001)。本發(fā)明包括GA的靶向形式。例如，赫賽汀，第一個(gè)批準(zhǔn)用于實(shí)體瘤治療的mAb，靶向Her2且被選擇用于將GA靶向超表達(dá)Her2的腫瘤。NCI已報(bào)道與單獨(dú)的赫賽汀相比，這些綴合物遞送了更有效的選擇性細(xì)胞毒性影響。為制備這些綴合物，修飾GA以引入潛在的伯胺(Mandler等人，2002)。在去保護(hù)后，該伯胺提供了引入使得能夠連接至蛋白的馬來(lái)酰亞胺基的位點(diǎn)(Mandler等人，2004)。稱(chēng)為InvivoGen的公司已產(chǎn)生了格爾德霉素的衍生物17-(3-(4-馬來(lái)酰亞胺基butyrcarboxamido)丙基-氨基)格爾德霉素(GMB-APA-GA)，可容易地將其與赫賽汀或其他mAb綴合。如在本申請(qǐng)中其它實(shí)施方案背景中所描述的，可將其他抗體用于本發(fā)明。格爾德霉素類(lèi)似物和衍生物包括，但不限于，17AAG、NSC255110、NSC682300、NSC683661、NSC683663、17DMAG、15-羥基格爾德霉素、三環(huán)格爾德霉素類(lèi)似物(KOSN-1633)、甲基-geldanamycinate、17-甲?；?17-去甲氧基-18-O，-21-O-二羥基格爾德霉素和17-羥甲基-17-去甲氧基格爾德霉素。參見(jiàn)Patel等人(2004)；Smith等人(2004)；Tian等人(2004)；Hu等人(2004)；LeBrazadec等人(2004)，其以參考引用方式并入本文。在某些實(shí)施方案中，以作為使用硼替佐米的治療方案的部分的形式提供GA或GA的衍生物或類(lèi)似物，所述硼替佐米是26S蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性的可逆抑制劑。劑量可以是大約，至少大約，或至多大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0mg/m2(對(duì)于腫瘤大小)或mg/天、或其間可衍生的任何范圍。在特定的實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)途徑提供硼替佐米。在某些實(shí)施方案中，患者將在28天的周期的第1、8和15天以300mg/m2的劑量通過(guò)靜脈內(nèi)輸注接受GA或類(lèi)似物或衍生物。如果需要，可進(jìn)行多個(gè)治療周期。K.維生素E化合物術(shù)語(yǔ)“維生素E”是指8個(gè)相關(guān)的、脂溶性的、抗氧化的化合物(alpha(α)-生育酚、beta(β)-生育酚、gamma(γ)-生育酚、delta(δ)-生育酚、α-生育三烯酸、β-生育三烯酸、γ-生育三烯酸和δ-生育三烯酸)的家族。生育酚和生育三烯酸亞家族各自由具有獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)的α、β、γ和δ同效維生素組成。生育酚與生育三烯酸的差異在于其具有飽和的植基側(cè)鏈而不是不飽和異戊烯側(cè)鏈。α-生育酚是唯一的在人體中保持活性的維生素E形式，從而是血液和組織中發(fā)現(xiàn)的最豐富的維生素E形式(Traber，1999)。α-生育酚在人中的主要功能似乎是其用作抗氧化劑的能力(參見(jiàn)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminE)。可獲得維生素E的合成形式(由12.5％真正的(authentic)RRR-α-生育酚和87.5％立體異構(gòu)體組成的化學(xué)混合物；即，在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的7種分子，所述分子具有相同數(shù)目和類(lèi)型的在RRR-α-生育酚中發(fā)現(xiàn)的以相同次序連接但其空間排列不同的原子)(參見(jiàn)“DietaryReferenceIntakesforVitaminC，VitaminE，Selenium，andCarotenoids，”2000，和Kline等人，2003)。因此，天然的真正的維生素E(稱(chēng)為RRR-α-生育酚或d-α-生育酚)和合成的維生素E(稱(chēng)為all-rac[emic]-α-生育酚或d1-α-生育酚)不是化學(xué)等同物。可以醋酸酯或琥珀酸酯衍生物的形式購(gòu)買(mǎi)真正的RRR-α-生育酚和合成的維生素E。進(jìn)行對(duì)RRR-α-生育酚的色滿頭的這些修飾以保護(hù)C-6位置上的羥基部分在暴露于空氣時(shí)免受氧化，且為恢復(fù)抗氧化潛能必須除去所述修飾(Kline等人，2003)。已鑒定了稱(chēng)為α-TEA的RRR-α-生育酚的非水解醚類(lèi)似物(Lawson等人，2003)。特別地，α-TEA可作為維生素E類(lèi)似物用于本發(fā)明的方法和組合物。Birringer等人的論文描述了維生素E的類(lèi)似物，且此處引用作為參考(Birringer等人，2003)。通常可以α-生育酚醋酸酯或α生育酚琥珀酸酯的形式產(chǎn)生和制備獲得維生素E化合物。這些形式通過(guò)在腸中除去醋酸或琥珀酸部分在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成α-生育酚之前都不具有任何抗氧化劑的活性。酯化形式比未酯化形式的抗氧化性更強(qiáng)且在存儲(chǔ)時(shí)間和溫度范圍內(nèi)比未酯化形式更加穩(wěn)定得多。琥珀酸酯形式的激活比醋酸酯形式慢，但琥珀酸酯形式表現(xiàn)出對(duì)于其他形式來(lái)說(shuō)不可獲得的組織的可接近性和有益方面。維生素E在體內(nèi)具有多種機(jī)制。其破壞自由基(抗氧化劑功能)、穩(wěn)定膜、抑制前列腺素的合成和阻止血小板凝集、在一些癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞分化且抑制一些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(鼠類(lèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤和人前列腺)。其抗癌能力可能與其抑制前列腺合成的能力相關(guān)，因?yàn)檫^(guò)量的前列腺素可抑制免疫系統(tǒng)(參見(jiàn)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站springboard4health.com/notebook/v-e.html)。幾項(xiàng)研究已描述了RRR-α-生育酚琥珀酸酯(維生素E琥珀酸酯；VES)、RRR-α-生育酚的可水解酯衍生物的有效的抗腫瘤活性。Prasad和Edwards-Prasad第一個(gè)描述了維生素E琥珀酸酯(而不是維生素E的其他形式)誘導(dǎo)小鼠黑素瘤B-16細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變和生長(zhǎng)抑制的能力并提出維生素E琥珀酸酯可以是有用的腫瘤治療劑(Prasad等人，1982)。其他研究已證明維生素E琥珀酸酯在體外是多種上皮癌細(xì)胞類(lèi)型包括乳腺、前列腺、肺和結(jié)腸癌細(xì)胞以及造血淋巴細(xì)胞性白細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的有效生長(zhǎng)抑制劑(Fariss等人，1994；Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2000；Prasad等人，1992；Schwartz等人，1992)。近年來(lái)的研究已證明當(dāng)其腹膜內(nèi)(i.p.)施用時(shí)，維生素E琥珀酸酯在動(dòng)物異種移植物和同種異體移植物模型中具有抗腫瘤活性(Malafa等人，2000；Malafa等人，2002；Neuzil等人，2001；Weber等人，2002)，表明可能的治療潛能。已顯示腹膜內(nèi)或口服(p.o.)給藥的維生素E琥珀酸酯具有對(duì)致癌物[苯并(a)芘]在小鼠中誘導(dǎo)的賁門(mén)竇致癌作用的抑制作用，從而表明作為抗癌劑的潛能(Wu等人，2001)。研究已證明維生素E琥珀酸酯通過(guò)DNA合成阻斷、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)誘導(dǎo)濃度和時(shí)間依賴(lài)性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制(Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2001；You等人，2001；You等人，2002；Yu等人，2001)。維生素E琥珀酸酯值得關(guān)注不僅是因?yàn)槠湔T導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)而且還因?yàn)槠洳痪哂袑?duì)正常細(xì)胞和組織的毒性(Fariss等人，1994；Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2000；Prasad等人，1992；Schwartz等人，1992；Weber等人，2002)。不可水解的維生素E琥珀酸酯衍生物的應(yīng)用已顯示其是完整的化合物而不是其分解產(chǎn)物的任一產(chǎn)物(即，RRR-α-生育酚或琥珀酸)，所述不可水解的維生素E琥珀酸酯衍生物負(fù)責(zé)抗增殖效應(yīng)(Fariss等人，1994)。因此，該維生素E衍生物的抗增殖作用被認(rèn)為是歸因于非抗氧化劑性質(zhì)。RRR-α-生育酚琥珀酸酯(VES)是已通過(guò)酯鍵進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾從而在色滿頭部的6位置包含替代羥基部分的琥珀酰部分的RRR-α-生育酚的衍生物。該酯連接的RRR-α-生育酚的琥珀酸部分是影響引發(fā)細(xì)胞凋亡和抑制DNA合成的最有效的維生素E形式。該維生素E形式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無(wú)凋亡誘導(dǎo)作用。維生素E的琥珀酸化形式以完整的試劑形式作為抗癌劑是有效的；然而，可斷裂琥珀酸部分從而將RRR-α-生育酚的琥珀酸酯形式轉(zhuǎn)變成游離RRR-α-生育酚的細(xì)胞和組織酯酶使得該化合物失去抗癌功效。RRR-α-生育酚在上皮或免疫來(lái)源的細(xì)胞中既不表現(xiàn)抗增殖活性也不表現(xiàn)促凋亡生物學(xué)活性。維生素E通常發(fā)現(xiàn)于植物中且在種子中更豐富，來(lái)自其中的生育酚，以其天然狀態(tài)，在人和動(dòng)物(野生和馴養(yǎng)的)中更容易被吸收和利用。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,179,122，其以參考引用方式并入本文。通過(guò)工業(yè)化方式對(duì)食物和飼料進(jìn)行加工以便長(zhǎng)期貯存促進(jìn)了維生素E組分的加速降解。為彌補(bǔ)天然或合成的維生素E的損失，通過(guò)注射或口服施用天然或合成的維生素E的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品。眾所周知，生育酚是不穩(wěn)定的分子。為提高生育酚的穩(wěn)定性，制造方法通常將醋酸或琥珀酸基團(tuán)附著至生育酚，產(chǎn)生維生素E醋酸酯或琥珀酸酯(d-或d1-α-生育酚醋酸酯或琥珀酸酯)。眾所周知，可通過(guò)正常和衰弱的腸對(duì)親水性維生素E的增加的吸收來(lái)表現(xiàn)水性維生素E水溶液和分散體的親水性質(zhì)對(duì)腸吸收維生素E的影響。天然或合成的維生素E的來(lái)源也影響其生物利用度在本領(lǐng)域是已知的。在衰弱的消化道中，在患有脂質(zhì)吸收障礙綜合征例如肝臟膽汁郁積和囊性纖維化的患者中對(duì)維生素E的吸收進(jìn)行了研究。這些患者不能夠吸收維生素E或其他飲食脂質(zhì)。當(dāng)給這些患者口服施用維生素E的水溶液性形式(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯或“TPGS”)時(shí)，在一周內(nèi)檢測(cè)到血液生育酚的提高。當(dāng)用植物油中的生育酚給相同的患者劑量給藥時(shí)，血液中沒(méi)有顯著的生育酚的增加(Traber等人，1988)。因此，天然的或合成的生育酚的類(lèi)型以及TPGS的親水性質(zhì)在確定人和動(dòng)物中維生素E的吸收和生物利用度中可以是非常重要的。Bateman等人(1984)在人臨床研究中顯示了以水可分散性制劑的形式施用維生素E的有利方面，在所述研究中，將維生素A、E和B2配制入液體媒介物(AquaBiosorb)中，然后封裝入口服施用的軟膠膠囊中。在該制劑中，以＜＝100nm的顆粒直徑的懸浮劑的形式將B2以整合入制劑中。所述軟彈性膠膠囊包含按重量百分比計(jì)算20％的聚山梨醇酯80、1％去水山梨糖醇單油酸酯和79％作為水分散基質(zhì)的蒸餾甘油一酯。Bateman證明在他的劑型中除了脂溶性維生素A和E外，水溶性維生素B2的親水性質(zhì)顯示了增強(qiáng)的吸收。維生素E的這些形式中的任何形式預(yù)期可用作本發(fā)明的部分。維生素E綴合物包括，但不限于，維生素E吡咯烷羧酸(焦谷氨酸)綴合物，包括維生素E琥珀酸(VESA)焦谷氨酸綴合物、維生素E琥珀酸(VESA)聚乙二醇胺焦谷氨酸綴合物；維生素E吡咯烷酮綴合物包括維生素E琥珀酸(VESA)吡咯烷酮綴合物；維生素E龍膽酸綴合物類(lèi)，包括維生素E龍膽酸綴合物。美國(guó)專(zhuān)利6,858,227，其以參考引用方式并入本文。L.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性的促有絲分裂劑。作為來(lái)自單個(gè)VEGF基因的選擇剪接的結(jié)果產(chǎn)生5種VEGF亞型。這些亞型的差異在于其分子量和生物學(xué)特性例如其結(jié)合細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白聚糖的能力。響應(yīng)缺氧，激活的癌基因和多種細(xì)胞因子增強(qiáng)VEGF的表達(dá)。VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡。體內(nèi)VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生和血管的透化作用，且在血管發(fā)生的調(diào)控中起著中心作用。下調(diào)的VEGF表達(dá)通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生來(lái)促進(jìn)實(shí)體瘤的進(jìn)展和促成了幾種其他疾病的病因?qū)W，所述其他疾病的特征在于異常血管發(fā)生。因此，VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制消除了許多腫瘤的發(fā)展。VEGF抑制劑是任何分子，例如DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白、多核苷酸、肽或小分子，與所述分子不存在的情況下的VEGF的活性相比，所述分子阻斷或減少VEGF活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何測(cè)定法評(píng)估VEGF的活性和確定在分子存在或不存在的情況下VEGF的活性。在本說(shuō)明書(shū)的其他部分詳細(xì)描述VEGF抑制劑的實(shí)例。VEGF抑制劑的劑量可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何劑量。例如，如果VEGF抑制劑是貝伐單抗，那么通過(guò)靜脈內(nèi)輸注的劑量可以在大約0.1至大約10mg/kg或更多?？筛鶕?jù)副作用和臨床指標(biāo)例如對(duì)治療的反應(yīng)來(lái)確定特定的劑量。在發(fā)生胃腸產(chǎn)孔、需要醫(yī)療干預(yù)的傷口裂開(kāi)、嚴(yán)重出血、腎病綜合征或高血壓危象的患者中應(yīng)當(dāng)永久性停用貝伐單抗。M.IL-10抑制劑干擾素10(IL-10)是近年來(lái)描述的在鼠類(lèi)和人生物體中鑒定的天然內(nèi)源免疫抑制細(xì)胞因子。鼠類(lèi)干擾素10(mIL-10)最初被描述為從T輔助T細(xì)胞克隆釋放的細(xì)胞因子合成抑制因子，但其也具有對(duì)多種淋巴細(xì)胞亞型的增殖效應(yīng)，包括對(duì)CD4-，8+鼠類(lèi)脾T細(xì)胞的克隆效率的促進(jìn)作用。最近已對(duì)人干擾素10(hIL-10)進(jìn)行了測(cè)序并顯示該干擾素在DNA序列水平以及氨基酸水平上具有與mIL10的高度同源性。此外，最近已對(duì)豬干擾素10進(jìn)行了測(cè)序并顯示其在DNA序列水平以及氨基酸水平上具有與hIL-10的高度同源性。同樣，hIL-10具有與Epstein-Barr病毒基因組中的可讀框BCRF1的高度同源性，且病毒IL-10確實(shí)顯示一些與hIL-10相似的活性。人IL-10由活化T細(xì)胞克隆和永生化B細(xì)胞產(chǎn)生，除了其細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)活性、抑制幾種促炎細(xì)胞因子和集落刺激因子的產(chǎn)生外，其也誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生天然白介素1受體拮抗劑蛋白/肽(IRAP)，從而間接抑制IL-1活性。IL-10也下調(diào)其自身由單核細(xì)胞的產(chǎn)生并抑制II類(lèi)MHC表達(dá)。IL-10抑制劑是任何分子，例如DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白、多核苷酸、肽或小分子，與所述分子不存在的情況下的IL-10的活性相比，所述分子阻斷或減小IL-10的活性。在本說(shuō)明書(shū)的其他部分已提供了關(guān)于特定的IL-10抑制劑的信息?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何測(cè)定法評(píng)估IL-10的活性和確定分子存在和不存在的情況下IL-10的活性。IL-10抑制劑的劑量可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何劑量。例如，通過(guò)靜脈內(nèi)輸注的劑量可以是大約0.1至大約10mg/kg或更多。可根據(jù)副作用和臨床指標(biāo)例如對(duì)治療的反應(yīng)來(lái)特別地制定劑量。N.TNFTNF是所有刺激急性期反應(yīng)的其他細(xì)胞因子組群的成員。在該家族中存在不同的成員例如TNF-α和TNF-β。TNF-α是從噬菌體表面上的212個(gè)氨基酸長(zhǎng)的前肽切割而來(lái)的185個(gè)氨基酸的糖蛋白肽激素。一些細(xì)胞分泌更短或更長(zhǎng)的亞型。TNFα由損傷過(guò)程例如由感染造成的損傷過(guò)程中的白細(xì)胞、內(nèi)皮組織和幾種其他組織釋放。其釋放受幾種其他介質(zhì)例如白介素1和細(xì)菌內(nèi)毒素刺激。其通常與白介素1和6一起具有許多對(duì)各種器官系統(tǒng)的作用。TNF的劑量可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何劑量。例如，通過(guò)靜脈內(nèi)輸注的劑量可以是大約0.1至大約10mg/kg或更高。可根據(jù)副作用和臨床指標(biāo)例如對(duì)治療的反應(yīng)來(lái)特別地制定劑量。O.泰索帝多西他奇(由Aventis制造的泰索帝)是抗瘤化療劑。經(jīng)顯示泰索帝用于在之前的化療失敗后治療具有局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者。泰素帝的劑量可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何劑量。例如，所述劑量可以是從大約1mg/m2至大約1,500mg/m2或更多。P.藥物制劑和遞送在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，涉及包括遞送編碼MDA-7蛋白的表達(dá)構(gòu)建體的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及編碼免疫原的表達(dá)構(gòu)建體的遞送。可選擇地，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼MDA-7多肽和免疫原的序列。涉及免疫反應(yīng)的疾病和狀況的實(shí)例包括使用疫苗進(jìn)行預(yù)防或治療的疾病。包括肺癌、頭與頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺中的瘤前病灶、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌和可通過(guò)施用MDA-7多蛋白以增強(qiáng)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)來(lái)治療的與免疫反應(yīng)相關(guān)的任何其他疾病或狀況。1.有效量藥物組合物的“有效量”通常定義為足以可檢測(cè)地和重復(fù)地獲得所述的想要的結(jié)果，例如改善、減輕、減小或限制疾病或其癥狀的程度的量?？墒褂酶鼑?yán)格的定義，包括疾病的消除、根除或治愈。2.施用在某些特定的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法和組合物殺死細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制轉(zhuǎn)移、減少腫瘤或組織大小以及逆轉(zhuǎn)或減小腫瘤細(xì)胞的惡性表型、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或抑制血管發(fā)生是想要的。施用的途徑將自然地隨病灶的位置和性質(zhì)或被靶向的位置變化而變化，其包括例如真皮內(nèi)、皮下、局域、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、全身性或口服施用和配制。直接注射、瘤內(nèi)注射或注射入腫瘤血管特別適用于分散的、實(shí)體的、可接近的腫瘤或其他可接近的靶區(qū)域。局部、局域或全身性施用也可以合適的。對(duì)于＞4cm的腫瘤，施用的體積為大約4-10ml(優(yōu)選地10ml)，而對(duì)于＜4cm的腫瘤，使用大約1-3ml的體積(優(yōu)選地3ml)。以單劑量遞送的多次注射包含大約0.1至大約0.5ml的體積。通過(guò)以大約1cm間距間隔對(duì)腫瘤或被向的位點(diǎn)施用多次注射有利于接觸病毒顆粒。在手術(shù)干預(yù)的情況下，可在手術(shù)前使用本發(fā)明以使不能做手術(shù)的腫瘤能夠接受切除?？蛇x擇地，可在手術(shù)時(shí)和/或之前使用本發(fā)明以治療殘留或轉(zhuǎn)移性疾病。例如，可用包含MDA-7或編碼MDA-7-的構(gòu)建體的組合物與免疫原性分子一起或在免疫原分子不存在的情況下注射或輸注切除產(chǎn)生的瘤床?？稍谇谐笸ㄟ^(guò)例如在手術(shù)的位置植入導(dǎo)管繼續(xù)進(jìn)行輸注。也設(shè)計(jì)周期性的術(shù)后療法。也涉及表達(dá)構(gòu)建體或病毒構(gòu)建體的連續(xù)輸注。可通過(guò)想要的吸收量來(lái)確定連續(xù)輸注中遞送的構(gòu)建體和肽的量。也可在合適時(shí)應(yīng)用連續(xù)施用，例如，腫瘤或其他不想要的受影響的區(qū)域被切除，對(duì)瘤床或被靶向的位置進(jìn)行治療以消除殘留、微小的疾病。有時(shí)通過(guò)注射或使用導(dǎo)管進(jìn)行遞送。這些連續(xù)輸注可在治療開(kāi)始后進(jìn)行從大約1-2小時(shí)至大約2-6小時(shí)、至大約6-12小時(shí)、至大約12-24小時(shí)、至大約1-2天、至大約1-2周或更長(zhǎng)時(shí)期。一般地，通過(guò)連續(xù)輸注的治療組合物的劑量等于通過(guò)單次或多次注射提供的量，所述劑量在進(jìn)行輸注的時(shí)段內(nèi)可進(jìn)行調(diào)整。治療方案也可變化，且通常依賴(lài)于腫瘤類(lèi)型、腫瘤部位、免疫狀況、靶位置、疾病進(jìn)展和患者的健康狀況和年齡。很明顯，某些類(lèi)型的腫瘤需要更激進(jìn)的治療，而同時(shí)某些患者不能忍受更繁重的方案。臨床醫(yī)生最適合于基于治療制劑的已知功效和毒性(如果有)作出這些判斷。在某些實(shí)施方案中，接受治療的腫瘤或影響的區(qū)域可以是(至少開(kāi)始時(shí)可以是)不能切除的。使用治療性病毒構(gòu)建體的治療可增加腫瘤的可切除性，這歸因于邊緣處的皺縮或某些特定侵襲性部分的消除。在進(jìn)行治療后，可能可以進(jìn)行切除術(shù)。術(shù)后的其他治療法將用于消除腫瘤或被靶向的位置上的微小殘留疾病。對(duì)于原發(fā)性腫瘤或術(shù)后瘤床，一般的療程包括多劑給藥。一般的原發(fā)性腫瘤治療包括在兩周的時(shí)間內(nèi)施用6劑藥物?？芍貜?fù)該兩周方案1、2、3、4、5、6或更多次。在療程中，可重新評(píng)估對(duì)完成計(jì)劃的劑量給藥的需要。所述治療可包括多種“單位劑量”。單位劑量定義為包含預(yù)先確定的量的治療性組合物。被施用的量和特定途徑以及制劑在臨床領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。單位劑量不一定以單次注射施用，相反其可包括在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)輸注。本發(fā)明的單位劑量可以根據(jù)病毒構(gòu)建體的噬斑形成單位(pfu)方便地進(jìn)行描述。單位劑量范圍為103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu或病毒顆粒(vp)和更高的范圍?；蛘撸付ǖ牧靠蔀樽鳛槠骄咳?、平均每周或平均每月劑量施用的量?？梢源蠹s或至少大約0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0.9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或更多ng/ml，或其間可衍生的任何范圍內(nèi)的劑量對(duì)患者施用蛋白?？蛇x擇地，此處指定的任何量可以是以平均每日、平均每周或平均每月劑量施用的量。可以大約或至少大約0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000mg或更多，或其間可衍生的任何范圍內(nèi)的劑量對(duì)患者施用COX-2抑制劑?？蛇x擇地，指定的量可以是以平均每日、平均每周或平均每月劑量施用的量，或其可以以mg/kg表示，其中kg是指患者的體重，上面已對(duì)mg進(jìn)行了說(shuō)明。在其他實(shí)施方案中，指定的量是上述任何數(shù)量，但表示為mg/m2(對(duì)于腫瘤的大小或患者表面)。GA或其類(lèi)似物和衍生物的濃度可為大約，至少大約或至多大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多mg或mg/m2(對(duì)于腫瘤大小或患者表面積)或其間可衍生的任何范圍的劑量?？蛇x擇地，指定的量可以是以平均每日、平均每周或平均每月劑量施用的量，或其以mg/kg表示，其中kg是指患者的體重，而上面已對(duì)mg進(jìn)行了說(shuō)明。維生素E化合物或其類(lèi)似物的濃度可以為大約，至少大約或至多大約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多mg、μg/ml、mg/kg(對(duì)于患者體重)或mg/m2(對(duì)于腫瘤大小或患者表面積)或其間可衍生的任何范圍內(nèi)的劑量?？蛇x擇地，維生素E化合物或類(lèi)似物的量可用I.U.(國(guó)際單位)來(lái)表示。在某些實(shí)施方案中，維生素E化合物的量是大約，至少大約，或至多大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000或更多I.U或其間可衍生的任何范圍。3.可注射的組合物和制劑在一些實(shí)施方案中，用于遞送免疫原性分子、編碼MDA-7蛋白的表達(dá)構(gòu)建體、MDA-7蛋白和/或免疫原的方法是通過(guò)全身性施用遞送。然而，此處公開(kāi)的藥物組合物可選擇地可通過(guò)如美國(guó)專(zhuān)利5,543,158、美國(guó)專(zhuān)利5,641,515和美國(guó)專(zhuān)利5,399,363(各自明確地以其全文以參考引用方式并入本文)中描述的胃腸外、皮下、直接、氣管內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)或甚至腹膜內(nèi)途徑施用?？赏ㄟ^(guò)注射器或用于注射溶液的任何其他方法注射遞送核酸，只要表達(dá)構(gòu)建體能夠通過(guò)注射所需的特定針頭規(guī)格。最近描述了新的無(wú)針注射系統(tǒng)(美國(guó)專(zhuān)利5,846,233)，該系統(tǒng)具有界定了用于裝載溶液的安瓿小室的噴嘴和用于將溶液推擠出安瓿小室至遞送位置的能量裝置。也描述了用于基因療法的注射系統(tǒng)，該注射系統(tǒng)允許以任何深度精確地多次注射預(yù)先確定的量的溶液(美國(guó)專(zhuān)利5,846,225)。可在水中適當(dāng)?shù)嘏c表面活性劑例如羥丙基纖維素混合來(lái)制備作為游離堿的活性物質(zhì)或藥物可接受鹽的溶液。也可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物以及油中制備分散體。在普通的貯藏和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。適合用于注射用途的藥物劑型包括無(wú)菌水溶液或分散體和用于無(wú)菌注射溶液或分散體的臨時(shí)配制的無(wú)菌粉劑(美國(guó)專(zhuān)利5,466,468，此處明確地以其全文以參考引用方式并入本文)。在所有情況下，劑型必須是無(wú)菌的且必須是達(dá)到容易注射的程度的流體。其在生產(chǎn)和貯藏條件下必須是穩(wěn)定的且必須進(jìn)行防腐處理以抵抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、聚乙醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)例如使用包衣例如卵磷脂，在分散體的情況下通過(guò)保持所需的顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過(guò)各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在許多情況下，其優(yōu)選地包含等滲劑，例如，糖或氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)產(chǎn)生可注射組合物的延遲吸收。在某些制劑中，使用基于水的制劑，而在其他情況下，其可以是基于脂質(zhì)的制劑。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，包含MDA-7(或編碼核酸)和/或MDA-7聯(lián)合劑的組合物存在于基于水的制劑中。在其他實(shí)施方案中，所述制劑是基于脂質(zhì)的。優(yōu)選地，維生素E化合物可存在于基于水或基于脂質(zhì)的制劑中。例如，對(duì)于以水溶液形式的胃腸外施用，如果需要，所述溶液應(yīng)當(dāng)被合適地緩沖且首先用足夠的鹽或糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)和腹膜內(nèi)施用。在該情況下，在本公開(kāi)內(nèi)容的教導(dǎo)下，可使用的無(wú)菌水性介質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。例如，可將一個(gè)劑量溶解在1ml等滲NaCl溶液中，然后將其加至1000ml的皮下輸液或注射入提及的輸注位置，(參見(jiàn)例如，“Remington′sPharmaceuticalSciences”第15版，pages1035-1038和1570-1580)。依賴(lài)于被治療的受試者的情況必需對(duì)劑量進(jìn)行一些改變。負(fù)責(zé)施用的人無(wú)論如何將確定個(gè)體受試者的合適劑量。此外，對(duì)于人的施用，制劑應(yīng)當(dāng)滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室(FDAOfficeofBiologicsstandard)要求的無(wú)菌、無(wú)熱原性、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)在合適的溶劑中將活性物質(zhì)以需要的量與與各種其他上面列舉的組分(當(dāng)需要時(shí))引入，然后通過(guò)過(guò)濾滅菌來(lái)制備無(wú)菌注射液。一般地，通過(guò)將各種無(wú)菌活性組分整合入媒介物中來(lái)制備分散體，所述媒介物包含基本分散介質(zhì)和需要的來(lái)自上面例舉的組分的其他組分。在用于無(wú)菌注射液的制備的無(wú)菌粉劑的情況下，一些制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)產(chǎn)生活性組分+來(lái)自其先前無(wú)菌過(guò)濾液的任何其他想要組分的粉劑?？梢灾行曰螓}的形式配制此處公開(kāi)的組合物。藥物可接受的鹽，包括酸加成鹽(用蛋白的游離氨基形成的)和用無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸或用例如有機(jī)酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。也可從無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋁、氫氧化鈣或氫氧化鐵和這樣的有機(jī)堿例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等衍生用游離羧基形成的鹽。在配制后，以與劑型相容的方式和以這樣的量例如治療有效量施用溶液。以多種劑型例如注射溶液、藥物釋放膠囊等容易地施用所述制劑。如此處所用的，“載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、媒介物、包衣、稀釋劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的應(yīng)用在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)和試劑不與活性組分相容，否則可將其用于治療性組合物。也可將補(bǔ)充性活性成分整合入組合物。術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的”是指當(dāng)給人施用時(shí)不產(chǎn)生過(guò)敏或相似的不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。包含作為活性組分的蛋白的水性組合物的配制在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。一般地，將這些組合物配制為可注射的液體溶液或懸浮液；也可配制適合在注射之前溶解或懸浮在液體中的固體形式?？赏ㄟ^(guò)注射例如皮下或肌內(nèi)注射經(jīng)胃腸外途徑常規(guī)地施用化合物和試劑。適合用于其他施用模式的其他制劑包括栓劑和在一些情況下為口服制劑。對(duì)于栓劑，常規(guī)的粘合劑和載體可包括，例如，聚烷基二醇或甘油三酯例如可從包含大約0.5％至大約10％，優(yōu)選地大約1％至大約2％的活性組分的混合物形成栓劑?？诜苿┌ㄟ@些常用的賦形劑如藥物級(jí)的甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉劑的形式且包含大約10％至大約95％的活性組分，優(yōu)選地大約25％至大約70％的活性組分?？蓪DA-7蛋白(或其片段)或編碼MDA-7的全部或部分的核酸配制為中性形式或鹽形式。藥物可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成的)和與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸或與有機(jī)酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。也可從無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋁、氫氧化鈣或氫氧化鐵和這樣的有機(jī)堿例如異丙胺、三甲胺、2-乙基羥乙胺、組氨酸、普魯卡因等生成與游離羧基形成的鹽。在某些制劑中，將MDA-7聯(lián)合劑配制為無(wú)水粉劑。使用以取代純糖形式的乳制品副產(chǎn)品形式存在的易接近的廉價(jià)原料進(jìn)行加工是本發(fā)明的進(jìn)一步的目的。已發(fā)現(xiàn)可通過(guò)制備包含蛋白膠體和雙糖的維生素E無(wú)水粉劑的方法實(shí)現(xiàn)這些目的，其中將維生素E酯分散在殘液中，該殘液堿土金屬離子含量較低但富含乳糖(來(lái)自乳糖產(chǎn)生)，存在按重量計(jì)算占?xì)堃汗腆w含量2至30％的酪蛋白酸鹽；并如美國(guó)專(zhuān)利4,262,017中所示的將所述分散體噴霧干燥，所述專(zhuān)利以參考引用方式并入本文。所述方法產(chǎn)生了具有可人的香味且可用作食品和動(dòng)物飼料的添加劑的自由流動(dòng)的維生素E無(wú)水粉劑。所述無(wú)水粉劑還具有良好的制錠特征。合適的維生素E酯是d-和d，1-α-生育酚的常規(guī)酯。特定的實(shí)例是維生素E醋酸酯、維生素E琥珀酸酯、維生素E棕櫚酸酯和維生素E煙酸酯。其中，醋酸酯是優(yōu)選的。以與劑型相容的方式和以這樣的量例如治療有效的量施用所述蛋白、核酸或COX-2抑制劑、Hsp90抑制劑或維生素E化合物。施用的量依賴(lài)于被治療的受試者，包括癌癥的侵襲性、任何腫瘤的大小、以前的或其他療程。需要施用的活性組分的精確量依賴(lài)于醫(yī)生的判斷。用于初始施用和后續(xù)施用的合適方案也是可變的，但通常是初始施用后，接著進(jìn)行其他施用。這些施用可以是以單劑形式在連續(xù)經(jīng)歷10，20，30，40，50，60分鐘和/或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或更多小時(shí)和/或1，2，3，4，5，6，7天或更多天的全身性施用。此外，施用可通過(guò)定時(shí)釋放或持續(xù)釋放機(jī)制(通過(guò)制劑和/或施用模式)。施用的方式可多種多樣?？墒褂糜糜谑┯玫某Ｒ?guī)方法中的任一種方法。據(jù)認(rèn)為這些方法包括對(duì)固體形式的生理可接受的基質(zhì)的口服施用或通過(guò)注射等以胃腸外途徑施用生理可接受的分散體。劑量可依賴(lài)于施用的途徑且可根據(jù)宿主的大小變化而變化。在許多情況下，想要對(duì)兩種治療劑(MDA-7和COX-2抑制、Hsp90抑制劑或維生素E化合物)中的各治療劑進(jìn)行多次施用。Q.聯(lián)合治療在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法包括MDA-7多肽或編碼其的表達(dá)構(gòu)建體以及COX-2抑制劑或Hsp90抑制劑和其他藥劑(包括MDA-7聯(lián)合劑或組合物)以增強(qiáng)MDA-7的功效或增加使用MDA-7的任何治療、診斷或預(yù)防功效?？梢杂行У孬@得想要的效果例如殺死癌細(xì)胞和/或抑制血管發(fā)生的組合量提供這些組合物。該方法可包括將細(xì)胞與表達(dá)構(gòu)建體和藥劑或多種因子同時(shí)接觸。這可通過(guò)將細(xì)胞與單一組合物或包含兩種或所有藥劑的藥物制劑接觸，或通過(guò)將細(xì)胞與兩種或多種不同的組合物或制劑同時(shí)接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中一種組合物提供1)MDA-7(作為蛋白或核酸)；和/或2)COX-2抑制劑或Hsp90抑制劑(或其他MDA-7聯(lián)合劑)；和/或3)第三藥劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，除了第二或其他抗腫瘤劑或療法外，將mda-7基因(或eDNA)或蛋白療法與COX-2抑制劑一起使用(稱(chēng)為“MDA-7/COX-2抑制劑療法”)。在其他實(shí)施方案中，除了第二或其他抗腫瘤劑或療法外，將mda-7基因(或cDNA)或蛋白療法與Hsp90抑制劑一起使用(稱(chēng)為“MDA-7/Hsp90抑制劑療法”)?？蛇x擇地，可以數(shù)分鐘至數(shù)周的間隔在其他抗癌治療之前或之后進(jìn)行MDA-7/COX-2抑制劑療法或MDA-7/Hsp90抑制劑療法。在其中將MDA基因或蛋白療法與COX-2抑制劑或Hsp90抑制劑分開(kāi)地提供給患者的實(shí)施方案中，一般確保有效時(shí)段不超過(guò)每次遞送的時(shí)間之間的間隔，這樣所述兩種物質(zhì)仍然能夠?qū)颊弋a(chǎn)生有利的組合效應(yīng)。可選擇地，在其中將MDA-7/COX-2抑制劑療法或MDA-7/Hsp90抑制劑療法與第二抗癌療法分開(kāi)地提供給患者的實(shí)施方案中，一般確保有效時(shí)段不超過(guò)每次治療時(shí)間之間的間隔，這樣所述兩種療法仍然能夠?qū)颊弋a(chǎn)生有利的組合效應(yīng)。在該情況下，可在相互之間大約12-24小時(shí)內(nèi)和更優(yōu)選地大約相互之間6-12小時(shí)內(nèi)為患者提供1)MDA-7/COX-2抑制劑療法或2)MDA-7/Hsp90抑制劑療法和第二抗癌療法。在一些情況下，顯著延長(zhǎng)治療的時(shí)段是想要的，然而，其中各個(gè)施用之間要經(jīng)過(guò)幾天(2、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)?？稍谑褂昧硪环NMDA-7聯(lián)合劑而不用COX-3抑制劑或Hsp-90抑制劑的情況下進(jìn)行本發(fā)明。在某些實(shí)施方案中，療程可持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90天或更長(zhǎng)時(shí)間?？稍诘?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、和/或90天和其任何組合提供一種藥劑，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和/或90天或其任何組合提供另一種藥劑。在一天內(nèi)(24小時(shí)期間)，可一次或多次地給患者施用藥劑。此外，在療程后，存在不施用抗癌療法的時(shí)間段。依賴(lài)于患者的狀況，例如其預(yù)后、抵抗力、健康狀況等，該時(shí)間段可持續(xù)1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更長(zhǎng)時(shí)間?？墒褂酶鞣N組合，MDA基因或蛋白療法為“A”，而MDA-7聯(lián)合劑為“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A可選擇地，“A”可以是MDA-7/聯(lián)合劑療法的施用，而“B”是第二抗癌療法的施用。在其他實(shí)施方案中，MDA-7基因或蛋白療法是“A”，而MDA-7聯(lián)合劑是“B”；或，“A”可以是MDA-7/MDA-7聯(lián)合劑療法的施用，而“B”是第二抗癌療法的施用。對(duì)患者施用本發(fā)明的任何物質(zhì)或療法將依照用于這些物質(zhì)的一般方案，如果有的話，要考慮載體或任何蛋白或其他藥劑的毒性。在此在一些實(shí)施方案中，存在監(jiān)測(cè)歸因于MDA-7和/或MDA-7聯(lián)合劑造成的毒性的步驟。必要時(shí)可重復(fù)治療周期。各種標(biāo)準(zhǔn)的治療法以及手術(shù)干預(yù)也可與所述的療法一起使用。在特定的實(shí)施方案中，可將第二抗癌療法例如化學(xué)療法、放射療法、免疫力療法或其他基因療法與例如此處描述的MDA-7/COX-2抑制劑療法或MDA-7/Hsp90抑制劑療法或任何其他MDA-7聯(lián)合療法一起使用。1.化學(xué)治療癌癥療法包括多種與基于化學(xué)和放射療法組合的聯(lián)合療法。組合化學(xué)治療劑包括，例如，順鉑(CDDP)、卡鉑、甲基芐肼、雙氯乙基甲胺、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、異磷酰胺、美法蘭、氯氨布西、重硫酸鹽、亞硝基脲、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、博來(lái)霉素、普卡霉素(plicomycin)、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、反鉑(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿或前述物質(zhì)的其任何類(lèi)似物或衍生變體。2.放射療法導(dǎo)致DNA損傷且已廣泛使用的其他因子包括通常稱(chēng)為γ射線、X射線和/或放射性同位素至腫瘤細(xì)胞的直接遞送。其他形式的DNA損傷因子也包括例如微波、質(zhì)子束輻射(美國(guó)專(zhuān)利5,760,395和美國(guó)專(zhuān)利4,870,287)以及UV輻射。所有這些因素最可能對(duì)DNA的前體、DNA復(fù)制和修復(fù)以及染色體的組裝和維持造成廣泛的DNA損傷。X射線的劑量范圍對(duì)于長(zhǎng)時(shí)段(3至4周)在50至200倫琴的日劑量范圍內(nèi)變動(dòng)，對(duì)于單一劑量為2000至6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍變化很廣，且依賴(lài)于同位素的變衰期、發(fā)射的輻射的強(qiáng)度和種類(lèi)以及被贅生性細(xì)胞的吸收。術(shù)語(yǔ)“接觸”和“暴露”，當(dāng)用于細(xì)胞時(shí)，在此處用于描述將治療性構(gòu)建體和化學(xué)治療劑或放射治療劑遞送至靶細(xì)胞或直接與靶細(xì)胞放置在一起的方法。例如，為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺傷作用，可將兩種藥劑以有效地殺死細(xì)胞或阻止其分裂的組合量遞送至細(xì)胞。3.免疫療法在癌癥治療的背景中，免疫療法通常依賴(lài)于免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子靶向和破壞癌細(xì)胞的應(yīng)用。曲妥單抗(赫賽汀TM)就是這樣的實(shí)例。免疫效應(yīng)器可以是例如對(duì)于腫瘤細(xì)胞表面上的一些標(biāo)記是特異性的抗體。所述抗體可單獨(dú)地用作療法的效應(yīng)器或其可招募其他細(xì)胞以進(jìn)行實(shí)際的細(xì)胞殺傷作用。也可將所述抗體綴合至藥物或毒素(化學(xué)治療劑、放射性核素、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)且只用作靶向試劑。可選擇地，所述效應(yīng)器可以是具有直接或間接地與腫瘤細(xì)胞靶相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。各種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。治療方法的組合，即，直接的細(xì)胞毒性活性與ErbB2的抑制或減少可在治療ErbB2超表達(dá)的癌癥中提供治療益處。另一種免疫療法也可用作使用MDA-7/COX-2抑制劑療法或MDA-7/Hsp90抑制劑療法的聯(lián)合療法的部分。下面描述用于聯(lián)合療法的一般方法。在免疫療法的一個(gè)方面，腫瘤細(xì)胞必須具有易于靶向(即不存在于大部分其他細(xì)胞上的)一些標(biāo)記。存在許多腫瘤標(biāo)記且這些標(biāo)記中的任一個(gè)可適合用于本發(fā)明的上下文中的靶向。常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)記包括癌胚抗原、前列腺特異抗原、泌尿系統(tǒng)腫瘤相關(guān)性抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erbB和p155?？蛇x擇的免疫療法的方面是組合抗癌效應(yīng)和免疫刺激效應(yīng)。也存在免疫刺激因子，包括細(xì)胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趨化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生長(zhǎng)因子例如FLT3配體。已顯示將免疫刺激分子例如蛋白或使用基因遞送與腫瘤抑制劑例如MDA-7組合可增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)(Ju等人，2000)。此外，可使用抗這些化合物中的任一種的抗體靶向此處描述的抗癌劑。如先前所述，目前在研究中的或使用中的免疫治療劑的實(shí)例是免疫佐劑例如，牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、鐮狀瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳香化合物(美國(guó)專(zhuān)利5,801,005、美國(guó)專(zhuān)利5,739,169、Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)、細(xì)胞因子治療劑例如干擾素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)、基因治療劑例如TNF、IL-1、IL-2、p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美國(guó)專(zhuān)利5,830,880和美國(guó)專(zhuān)利5,846,945)和單克隆抗體例如，抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM2、抗HER-2、抗p185；Pietras等人，1998；Hanibuchi等人，1998；美國(guó)專(zhuān)利5,824,311)。赫賽汀(曲妥單抗)是阻斷HER2-neu受體的嵌合(小鼠-人)單克隆抗體。其具有抗腫瘤活性和已被批準(zhǔn)用于惡性腫瘤的治療(Dillman，1999)。也將一種或多種抗癌療法與此處描述的MDA-7療法一起使用。存在許多用于癌癥的被動(dòng)免疫療法的不同方法。其可被廣泛地分為下列類(lèi)型單獨(dú)的抗體注射；偶聯(lián)至毒素或化學(xué)治療劑的抗體的注射；偶聯(lián)至抗放射性同位素的抗體的注射；抗獨(dú)特型抗體的注射；和最后，骨髓中腫瘤細(xì)胞的凈化(purging)。4.基因療法在另一個(gè)實(shí)施方案中，聯(lián)合療法包括其中在施用MDA-7多肽或編碼該多肽的核酸之前、之后或同時(shí)施用治療性多核苷酸。將MDA-7多肽或編碼核酸與編碼另一種基因產(chǎn)物的載體一起遞送可具有對(duì)靶組織的組合治療效應(yīng)。5.手術(shù)大約60％的癌癥患者經(jīng)歷了一些類(lèi)型的手術(shù)，該手術(shù)包括預(yù)防性、診斷性或分期、治療性和姑息性手術(shù)。治療性手術(shù)是可與其他療法例如本發(fā)明的療法、化學(xué)療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法和/或可選擇的療法一起使用的癌癥療法。根治手術(shù)包括其中組織的全部或部分被物理除去、切離和/或破壞的切除。腫瘤切除是指腫瘤的至少部分的物理除去。除了腫瘤切除外，通過(guò)手術(shù)的療法包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微鏡控制手術(shù)(Mohs氏手術(shù))。本發(fā)明還可與淺表癌、初癌或附帶量的正常組織的去除一起使用。在癌細(xì)胞、組織或腫瘤的部分或全部切除后，可在體內(nèi)形成腔。可通過(guò)用其他抗癌療法對(duì)該區(qū)域進(jìn)行輸注、直接注射或局部施用來(lái)進(jìn)行治療。例如可每1、2、3、4、5、6或7天、或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月重復(fù)這些治療。這些治療也可具有不同的劑量。6.激素療法也可將激素療法與本發(fā)明或與先前描述的任何其他癌癥療法一起使用。激素的應(yīng)用可用于某些癌癥例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宮頸癌的治療以降低某些激素例如睪酮或雌激素的水平或阻斷其效應(yīng)。該治療通常與至少一種作為治療選擇或減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的其他癌癥療法一起使用。R.實(shí)施例包括下列實(shí)施例用于展示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到后面的實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了由本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)施中良好地發(fā)揮功能的技術(shù)，因此可被認(rèn)為組成了其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，在本公開(kāi)內(nèi)容的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到可在公開(kāi)的特定實(shí)施方案中產(chǎn)生許多改變但仍能獲得相似或類(lèi)似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神或范圍。實(shí)施例1塞來(lái)考昔和AD-MDA7的協(xié)同殺腫瘤效應(yīng)A.材料和方法1.細(xì)胞系經(jīng)基因工程改造而表達(dá)提高的HER-2/neu水平的雌激素受體陽(yáng)性MCF7細(xì)胞(MCF7/Her18細(xì)胞)是來(lái)自Dr.Mien-ChieHung的贈(zèng)品。雌激素受體陰性和非超表達(dá)HER-2/neu的MDA-MB-436人乳腺癌細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia)。將細(xì)胞在潮濕的37℃、5％CO2的氣氛下培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％胎牛血清和10mML谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(GIBCOInvitrogenCorporation，Grandisland，NY)的高蔗糖DMEM/F-12培養(yǎng)基中。2.腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和塞來(lái)考昔處理具有mda-7基因(Ad-mda7)和螢光素酶報(bào)道基因(Ad-luc)的重組腺病毒載體獲自IntrogenTherapeutics(IntrogenTherapeutics，Houston，TX)。對(duì)于MCF7/Her18和MDA-MB-436細(xì)胞系，分別以每細(xì)胞2000或1000個(gè)病毒顆粒(vp)(100或50噬斑形成單位/細(xì)胞)的MOI使用Ad-mda7或Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)皿中的1×106個(gè)細(xì)胞。將塞來(lái)考昔溶解在DMSO中，然后以低于0.1％(為了不影響細(xì)胞存活)的終濃度加入至細(xì)胞培養(yǎng)基-然后對(duì)于以20或50μM的劑量(分別對(duì)于MCF7/Her18和MDA-MB-436細(xì)胞)導(dǎo)入培養(yǎng)物中。為了比較Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合效應(yīng)，選擇載體和塞來(lái)考昔的劑量以確保低于50％的毒性。3.細(xì)胞增殖測(cè)定通過(guò)在臺(tái)盼藍(lán)(InvitrogenCo.，Carlsbad，CA)排斥法和MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鹽)(Sigma，St.Louis，MO)測(cè)定法后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定塞來(lái)考昔和Ad-mda7對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。簡(jiǎn)而言之，以每60mm培養(yǎng)皿6×105個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞。24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，然后按計(jì)劃加入具有或不具有塞來(lái)考昔的培養(yǎng)基，然后如所描述的進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。15在72小時(shí)的溫育后，收集懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞，然后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算混合的細(xì)胞群體。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法染色確定細(xì)胞生存力。關(guān)于MTT測(cè)定，以三份重復(fù)將1,000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中并在72小時(shí)后進(jìn)行測(cè)定。溫育后，用DMSO固定細(xì)胞，然后用MTT溶液(5mg/ml)染色。用自動(dòng)分光光度測(cè)量微量板讀數(shù)儀(EL808Ultramicroplatereader，Bio-TekInstruments，Inc.，Winooski，VT)在570nm讀取吸光率。將值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并將其表示為與對(duì)照細(xì)胞相比的百分比變化并作圖(平均值±S.E.M.)。4.細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的測(cè)定收獲時(shí)所有培養(yǎng)物都是未匯合的。用經(jīng)冰預(yù)冷的80％的乙醇固定收獲的細(xì)胞，用碘化丙啶(PI)(Sigma，St.Louis，MO)染色，然后如先前所述使用流式細(xì)胞儀(FCM)(EPICSXL-MCL，Coulter，Miami，F(xiàn)L)進(jìn)行分析。收集和沉淀懸浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞和經(jīng)胰蛋白酶處理的貼壁細(xì)胞。洗滌所述收獲的細(xì)胞，然后通過(guò)使用膜聯(lián)蛋白V/FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BDBiosciences，F(xiàn)ranklinLake，NJ)用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)/PI進(jìn)行染色。按照廠商的方案進(jìn)行BrdU(5-溴-2-脫氧尿苷)/末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)-介導(dǎo)的2’-脫氧尿苷5’-三磷酸(dUTP)-生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測(cè)定法(APO-Direct，BDBiosciences，F(xiàn)ranklinLake，NJ)。簡(jiǎn)而言之，洗滌多聚甲醛固定的細(xì)胞，然后將其與染色液(10μlTdT反應(yīng)緩沖液、0.75μlTdT酶和8μlFITC-dUTP)一起溫育過(guò)夜。第二天，漂洗細(xì)胞并將其重懸浮于1mlPI/RNA酶溶液中。在黑暗處在室溫下溫育30分鐘后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以獲得凋亡細(xì)胞的百分比。使用與FCM組合的程序(Multicycle，PhoenixFlowSystem，SanDiego，CA)分析細(xì)胞周期。5.前列腺素E2(PGE2)的測(cè)量為了確定PGE2，的濃度，以1×106個(gè)細(xì)胞/100mm的培養(yǎng)皿的密度接種細(xì)胞，然后用塞來(lái)考昔、Ad-mda7或兩種藥劑的組合處理細(xì)胞。在72小時(shí)的溫育后，將3μl花生四烯酸(1mM)加入培養(yǎng)基中以提高PGE2的產(chǎn)量，進(jìn)行30分鐘。收集上清液，然后在-80℃下貯存直至按照廠商的指導(dǎo)手冊(cè)使用酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒(CaymanChemical，AnnArbor，MI)測(cè)量PGE2的濃度。來(lái)自三份重復(fù)的值的最終結(jié)果表示為pg/ml。6.Western印跡法裂解細(xì)胞，然后使用BioRadAssay(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)確定蛋白濃度。通過(guò)western印跡分析法使用10％SDS凝膠分析裂解物。用50ug蛋白給泳道上樣，在90V下電泳2小時(shí)。將凝膠轉(zhuǎn)移至用5％脫脂奶粉封閉的硝酸纖維素膜上，然后用一抗(COX-2(CaymanChemicalCo.，AnnArbor，MI)、β連環(huán)蛋白(SantaCruzBiotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)、Akt(CellSignaling，Beverly，MA)和p-Akt(CellSignaling，Beverly，MA))在4℃下溫育過(guò)夜。洗滌膜，然后用二抗在室溫下溫育1小時(shí)。然后將膜顯影，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)western印跡檢測(cè)劑(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)檢測(cè)蛋白信號(hào)。用抗β連環(huán)蛋白的抗體(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)溫育膜以評(píng)估等量的蛋白上樣。將結(jié)果接受密度測(cè)定法。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在對(duì)照和處理組之間和不同實(shí)驗(yàn)組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行平均值的比較。也用Student’st檢驗(yàn)就顯著性分析western印跡的密度測(cè)定法。具有p＜0.05的值的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上被認(rèn)為是顯著的。B.結(jié)果1.Ad-mda7和塞來(lái)考昔的共處理抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)在用Ad-mda7和/或塞來(lái)考昔處理后，使用臺(tái)盼藍(lán)排斥法和MTT測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞的生存力。如使用MTT測(cè)定法的圖1所示，所述組合治療組在48小時(shí)和72小時(shí)的溫育后，與對(duì)照相比，無(wú)論HER-2/neu的表達(dá)狀況如何，都顯示了顯著降低的細(xì)胞生存力。HER-2/neu(+)細(xì)胞顯示了在24小時(shí)的處理后Ad-mda7和組合處理之間可存活細(xì)胞的數(shù)目的差異(p＝0.04)，在48小時(shí)的處理后，與對(duì)照相比，組合組中的生存力顯著降低(p＝0.045)，且所有處理組都顯示，與對(duì)照相比，存活顯著降低(對(duì)塞來(lái)考昔p＝0.002，對(duì)于Ad-mda7p＝0.02，和對(duì)于組合p＝0.009)。24小時(shí)后，HER-2/neu(-)細(xì)胞在組間未顯示差異，但與對(duì)照相比，組合開(kāi)始顯示差異(p＝0.049)。組合處理和Ad-mda7處理與塞來(lái)考昔相比似乎在殺死HER2/neu(-)細(xì)胞方面更有效(分別為p＝0.03和p＝0.02)，且在第2天所述組合在對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷上優(yōu)于Ad-mda7(p＝0.02)。在72小時(shí)的處理后，Ad-mda7比對(duì)照更有效(p＝0.02)，且所述組合在細(xì)胞毒性上要優(yōu)于塞來(lái)考昔(p＝0.01)。如使用臺(tái)盼藍(lán)排斥法的圖2所示，在HER-2/neu(+)細(xì)胞中，塞來(lái)考昔和組合處理與對(duì)照相比在腫瘤細(xì)胞殺傷數(shù)目中顯示更大功效(分別為p＝0.04和p＝0.01)。在MCF7/Her18細(xì)胞中的三個(gè)處理組之間，塞來(lái)考昔和Ad-mda7與組合相比都未顯示增加的細(xì)胞毒性(p＝0.01)。在MDA-MB-436細(xì)胞中，與對(duì)照、Ad-mda7或塞來(lái)考昔(分別為p＝0.01、0.01和0.01)相比，組合處理是最有效的治療組。也在這些細(xì)胞中確定組合處理對(duì)PGE2產(chǎn)生的影響(表4)?？芍噩F(xiàn)地，與對(duì)照(對(duì)于HER-2/neu(+)p＝0.01和對(duì)HER-2/neu(-)細(xì)胞p＝0.049)相比，組合顯示更大的對(duì)PGE2產(chǎn)生的抑制。與MCF7/Her18細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的顯著減少(p＝0.04)相比，在MDA-MB-436細(xì)胞中使用單一療法Ad-mda7的處理沒(méi)有顯示產(chǎn)生的PGE2的量的顯著減小(p＝0.06)。塞來(lái)考昔在兩種細(xì)胞系中都誘導(dǎo)PGE2產(chǎn)生(對(duì)于MCF7/Her18，p＝0.03和對(duì)于MDA-MB-436，p＝0.049)。表4.在用單一療法或聯(lián)合療法處理72小時(shí)后乳腺癌細(xì)胞中的前列腺素E2的產(chǎn)量(pg/ml)。*2000vp/細(xì)胞(對(duì)于MDA7/Her18細(xì)胞)和1000vp/細(xì)胞(對(duì)于MDA-MB-436細(xì)胞)的感染復(fù)數(shù)(MOI)20uM(對(duì)于MCF7/Her18)，50uM(對(duì)于MDA-MB-436)Ad-mda7(編碼黑素瘤分化相關(guān)基因-7的重組腺病毒)，2000vp/細(xì)胞(對(duì)于MCF7/Her18)和1000vp/細(xì)胞(對(duì)于MDA-MB-436)的MOI§p＜0.05，與對(duì)照相比2.與單獨(dú)處理相比，Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合增加細(xì)胞凋亡以前使用腫瘤細(xì)胞系的研究已證明Ad-mda7誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯，而塞來(lái)考昔誘導(dǎo)G1阻斷。Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合在細(xì)胞周期的G1期阻斷MCF7/Her18細(xì)胞(p＝0.03)且顯著地比單獨(dú)的塞來(lái)考昔介導(dǎo)的G1阻斷更明顯。在HER2/neu(-)細(xì)胞中，組合治療導(dǎo)致，與塞來(lái)考昔或Ad-mda7相比，S期的細(xì)胞增加(圖3)。在MCF7/Her18和MDA-MB-436細(xì)胞中，塞來(lái)考昔在G1檢查點(diǎn)比Ad-mda7阻止更多的細(xì)胞(p＝0.02)，而Ad-mda7單一療法導(dǎo)致G2/M阻斷(圖3)。使用膜聯(lián)蛋白V-FITC和TUNEL測(cè)定法評(píng)估早期和晚期細(xì)胞凋亡事件(圖4)；兩種測(cè)定法都證明與單一療法或?qū)φ障啾?，?lián)合療法誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著增加。此外，無(wú)論HER-2/neu表達(dá)狀態(tài)如何都觀察到增加的細(xì)胞凋亡(p＜0.05)。膜聯(lián)蛋白V-FITC測(cè)定表明塞來(lái)考昔和Ad-mda7在兩種細(xì)胞中都促進(jìn)細(xì)胞凋亡(p＜0.05)。在HER-2/neu(+)細(xì)胞中，與TUNEL相比，增加的膜聯(lián)蛋白V染色可反映與MDA-MB-436相比，MCF7/Her18細(xì)胞中更快的細(xì)胞凋亡的動(dòng)力學(xué)。3.Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合減少COX-2、Akt和p-Akt的表達(dá)已知Ad-mda7處理負(fù)調(diào)控Akt和p-Akt的表達(dá)(Mhashilkar等人，2003)。在Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)后就β連環(huán)蛋白的表達(dá)觀察到相似的效果。為了闡明在Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合處理后Ad-mda7和塞來(lái)考昔對(duì)代表性促存活標(biāo)記的表達(dá)的作用，進(jìn)行western印跡以分析COX-2、Akt、p-Akt和β連環(huán)蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)水平。通過(guò)Western印跡分析和密度測(cè)定法確定Akt和p-Akt的水平。與對(duì)照(PBS)相比，HER2-(MDA-MB-436)和HER2+(MCF7/Her18)細(xì)胞在組合處理后顯示顯著減少的Akt和p-Akt的表達(dá)。HER2+細(xì)胞中Akt的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(1.01)、Ad-mda7(0.99)和兩者(0.53*)(*p＜0.05)。HER2+細(xì)胞中pAkt的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.61*)、Ad-mda7(1.85)和兩者(0.36*)(*p＜0.05)。HER2-細(xì)胞中Akt的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.72)、Ad-mda7(1.00)和兩者(0.44*)(*p＜0.05)。HER2-細(xì)胞中pAkt的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.67)、Ad-mda7(1.61)和兩者(0.37*)(*p＜0.05)。通過(guò)Western印跡分析和密度測(cè)定法確定COX-2的相對(duì)水平。與對(duì)照(PBS)相比，HER2-(MDA-MB-436)和HER2+(MCF7/Her18)細(xì)胞在組合處理后顯示顯著減少的COX-2的表達(dá)。HER2+細(xì)胞中COX-2的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.53)、Ad-mda7(0.78)和兩者(0.53*)(*p＜0.05)。HER2-細(xì)胞中COX-2的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.74)、Ad-mda7(0.78)和兩者(0.45*)(*p＜0.05)。通過(guò)Western印跡分析和密度測(cè)定法確定β連環(huán)蛋白的相對(duì)水平。HER2-(MDA-MB-436)和HER2+(MCF7/Her18)細(xì)胞未顯示β連環(huán)蛋白表達(dá)的顯著差異。HER2+細(xì)胞中β連環(huán)蛋白的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.78)、Ad-mda7(0.64)和兩者(0.85)(*p＜0.05)。HER2-細(xì)胞中β連環(huán)蛋白的相對(duì)密度數(shù)值是塞來(lái)考昔(0.82)、Ad-mda7(0.97)和兩者(0.61)。在處理后，無(wú)論HER-2/neu表達(dá)如何，顯著減少的Akt、p-Akt和COX-2的水平非常明顯(p＜0.05)。除了組合處理外，塞來(lái)考昔在MCF7/Her18細(xì)胞中顯示比對(duì)照更強(qiáng)的抑制Akt的磷酸化的能力(p＝0.04)。在MDA-MB-436細(xì)胞中，與對(duì)照相比塞來(lái)考昔在一定程度上抑制Akt的表達(dá)(p＝0.054)。Ad-mda7在兩種細(xì)胞系中都增加p-Akt，然而對(duì)于Ad-luc也觀察到該增加，表明該效應(yīng)不是MDA-7蛋白依賴(lài)性的。與對(duì)照相比Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合減少p-Akt超過(guò)70％，與塞來(lái)考昔單一療法相比，減少大約50％。Ad-mda7和塞來(lái)考昔都減少COX-2的表達(dá)，此外在MDA-MB-436中看到COX-2被聯(lián)合療法抑制。Ad-mda7和塞來(lái)考昔在MCF7/Her18細(xì)胞中都減少連環(huán)蛋白，但在MDA-MB-436細(xì)胞中只少量地減少連環(huán)蛋白水平。所述組合在兩種細(xì)胞系中減少連環(huán)蛋白，然而該下調(diào)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。C.討論Ad-mda7的獨(dú)特特性是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞(Mhashilkar等人，2003；Pataer等人，2002；Jiang等人，1996；Saeki等人，2000)。一個(gè)在腫瘤細(xì)胞中起作用的機(jī)制(該機(jī)制可負(fù)責(zé)腫瘤細(xì)胞殺傷作用)是促存活調(diào)節(jié)因子Akt和磷酸化的Akt的下調(diào)(Mhashilkar等人，2003；McKenzie等人，2004)。環(huán)氧合酶2(COX-2)是代謝花生四烯酸從而產(chǎn)生各種類(lèi)型的前列腺素所需的一個(gè)酶。級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的其他酶，環(huán)氧合酶1在細(xì)胞中組成型表達(dá)，但COX-2的不同在于其通常在腫瘤細(xì)胞中被誘導(dǎo)或上調(diào)。最近，已認(rèn)識(shí)到COX-2在多種人癌癥中表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致許多研究人員考查選擇性或非特異性COX-2抑制劑預(yù)防或治療癌癥的作用。阿斯匹林和其他非甾體抗炎藥物已證明在其在許多癌癥特別是結(jié)腸癌中的化學(xué)預(yù)防用途是有效的(Steinbach等人，2000；Thun等人，1991)。更近以來(lái)，存在不斷增多的檢查選擇性COX-2抑制劑(包括塞來(lái)考昔)在預(yù)防和治療多種癌癥包括乳腺癌中的潛在用途的報(bào)道(Basu等人，2004；Liu等人，2003；Howe等人，2002)。在復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，PI3K/Akt因其在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活途徑中的作用已受到明顯的關(guān)注(Mhashilkar等人，2003)。最早作為逆轉(zhuǎn)錄病毒致癌基因被分離的PI3K在幾種人癌癥中驅(qū)動(dòng)促存活途徑(Fry，2001)。受細(xì)胞內(nèi)磷脂水平調(diào)節(jié)的PKB/Akt(絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)似乎在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用(Knuefermann等人，2003)。由于PKB/Akt(一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)是PI3K的下游靶，因此其在多種人癌癥中通過(guò)在Thr308和Ser473上磷酸化擴(kuò)增或激活(Marte和Downward，1997)。已顯示PI3K/Akt存活途徑調(diào)節(jié)NF-κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和抑制腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用(Burow等人，2000)。HER-2/neu促進(jìn)PI3K/Akt途徑的激活，然后該激活又激活NF-κB，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的抑制。此外，PI3K/Akt信號(hào)途徑可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)介導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移(Bakin等人，2000)。因此，在各種癌癥的治療中，近年來(lái)的研究已集中在對(duì)Akt的活性的調(diào)控或抑制上。最近報(bào)道塞來(lái)考昔，一種有效的且具有選擇性的COX-2抑制劑，在體外通過(guò)抑制Akt的激活來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Hsu等人，2000)。腺病毒載體已成功地廣泛用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移治療性基因?？赡茴A(yù)測(cè)Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合將減少Akt的磷酸化，且由于PGE2和HER-2/neu受體表達(dá)之間的正反饋環(huán)的原因，在超表達(dá)HER-2/neu的細(xì)胞中增強(qiáng)的殺腫瘤效應(yīng)更令人注目(Benoit等人，2004)。事實(shí)上，這些實(shí)驗(yàn)成功地證明了塞來(lái)考昔和Ad-mda7組合在HER-2/neu陽(yáng)性和HER-2/neu陰性乳腺癌細(xì)胞中產(chǎn)生增強(qiáng)的抗腫瘤活性。這些抗腫瘤活性通過(guò)抑制COX-2表達(dá)和通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt促存活途徑而發(fā)生。Ad-mda7和塞來(lái)考昔的聯(lián)合應(yīng)用可提供幾個(gè)有利方面，包括以低于兩種藥劑作為單一療法產(chǎn)生有效作用所需的劑量的劑量增加細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)施例2MDA7和塞來(lái)考昔產(chǎn)生的輻射敏化作用A.材料和方法在輻射前，在用或不用單獨(dú)的Ad-mda7、單獨(dú)的塞來(lái)考昔或兩種物質(zhì)的組合預(yù)處理3天的情況下，將MDA-MB-436和MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞(參見(jiàn)實(shí)施例1)暴露于不同劑量的輻射。就克隆形成存活檢測(cè)所述細(xì)胞以比較三種不同處理方法的輻射敏化效應(yīng)。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞周期分析以評(píng)估細(xì)胞周期的改變和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。通過(guò)Student’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。B.結(jié)果克隆形成存活檢測(cè)顯示Ad-mda7和塞來(lái)考昔的組合在兩種乳腺癌細(xì)胞系中都顯著增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的輻射敏化作用。在亞致死劑量(即在低于塞來(lái)考昔(對(duì)于MB436，50μM和對(duì)于MB468，30μM)和Ad-mda7(對(duì)于MB436為1,000和對(duì)于MB468為2,000的感染復(fù)數(shù)(MOI))的50％殺腫瘤效應(yīng)的劑量)，所述組合顯示兩種細(xì)胞系的顯著增強(qiáng)的輻射敏化作用(p＜0.05)。與對(duì)照相比，在聯(lián)合療法組中存在增加的凋亡細(xì)胞的百分比，但這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。細(xì)胞周期分析證明與對(duì)照相比，組合組中G2/M細(xì)胞周期增加。實(shí)施例3使用格爾德霉素和其類(lèi)似物增強(qiáng)AD-MDA7的細(xì)胞殺傷作用A.材料和方法1.細(xì)胞系和試劑A549和H460人肺癌細(xì)胞系獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將所有細(xì)胞在5％CO2氣氛、37℃下保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清、10mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)的RPMI1640。格爾德霉素(GA)獲自Calbiochem(SanDiego，CA)。17-烯丙基-氨基格爾德霉素(17AAG)由Dr.NguyenDao(NationalCancerInstitute，Bethesda，MD)饋贈(zèng)。將17AAG作為10mM母液配制在DMSO(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)中，然后在-20℃下貯存。最終的工作液在培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩儆?.01％的DMSO。在弱光條件下進(jìn)行使用該化合物的所有實(shí)驗(yàn)。2.腺病毒的產(chǎn)生以前報(bào)道過(guò)Ad-mda7、Ad-LacZ和Ad-Luc載體的構(gòu)建(Pataer等人，2002)。通過(guò)用Ad-LacZ感染細(xì)胞，然后確定轉(zhuǎn)導(dǎo)至少70％的細(xì)胞所需的滴度來(lái)確定A549和H460癌細(xì)胞系中腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。3.流式細(xì)胞術(shù)分析通過(guò)碘化丙啶染色和FACS分析測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞，通過(guò)離心沉淀細(xì)胞，然后重懸浮于包含50μg/ml碘化丙啶、0.1％TritonX-100和0.1％檸檬酸鈉的磷酸緩沖鹽溶液中，在FACS分析之前進(jìn)行渦旋(Becton-DickensonFACScan，MountainView，CA；FL-3channel)。4.Western印跡分析在48小時(shí)的感染之后，制備細(xì)胞的提取物，然后如先前所述進(jìn)行免疫印跡測(cè)定(Pataer等人，2002)。使用下列抗體PKR(K-17)、HSP90、β連環(huán)蛋白、E-鈣粘蛋白、Raf-1和β肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。磷酸-PKR[pT451]和磷酸-eIF-2α[pS51]抗體購(gòu)自BioSourceInternational(BioSourceInternational，Camarillo，CA)。Akt和磷酸-Akt(Ser473)購(gòu)自CellSignaling(CellSignaling；Beverly，MA)?？筂DA-7的多克隆抗體或單克隆抗體購(gòu)自IntrogenTherapeuticsInc(Houston，TX)。5.免疫熒光分析使A549細(xì)胞(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)生長(zhǎng)在chamber載玻片上直至70％的匯合，然后用Ad-luc、Ad-mda7、GA、Ad-mda7+GA或Ad-luc+GA進(jìn)行處理。48小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，然后用新配制的4％多聚甲醛/PBS固定15分鐘。然后在4℃下用0.2％TritonX-100透化細(xì)胞20分鐘，然后用1％正常山羊血清封閉1小時(shí)。將兔抗β連環(huán)蛋白多克隆抗體在4℃下溫育過(guò)夜，然后在37℃下用羅丹明二抗顯影30分鐘。然后在熒光顯微鏡(OlympusBX50熒光顯微鏡)下觀察細(xì)胞(Vorburger等人，2002)。6.免疫沉淀分析用PBS、Ad-mda7、Ad-mda7+GA或單獨(dú)的GA處理細(xì)胞48小時(shí)，然后在RIPA緩沖液(1×PBS，1％NonidetP-40，0.5％去氧膽酸鈉，0.1％SDS)中裂解細(xì)胞。將500μl(500μg)細(xì)胞裂解物與一抗在4℃下一起溫育過(guò)夜。將蛋白A/G瓊脂糖加入混合物中并溫育4小時(shí)。通過(guò)在4℃下以2500rpm離心5分鐘沉淀小珠。用1mlRIPA緩沖液洗滌沉淀4次。在最后一次洗滌后，向小珠中加入50μl1XSDS-PAGE樣品緩沖液，然后渦旋該小珠，并煮沸5分鐘。然后在將上清液加載在凝膠上之前，以2500rpm將其離心1分鐘。7.運(yùn)動(dòng)性測(cè)定向24孔板(Costar)的各個(gè)孔中加入培養(yǎng)基(0.7ml)。將細(xì)胞培養(yǎng)用插件(Fisher；8μm孔徑大小，F(xiàn)alcon3097)置于各孔中。將A549和H460細(xì)胞調(diào)整至5×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，然后將500μl的細(xì)胞放入各插件中。用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、GA、Ad-mda7+GA和Ad-luc+GA溫育細(xì)胞36小時(shí)。36小時(shí)后，計(jì)數(shù)附著在小孔底部的細(xì)胞數(shù)目。運(yùn)動(dòng)性表示為36小時(shí)后無(wú)藥小孔中附著至小孔的細(xì)胞數(shù)目的百分比。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析報(bào)道的數(shù)據(jù)代表三個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，且條柱顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。使用ANOVA和雙尾Student’st檢驗(yàn)分別進(jìn)行多組和成對(duì)比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05被認(rèn)為是顯著的。B.結(jié)果1.格爾德霉素(GA)在人肺癌細(xì)胞中增強(qiáng)腺病毒mda-7介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。許多研究人員已顯示格爾德霉素可誘導(dǎo)對(duì)乳腺部和結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡。對(duì)GA是否在人肺癌A549細(xì)胞和H460細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了研究。在暴露于不同劑量的GA后48小時(shí)，對(duì)A549和H460細(xì)胞系進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。圖5A顯示使用GA處理肺癌細(xì)胞導(dǎo)致兩種細(xì)胞系中高百分比的細(xì)胞死亡。在這些癌細(xì)胞系中由GA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是劑量依賴(lài)性的。在A549和H460細(xì)胞系中都檢查了在Ad-mda7與50nm和150nm劑量的GA一起處理48小時(shí)的效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示單獨(dú)的Ad-mda-7在A549和H460細(xì)胞中分別導(dǎo)致百分之15和12的細(xì)胞凋亡。在第48小時(shí)，150nm的單獨(dú)的GA在A549和H460細(xì)胞中分別導(dǎo)致百分之6.3和5.7的細(xì)胞凋亡。GA和Ad-mda7組合在A549(25.3和44％)和H460(21.7和37.5％)細(xì)胞中導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的顯著增加(圖5B)。對(duì)于GA和Ad-luc的組合，在這些癌細(xì)胞中不顯示該凋亡效應(yīng)的增加(圖5B)。此外，該組合效應(yīng)大于各藥劑的累加效應(yīng)。2.Ad-mda7和GA的聯(lián)合處理不增加PKR的表達(dá)本發(fā)明者以前曾報(bào)道Ad-mda7誘導(dǎo)和激活ds-RNA依賴(lài)性蛋白激酶(PKR)，這導(dǎo)致eIF-2α的磷酸化和肺癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。因此檢測(cè)Ad-mda7和GA聯(lián)合處理是否增加PKR的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)。用Ad-mda7處理的A549和H460細(xì)胞展示PKR和磷酸化PKR的量的增加。相比之下，PBS、GA或Ad-luc處理不導(dǎo)致PKR或PKR磷酸化的增加。Ad-mda7和GA的組合在A549和H460細(xì)胞中都不增加PKR水平或其磷酸化狀態(tài)。相比之下，使用GA處理這些癌細(xì)胞導(dǎo)致需要Hsp90來(lái)產(chǎn)生構(gòu)象成熟的AKT、P-AKT、Raf靶的降解。有趣的是，Ad-mda7降解AKT，但同時(shí)在A549和H460細(xì)胞中增加AKT的磷酸化狀態(tài)。Ad-mda7和GA的共處理顯著地在這些癌細(xì)胞中降解磷酸化的AKT。這些結(jié)果表明對(duì)Ad-mda7介導(dǎo)的AKT激活的抑制可部分地歸因于Ad-mda7和GA的協(xié)同效應(yīng)。3.Ad-mda7和GA的組合在肺癌細(xì)胞中上調(diào)表面E-鈣粘蛋白和增加β連環(huán)蛋白/E鈣粘蛋白締合以前的報(bào)道已顯示Ad-mda7可上調(diào)人肺癌細(xì)胞中的E鈣粘蛋白(Mhashilkar等人，2003)。本發(fā)明者研究了Ad-mda7和GA的組合是否可在人肺癌細(xì)胞中增強(qiáng)E鈣粘蛋白的上調(diào)。如圖6A中所示，如通過(guò)使用抗E鈣粘蛋白單克隆抗體染色和流式細(xì)胞術(shù)所確定的，單獨(dú)的Ad-mda7和單獨(dú)的GA各自可在A549和H460細(xì)胞中增加E鈣粘蛋白的水平。與PBS、Ad-luc、Ad-mda7、單獨(dú)的GA或Ad-luc+GA處理相比，Ad-mda7和GA(50nm)的組合處理在這些細(xì)胞中進(jìn)一步增加了E鈣粘蛋白的水平。免疫熒光染色顯示單獨(dú)的Ad-mda7和單獨(dú)的GA各自可在A549細(xì)胞中增加β連環(huán)蛋白的水平。所述染色實(shí)驗(yàn)也顯示Ad-mda7和GA的組合在這些細(xì)胞中顯著地增加β連環(huán)蛋白的水平。以前的研究也證明格爾德霉素可刺激β連環(huán)蛋白的酪氨酸去磷酸化和增加β連環(huán)蛋白/E鈣粘蛋白締合，從而導(dǎo)致顯著減少的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(Bonvini等人，2001)。因此，研究Ad-mda7和GA的組合是否可增加β連環(huán)蛋白/E鈣粘蛋白締合。首先用抗E鈣粘蛋白抗體免疫沉淀PBS、Ad-mda7、GA或組合處理的細(xì)胞，然后用β連環(huán)蛋白特異性抗體對(duì)其進(jìn)行免疫印跡。該方法顯示，與用PBS、單獨(dú)的Ad-mda7或GA處理的A549和H460細(xì)胞中觀察到的水平相比，在用MDA-7和GA的組合處理的細(xì)胞中與E鈣粘蛋白免疫共沉淀的β連環(huán)蛋白的量顯著增加。在兩種細(xì)胞系中，當(dāng)用抗E鈣粘蛋白抗體免疫印跡免疫沉淀時(shí)也檢測(cè)到相同的E鈣粘蛋白水平。因?yàn)槟そY(jié)合的β連環(huán)蛋白-E鈣粘蛋白復(fù)合物的豐度與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)呈反相關(guān)，因此在體外調(diào)查Ad-mda7和GA的組合是否可誘導(dǎo)A549和H460細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。當(dāng)在36小時(shí)的體外運(yùn)動(dòng)檢測(cè)中加入時(shí)，如通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色所評(píng)估的(圖6B)，單獨(dú)的Ad-mda7或GA(50nM)在兩種細(xì)胞系中都減小運(yùn)動(dòng)而不影響細(xì)胞生存力。Ad-mda7和GA共處理在A549和H460細(xì)胞都導(dǎo)致顯著減少的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性(圖6B)。當(dāng)用Ad-luc和GA共處理時(shí)，兩個(gè)細(xì)胞系中都不表現(xiàn)該結(jié)果(圖6B)。然后調(diào)查17AAG-GA類(lèi)似物一對(duì)用MDA-7處理的人肺癌細(xì)胞是否具有與GA相同的效應(yīng)。在用兩種不同劑量的17AAG暴露后48小時(shí)，對(duì)A549和H460細(xì)胞系進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。圖7顯示單獨(dú)使用17AAG或Ad-mda7處理肺癌細(xì)胞導(dǎo)致兩種細(xì)胞系的細(xì)胞死亡。與Ad-luc和17AAG的組合相比，17AAG和Ad-mda7的組合導(dǎo)致A549和H460細(xì)胞的細(xì)胞凋亡顯著增加(圖7)。實(shí)施例4與維生素E琥珀酸酯(VES)組合增強(qiáng)AD-MDA7的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)A.材料和方法1.細(xì)胞系和試劑從MDAndersonCancerCenter的Dr.JudithWolf獲得人卵巢癌細(xì)胞MDAH2774。正常的成纖維細(xì)胞系MRC-9獲自ATCC。Ad螢光素酶和Ad-MDA7載體獲自IntrogenTherapeutics(參見(jiàn)例如，Mhashilkar等人，2001，其以參考引用方式并入本文)。維生素E琥珀酸酯獲自SigmaChemicals，St.Louis，MO。2.生長(zhǎng)抑制的測(cè)定法用Ad-luc(載體對(duì)照)、生育酚(維生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(2000vp/細(xì)胞)或其組合處理人卵巢癌細(xì)胞(MDAH2774)或正常人成纖維細(xì)胞(MRC-9)72小時(shí)(3天)。在無(wú)血清培養(yǎng)基中用Ad-luc或Ad-mda7感染細(xì)胞3小時(shí)。在3小時(shí)的溫育后，給細(xì)胞補(bǔ)充完全培養(yǎng)基。此時(shí)將溶解在DMSO中的生育酚加入細(xì)胞以產(chǎn)生8μg/ml的終濃度。在72小時(shí)的溫育后，收集細(xì)胞，然后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法確定百分比生長(zhǎng)抑制。3.Western印跡分析對(duì)于Western印跡分析，通過(guò)加入細(xì)胞裂解緩沖液(20mMHEPES，pH7.5；10mMKCl，1mMMgCl2，1mMEDTA，1mMDTT，250mM蔗糖和1X蛋白酶抑制劑)從用Ad-luc(載體對(duì)照)、生育酚(維生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(2000vp/細(xì)胞)或其組合處理的MDAH2774細(xì)胞分離總蛋白。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將其固定在尼龍膜上。用抗胱天蛋白酶-9(CellSignaling，Boston，MA)和抗胱天蛋白酶-3、抗Poly(ADP-核糖)聚合酶PARP、抗Bid和抗胱天蛋白酶-8(BD-Pharmingen，SanDiego，CA)、抗Fas和抗MDA-7(IntrogenTherapeutics)、抗細(xì)胞色素C(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)和抗β肌動(dòng)蛋白的一抗探測(cè)膜。通過(guò)使用合適的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的二抗確定蛋白的表達(dá)，然后通過(guò)使用Amersham的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光western印跡檢測(cè)系統(tǒng)在增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光膠片(Hyperfilm，Amersham)上顯示蛋白的表達(dá)。4.細(xì)胞分級(jí)分離如先前所述(Gewies等人，CancerRes.，602163-2168，2000)將細(xì)胞分級(jí)分離成胞質(zhì)和線粒體級(jí)分以檢測(cè)細(xì)胞色素C的釋放。簡(jiǎn)而言之，用，PBS、Ad-luc、Ad-mda7、生育酚或其組合處理腫瘤細(xì)胞72小時(shí)。在處理后72小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞，通過(guò)刮取將細(xì)胞收集入管中，然后用聚四氟乙烯樹(shù)脂研杵將其在小玻璃勻漿器中在100μl冰冷緩沖液M(20mMHEPES(pH7.5)，10mMKCl，1.5mMMgCl2，1mMEGTA，1mMEDTA，1mMDTT，250mM蔗糖，0.1mMPMSF，2μg/ml胃蛋白酶抑制劑，2μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)和2μg/ml胰蛋白酶抑制)中進(jìn)行勻漿(在冰上沖擊50次)。以6,000xg在4℃下離心勻漿物20分鐘，然后通過(guò)western印跡分析，將上清液(線粒體級(jí)分)和細(xì)胞沉淀(胞質(zhì)級(jí)分)用于檢測(cè)細(xì)胞色素C。R.結(jié)果1.使用Ad-mda7聯(lián)合維生素E(生育酚)的處理增強(qiáng)了對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制為確定Ad-mda7的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)是否可被維生素E增強(qiáng)，用Ad-luc(載體對(duì)照)、生育酚(維生素E琥珀酸酯)、Ad-mda7或其組合處理細(xì)胞。如圖8A所示，與單獨(dú)使用Ad-mda7或維生素E琥珀酸酯的處理相比，Ad-mda7與維生素E琥珀酸酯的組合提高了生長(zhǎng)抑制。圖8B顯示使用Ad-mda7和維生素E處理正常成纖維細(xì)胞不增加生長(zhǎng)抑制效應(yīng)超過(guò)在單獨(dú)用Ad-mda7處理后觀察到的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。2.細(xì)胞凋亡在用Ad-mda7維生素E(生育酚)處理的卵巢癌細(xì)胞中增加的指標(biāo)為確定Ad-mda7與維生素E琥珀酸酯的組合的提高的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)是否歸因于細(xì)胞凋亡，對(duì)用Ad-luc、Ad-mda7、維生素E琥珀酸酯或其組合處理的人卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行Western印跡分析。該分析顯示在維生素E琥珀酸酯存在的情況下，MDA-7蛋白的產(chǎn)量極大地增加。與增加的MDA-7蛋白產(chǎn)量一致，Western印跡分析也顯示觀察到用Ad-mda7聯(lián)合維生素E琥珀酸酯處理的癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的標(biāo)志增加。特別地，與用各藥劑單獨(dú)處理的細(xì)胞相比，觀察到在用Ad-mda7和維生素E琥珀酸酯處理的癌細(xì)胞中胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、PARP和Bid的裂解具有更大程度的增加。此外，來(lái)自線粒體的細(xì)胞色素C的增加的釋放(如由減少的細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)所表明的)也表明用Ad-mda7和維生素E琥珀酸酯處理的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡增加。最后，與單獨(dú)使用各藥劑的情況相比，在用Ad-mda7和維生素E琥珀酸酯處理的癌細(xì)胞中更容易檢測(cè)到細(xì)胞凋亡相關(guān)的Fas蛋白(圖9)。實(shí)施例5在脂質(zhì)體介導(dǎo)的mda-7/IL-24基因遞送后對(duì)肺腫瘤生長(zhǎng)的局部和全身性抑制作用A.材料和方法1.材料所有脂質(zhì)(DOTAP、膽固醇)都購(gòu)自AvantiPolarLipids(Albaster，AL)。Ham’s/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自GIBCO-BRL-LifeTechnologies(NewYork，NY)。多克隆兔抗人MDA-7抗體獲自IntrogenTherapeutics，Inc.(Houston，TX)，抗鼠CD31購(gòu)自SantaCruzBiotechnology，Inc.(PaloAlto，CA)。2.細(xì)胞系和動(dòng)物人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，并將其保持在補(bǔ)充有10％FBS、1％谷氨酸和抗生素的Ham’s-F12培養(yǎng)基中。鼠類(lèi)UV2237M細(xì)胞獲自Dr.IsaiahJ.Fidler(M.D.AndersonCancerCenter)且如其他文獻(xiàn)(Ramesh等人，2001)中所描述的進(jìn)行保持。定期傳代細(xì)胞并就支原體的存在檢測(cè)細(xì)胞。按照已建立的動(dòng)物培養(yǎng)和使用的規(guī)章指導(dǎo)方針將用于本研究的4至6周齡的雌性BALB/c裸(nu/nu)小鼠(Harlan-SpragueDawleyInc.，Indianapolis，IN)和C3H/Ncr小鼠(國(guó)立癌癥研究所，F(xiàn)redericksburg，MD)保持在無(wú)病原體環(huán)境中和進(jìn)行操作。3.質(zhì)粒的純化如在其他文獻(xiàn)(Templeton等人，1997；Gaensler等人，1999)中所描述的將用于本研究的質(zhì)粒克隆入pVax質(zhì)粒載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)和進(jìn)行純化。簡(jiǎn)而言之，將攜帶在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的細(xì)菌β半乳糖苷酶(Lac-Z)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)或人mda-7cDNA的質(zhì)粒在卡那霉素選擇的條件下培養(yǎng)在大腸桿菌宿主株系DH5α中。通過(guò)使用顯色鱟阿米巴樣細(xì)胞裂解物動(dòng)力學(xué)測(cè)定試劑盒(chromogeniclimulusamebocytelysatekineticassaykit)(Kinetic-QCL；Biowhittaker，Walkersville，MD)確定純化的質(zhì)粒的內(nèi)毒素水平。通過(guò)OD260/280比率確定純化的質(zhì)粒DNA的濃度和純度。4.DOTAP膽固醇脂質(zhì)體的合成和DOTAPCHOL-DNA混合物的制備如在其他文獻(xiàn)Chada等人，2003；Templeton等人，1997)中所描述的，通過(guò)減小的大小(1.0、0.45、0.2和0.1μm)的Whatman過(guò)濾器(Kent，UK)合成和擠出DOTAP膽固醇脂質(zhì)體。在小鼠中進(jìn)行注射之前2至3小時(shí)新配制DOTAPCHOL-DNA復(fù)合物。5.顆粒大小分析通過(guò)使用N4顆粒大小分析儀(Coulter，Miami，F(xiàn)L)就平均顆粒大小分析新配制的DOTAPCHOL-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的平均顆粒大小在300nm至325nm的范圍內(nèi)。6.DOTAPCHOL-mda7復(fù)合物對(duì)皮下腫瘤異種移植物的影響在所有實(shí)驗(yàn)中，將懸浮于100μl無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入右背脅側(cè)。當(dāng)腫瘤達(dá)到4-5mM2的大小時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分組并開(kāi)始進(jìn)行處理。將具有腫瘤的動(dòng)物分成4組，每組6只動(dòng)物。組1不接受處理，組2接受PBS，組3接受DOTAPCHOL-LacZ復(fù)合物(50μg/劑量)，組4接受DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物(50μg/劑量)；通過(guò)腫瘤內(nèi)途徑施用所有處理且每天提供一次處理，總共提供6個(gè)劑量。按照規(guī)章指導(dǎo)方針通過(guò)瘤內(nèi)注射甲氧氟烷(Schering-Plough，Kenilworth，NJ)來(lái)麻醉動(dòng)物。由不知道處理組的觀察人員每隔一天記錄腫瘤測(cè)量值，使用公式V(mm3)＝a×b2/2計(jì)算腫瘤體積，其中“a”是最大面積(dimension)，“b”是垂直直徑(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2001)。抗腫瘤功效數(shù)據(jù)表示為各組中所有動(dòng)物累積腫瘤體積以考慮腫瘤的大小和數(shù)目?jī)烧?。在所有?shí)驗(yàn)中，在第21天和第24天通過(guò)ANOVA確定腫瘤大小的改變的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性.為檢測(cè)mda-7對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，我們使用同系基因型腫瘤模型。為此，用鼠類(lèi)UV2237m纖維肉瘤細(xì)胞(1×106)皮下注射C3H小鼠并將其分成三組(n＝8/組)。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到4-5mM2-時(shí)，如下使動(dòng)物接受瘤內(nèi)處理無(wú)處理(對(duì)照)、DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物或DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物。處理方案和治療效應(yīng)的分析與已對(duì)于A549腫瘤模型所描述的一樣。重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次以在第21天和23天通過(guò)ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和顯著性計(jì)算。7.MDA-7、細(xì)胞凋亡和CD31的測(cè)量收獲分別在nu/nu或C3H小鼠中建立的皮下A549或UV2237m腫瘤，將其固定在4％緩沖的福爾馬林中，包埋在石蠟中，然后切成4μm的切片。如在其他文獻(xiàn)(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)中所描述的就MDA-7轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對(duì)組織切片進(jìn)行免疫染色。在明視野顯微鏡下分析對(duì)于MDA-7呈染色陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞并由不知道處理組的觀察人員進(jìn)行定量。每個(gè)樣品分析至少5個(gè)視野。為確定處理后腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)，如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2001)，就凋亡細(xì)胞死亡用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Tdt)試劑盒(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行染色，然后用亞甲藍(lán)或甲基綠進(jìn)行負(fù)染。在所有染色方法中，包括合適的陰性對(duì)照。對(duì)于CD-31染色，如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)用抗CD31抗體對(duì)組織進(jìn)行染色，然后以盲方式在顯微鏡下進(jìn)行觀察。通過(guò)在高倍放大率(highpowermagnification)(X400)下在每個(gè)樣品5個(gè)隨機(jī)選擇的視野中計(jì)數(shù)CD31陽(yáng)性染色血管的數(shù)目來(lái)半定量確定微血管密度(MVD)。檢查和定量代表每處理組3個(gè)腫瘤組織的總共15個(gè)視野，結(jié)果表示為每視野血管的平均數(shù)目。8.處理后腫瘤的特征為確定mda-7基因的治療效果，在最后一次處理后從小鼠收集腫瘤并將其接受組織病理學(xué)檢查。由不知道處理組的病理學(xué)家進(jìn)行分析。9.DOTAPCHOL-mda7復(fù)合物對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移的功效為檢測(cè)DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物對(duì)肺轉(zhuǎn)移的功效，用懸浮在100μl無(wú)菌PBS中的106個(gè)A549腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射入雌性裸鼠。6天后，將小鼠分成3組并如下進(jìn)行處理無(wú)處理(組1)、DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物(組2)和DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物(組3)。各組有8只小鼠。所有處理包含50μg脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，且每天使用27號(hào)針經(jīng)尾靜脈施用一次，總共進(jìn)行6個(gè)劑量。在最后一次劑量給藥后3周，通過(guò)CO2吸入對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。用印度墨汁氣管內(nèi)注射各小鼠的肺并將其固定在Feketes溶液中(Ramesh等人，2001)。通過(guò)不知道處理組的觀察人員在解剖鏡下對(duì)各肺中的轉(zhuǎn)移性腫瘤的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)確定全身性mda-7基因處理的治療效果。通過(guò)Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如果P值＜0.05那么組間的差異解釋為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。作為同系基因型肺腫瘤模型，用鼠類(lèi)UV2237m纖維肉瘤細(xì)胞(1×106)注射C3H小鼠并將其分成3組(n＝7/組)。注射后6天，如下處理動(dòng)物無(wú)處理、DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物或DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物。處理方案和治療效果的分析與已對(duì)于A549模型所描述的一樣。進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。B.結(jié)果1.使用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染評(píng)估DOTAP膽固醇脂質(zhì)體通過(guò)使用編碼人MDA-7/IL-24蛋白的表達(dá)質(zhì)粒將質(zhì)粒DNA遞送入人(A549)和小鼠(UV2237m)腫瘤細(xì)胞的能力。使用與mda-7質(zhì)粒DNA復(fù)合的DOTAP膽固醇脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染導(dǎo)致外源MDA-7蛋白在第24和48小時(shí)在A549和UV2237m腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。對(duì)來(lái)自DOTAPCHOL-mda-7轉(zhuǎn)染的A549和UV2237m細(xì)胞的組織培養(yǎng)物上清液的分析在第48小時(shí)但非第24小時(shí)顯示分泌的MDA-7蛋白。在第48小時(shí)，分泌MDA-7蛋白的檢測(cè)與Ad-mda7處理的細(xì)胞中觀察的不同，在所述細(xì)胞中，在第24小時(shí)可檢測(cè)到分泌的MDA-7蛋白(Mhashilkar等人，2001)。這表明使用DOTAP膽固醇脂質(zhì)體獲得的轉(zhuǎn)基因MDA-7表達(dá)低于使用Ad-mda7獲得的表達(dá)。在PBS處理的細(xì)胞中未觀察到分泌的MDA-7蛋白。因此，DOTAP膽固醇脂質(zhì)體可有效地將mda-7DNA遞送至腫瘤細(xì)胞，從而產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)和分泌的轉(zhuǎn)基因MDA-7產(chǎn)物，盡管低于Ad-mda7。2.MDA-7抑制皮下腫瘤生長(zhǎng)評(píng)估DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物在nu/nu小鼠中抑制A549人肺皮下腫瘤的生長(zhǎng)的能力。與未處理的、用PBS處理的或用DOTAPCHOL-LacZ復(fù)合物處理的動(dòng)物中的腫瘤生長(zhǎng)相比，通過(guò)瘤內(nèi)途徑用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物處理荷瘤小鼠顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)(P＝0.001)(圖10A)。對(duì)腫瘤的組織病理學(xué)分析顯示在各處理組之間腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞無(wú)顯著改變。然后評(píng)估m(xù)da-7基因?qū)3H小鼠中的皮下腫瘤的治療效應(yīng)。將具有UV223M腫瘤的小鼠分成3組，一組不接受處理，第二組接受使用DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物的處理，第三組接受使用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物的處理。當(dāng)與兩個(gè)對(duì)照組中的腫瘤生長(zhǎng)相比時(shí)，在用瘤內(nèi)施用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物處理的小鼠中從第19天開(kāi)始UV2237m腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制(圖10B)。然而在第23天觀察到顯著的腫瘤抑制作用(P＝0.01)。與未處理的對(duì)照小鼠相比，也在用DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物處理的小鼠中觀察到腫瘤抑制(P＝0.24)。然而，在DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物處理的小鼠中觀察到的抑制效應(yīng)歸于非特異性效應(yīng)且與我們先前的研究一致(Ramesh等人，2001).為了證明觀察到的腫瘤抑制效應(yīng)是由于mda-7基因表達(dá)引起的，就MDA-7蛋白的表達(dá)將注射后48小時(shí)獲得的皮下A549和UV2237m腫瘤接受免疫組織化學(xué)分析。在用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物處理的A549腫瘤(8％)和UV223m腫瘤(13％)中觀察到MDA-7蛋白的表達(dá)(P＝0.001；圖10C)，表達(dá)MDA-7蛋白的腫瘤數(shù)目顯著高于未處理的、用PBS處理的、DOTAP膽固醇LacZ處理的或用DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物處理的動(dòng)物中的數(shù)目。在用DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物處理的A549腫瘤中觀察到幾種非特異性染色水平。對(duì)MDA-7表達(dá)模式的分析顯示除了呈現(xiàn)為細(xì)胞外的更彌散的染色模式外還存在強(qiáng)烈的細(xì)胞內(nèi)染色。在人腫瘤異種移植物和鼠類(lèi)同系基因型腫瘤中都觀察到該染色模式。3.用DOTAPCHOL-mda7復(fù)合物處理的肺腫瘤中的凋亡性細(xì)胞死亡為確定用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物處理后的腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)，如先前所述(Saeki等人，2002)就凋亡性細(xì)胞死亡分析來(lái)自nu/nu小鼠和C3H小鼠的皮下腫瘤(A549，UV2237m)。與來(lái)自未處理的、用PBS處理的、用DOTAPCHOL-CAT處理的或用DOTAPCHOL-LacZ處理的對(duì)照動(dòng)物的腫瘤相比，在用DOTAPCHOL-mda-7處理的腫瘤中觀察到顯著水平的(P＝0.001)標(biāo)志凋亡性細(xì)胞死亡的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(13％A549和9％UV2237m)(圖11)。4.用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物處理的肺腫瘤中的減少的CD31陽(yáng)性染色為確定mda-7處理對(duì)腫瘤血管化作用的影響，如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)將腫瘤組織接受CD31染色。與從未處理、PBS處理、DOTAPCHOL-LacZ復(fù)合物處理和DOTAPCHOL-CAT-處理的小鼠獲得的腫瘤組織相比，在DOTAPCHOL-mda7處理的A549(10％)和UV2237m(5.8％)腫瘤組織中CD31陽(yáng)性染色的水平顯著(P＝0.01)減少(圖12)。減少的CD31染色表示減少的血管化作用。5.MDA-7抑制實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移然后使用人A549肺癌細(xì)胞或小鼠UV227m細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型中檢查DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物的活性。腫瘤細(xì)胞的靜脈內(nèi)遞送導(dǎo)致快速的肺部腫瘤接種，在30天后，動(dòng)物死于極大的肺腫瘤負(fù)荷。使用DOTAPCHOL-mda-7復(fù)合物全身性治療荷A549和UV2237m肺腫瘤裸鼠或C3H小鼠導(dǎo)致比使用PBS或DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物的處理顯著(P＜0.05)更低的肺轉(zhuǎn)移數(shù)目(圖13)。在UV2237m小鼠中，當(dāng)與用PBS處理的小鼠相比時(shí)，使用DOTAPCHOL-CAT復(fù)合物的處理導(dǎo)致腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目的顯著減少，從而表明存在一些非特異性抗腫瘤活性(圖13)。此外，如由缺乏發(fā)病率和死亡率所證明的，所述處理能被充分耐受而無(wú)觀察到的處理相關(guān)性毒性。實(shí)施例6Ad-mda7誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的化學(xué)敏化作用用紫杉醇(0.5nM)、Ad-luc(500vp/細(xì)胞)、Ad-luc和紫杉醇或Ad-mda7和紫杉醇處理接種在6孔培養(yǎng)板(5×105/孔)中的MDAH2774卵巢癌細(xì)胞。在處理后72小時(shí)收獲細(xì)胞，然后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法就細(xì)胞生存力分析所述細(xì)胞。未處理的細(xì)胞用作對(duì)照。與其他處理組相比，用Ad-luc和紫杉醇或用Ad-mda7和紫杉醇處理的細(xì)胞顯示生長(zhǎng)抑制。然而，只在用Ad-mda7和紫杉醇處理的細(xì)胞中觀察到累加至協(xié)同的顯著生長(zhǎng)抑制(P＝＜0.05)(圖14)。在三份重復(fù)小孔中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果表示為2個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)施例7mda-7基因轉(zhuǎn)移使乳腺癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法、生物學(xué)療法和放射療法敏化與blc-2家族成員表達(dá)的相關(guān)性A.材料和方法1.細(xì)胞和試劑所有的細(xì)胞系獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。被評(píng)估的乳腺癌細(xì)胞系是T47D、MCF-7、MDA-MB-453、SKBr3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、HBL-100和BT-20。原代人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)、人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和MJ-90人成纖維細(xì)胞獲自Clonetics(SanDiego，CA)。將細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，GrandIsland，NY)和胎牛血清(5-10％，依照各細(xì)胞系)中，并就支原體的存在對(duì)其進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。赫賽汀(Genentech，SanFrancisco，CA)、泰索帝(Aventis-RPR，Collegeville，PA)、他莫昔芬(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)和阿霉素(AdriaLabs，ColumbusOH)獲自MDAndersonCancerCenterpharmacy。2.重組腺病毒以前曾報(bào)道包含mda-7基因(Ad-mda7)、螢光素酶報(bào)道基因(Ad-luc)或空載體(Ad-CMVp(A))的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)的產(chǎn)生(Mhashilkar，2001)。Ad-mda7的構(gòu)建包括將mda-7cDNA連接至CMV-IE啟動(dòng)子，然后連接至SV40多腺苷酸化[p(A)]序列；將該表達(dá)盒置于Ad5的E1區(qū)域中。進(jìn)行PCRTM，然后用限制性內(nèi)切酶降解，然后使用DNA測(cè)序分析以確定病毒種。Western印跡法分析，將細(xì)胞裂解物接受10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后使用辣根過(guò)氧化物酶的Super-Signal底物(Pierce，Inc.)通過(guò)Western印跡法對(duì)其進(jìn)行分析。由IntrogenTherapeutics產(chǎn)生抗MDA-7多克隆和單克隆抗體。用于本研究的其他單克隆抗體識(shí)別PKR、p53、BCL-2、BCL-XL、BAX、微管蛋白和肌動(dòng)蛋白(SantaCruzBiotechnology)。二抗購(gòu)自Santa-CruzBiotechnology(SantaCruz，CA)和AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)。3.轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物處理在指定的藥物(他莫昔芬1-10μg/mL；泰索帝1-10ng/mL；阿霉素1-10ng/mL和赫賽汀1μg/mL)存在或不存在的情況下用Ad-mda7、Ad-空載體或Ad-luc以增加的感染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。以500-2000個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞涂板在96孔板形式中以進(jìn)行3H胸苷摻入測(cè)定法，或以105-106個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞涂板在6孔板形式中以進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)、臺(tái)盼藍(lán)生存力測(cè)定或細(xì)胞凋亡測(cè)定。在藥物組合研究中，只在加入載體之前加入藥物一次，且同時(shí)將細(xì)胞持續(xù)暴露于藥劑中。4.細(xì)胞增殖分析通過(guò)3H胸苷向活躍復(fù)制的細(xì)胞的DNA中的摻入來(lái)測(cè)量細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。向所述細(xì)胞加入3H胸苷(1Ci/mL)，然后在15小時(shí)后通過(guò)從受體細(xì)胞除去上清液來(lái)終止反應(yīng)。使用胰蛋白酶/EDTA(GIBCO)收獲細(xì)胞，使用PackardFiltermate細(xì)胞收集器在過(guò)濾器上收集細(xì)胞，然后按照廠商方案將其在去離子水和甲醇中進(jìn)行洗滌。干燥過(guò)濾器并使用Matrix9600(Packard)分析。5.細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生存力測(cè)定通過(guò)TUNEL和膜聯(lián)蛋白V測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞凋亡。對(duì)于TUNEL測(cè)定法，按照廠商方案(Saeki等人，2000)使用生色TUNEL-POD(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)測(cè)定法就細(xì)胞凋亡分析腫瘤切片，且通過(guò)其暗褐色染色鑒定TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。使用ApoAlertAnnexinV-FITC試劑盒(CLONTECH，PaloAlto，CA)(Saeki等人，2000)進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V測(cè)定法。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法確定細(xì)胞生存力。使用碘化丙啶(PI)染色的細(xì)胞周期分析。通過(guò)細(xì)胞DNA的PI染色確定細(xì)胞周期的進(jìn)程。將細(xì)胞制備為1-2×106個(gè)細(xì)胞/mLPBS的單細(xì)胞懸浮液，用冷70％乙醇固定2小時(shí)，然后離心。倒出固定劑，然后在PBS中洗滌細(xì)胞，用碘化丙啶(PI，50g/mL)和RNA酶(20g/mL配制于PBS中)進(jìn)行染色。通過(guò)FACS分析評(píng)估處理的細(xì)胞克隆形成存活測(cè)定。使用Ad-mda7和Ad-CMVp(A)(MOI2000個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞)與XRT(0、2或4Gy)一起進(jìn)行克隆形成存活測(cè)定法。以1×105個(gè)細(xì)胞將MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞與空腺病毒載體(Ad-CMVp(A))或Ad-mda7一起培養(yǎng)2天，然后用放射療法(XRT)進(jìn)行處理。以2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度重新接種細(xì)胞。3周后評(píng)估克隆形成存活；固定集落，用吉姆薩染料進(jìn)行染色，然后計(jì)數(shù)(Nishikawa等人，2004)。6.動(dòng)物研究和免疫組織化學(xué)分析BalbCnu/nu小鼠獲自CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室(Wilmington，MA)。將乳腺癌細(xì)胞注射入6周齡的雌性小鼠的右后肢并觀察腫瘤的生長(zhǎng)。在所有實(shí)驗(yàn)中，將懸浮在100μl無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-361；MCF-7或MDA-MB-468)注射入右背脅側(cè)，然后使其生長(zhǎng)至大約100mm3。然后將動(dòng)物隨機(jī)分組(n＝5-10只動(dòng)物/組)，并如下開(kāi)始處理組1接受PBS，組2接受Ad-luc以及組3接受Ad-mda7。對(duì)于不同的模型劑量給藥方案不同在MB-361異種移植物模型中，當(dāng)腫瘤達(dá)到130mM3時(shí)，以1×1010vp的劑量用PBS、Ad-luc或Ad-mda7隔日注射每組10只動(dòng)物，進(jìn)行總共3個(gè)劑量。在MDA-MB-468模型中，以2×1010vp的劑量用PBS、Ad-luc或Ad-mda7隔日注射各自具有130mM3的腫瘤的5只動(dòng)物，總共進(jìn)行3次注射。在MCF-7異種移植物模型中，當(dāng)腫瘤達(dá)到85mM3時(shí)以1×1010、3×1010或1×1011vp的劑量用PBS、Ad-luc或Ad-mda7隔日注射每組10只動(dòng)物，進(jìn)行6次注射。為評(píng)估放射療法組合，將小鼠分成6個(gè)處理組(n＝5/組)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、Ad-luc、Ad-luc+XRT、單獨(dú)的XRT、Ad-mda7、Ad-mda7+XRT。在第1、3和5天以2×1010vp/ml的劑量用PBS或腺病毒載體直接注射處理腫瘤，對(duì)后肢施用單次輻射(5Gy)來(lái)治療動(dòng)物。隔日進(jìn)行腫瘤測(cè)量并計(jì)算體積。在殺死動(dòng)物后立即從選擇的小鼠收獲腫瘤并將其包埋在石蠟中。使用BCIP/NBT底物試劑盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)通過(guò)免疫組織化學(xué)就MDA和PKR的表達(dá)分析腫瘤樣品。按照規(guī)章指導(dǎo)方針在使用甲氧氟烷(ScheringPlough，Kenilworth，NJ)進(jìn)行麻醉的情況下進(jìn)行瘤內(nèi)注射。在不知道處理組的情況下隔日記錄腫瘤測(cè)量值，使用公式V(mm3)＝a×b2/2計(jì)算體積，其中“a”是最大的面積，“b”是垂直直徑(15，23)。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到1.5cm時(shí)對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)腫瘤測(cè)量使用Student’st檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。ANOVA和雙尾Student’st檢驗(yàn)分別用于多組和成對(duì)組比較的統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05被認(rèn)為是顯著的。B.結(jié)果1.在用Ad-mda7處理后，MDA-7在乳腺癌細(xì)胞中超表達(dá)使用一組9種乳腺癌細(xì)胞系；親本腫瘤類(lèi)型和p53突變狀態(tài)概述于圖15中。兩個(gè)代表性乳腺癌系MDA-MB-453(突變型p53)和MCF-7(野生型p53)的Western印跡分析顯示在Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)后，無(wú)論p53狀態(tài)如何，MDA-7蛋白都顯著地超表達(dá)(圖16A)；在Ad-luc或PBS處理的細(xì)胞的裂解物中MDA-7蛋白不明顯。肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)對(duì)照以確保等量的蛋白上樣。所述結(jié)果顯示MDA-7的異位表達(dá)誘導(dǎo)高水平的雙鏈RNA激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶PKR，而用Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則不具該作用。來(lái)自其他乳腺癌細(xì)胞(T47D、MB-231、MB-361、MB-468、SKBr3、BT-20、HBL-100)的裂解物的Western印跡分析也在Ad-mda7處理的細(xì)胞中顯示高M(jìn)DA-7表達(dá)。2.Ad-mda7在體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡用增加的劑量的Ad-mda7或?qū)φ蛰d體-Ad-螢光素酶(Ad-luc)或Ad-CMVp(A)(空Ad)處理乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D、SKBr3、HBL-100、BT-20、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453和MDA-MB-361和3個(gè)正常細(xì)胞類(lèi)型HMEC(乳房上皮細(xì)胞)、MJ90(成纖維細(xì)胞)和HUVEC(內(nèi)皮細(xì)胞)并就生長(zhǎng)抑制評(píng)估所述細(xì)胞。計(jì)算各細(xì)胞系生長(zhǎng)抑制達(dá)50％(IC50)所需的載體濃度并將其列于圖15中。將Ad-mda7產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制的IC50值除以獲得的對(duì)照載體的IC50值，從而得出選擇性系數(shù)(S.I.)。該SI表示與對(duì)照Ad載體相比，Ad-mda7產(chǎn)生細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的相對(duì)能力。正常細(xì)胞的SI值都等于1；但乳腺腫瘤細(xì)胞的SI值顯示Ad-mda7的細(xì)胞毒性大于對(duì)照＞2至＞30倍(平均＞8)(圖15)。盡管S.I.值的變化范圍較大，但其證明mda-7活性對(duì)于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是選擇性的，且MDA-7蛋白的表達(dá)不在正常細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性。Ad-mda7的腫瘤細(xì)胞選擇性效應(yīng)的另一個(gè)實(shí)例來(lái)自3H胸苷摻入測(cè)定法(圖16A)；我們的結(jié)果顯示在用Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的T47D、BT-20、MDA-MB-361和MCF-7乳腺癌細(xì)胞中存在顯著的劑量依賴(lài)性生長(zhǎng)抑制(p＜0.001)。MDA-7的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖高至96％，而Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的生長(zhǎng)改變最小。這些結(jié)果表明Ad-mda7可能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，從而我們進(jìn)行對(duì)未處理的、Ad-luc和Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期分析(PI染色)。如圖16C中所示，用Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期阻斷，與未處理或Ad-luc處理的細(xì)胞相比，G2/M細(xì)胞的比例增加2-3倍。評(píng)估細(xì)胞死亡的動(dòng)力學(xué)和劑量反應(yīng)，顯示MDA-MB-453細(xì)胞的代表性數(shù)據(jù)(圖16D)在低Ad-mda7劑量(1000vp/細(xì)胞50pfu/細(xì)胞)在處理后第2天觀察到顯著的細(xì)胞死亡(p＜0.001)；在更高的劑量在第1天觀察到顯著的殺傷作用，且隨時(shí)間的推移殺傷作用增強(qiáng)?？傊?，MDA-7的表達(dá)以時(shí)間和劑量依賴(lài)性方式殺傷乳腺腫瘤細(xì)胞，而Ad-luc只顯示很小的作用(圖16D)。相比之下，對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞-人乳房上皮細(xì)胞(HMEC)沒(méi)有顯示(即使在更長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)上也未顯示)來(lái)自Ad-luc和Ad-mda7的顯著的毒性(圖16E)。使用正常成纖維細(xì)胞和原代上皮細(xì)胞的其他研究確證缺乏抗正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性(圖15)。3.Ad-mda7對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中MDA-7的表達(dá)除了影響與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制相關(guān)的信號(hào)外，還影響其他信號(hào)，據(jù)報(bào)道MDA-7的表達(dá)在多種癌細(xì)胞類(lèi)型中激活細(xì)胞凋亡途徑(Mhashilkar等人，2001；Su等人，1998；Saeki等人，2000；Chada等人，2004)。與這些發(fā)現(xiàn)相一致，觀察到使用Ad-mda7的轉(zhuǎn)導(dǎo)在T47D、MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468細(xì)胞系(分別為41、52、43和32％)中引發(fā)細(xì)胞凋亡(圖17A)。相比之下，當(dāng)用對(duì)照Ad-luc或空Ad轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞系時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)目與在用媒介物處理的細(xì)胞中觀察到的相當(dāng)。對(duì)這些細(xì)胞系的進(jìn)一步測(cè)定驗(yàn)證了d-mda7在T47D乳腺癌細(xì)胞中劑量依賴(lài)性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和上調(diào)BAX(圖17B)。使用泛胱天蛋白酶抑制劑ZVAD的處理減少細(xì)胞凋亡40％然而B(niǎo)AX的MDA-7誘導(dǎo)并未減少。使用Ad-luc的處理不激活BAX或細(xì)胞凋亡(圖17B)。然后評(píng)估細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的機(jī)制。Ad-mda7誘導(dǎo)胱天蛋白酶3和PARP的裂解，與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)一致(圖17C)。4.mda-7的表達(dá)在體內(nèi)減少腫瘤生長(zhǎng)為確定由Ad-mda7誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制是否在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)腫瘤生長(zhǎng)的相似效應(yīng)，我們?cè)诼闶竽Ｐ椭性u(píng)估了使用MDA-MB-361、MDA-MB-468和MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植物腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約100mM3時(shí)，將動(dòng)物分成處理組(n＝5-10只動(dòng)物/組)，并用PBS、Ad-luc或Ad-mda7進(jìn)行處理。如圖18A-D中所示，使用Ad-mda7直接注射腫瘤在所有3個(gè)異種移植物模型中誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著減小(p＝0.002-0.004)，這在第10天非常明顯。在第20天理，用Ad-luc或PBS處理的對(duì)照腫瘤已經(jīng)歷了4至8倍的體積增加，達(dá)到最大超過(guò)800mM3。相比之下，Ad-mda7處理的腫瘤顯示較小的腫瘤生長(zhǎng)(MDA-MB-361和MDA-MB-468)或長(zhǎng)至大約其初始體積的3倍(MCF-7)。Ad-luc誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)是可變的，在MB-361模型中具有最大效應(yīng)；然而Ad-mda7在所有3種模型中恒定地誘導(dǎo)更強(qiáng)和更穩(wěn)定的生長(zhǎng)抑制，從而導(dǎo)致長(zhǎng)期的腫瘤生長(zhǎng)控制作用。在對(duì)于p53是突變型和野生型的兩種腫瘤細(xì)胞中顯著的生長(zhǎng)抑制非常明顯(參見(jiàn)圖19)。在p53野生型MCF-7腫瘤中進(jìn)行劑量遞增試驗(yàn)研究，其中發(fā)現(xiàn)低劑量在阻止腫瘤生長(zhǎng)上無(wú)效，而3倍更高的劑量產(chǎn)生一定的腫瘤生長(zhǎng)抑制(p＝0.08)，而對(duì)數(shù)更高劑量對(duì)該攻擊性腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)烈的腫瘤生長(zhǎng)抑制(p＝0.002)(圖19和圖18A-D)。Ad-mda7處理顯著地減少腫瘤生長(zhǎng)速率(參見(jiàn)圖18C)，如這些腫瘤大小倍增所需時(shí)間上所反映的(圖19)。這些結(jié)果顯示MDA-7的表達(dá)在體外和體內(nèi)，在p53野生型和p53突變型乳腺癌細(xì)胞中都具有抗增殖活性。也就MDA-7的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)分析MDA-MB-468異種移植物。在Ad-mda7處理的但非PBS或Ad-luc處理的腫瘤中觀察到強(qiáng)MDA-7免疫染色(圖18D)。TUNEL分析顯示MDA-7蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡相關(guān)。表達(dá)MDA-7的腫瘤顯示PKR蛋白的高表達(dá)(圖18D)，類(lèi)似于體外觀察到的情況(圖16A)。5.Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)與他莫昔芬、泰索帝或阿霉素處理的組合對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞死亡具有累加效應(yīng)如上所示，使用Ad-mda7的單一藥劑療法展示很有前景的抗乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。然而，目前的乳腺癌治療法使用組合細(xì)胞毒性化療法、放射療法、激素療法和新的生物學(xué)療法例如赫賽汀的多方式療法(Winer等人，2000；Fisher等人，1997；Amat等人，2003；Bonnadona，1989；Tantivejkul等人，2003；Pegram等人，2004)。為調(diào)查Ad-mda7與化學(xué)治療劑的組合是否可增強(qiáng)細(xì)胞毒性，用Ad-mda7+系列化學(xué)治療劑處理乳腺癌細(xì)胞系，然后使用細(xì)胞增殖和細(xì)胞生存力測(cè)定法進(jìn)行分析。首先用雌激素拮抗劑他莫昔芬(其為通過(guò)在靶組織中與雌激素競(jìng)爭(zhēng)對(duì)其受體的結(jié)合來(lái)起作用的非甾體藥劑)處理這些細(xì)胞(Winer等人，2000；Fisher等人，1997)。為有助于評(píng)估組合藥物的相互作用，使用各藥劑的亞治療劑量。首先建立Ad-mda7和他莫昔芬(圖20A)之間的劑量反應(yīng)。在T47D細(xì)胞中低劑量的空Ad(0-1000vp/細(xì)胞)或他莫昔芬(多至2μg/ml)減少細(xì)胞增殖少于20％。加入非常低劑量(100vp/細(xì)胞)的Ad-mda7不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，而當(dāng)Ad-mda7與他莫昔芬(分別為60％和80％的抑制)組合時(shí)，500vp/細(xì)胞和1000vp/細(xì)胞的Ad-mda7導(dǎo)致劑量依賴(lài)性生長(zhǎng)抑制。如圖20B(上圖框)中所示，MCF-7細(xì)胞對(duì)單獨(dú)的他莫昔芬(1g/mL)和Ad-mda7(以1000vp/細(xì)胞)顯示較小的反應(yīng)(＜15％)，但使用兩種藥劑的組合的處理具有協(xié)同效應(yīng)且減少細(xì)胞增殖超過(guò)60％(p＜0.001)。進(jìn)行進(jìn)一步的研究以評(píng)估p53突變型T47D細(xì)胞在該情況下使用Ad-mda7作為單一藥劑的處理顯著減少生長(zhǎng)。然而，與使用p53wtMCF-7細(xì)胞的情況一樣，兩種組合治療劑的效應(yīng)是協(xié)同的，且減少胸苷計(jì)數(shù)80％(p＜0.01)。用Ad-luc或空Ad轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞減少生長(zhǎng)不超過(guò)15％。也在MDA-MB-361細(xì)胞中觀察到類(lèi)似的協(xié)同相互作用。為調(diào)查Ad-mda7是否可增強(qiáng)屬于紫杉烷家族的藥劑的效應(yīng)，用泰索帝(多西他奇，0.5-2ng/mL)處理乳腺癌細(xì)胞。泰索帝是破壞微管網(wǎng)絡(luò)從而阻止細(xì)胞完成有絲分裂和分裂間期的抗腫瘤藥(Winer等人，2000；Fisher等人，1997；Amat等人，2003)。使用導(dǎo)致大約40％的胸苷摻入抑制的泰索帝劑量對(duì)T47D和MCF-7進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定(圖21A-B)。所述細(xì)胞對(duì)Ad-mda7敏感但對(duì)Ad-luc不敏感；當(dāng)Ad-mda7與泰索帝組合時(shí)，在兩種細(xì)胞系中都觀察到增強(qiáng)的敏化作用。在MDA-MB-361細(xì)胞中獲得相同的結(jié)果。然后檢測(cè)阿霉素(多柔比星)(其為細(xì)胞毒性蒽環(huán)類(lèi)抗生素)，據(jù)認(rèn)為其效應(yīng)是由其核苷酸堿基相互作用和細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)合活性介導(dǎo)的(Winer等人，2000；Tantivejkul等人，2003)。據(jù)認(rèn)為該藥劑與修復(fù)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶II形成可斷裂DNA的復(fù)合物的直接相互作用在該藥物細(xì)胞毒性中起著重要作用。使用用作單一藥劑的Ad-mda7(200-2500vp/細(xì)胞)或阿霉素(1ng/mL)處理T47D或MCF-細(xì)胞減少了細(xì)胞增殖；而使用Ad-mda7和阿霉素的組合的處理顯示了超累加(協(xié)同)效應(yīng)(圖22A-B)。協(xié)同活性在低藥物濃度上非常明顯。在T47D細(xì)胞中，200vp/細(xì)胞的Ad-mda7或1ng/ml的阿霉素導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的少量(17-23％)減少，但兩種藥劑的組合導(dǎo)致顯著更大的(＞60％)的生長(zhǎng)抑制(p＜0.01)。然后評(píng)估使用Ad-mda7與泰索帝、阿霉素、他莫昔芬和赫賽汀一起處理的乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(p53；BCL-XL；BCL-2和BAX)(圖15C和圖16)。與在T47D細(xì)胞中觀察到的效應(yīng)相似，乳腺腫瘤細(xì)胞的單一藥劑Ad-mda7的處理不顯著地改變p53或BCL-XL的穩(wěn)定狀態(tài)水平，盡管其可減少BCL-2的表達(dá)和上調(diào)BAX(圖22C)。在用泰索帝、阿霉素或赫賽汀處理的細(xì)胞中，在Ad-mda7處理后沒(méi)有觀察到p53和BCL-XL的顯著改變(圖23)。在用兩種化學(xué)療法一起處理的細(xì)胞中BCL-2和BCL-XL的穩(wěn)定狀態(tài)水平減少。Ad-mda7在用泰索帝或阿霉素處理的細(xì)胞中誘導(dǎo)BAX的上調(diào)，而當(dāng)與赫賽汀組合時(shí)，MDA-7的表達(dá)導(dǎo)致BCL-2的減少(圖22C)。p53和BCL-2家族成員的分子改變概述于圖23中。這些細(xì)胞凋亡介導(dǎo)因子顯示基于所用的藥物和載體的差異調(diào)控作用。當(dāng)作為單一療法或與化學(xué)治療劑一起遞送時(shí)，Ad-mda7在乳腺癌細(xì)胞中組成型地上調(diào)BAX。赫賽汀是作為人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)的拮抗劑開(kāi)發(fā)的人源化抗體(Pegram等人，2004)。在本研究中，進(jìn)行研究以評(píng)估通過(guò)Ad-mda7的表達(dá)增強(qiáng)的赫賽汀對(duì)MDA-MB-453(超表達(dá)HER2)和MCF-7(HER2陰性)的細(xì)胞毒性(圖22D)。事實(shí)上，當(dāng)用Ad-mda7和赫賽汀一起處理細(xì)胞時(shí)，觀察到與未處理的對(duì)照相比MDA-MB-453細(xì)胞的細(xì)胞死亡增加超過(guò)5倍的協(xié)同作用(p＜0.001)。相比之下，MCF-7細(xì)胞對(duì)赫賽汀具有抗性，正如通過(guò)其缺乏Her-2受體表達(dá)所預(yù)測(cè)的。Ad-mda7誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的死亡；然而Ad-mda7/赫賽汀的組合不顯示增強(qiáng)的活性。在上述相似的條件下，使用作為單一藥劑的Ad-luc或與赫賽汀一起的Ad-luc的處理不顯著地增加觀察到的細(xì)胞死亡的百分比。這些結(jié)果表明，與單一療法相比，Ad-mda7和化學(xué)治療劑、激素或生物藥劑的組合使用可降低腫瘤細(xì)胞死亡所需的治療濃度，從而潛地在減少了相關(guān)毒性。6.Ad-mda7和放射療法的組合對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成存活和腫瘤生長(zhǎng)具有協(xié)同效應(yīng)。然后進(jìn)行研究以調(diào)查Ad-mda7和XRT聯(lián)合療法對(duì)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的影響。用空腺病毒載體(Ad-p(A))或Ad-mda7(兩者都用2000vp/細(xì)胞的MOI)處理MDA-MB-468細(xì)胞，然后進(jìn)行輻射。使用集落形成測(cè)定法評(píng)估抗腫瘤活性。如圖24A中所示，觀察到與XRT或Ad-p(A)相比，Ad-mda7+XRT處理的細(xì)胞的存活率顯著減少。在2和4GyXRT處觀察到MDA-7介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力的增強(qiáng)(圖24A)。這些結(jié)果表明Ad-mda7+放射療法的組合在體外以超累加的方式抑制MDA-MB-468細(xì)胞的集落形成。為調(diào)查Ad-mda7和XRT聯(lián)合療法在體內(nèi)的效果，我們單獨(dú)地或與XRT(5Gy)組合使用Ad-mda7、Ad-luc或PBS處理大的(＞130mM3)MDA-MB-468乳腺癌異種移植物腫瘤。將動(dòng)物分成6個(gè)處理組(各組中n＝5)，并用PBS、Ad-luc、Ad-luc+XRT、XRT、Ad-mda7或Ad-mda7+XRT進(jìn)行處理。處理組之間腫瘤的顯著差異在處理停止后一周內(nèi)變得明顯。單獨(dú)使用XRT、Ad-mda7的處理以及使用Ad-luc和XRT的組合的處理都導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的顯著減少(p＜0.05)。然而，在接受XRT和Ad-mda7的組合的動(dòng)物中觀察到最顯著的改變。如在圖24B中所示，觀察到Ad-mda7處理的動(dòng)物中的腫瘤進(jìn)程的顯著抑制。然而當(dāng)Ad-mda7和XRT一起使用時(shí)，觀察到腫瘤生長(zhǎng)的衰退(p＝0.0017)。來(lái)自Ad-mda7/XRT處理的動(dòng)物中的腫瘤最初大小增加大約50％，但隨后減少多至80％。Ad-mda7/XRT組中的所有動(dòng)物都經(jīng)歷衰退，腫瘤測(cè)量達(dá)到小于42mM3的最低點(diǎn)。對(duì)照腫瘤大小增加超過(guò)500％，而XRT處理的腫瘤增加超過(guò)350％。Ad-mda7/XRT組中的腫瘤展示長(zhǎng)期的穩(wěn)定作用，而XRT、Ad-luc或Ad-luc/XRT腫瘤生長(zhǎng)增大。當(dāng)就腫瘤大小倍增的時(shí)間進(jìn)行評(píng)估時(shí)，PBS和Ad-luc處理的動(dòng)物分別到第10和11天達(dá)到該大??；XRT和Ad-luc/XRT組中的動(dòng)物都用了15天，而Ad-mda7處理的腫瘤用了25天。來(lái)自Ad-mda7/XRT處理的動(dòng)物的腫瘤在超過(guò)30天后大小仍未加倍，且平均比其初始大小小25％。只在Ad-mda7處理的腫瘤中而未在PBS或Ad-luc處理的腫瘤中觀察到轉(zhuǎn)基因MDA-7蛋白的升高表達(dá)(圖18D)。實(shí)施例8人白介素24(IL-24)蛋白通過(guò)IL-20受體殺死乳腺癌細(xì)胞并被IL-10拮抗A.材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)和試劑MDA-MB231和MDA-MB453乳腺癌細(xì)胞系獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)且將其保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清(LifeTechnologies，Inc.)、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mML谷氨酰胺和HEPES緩沖液(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)的DMEM(Hyclone，Inc.，Logan，Utah)中。常規(guī)地篩選細(xì)胞以確證不存在支原體污染并在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行使用。如先前所描述的(Caudell等人，2002)制備單克隆抗IL-24抗體。兔磷酸Stat3(Tyr705)抗體購(gòu)自CellSignalingTechnologyInc.(Beverly，MA)，β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購(gòu)自O(shè)ncogeneResearchProducts(SanDiego，CA)，所有其他一抗和二抗購(gòu)自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥測(cè)定法分析細(xì)胞生存力。用胰蛋白酶處理細(xì)胞并將等分以1∶1的體積懸浮于0.4％臺(tái)盼藍(lán)中。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過(guò)光學(xué)顯微鏡評(píng)估總細(xì)胞數(shù)目和進(jìn)行細(xì)胞生存力計(jì)數(shù)(Chada等人，2005)。2.純化和使用人IL-24的處理將全長(zhǎng)mda-7cDNA克隆入包含CMV啟動(dòng)子的pCEP4FLAG載體(Invitrogen，SanDiego，CA)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，然后使用潮霉素(0.4μg/ml)分離穩(wěn)定的亞克隆。如所描述的(Caudell等人，2002)使用親和層析濃縮和純化來(lái)自293-IL24細(xì)胞的上清液。以0-30ng/ml的濃度用純化的IL-24蛋白處理細(xì)胞，或使用transwell系統(tǒng)將細(xì)胞與293-IL24產(chǎn)生性細(xì)胞共培養(yǎng)(Chada等人，2005；Chada等人，2004)。3.基因轉(zhuǎn)移以前已描述了具有mda-7基因的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)(Mhashilkar等人，2001)。將mda-7基因連接至內(nèi)CMV-IE啟動(dòng)子，然后連接至SV40多腺苷酸化序列。將包含用于螢光素酶的表達(dá)的序列的相同腺病毒載體(Ad-luc)用作對(duì)照病毒。在感染前1天將細(xì)胞涂板。以每細(xì)胞625-10,000個(gè)病毒顆粒(33-500pfu/細(xì)胞)用腺病毒載體(Ad-mda7或Ad-luc)感染靶細(xì)胞。最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以在大于70％的細(xì)胞中獲得IL-24蛋白的表達(dá)(基于免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果)。4.免疫印跡法如先前所述(Chada等人，2005)進(jìn)行使用各種抗體和標(biāo)準(zhǔn)方法的免疫印跡法。受試一抗是p-STAT3，胱天蛋白酶-3、p-cdc2(tyr-15)、p-cdc25(ser-216)(CellSignalingTechnologies，Beverly，MA)、抗p27兔多克隆抗體、抗β連環(huán)蛋白單克隆、抗p-Akt、抗Akt、抗肌動(dòng)蛋白(SantaCruzBiotechnology，SantaCruzCA)或抗IL-24抗體(IntrogenTherapeutics，Houston，TX)。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(AmershamBiosciences)顯現(xiàn)蛋白。使用磷酸-STAT3特異性抗體通過(guò)免疫熒光測(cè)定法確定STAT-3的激活(Chada等人，2005)。在染色后1至2小時(shí)使用熒光顯微鏡拍攝照片。5.FACS分析通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞表面受體亞基IL-20R1和IL-22R1。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)加入0.2％EDTA/PBS使單層細(xì)胞分離，然后用冰冷PBS洗滌一次，將所述細(xì)胞沉淀和重懸浮至0.1ml1％在PBS中配制的FBS中并用抗IL-20R1、抗IL-22R1抗體或正常IgG對(duì)照抗體在室溫下溫育至少60分鐘。洗滌細(xì)胞并在冰上將其在FITC綴合的二抗(于1％的于PBS中配制的FBS中)中溫育30分鐘。用0.1％的PBS中的Tween20洗滌細(xì)胞3次，沉淀細(xì)胞并將其重懸浮于500μl1％的多聚甲醛中，獲取和分析數(shù)據(jù)。使用按照廠商方案進(jìn)行的膜聯(lián)蛋白V測(cè)定法通過(guò)FACS分析確定細(xì)胞凋亡。通過(guò)在FACScalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences，SanJoseCA)上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)分析細(xì)胞。使用10,000個(gè)細(xì)胞的樣品群體進(jìn)行分析。6.免疫熒光測(cè)定法以不同濃度(0-20ng/ml)的人IL-24蛋白處理培養(yǎng)在chamber載玻片中的細(xì)胞30分鐘。用乙醇∶醋酸(9.5∶0.5)固定細(xì)胞，然后用磷酸Stat3一抗和FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行染色。使用Nikon熒光顯微鏡分析載玻片。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Student’st檢驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。顯著性設(shè)置在p＜0.05。B.結(jié)果1.Ad-mda7載體在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平的IL-24表達(dá)和細(xì)胞殺傷作用在本研究中，評(píng)估兩個(gè)良好建立的乳腺癌細(xì)胞系模型MDA-MB231和MDA-MB453。用不同劑量(每細(xì)胞0至10,000個(gè)病毒顆粒；0-500pfu/細(xì)胞)的Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)這些乳腺癌細(xì)胞，在72小時(shí)后，收集上清液和細(xì)胞裂解物，并通過(guò)western印跡法就IL-24蛋白的表達(dá)探測(cè)所述裂解物。兩個(gè)細(xì)胞系都顯示IL-24的高水平表達(dá)和分泌，所述IL-24的增加與Ad-mda7的劑量相關(guān)。在印跡上觀察到多個(gè)條帶，反映了IL-24變成其成熟的糖基化形式的加工。IL-24表達(dá)是基因遞送的直接結(jié)果，因?yàn)槲刺幚淼募?xì)胞或用具有螢光素酶基因(Ad-luc)的對(duì)照載體處理的細(xì)胞沒(méi)有顯示IL-24的表達(dá)。3天后也通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥分析就生存力監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物。與未處理的細(xì)胞相比，使用螢光素酶對(duì)照載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)只產(chǎn)生少量的殺傷作用，而Ad-mda7以劑量依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)顯著更高(P＜0.001)的殺傷(圖25)。細(xì)胞殺傷作用與Ad-mda7介導(dǎo)的分泌IL-24的表達(dá)強(qiáng)相關(guān)，對(duì)于MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞相關(guān)系數(shù)分別為0.98和0.93(表5)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地表明觀察到的細(xì)胞殺傷效應(yīng)是增加的IL-24蛋白表達(dá)水平的結(jié)果。2.Ad-mda7在乳腺癌細(xì)胞中阻止細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為理解乳腺癌細(xì)胞中Ad-mda7誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的機(jī)制，進(jìn)行使用PI染色和流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞周期分析。用Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中的細(xì)胞周期的分析顯示，與未處理的對(duì)照或用Ad-luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，G2/M群體顯著增加(p＜0.05)，表明細(xì)胞周期停止在該期(圖26A)。通過(guò)分析細(xì)胞周期蛋白獲得對(duì)Ad-mda7阻止細(xì)胞周期進(jìn)程的進(jìn)一步支持。使用Ad-mda7的處理導(dǎo)致CDC-25的磷酸化增加以及總p27水平的增加。CDC-25是參與從G2至M期的細(xì)胞周期進(jìn)程的磷酸酶，通過(guò)在Ser216上磷酸化使用該酶失活。CDC-25的失活阻止其使其下游靶去磷酸化，所述下游靶的去磷酸化將使細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)行。p27是其水平在靜止期細(xì)胞中增加的另一個(gè)至關(guān)重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白。增加的細(xì)胞周期阻斷與減少的CDC-2的磷酸化相關(guān)。未處理的細(xì)胞和用Ad-Luc對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞未顯示p27或p-CDC-25或p-cdc2水平的變化。為了評(píng)價(jià)Ad-mda7在細(xì)胞凋亡途徑的激活中的作用，進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V測(cè)定以分析早期細(xì)胞凋亡事件。與Ad-luc處理的對(duì)照相比，使用Ad-mda7處理MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞都導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞的顯著增加(p＜0.01)，從而表明更高的細(xì)胞凋亡比例(圖26B)。Western分析顯示在Ad-mda7處理后胱天蛋白酶-3在乳腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性裂解和激活。PI3K存活途徑參與乳腺腫瘤發(fā)生和化學(xué)抗性；因此檢查MDA-MB453細(xì)胞中的PI3K和Wnt存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白表達(dá)的調(diào)控(Nicholson和Anderson，2002；Campbell等人，2004；Simstein等人，2003)。Western印跡分析顯示增加的MDA-7/IL-24表達(dá)水平與對(duì)涉及細(xì)胞存活途徑的蛋白的抑制相關(guān)。隨著細(xì)胞內(nèi)IL-24水平增加，觀察到Akt、p-Akt和β連環(huán)蛋白的伴隨性減少。3.外源IL-24蛋白激活STAT3并殺死乳腺癌細(xì)胞因?yàn)镮L-24蛋白存在于Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的上清液和細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中，因此檢查細(xì)胞內(nèi)IL-24對(duì)細(xì)胞外IL-24在乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制中的功能。MeWo黑素瘤細(xì)胞用作陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞系，因?yàn)橐褕?bào)道IL-24通過(guò)配體-受體結(jié)合有效地殺死黑素瘤細(xì)胞(Chada等人，2004)。將濃度增加的抗MDA7中和抗體加入Ad-mda7轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的培養(yǎng)物中。在乳腺和黑素瘤細(xì)胞系中，與非特異性IgG抗體的加入相比，IL-24的中和顯著地減少細(xì)胞的殺傷作用(p＜0.01)(圖27)，表明該效應(yīng)是IL-24特異性的。要注意抗IL-24不能完全消除細(xì)胞殺傷作用，表明Ad-mda7通過(guò)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外機(jī)制殺死乳腺癌細(xì)胞。已顯示所有IL-10細(xì)胞因子家族成員(包括MDA-7/IL-24)在受體陽(yáng)性細(xì)胞系中誘導(dǎo)STAT3的激活(Pestka等人，2004)。因此，通過(guò)在乳腺癌細(xì)胞中檢測(cè)STAT3磷酸化和至細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)評(píng)估IL-24受體結(jié)合。IL-24的受體是稱(chēng)為1型IL-20R(IL-20R1/IL-20R2)和2型IL-20R(IL-22R1/IL-20R2)的異源二聚細(xì)胞因子受體。使用抗磷酸-STAT3抗體的免疫熒光顯微鏡技術(shù)顯示IL-24和IL-10都能夠在兩種乳腺癌細(xì)胞系中激活STAT3。4.IL-24需要結(jié)合其IL-20受體以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因?yàn)镮L-24和IL-10都結(jié)合相關(guān)的受體和激活STAT3，但只有IL-24具有殺死細(xì)胞的能力，進(jìn)行鑒定通過(guò)IL-24介導(dǎo)細(xì)胞死亡的受體的研究。用抗IL-24、IL-20R1或IL-22R1的中和抗體處理MDA-MB453和MDA-MB231細(xì)胞，然后將其暴露于IL-24并使用臺(tái)盼藍(lán)染色監(jiān)測(cè)細(xì)胞的死亡?？笽L-24能夠顯著抑制(p＜0.01)IL-24介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷不低于80％?？笽L-22R1顯示中等減少(對(duì)于MB231，16％以及對(duì)于MB453，22％)，而抗IL-20R1在兩種細(xì)胞系中顯著減少殺傷(p＜0.01)不低于60％(圖28A)。組合兩種受體中和抗體進(jìn)一步顯著地減少殺傷至與對(duì)照相當(dāng)?shù)乃健Ｊ褂每惯@些受體的特異性抗體和FACS分析進(jìn)行檢查IL-20R1和IL-22R1的細(xì)胞表面表達(dá)的研究。結(jié)果顯示IL-20R1染色幾乎比IL-22R1染色高4倍，表明IL-20R1在細(xì)胞表面更豐富或抗IL-22R1抗體比抗IL-20R1具有更低的結(jié)合親和力(表6)。陽(yáng)性對(duì)照MeWo黑素瘤細(xì)胞系表達(dá)高水平的兩種細(xì)胞表面IL-20R1和IL-22R1受體亞基，而這些受體的水平在A549(肺癌細(xì)胞)細(xì)胞上非常低。5.IL-24，但非其他IL-10家族成員，在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)劑量依賴(lài)性細(xì)胞凋亡為了評(píng)估由IL-24蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的機(jī)制，使用膜聯(lián)蛋白V測(cè)定法評(píng)估暴露于IL-24蛋白后乳腺腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。通過(guò)Western印跡法就穩(wěn)定狀態(tài)的IL-24蛋白水平分析平行培養(yǎng)上清液。使用IL-24蛋白處理乳腺腫瘤系導(dǎo)致顯著的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)，細(xì)胞凋亡的不斷增加的水平直接與IL-24的劑量相關(guān)(圖28B)。對(duì)于其他IL-10家族細(xì)胞因子未觀察到該結(jié)果。就抗乳腺腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)估IL-10、IL-19、IL-20和IL-22，但這些因子中沒(méi)有一個(gè)誘導(dǎo)高于背景水平的細(xì)胞死亡(圖29A)。在乳腺癌細(xì)胞中，盡管IL-10和所有其他家族成員都可激活STAT3，但I(xiàn)L-24是唯一的具有直接細(xì)胞毒性特征的家族成員。6.IL-10拮抗由IL-24介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用因?yàn)橐郧暗难芯孔C明IL-10在PBMC中阻止由IL-24誘導(dǎo)的IL-6、干擾素、TNF和其他細(xì)胞因子的表達(dá)(Caudell等人，2002；Wang等人，2002)，所以進(jìn)行研究以評(píng)估IL-10和IL-24在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖中是否相互拮抗。為確定IL-10是否可調(diào)節(jié)IL-24誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制，用相同量的IL-24蛋白和增加量的重組IL-10處理MDA-MB231和MDA-MB453細(xì)胞。結(jié)果顯示IL-10劑量依賴(lài)性的方式顯著抑制IL-24蛋白誘導(dǎo)的殺傷作用(圖29B)。單獨(dú)的IL-10不刺激細(xì)胞增殖或殺死乳腺癌細(xì)胞系(圖29A)。作為特異性的另外的對(duì)照，將IL-10煮沸以阻斷其活性。IL-10的煮沸消除了其抑制通過(guò)IL-24介導(dǎo)的殺傷作用的能力(圖29B)。實(shí)施例9貝伐單抗增強(qiáng)Ad-mda7介導(dǎo)的抗肺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性A.材料和方法1.重組腺病毒載體如以前所報(bào)道的(Mhashilkar等人，2001；Saeki等人，2000)構(gòu)建和純化Ad-mda7和Ad-螢光素酶(luc)載體。使用攜帶GFP的腺病毒載體(Ad-GFP)確定對(duì)于細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。當(dāng)用3000vp/細(xì)胞進(jìn)行感染時(shí)，各細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大于80。用合適的病毒顆粒處理細(xì)胞。2.細(xì)胞培養(yǎng)和試劑。如以前所描述的(Saeki等人，2000)培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299和A549。HUVEC購(gòu)自clonetics(Walkersville，MD)并保持在由廠商以bullet試劑盒提供的具有5％胎牛血清和其他試劑的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。在第3至8代時(shí)使用內(nèi)皮細(xì)胞。3.細(xì)胞增殖測(cè)定法。為確定非細(xì)胞毒性劑量，進(jìn)行劑量滴定研究。根據(jù)該初步研究，在長(zhǎng)達(dá)4天中1000vp/細(xì)胞的Ad-mda對(duì)肺腫瘤細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性而2000和3000vp/細(xì)胞的劑量具有細(xì)胞毒性?；谶@些結(jié)果以1000vp/細(xì)胞使用Ad-luc或Ad-mda7進(jìn)行下述所有隨后的測(cè)定。將腫瘤細(xì)胞(H1299和A549)接種在6孔板(2×105個(gè)細(xì)胞/孔)中并用表達(dá)螢光素酶(luc)基因(Ad-luc)或Ad-mda7(1000個(gè)病毒顆粒[vp]/細(xì)胞)的腺病毒載體進(jìn)行處理。用PBS處理的細(xì)胞用作對(duì)照。在圖中所列的不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞并將其接受先前所描述的細(xì)胞生存力測(cè)定法(Saeki等人，2000)。為分析來(lái)自Ad-mda7處理的H1299的條件培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)接種在6孔板(3×105個(gè)細(xì)胞/孔)中。在溫育后24小時(shí)，用從用PBS、Ad-luc或Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。將HUVEC再溫育3天，然后收獲細(xì)胞并將其接受細(xì)胞生存力測(cè)定(Ramesh等人，2003；Mhashilkar等人，2001)。在分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)組中，用來(lái)自Ad-mda7處理的細(xì)胞的包含重組人VEGF165的條件培養(yǎng)基或抗MDA-7抗體(10μg/ml；IntrogenTherapeutics，Houston，TX)處理HUVEC，然后如上所述確定細(xì)胞生存力。4.Western印跡法。在處理后指定的時(shí)間點(diǎn)收獲用PBS、Ad-luc或Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞。如先前所述(Mhashilkar等人，2001；Saeki等人，2000)收集細(xì)胞裂解物并通過(guò)western印跡法分析進(jìn)行分析。將下列抗人一抗用于檢測(cè)VEGFR2(Chemicon，Temecula，CA)、磷酸化VEGFR2(pVEGFR2，Y1214；Biosource，Camarillo，CA)、VEGF(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)、β肌動(dòng)蛋白(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)、AKT、磷酸化AKT(pAKT)、胱天蛋白酶-3(CellSignalingTechnologyInc.，Beverly，CA)和MDA-7(IntrogenTherapeutics)。5.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。將腫瘤細(xì)胞接種在6孔板中并用PBS、Ad-luc或Ad-mda7(1000vp/細(xì)胞)進(jìn)行處理。在處理后48小時(shí)和72小時(shí)收集條件培養(yǎng)基，然后將其在13,000rpm下離心15分鐘以除去細(xì)胞碎片。使用商購(gòu)可獲得的ELISA試劑盒(QuantikinehumanVEGF，R&DSystems)以三份重復(fù)就人VEGF分析上清液。按照廠商的方案進(jìn)行所述測(cè)定，確定VEGF濃度。Ad-luc或Ad-mda7處理的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的VEGF濃度表示為相對(duì)于PBS處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中的VEGF濃度的抑制百分比。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)3次并將結(jié)果表示為3個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)的平均值。6.Src激酶測(cè)定。如先前所述(Boyd等人，2004)進(jìn)行Src激酶測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，在放射免疫沉淀分析緩沖液中制備來(lái)自PBS、Ad-luc和Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞裂解物，然后將其與抗c-Src單克隆抗體327(OncogeneScienceInc.，Cambridge，MA)反應(yīng)。用兔抗鼠IgG和福爾馬林固定的Pandorbin形成免疫復(fù)合物。通過(guò)加入10μCi的[γ-32P]ATP、10mMMg2+、10μg的兔肌肉烯醇化酶(Sigma)和100μM20mMHEPES中配制的原釩酸鈉起始激酶反應(yīng)。用十二烷基硫酸鈉終止反應(yīng)。在8％的聚丙烯酰胺凝膠中分離放射性標(biāo)記的蛋白產(chǎn)物，然后將其接受放射自顯影術(shù)。使用密度計(jì)對(duì)印跡進(jìn)行半定量分析，將所述值表示為相對(duì)于PBS的抑制百分比。7.VEGF受體激活測(cè)定。將HUVEC接種在6孔板(5×105/孔)中，然后用包含1％FBS的無(wú)生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基使所述細(xì)胞肌餓過(guò)夜。第2天，用從用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Ad-mda7+抗MDA7抗體、Ad-mda7+重組人VEGF(rhVEGF)處理的腫瘤細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。在不同的實(shí)驗(yàn)組中，也用用Avastin、Avastin+Ad-luc和Avastin+Ad-mda7處理的條件培養(yǎng)基處理細(xì)胞。未向其中加入條件培養(yǎng)基的HUVEC用作對(duì)照。在加入條件培養(yǎng)基后第5、10和60分鐘收獲細(xì)胞，制備細(xì)胞裂物并通過(guò)western印跡法分析VEGF受體的磷酸化和AKT(VEGF受體的下游靶)的磷酸化。8.體內(nèi)分析為確定Ad-mda7+貝伐單抗組合是否在體內(nèi)增強(qiáng)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)抑制，將H1299腫瘤細(xì)胞(5×106)經(jīng)皮下注射入無(wú)胸腺BALB/c雌性裸鼠(n＝50)的右下脅腹。將小鼠分組且當(dāng)腫瘤大小達(dá)到50至100mM3時(shí)如下進(jìn)行處理PBS(n＝8)、Ad-luc(n＝8)、Ad-mda7(n＝8)、貝伐單抗(n＝9)、Ad-luc+貝伐單抗(n＝8)、Ad-mda7+貝伐單抗(n＝9)。每周用Ad-luc或Ad-mda7皮下(1×1010vp/劑)處理小鼠2次。每周腹膜內(nèi)提供貝伐單抗(100ug/身體)2次。如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)每周稱(chēng)取動(dòng)物體重和每周測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)3次。在第一次處理后第28天，通過(guò)CO2吸入殺死所有動(dòng)物，收集腫瘤以進(jìn)行組織病理學(xué)檢查和Western印跡分析。進(jìn)行2組不同的實(shí)驗(yàn)。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，使用Student’st檢驗(yàn)和方差分析計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。顯著性水平設(shè)置在P＜0.05。B.結(jié)果1.Ad-mda7在NSCLC中以不依賴(lài)于其殺傷效應(yīng)的方式抑制VEGF將H1299和A549培養(yǎng)在6孔組織培養(yǎng)板(2×105)中，然后用1000VP/細(xì)胞的Ad-mda7進(jìn)行處理。用PBS和Ad-luc(1000vp/細(xì)胞)處理細(xì)胞并將其用作對(duì)照。在處理后48小時(shí)和72小時(shí)收集細(xì)胞提取物和培養(yǎng)上清液。與PBS和Ad-luc相比，Ad-mda7在兩種NSCLC中顯著減少VEGF的表達(dá)(圖30A)。且觀察到MDA-7蛋白的表達(dá)是時(shí)間依賴(lài)性的。細(xì)胞生存力測(cè)定顯示1000vp/細(xì)胞的Ad-mda7在處理后長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)不顯示對(duì)兩種肺癌細(xì)胞系的任何殺傷作用(圖31A-B)。培養(yǎng)物上清液中的VEGF的分析顯示與Ad-luc相比，Ad-mda7在兩種NSCLC中顯著抑制VEGF(圖30B，圖31B)。這些數(shù)據(jù)表明Ad-mda7不依賴(lài)于其抗腫瘤細(xì)胞的毒性效應(yīng)在NSCLC中抑制VEGF的表達(dá)。2.Ad-mda7在NSCLC中下調(diào)Src激活。以前的幾個(gè)研究已顯示c-Src(非受體激酶)在調(diào)控VEGF的表達(dá)中起著重要作用且已報(bào)道Src的高表達(dá)與增加的VEGF表達(dá)相關(guān)(Inoue等人，2005；Irby和Yeatman，2000；Bromann等人，2004)?；谶@些報(bào)道我們通過(guò)Src激酶測(cè)定來(lái)檢查在NSCL中Ad-mda7介導(dǎo)的VEGF抑制是否涉及c-Src。將H1299和A549細(xì)胞接種在6孔板中并在用PBS、Ad-luc和Ad-mda7處理后48小時(shí)收集裂解物。使用激酶檢測(cè)試劑盒分析Src活性。Ad-mda7在兩種NSCLC中顯著減少Src的活性(圖32)。該數(shù)據(jù)表明Ad-mda7抑制Src活性導(dǎo)致肺癌細(xì)胞中VEGF的下調(diào)。3.肺腫瘤細(xì)胞中MDA-7介導(dǎo)的VEGF抑制影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖和VEGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已顯示VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和存活的至關(guān)重要的生長(zhǎng)因子(Gerber等人，1998)。因此VEGF的抑制應(yīng)當(dāng)促使內(nèi)皮細(xì)胞死亡。為調(diào)查腫瘤細(xì)胞減少的VEGF產(chǎn)量是否影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，就VEGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)HUVEC進(jìn)行細(xì)胞生存力檢測(cè)和Western印跡分析。當(dāng)數(shù)據(jù)以相對(duì)于PBS組的抑制百分比表示時(shí)，與用來(lái)自Ad-luc處理的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理相比(圖33A)，使用從Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基處理HUVEC顯示顯著的細(xì)胞增殖抑制作用(圖33A)。為進(jìn)一步評(píng)估HUVEC增殖的抑制是否是由于減少的VEGF造成的，如上所述處理血清饑餓的HUVEC并就VEGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)其進(jìn)行分析。此外，加入過(guò)量體積的抗MDA7中和抗體以排除MDA-7蛋白的分泌形式可能影響HUVEC增殖的可能性。當(dāng)用來(lái)自PBS和Ad-luc處理的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理HUVEC時(shí)，VEGFR2和AKT(VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游靶)被磷酸化。無(wú)論在哪里，在MDA7中和抗體存在或不存在的情況下在用來(lái)自用Ad-mda7處理的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的HUVEC中未觀察到VEGFR2和AKT的激活。向來(lái)自Ad-mda7處理的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中加入rhVEGF165則恢復(fù)VEGFR2和AKT的激活(圖33B)。4.Ad-mda7不顯示對(duì)HUVEC的任何殺傷效應(yīng)且Avastin抑制HUVEC細(xì)胞增殖但不影響H1299細(xì)胞的增殖進(jìn)行研究以調(diào)查Ad-mda7和貝伐單抗組合是否有效地抗肺癌。為評(píng)估Ad-mda7和貝伐單抗抗腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的毒性，進(jìn)行細(xì)胞生存力測(cè)定。將H1299細(xì)胞(2×105/孔)和HUVEC(3×105/孔)接種在6孔板中。第2天，分別用PBS、Ad-luc(1000vp/細(xì)胞)、Ad-mda7(1000vp/細(xì)胞)和貝伐單抗(0.78ug/ml、1.56ug/ml、3,125ug/mi)、Ad-luc+貝伐單抗和Ad-mda7+貝伐單抗處理細(xì)胞。在處理后48小時(shí)和73小時(shí)，用胰蛋白酶處理細(xì)胞并使用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞排斥測(cè)定法進(jìn)行分析。與先前的數(shù)據(jù)相一致，1000vp/細(xì)胞的Ad-mda7對(duì)H1299和HUVEC未顯示任何毒性。雖然貝伐單抗抑制HUVEC的生存力，然而貝伐單抗未顯示對(duì)H1299的有害效應(yīng)(圖34).5.肺腫瘤細(xì)胞中MDA-7對(duì)VEGF的抑制和Avastin影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖當(dāng)數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于PBS組的抑制百分比時(shí)(圖35)，與使用來(lái)自Ad-luc處理的腫瘤細(xì)胞的處理相比，使用從Ad-mda7處理的腫瘤細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基處理HUVEC顯示細(xì)胞增殖的顯著抑制(P＝＜0.05；圖34)。6.當(dāng)將Ad-mda7和貝伐單抗組合時(shí)，對(duì)HUVEC的VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷被顯著增強(qiáng)為評(píng)估Ad-mda7與貝伐單抗一起是否在HUVEC中增強(qiáng)對(duì)VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制效應(yīng)，除了將Ad-mda7和貝伐單抗組合外，進(jìn)行如上所述的相同組的實(shí)驗(yàn)。同樣，來(lái)自PBS和Ad-luc處理的腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基激活VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在用來(lái)自Ad-mda7處理的細(xì)胞和貝伐單抗處理的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的HUVEC中觀察到較少的VEGFR2和AKT的激活。此外，貝伐單抗處理的上清液對(duì)HUVEC中VEGFR2和AKT激活的抑制效應(yīng)與Ad-mda7處理的和Ad-luc+貝伐單抗處理的上清液的所述效應(yīng)相似。當(dāng)用用Ad-mda7+貝伐單抗處理的培養(yǎng)物上清液處理HUVEC時(shí)，VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活被顯著減少(圖36)。7.Ad-mda7+貝伐單抗組合在體內(nèi)增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)抑制為評(píng)估Ad-mda7+貝伐單抗組合處理是否增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)抑制，使用異種移植物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。與用PBS、Ad-luc、貝伐單抗或Ad-luc+貝伐單抗處理的小鼠相比，用Ad-mda7+貝伐單抗處理的小鼠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。而且，未觀察到與各藥劑或組合相關(guān)的不良作用例如體重減輕、發(fā)病或死亡，表明所有處理都是可耐受的。為檢查腫瘤抑制的分子機(jī)制，在最后一次處理后24小時(shí)對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，然后收集腫瘤樣品并快速冷凍或固定在福爾馬林中。從快速冷凍腫瘤組織提取總蛋白并通過(guò)Western印跡分析就VEGF、MDA-7和胱天蛋白酶-3對(duì)其進(jìn)行分析。成功地將mda-7基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞。Ad-mda7處理抑制腫瘤樣品中的VEGF，而PBS和Ad-luc不抑制其(圖37)。當(dāng)用Ad-mda7+貝伐單抗處理腫瘤時(shí)，VEGF的表達(dá)顯著減少。此外，在用Ad-mda7處理的腫瘤中觀察到斷裂的胱天蛋白酶-3。有趣的是，當(dāng)用Ad-mda7+貝伐單抗處理腫瘤時(shí)，觀察到更多的胱天蛋白酶-3裂解。就MDA-7、VEGF、CD31和TUNEL對(duì)腫瘤組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析顯示來(lái)自用AD-mda7和貝伐單抗處理的小鼠的腫瘤顯示，與所有其他處理組相比，VEGF、CD31顯著減少且TUNEL陽(yáng)性染色增加。此外，觀察到的效應(yīng)與MDA-7蛋白表達(dá)相關(guān)?？傊?，Ad-mda7在NSCLC中通過(guò)抑制Src激酶的活性來(lái)抑制VEGF。當(dāng)Ad-mda7和貝伐單抗組合時(shí)，顯著增強(qiáng)對(duì)HUVEC的VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷。肺腫瘤細(xì)胞中MDA-7介導(dǎo)的VEGF抑制影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖和VEGF受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ad-mda7+貝伐單抗的組合在體內(nèi)增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)抑制。Ad-mda7+貝伐單抗的組合在體內(nèi)增強(qiáng)對(duì)VEGF的抑制效應(yīng)和腫瘤細(xì)胞凋亡。實(shí)施例10Ad-mda7+TNFα處理增強(qiáng)對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞的殺傷作用A.材料和方法1.重組腺病毒載體由IntrogenTherapeutics，Inc，Houston，Texas構(gòu)建、純化和提供Ad-mda7和Ad-螢光素霉(luc)載體。2.轉(zhuǎn)導(dǎo)效率使用攜帶GFP(Ad-GFP)的腺病毒載體確定前列腺癌細(xì)胞系LNCaP。將細(xì)胞接種在6孔板中并用不同劑量的Ad-GFP(100、300、600和1200vp/細(xì)胞)處理。隨后不處理或用重組人TNFα蛋白(10ng/ml)處理經(jīng)Ad-GFP處理的細(xì)胞。在TNFα處理后24小時(shí)通過(guò)胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，用PBS洗滌3次，重懸浮于PBS中，然后將其接受FACS分析。用PBS處理的細(xì)胞用作對(duì)照。3.細(xì)胞培養(yǎng)和試劑。如ATCC所推薦的培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和DU145。4.細(xì)胞增殖測(cè)定法。將腫瘤細(xì)胞(LNCaP)接種在6孔(5×104)或96孔板(2×103個(gè)細(xì)胞/孔)，然后將表達(dá)螢光素酶(luc)基因(Ad-luc)或Ad-mda7(1500-2000個(gè)病毒顆粒[vp]/細(xì)胞)的腺病毒載體單獨(dú)地或與TNFα(5ng/ml)組合處理所述細(xì)胞。用PBS處理的細(xì)胞用作對(duì)照。在處理后48和72小時(shí)，使用先前描述的XTT方法使細(xì)胞接受細(xì)胞生存力測(cè)定。5.Western印跡法在處理后24小時(shí)收獲用Ad-mda7(1000-2000vp/細(xì)胞)、Ad-mda7+TNFα(10-20ng/ml)或Ad-mda7+抗TNFα抗體(0.5-1ug/ml)處理的腫瘤細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解物并就MDA-7蛋白的表達(dá)通過(guò)western印跡法對(duì)其進(jìn)行分析。6.細(xì)胞周期將腫瘤細(xì)胞(LNCaP)接種在6孔板中并用Ad-mda7或Ad-luc(1500vp/細(xì)胞)、Ad-mda7+TNFα(10ng/ml)、Ad-mda7+抗TNF抗體(1ug/ml)、Ad-luc+TNFα或Ad-luc+抗TNF抗體進(jìn)行處理。在處理后48小時(shí)收獲細(xì)胞并就SubG0/G1期的細(xì)胞數(shù)目通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。用PBS處理的細(xì)胞用作對(duì)照。B.結(jié)果1.Ad-mda7+TNF-α處理增強(qiáng)前列腺腫瘤細(xì)胞殺傷用PBS、TNFα、Ad-Luc、Ad-mda7、Ad-luc+TNF或Ad-mda7+TNF處理前列腺腫瘤(LNCaP)腫瘤細(xì)胞。以2000vp/細(xì)胞進(jìn)行病毒處理和以5ng/ml進(jìn)行TNF處理。在處理后48小時(shí)在明視野顯微鏡下顯現(xiàn)細(xì)胞。與其他處理組相比，用Ad-mda7+TNF處理的細(xì)胞顯示顯著的細(xì)胞增殖抑制。2.Ad-mda7+TNFα處理抑制腫瘤細(xì)胞增殖用PBS、TNFα、Ad-Luc、d-mda7、Ad-luc+TNF或Ad-mda7+TNF處理前列腺腫瘤(LNCaP)腫瘤細(xì)胞。以1500vp/細(xì)胞進(jìn)行病毒處理和以5ng/ml進(jìn)行TNF處理。在處理后48小時(shí)和72小時(shí)將細(xì)胞接受XTT測(cè)定以確定細(xì)胞生存力。與其他處理組相比，用Ad-mda7+TNF處理的細(xì)胞顯示顯著的生長(zhǎng)抑制(圖37)。所述抑制效應(yīng)是協(xié)同性的。3.Ad-mda7+TNFα處理增加外源MDA-7蛋白表達(dá)用Ad-mda7(1000-2000vp/細(xì)胞)、Ad-mda7+TNFα(10-20ng/ml)和Ad-mda7+抗TNF抗體(0.5-1ug/ml)處理接種在6孔板中的前列腺腫瘤細(xì)胞(LNCaP和DU145)。在處理后24小時(shí)收獲細(xì)胞并就MDA-7蛋白的表達(dá)通過(guò)western印跡法對(duì)其進(jìn)行分析。用Ad-mda7(2000vp/細(xì)胞)處理的LNCaP顯示MDA-7表達(dá)。然而，用Ad-mda7+TNFα(20ng/ml)處理的細(xì)胞顯示外源MDA-7蛋白表達(dá)的顯著增加，其在抗TNF抗體(0.5ug/ml)存在的情況下被抑制。用Ad-mda7(1500vp/細(xì)胞)處理的LNCaP和DU145細(xì)胞顯示MDA-7的表達(dá)。然而，用Ad-mda7+TNFα(10ng/ml)處理的細(xì)胞顯示外源MDA-7蛋白表達(dá)的顯著增加，其在抗TNF抗體(1.0ug/ml)存在的情況下被消除。4.TNFα增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在TNFα(10ng/ml)存在或不存在的情況下用100、300、600和1200vp/細(xì)胞的Ad-GFP處理腫瘤(LNCaP)細(xì)胞。不接受處理的細(xì)胞用作對(duì)照。在TNFα處理后24小時(shí)收獲細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，重懸浮于500ulPBS中并將其接受FACS分析。單獨(dú)用Ad-GFP處理的細(xì)胞顯示始于73.5％(對(duì)于100vp/細(xì)胞的Ad-GFP)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的劑量依賴(lài)性增加(圖38)。然而，在TNFα存在的情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增加且觀察到對(duì)100vp/細(xì)胞的Ad-GFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為92.8％。在TNFα存在的情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)的增加似乎從300vp/細(xì)胞的Ad-GFP起飽和。5.Ad-mda7+TNFα處理導(dǎo)致SubG0/G1期的細(xì)胞數(shù)目增加用PBS、TNFα(10ng/ml)、Ad-Luc(1500vp/細(xì)胞)、Ad-mda7(1500vp/細(xì)胞)、Ad-luc+TNF、Ad-mda7+TNF、Ad-luc+抗TNF抗體(1ug/ml)或Ad-mda7+抗TNF抗體處理腫瘤(LNCaP)細(xì)胞。在處理后48小時(shí)收獲細(xì)胞，用PBS洗滌3次，重懸浮于500ul包含碘化丙啶的PBS(0.5ug/ml)中。將細(xì)胞接受FACS分析。與其他處理組(范圍從0.45％至26.3％)相比，觀察到大量用Ad-mda7+TNF處理的細(xì)胞處于在標(biāo)志凋亡細(xì)胞的SubG0/G1期(70％)。********在本公開(kāi)內(nèi)容的教導(dǎo)下，可制備和實(shí)施此處公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和方法而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。盡管已以優(yōu)選的實(shí)施方案的方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很明顯的是可對(duì)此處描述的組合物和方法以及在所述方法的步驟中或所述方法的步驟的順序中產(chǎn)生變化而不背離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更特別地，很明顯的是可用化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些試劑替代此處描述的試劑而仍可獲得相同或相似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的所有這些相似的替代物和修飾被認(rèn)為在所附的權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)，就其提供示例性程序或?yàn)榇颂幯a(bǔ)充其他詳細(xì)內(nèi)容的程度，特別地以參考引用方式并入本文。美國(guó)專(zhuān)利4,196,265美國(guó)專(zhuān)利4,262,017美國(guó)專(zhuān)利4,554,101美國(guó)專(zhuān)利4,797,368美國(guó)專(zhuān)利4,870,287美國(guó)專(zhuān)利5,139,941美國(guó)專(zhuān)利5,179,122美國(guó)專(zhuān)利5,187,260美國(guó)專(zhuān)利5,399,363美國(guó)專(zhuān)利5,466,468美國(guó)專(zhuān)利5,543,158美國(guó)專(zhuān)利5,641,515美國(guó)專(zhuān)利5,739,169美國(guó)專(zhuān)利5,760,395美國(guó)專(zhuān)利5,801,005美國(guó)專(zhuān)利5,824,311美國(guó)專(zhuān)利5,830,880美國(guó)專(zhuān)利5,846,225美國(guó)專(zhuān)利5,846,233美國(guó)專(zhuān)利5,846,945美國(guó)專(zhuān)利6,858,227美國(guó)申請(qǐng)09/575,473美國(guó)申請(qǐng)09/615,154美國(guó)申請(qǐng)10/017,472美國(guó)申請(qǐng)10/378,590美國(guó)申請(qǐng)10/391,068美國(guó)申請(qǐng)10/791,692美國(guó)申請(qǐng)10/791,692美國(guó)申請(qǐng)60/661,680美國(guó)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A-7核酸組合物。10.權(quán)利要求2的方法，其中所述MDA-7核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。12.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給患者提供MDA-7。13.權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用純化的MDA-7蛋白組合物。14.權(quán)利要求1的方法，其中給患者提供包含COX-2抑制劑和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。15.權(quán)利要求1的方法，其中在提供COX-2抑制劑前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。16.權(quán)利要求15的方法，其中在提供COX-2抑制劑前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。17.權(quán)利要求15的方法，其中在提供COX-2抑制劑之前給患者提供MDA-7。18.權(quán)利要求15的方法，其中在提供MDA-7之前給患者提供COX-2抑制劑。19.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)給患者施用COX-2抑制劑來(lái)給所述患者提供COX-2抑制劑。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述COX-2抑制劑是塞來(lái)考昔、羅非考昔、伐地考昔、lumiracoxib或艾托考昔或其組合。21.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)給患者施用COX-2抑制劑前體藥物來(lái)給所述患者提供COX-2抑制劑。22.權(quán)利要求19或21的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用COX-2抑制劑或COX-2抑制劑前體藥物。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。24.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥包含上皮癌細(xì)胞。25.權(quán)利要求1的方法，其還包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。26.權(quán)利要求25的方法，其中使患者接受放射療法。27.權(quán)利要求26的方法，其中在提供MDA-7和COX-2抑制劑各自至少一次之后使患者接受放射療法。28.權(quán)利要求27的方法，其中使患者接受亞致死劑量的放射療法。29.權(quán)利要求1的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。30.權(quán)利要求29的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或COX-2抑制劑。31.權(quán)利要求30的方法，其中至少通過(guò)對(duì)所得的瘤床施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7和/或COX-2抑制劑。32.權(quán)利要求1的方法，其中多次給患者提供MDA-7和/或COX-2抑制劑。33.用于在患者中治療乳腺癌的方法，其包括給患者施用i)包含編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體，其中所述核酸序列在能夠在該患者中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下；和，ii)COX-2抑制劑。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述患者呈HER-2/neu陰性。35.權(quán)利要求33的方法，其還包括切除患者的一個(gè)或多個(gè)腫瘤的全部或部分。36.權(quán)利要求33的方法，其中所述腺病毒載體和COX-2抑制劑存在于一種或多種藥物可接受的組合物中。37.權(quán)利要求33的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。38.權(quán)利要求33的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。39.權(quán)利要求33的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用腺病毒載體和/或COX-2抑制劑。40.權(quán)利要求33的方法，其中在施用COX-2抑制劑前后24小時(shí)內(nèi)給所述患者施用腺病毒載體。41.權(quán)利要求40的方法，其中在提供COX-2抑制劑前后2小時(shí)內(nèi)給所述患者施用腺病毒載體。42.權(quán)利要求33的方法，其中在施用COX-2抑制劑之前給患者施用腺病毒載體。43.權(quán)利要求33的方法，其中在施用腺病毒載體之前給患者提供COX-2抑制劑。44.權(quán)利要求33的方法，其中所述COX-2抑制劑是塞來(lái)考昔、羅非考昔、伐地考昔、lumiracoxib或艾托考昔或其組合。45.權(quán)利要求33的方法，其還包括使患者接受放射療法、化學(xué)療法和/或免疫療法。46.權(quán)利要求33的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。47.權(quán)利要求46的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或COX-2抑制劑。48.權(quán)利要求30的方法，其中給患者施用腺病毒和/或向所得的瘤床施用COX-2抑制劑。49.權(quán)利要求33的方法，其中多次給患者施用腺病毒和/或COX-2抑制劑。50.用于使癌細(xì)胞輻射敏化的方法，其包括給所述細(xì)胞提供一定量MDA-7和COX-2抑制劑。51.權(quán)利要求50的方法，其還包括使癌細(xì)胞接受輻射。52.權(quán)利要求51的方法，其中使所述癌細(xì)胞接受亞致死劑量的輻射。53.藥物組合物，其包含a)COX-2抑制劑或COX-2抑制劑前體藥物；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。54.權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。55.權(quán)利要求54的藥物組合物，其中所述核酸是腺病毒載體。56.權(quán)利要求54的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含COX-2抑制劑。57.權(quán)利要求56的藥物組合物，其中所述COX-2抑制劑是塞來(lái)考昔。58.包含i)具有編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體和ii)COX-2抑制劑的藥物組合物，其中所述核酸序列有效連接至啟動(dòng)子。59.用于治療乳腺癌細(xì)胞的方法，其包括給患者提供MDA-7和COX-2抑制劑。60.用于在患者中治療癌癥的方法，其包括給患者提供MDA-7和Hsp90抑制劑。61.權(quán)利要求60的方法，其中通過(guò)給患者施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7，所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表達(dá)。62.權(quán)利要求61的方法，其中所述組合物是藥物可接受的組合物。63.權(quán)利要求61的方法，其中所述核酸存在于載體中。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述載體是病毒載體。65.權(quán)利要求64的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至1013個(gè)病毒顆粒。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述載體是腺病毒載體。67.權(quán)利要求66的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。68.權(quán)利要求61的方法，其中經(jīng)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用MDA-7核酸組合物。69.權(quán)利要求61的方法，其中所述MDA-7核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。71.權(quán)利要求60的方法，其中通過(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7。72.權(quán)利要求71的方法，其中經(jīng)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用純化的MDA-7蛋白組合物。73.權(quán)利要求60的方法，其中給患者提供包含Hsp90抑制劑和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。74.權(quán)利要求60的方法，其中在提供Hsp90抑制劑前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。75.權(quán)利要求74的方法，其中在提供Hsp90抑制劑前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。76.權(quán)利要求74的方法，其中在提供Hsp90抑制劑之前給患者提供MDA-7。77.權(quán)利要求74的方法，其中在提供MDA-7之前給患者提供Hsp90抑制劑。78.權(quán)利要求60的方法，其中通過(guò)給患者施用Hsp90抑制劑來(lái)給患者提供Hsp90抑制劑。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述Hsp90抑制劑是格爾德霉素、或其衍生物或類(lèi)似物、或其組合。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述Hsp90抑制劑是格爾德霉素類(lèi)似物。81.權(quán)利要求80的方法，其中所述格爾德霉素類(lèi)似物是17-AAG。82.權(quán)利要求60的方法，其中通過(guò)給患者施用Hsp90抑制劑前體藥物來(lái)給所述患者提供Hsp90抑制劑。83.權(quán)利要求78的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用Hsp90抑制劑或Hsp90抑制劑前體藥物。84.權(quán)利要求60的方法，其中所述癌癥是黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。85.權(quán)利要求60的方法，其中所述癌癥包含上皮癌細(xì)胞。86.權(quán)利要求60的方法，其還包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。87.權(quán)利要求60的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。88.權(quán)利要求87的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制劑。89.權(quán)利要求88的方法，其中至少通過(guò)向所得的瘤床施用組合物來(lái)給患者提MDA-7和/或Hsp90抑制劑。90.權(quán)利要求60的方法，其中多次給患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制劑。91.用于在患者中治療肺癌的方法，其包括給患者施用i)包含編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體，其中所述核酸序列在能夠在該患者中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下；和，ii)Hsp90抑制劑。92.權(quán)利要求91的方法，其還包括切除患者的一個(gè)或多個(gè)腫瘤的全部或部分。93.權(quán)利要求91的方法，其中所述腺病毒載體和Hsp90抑制劑存在于一種或多種藥物可接受的組合物中。94.權(quán)利要求91的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。95.權(quán)利要求91的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。96.權(quán)利要求91的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管和/或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用腺病毒載體和/或Hsp90抑制劑。97.權(quán)利要求91的方法，其中在施用Hsp90抑制劑前后24小時(shí)內(nèi)給患者施用腺病毒載體。98.權(quán)利要求97的方法，其中在施用Hsp90抑制劑前后2小時(shí)內(nèi)給患者施用腺病毒載體。99.權(quán)利要求91的方法，其中在施用Hsp90抑制劑之前給患者施用腺病毒載體。100.權(quán)利要求91的方法，其中在施用腺病毒載體之前給患者提供Hsp90抑制劑。101.權(quán)利要求91的方法，其中所述Hsp90抑制劑是格爾德霉素、或其衍生物或類(lèi)似物、或其組合。102.權(quán)利要求91的方法，其還包括使患者接受放射療法、化學(xué)療法和/或免疫療法。103.權(quán)利要求91的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。104.權(quán)利要求103的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制劑。105.權(quán)利要求88的方法，其中給患者施用腺病毒和/或向所得的瘤床施用Hsp90抑制劑。106.權(quán)利要求91的方法，其中多次給患者施用腺病毒和/或Hsp90抑制劑。107.藥物組合物，其包含a)Hsp90抑制劑或Hsp90抑制劑前體藥物；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。108.權(quán)利要求107的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。109.權(quán)利要求108的藥物組合物，其中所述核酸是腺病毒載體。110.權(quán)利要求108的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含Hsp90抑制劑。111.權(quán)利要求110的藥物組合物，其中所述Hsp90抑制劑是格爾德霉素或17-GAA。112.包含i)具有編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體和ii)Hsp90抑制劑的藥物組合物，其中所述核酸序列有效連接至啟動(dòng)子。113.用于治療肺癌細(xì)胞的方法，其包括給患者提供MDA-7和Hsp90抑制劑。114.用于在患者中治療癌癥的方法，其包括給患者提供MDA-7和MDA-7聯(lián)合劑。115.權(quán)利要求114的方法，其中所述聯(lián)合劑是COX-2抑制劑。116.權(quán)利要求114的方法，其中所述聯(lián)合劑是Hsp90抑制劑。117.權(quán)利要求114的方法，其中所述聯(lián)合劑是維生素E化合物。118.用于在患者中治療癌癥的方法，其包括給患者提供MDA-7和維生素E化合物。119.權(quán)利要求118的方法，其中通過(guò)給患者施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7，所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表達(dá)。120.權(quán)利要求119的方法，其中所述組合物是藥物可接受的組合物。121.權(quán)利要求119的方法，其中所述核酸存在于載體中。122.權(quán)利要求121的方法，其中所述載體是病毒載體。123.權(quán)利要求122的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。124.權(quán)利要求122的方法，其中所述載體是腺病毒載體。125.權(quán)利要求124的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。126.權(quán)利要求119的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用MDA-7核酸組合物。127.權(quán)利要求119的方法，其中所述MDA-7核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。128.權(quán)利要求127的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。129.權(quán)利要求118的方法，其中通過(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給患者提供MDA-7。130.權(quán)利要求129的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用純化的MDA-7蛋白組合物。131.權(quán)利要求118的方法，其中對(duì)于每次治療給患者提供大約5至500mg的維生素E化合物。132.權(quán)利要求118的方法，其中以固體或干粉的形式給患者提供維生素E化合物。133.權(quán)利要求118的方法，其中以包含一種或多種脂質(zhì)體的組合物形式給患者提供維生素E化合物。134.權(quán)利要求118的方法，其中通過(guò)給患者施用包含生育酚或其酯化形式的組合物來(lái)給患者提供維生素E化合物。135.權(quán)利要求134的方法，其中所述生育酚是α生育酚。136.權(quán)利要求134的方法，其中所述酯化形式是生育酚醋酸酯或生育酚琥珀酸酯。137.權(quán)利要求136的方法，其中所述組合物包含α生育酚琥珀酸酯。138.權(quán)利要求118的方法，其中給患者提供組合物，所述組合物包含維生素E化合物，或其酯化形式，和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸。139.權(quán)利要求118的方法，其中在提供維生素E化合物前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。140.權(quán)利要求139的方法，其中在提供維生素E化合物前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。141.權(quán)利要求139的方法，其中在提供維生素E化合物之前給患者提供MDA-7。142.權(quán)利要求139的方法，其中在提供MDA-7之前給患者提供維生素E化合物。143.權(quán)利要求134的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用維生素E化合物。144.權(quán)利要求118的方法，其中所述癌癥是黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。145.權(quán)利要求118的方法，其中所述癌癥包含上皮癌細(xì)胞。146.權(quán)利要求118的方法，其還包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。147.權(quán)利要求118的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。148.權(quán)利要求147的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或維生素E化合物。149.權(quán)利要求148的方法，其中至少通過(guò)對(duì)所得的瘤床施用組合物來(lái)給患者提MDA-7和/或維生素E化合物。150.權(quán)利要求118的方法，其中多次給患者提供MDA-7和/或維生素E化合物。151.用于在患者中治療癌癥的方法，其包括給患者施用i)包含編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體，其中所述核酸序列處在能夠在該患者中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下；和，ii)α生育酚或α生育酚的酯化形式。152.權(quán)利要求151的方法，其中給患者施用α生育酚琥珀酸酯或α生育酚醋酸酯。153.權(quán)利要求151的方法，其還包括切除患者的一個(gè)或多個(gè)腫瘤的全部或部分。154.權(quán)利要求151的方法，其中所述腺病毒載體和α生育酚或α生育酚的酯化形式存在于一種或多種藥物可接受的組合物中。155.權(quán)利要求151的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。156.權(quán)利要求151的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。157.權(quán)利要求151的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管和/或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用腺病毒載體和/或α生育酚或α生育酚的酯化形式。158.權(quán)利要求151的方法，其中在施用α生育酚或α生育酚的酯化形式前后24小時(shí)內(nèi)給患者施用腺病毒載體。159.權(quán)利要求158的方法，其中在施用α生育酚或α生育酚的酯化形式前后2小時(shí)內(nèi)給患者施用腺病毒載體。160.權(quán)利要求151的方法，其中在施用α生育酚或α生育酚的酯化形式之前給患者施用腺病毒載體。161.權(quán)利要求151的方法，其中在施用腺病毒載體之前給患者提供α生育酚或α生育酚的酯化形式。162.權(quán)利要求151的方法，其還包括使患者接受放射療法、化學(xué)療法和/或免疫療法。163.權(quán)利要求151的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。164.權(quán)利要求163的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或α生育酚或α生育酚的酯化形式。165.權(quán)利要求148的方法，其中給患者施用腺病毒和/或施用α生育酚或α生育酚的酯化形式至所得的瘤床。166.權(quán)利要求151的方法，其中多次給患者施用腺病毒和/或α生育酚或α生育酚的酯化形式。167.藥物組合物，其包含a)維生素E化合物；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。168.權(quán)利要求167的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。169.權(quán)利要求168的藥物組合物，其中所述核酸是腺病毒載體。170.權(quán)利要求168的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含為α生育酚或其酯化形式的維生素E化合物。171.權(quán)利要求170的藥物組合物，其中所述α生育酚是α生育酚琥珀酸酯。172.包含i)具有編碼MDA-7的核酸序列的腺病毒載體和ii)α生育酚或α生育酚琥珀酸酯的藥物組合物，其中所述核酸序列有效連接至啟動(dòng)子。173.藥物組合物，其包含a)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸，和b)MDA-7聯(lián)合劑。174.用于在患者中治療或預(yù)防肺癌的方法，其包括給患者施用包含編碼MDA-7蛋白的多核苷酸、DOTAP和膽固醇的藥物可接受的組合物。175.權(quán)利要求174的方法，其中編碼MDA-7蛋白的多核苷酸包括表達(dá)構(gòu)建體。176.權(quán)利要求174的方法，其中所述組合物包含脂質(zhì)體。177.權(quán)利要求176的方法，其中所述脂質(zhì)體是DOTAP膽固醇納米顆粒。178.權(quán)利要求174的方法，其中所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌或轉(zhuǎn)移性肺癌。179.權(quán)利要求174的方法，其中所述方法是在患者中治療轉(zhuǎn)移性肺癌的方法。180.權(quán)利要求174的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管和/或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用組合物。181.用于在患者中治療癌癥的方法，其包括給患者提供MDA-7和腫瘤壞死因子(TNF)。182.權(quán)利要求181的方法，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。183.權(quán)利要求182的方法，其中所述TNF是TNFα。184.權(quán)利要求181的方法，其中通過(guò)給患者施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7，所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表達(dá)。185.權(quán)利要求184的方法，其中所述組合物是藥物可接受的組合物。186.權(quán)利要求184的方法，其中所述核酸存在于載體中。187.權(quán)利要求186的方法，其中所述載體是病毒載體。188.權(quán)利要求187的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。189.權(quán)利要求186的方法，其中所述載體是腺病毒載體。190.權(quán)利要求189的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。191.權(quán)利要求184的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用MDA-7核酸組合物。192.權(quán)利要求184的方法，其中所述MDA-7核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。193.權(quán)利要求192的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。194.權(quán)利要求181的方法，其中通過(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給患者提供MDA-7。195.權(quán)利要求194的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用純化的MDA-7蛋白組合物。196.權(quán)利要求181的方法，其中通過(guò)給患者施用組合物來(lái)給所述患者提供TNF，所述組合物包含具有編碼TNF的序列的核酸，其中所述TNF在所述患者中表達(dá)。197.權(quán)利要求196的方法，其中所述組合物是藥物可接受的組合物。198.權(quán)利要求196的方法，其中所述核酸存在于載體中。199.權(quán)利要求198的方法，其中所述載體是病毒載體。200.權(quán)利要求199的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至1013個(gè)病毒顆粒。201.權(quán)利要求199的方法，其中所述載體是腺病毒載體。202.權(quán)利要求201的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。203.權(quán)利要求196的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用TNF核酸組合物。204.權(quán)利要求196的方法，其中所述TNF核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。205.權(quán)利要求204的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。206.權(quán)利要求196的方法，其中通過(guò)給患者施用包含純化的TNF的組合物來(lái)給患者提供TNF。207.權(quán)利要求206的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用純化的TNF組合物。208.權(quán)利要求181的方法，其中給患者提供組合物，所述組合物包含a)純化的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7的序列的核酸；和b)純化的TNF或具有編碼TNF的序列的核酸。209.權(quán)利要求208的方法，其中給患者提供包含TNF和i)純化的MDA-7蛋白或ii)具有編碼MDA-7的序列的核酸的組合物。210.權(quán)利要求209的方法，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。211.權(quán)利要求210的方法，其中所述TNF是TNFα。212.權(quán)利要求181的方法，其中在提供TNF前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。213.權(quán)利要求212的方法，其中在提供TNF前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。214.權(quán)利要求212的方法，其中在提供TNF之前給患者提供MDA-7。215.權(quán)利要求212的方法，其中在提供MDA-7之前給患者提供TNF。216.權(quán)利要求181的方法，其中所述癌癥是黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。217.權(quán)利要求181的方法，其中所述癌癥包含上皮癌細(xì)胞。218.權(quán)利要求181的方法，其還包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。219.權(quán)利要求218的方法，其中使患者接受放射療法。220.權(quán)利要求218的方法，其中在提供MDA-7和TNF各自至少一次后使患者接受放射療法。221.權(quán)利要求220的方法，其中使患者接受亞致死劑量的放射療法。222.權(quán)利要求181的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。223.權(quán)利要求222的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或TNF。224.權(quán)利要求223的方法，其中至少通過(guò)對(duì)所得的瘤床施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7和/或TNF。225.權(quán)利要求181的方法，其中多次給患者提供MDA-7和/或TNF。226.藥物組合物，其包含a)純化的且有活性的TNF或具有編碼TNF的序列的核酸；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。227.權(quán)利要求226的藥物組合物，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。228.權(quán)利要求227的藥物組合物，其中所述TNF是TNFα。229.權(quán)利要求226的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。230.權(quán)利要求229的藥物組合物，其中具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸是腺病毒載體。231.權(quán)利要求226的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼TNF的序列的核酸。232.權(quán)利要求231的藥物組合物，其中具有編碼TNF的序列的核酸是腺病毒載體。233.藥物組合物，所述藥物組合物包含i)具有編碼MDA-7的核酸序列的第一腺病毒載體，其中所述核酸序列有效連接至第一啟動(dòng)子；和ii)具有編碼TNF的序列的第二腺病毒載體，其中所述核酸序列有效連接至第二啟動(dòng)子。234.權(quán)利要求233的藥物組合物，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。235.權(quán)利要求234的藥物組合物，其中所述TNF是TNFα。236.包含具有編碼MDA-7的第一核酸序列和編碼TNF的第二核酸序列的腺病毒載體的藥物組合物。237.權(quán)利要求236的藥物組合物，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。238.權(quán)利要求237的藥物組合物，其中所述TNF是TNFα。239.權(quán)利要求236的藥物組合物，其中第一核酸序列和第二核酸序列有效連接至啟動(dòng)子。240.權(quán)利要求236的藥物組合物，其中第一核酸序列有效偶聯(lián)至第一啟動(dòng)子，且第二核酸序列有效偶聯(lián)至第二啟動(dòng)子。241.用于在患者中治療癌癥的方法，其包括提供MDA-7和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑。242.權(quán)利要求241的方法，其中所述抑制劑特異性結(jié)合VEGF或VEGF受體。243.權(quán)利要求242的方法，其中所述VEGF抑制劑是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽或小分子。244.權(quán)利要求242的方法，其中所述VEGF抑制劑是抗體。245.權(quán)利要求244的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。246.權(quán)利要求245的方法，其中所述單克隆抗體是抗VEGF或VEGF受體的單克隆抗體。247.權(quán)利要求246的方法，其中所述單克隆抗體是抗VEGF的單克隆抗體。248.權(quán)利要求246的方法，其中所述單克隆抗體是貝伐單抗。249.權(quán)利要求243的方法，其中所述VEGF抑制劑是小分子。250.權(quán)利要求249的方法，其中所述小分子是VEGF的酪氨酸激酶抑制劑。251.權(quán)利要求243的方法，其中所述VEGF的抑制劑是核酶。252.權(quán)利要求251的方法，其中所述核酶是特異性靶向VEGFmRNA或VEGF受體mRNA的核酶。253.權(quán)利要求243的方法，其中所述VEGF抑制劑是可溶性VEGF受體。254.權(quán)利要求241的方法，其中通過(guò)給患者施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7，所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表達(dá)。255.權(quán)利要求254的方法，其中所述組合物是藥物可接受的組合物。256.權(quán)利要求254的方法，其中所述核酸存在于載體中。257.權(quán)利要求256的方法，其中所述載體是病毒載體。258.權(quán)利要求257的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。259.權(quán)利要求257的方法，其中所述載體是腺病毒載體。260.權(quán)利要求259的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。261.權(quán)利要求254的方法，其中經(jīng)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用MDA-7核酸組合物。262.權(quán)利要求254的方法，其中所述MDA-7核酸組合物包含一種或多種脂質(zhì)。263.權(quán)利要求262的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。264.權(quán)利要求241的方法，其中通過(guò)給患者施用包含純化的MDA-7蛋白的組合物來(lái)給患者提供MDA-7。265.權(quán)利要求264的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用純化的MDA-7蛋白組合物。266.權(quán)利要求241的方法，其中通過(guò)給患者施用包含具有編碼VEGF抑制劑的序列的核酸的組合物來(lái)給所述患者提供VEGF抑制劑，其中所述VEGF抑制劑在所述患者中表達(dá)。267.權(quán)利要求266的方法，其中所述VEGF抑制劑是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽或小分子。268.權(quán)利要求267的方法，其中所述VEGF抑制劑是抗體。269.權(quán)利要求268的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。270.權(quán)利要求269的方法，其中所述單克隆抗體是抗VEGF或VEGF受體的單克隆抗體。271.權(quán)利要求270的方法，其中所述單克隆抗體是抗VEGF的單克隆抗體。272.權(quán)利要求271的方法，其中所述單克隆抗體是貝伐單抗。273.權(quán)利要求267的方法，其中所述VEGF抑制劑是小分子。274.權(quán)利要求273的方法，其中所述小分子是VEGF受體的酪氨酸激酶抑制劑。275.權(quán)利要求267的方法，其中所述VEGF抑制劑是核酶。276.權(quán)利要求274的方法，其中所述核酶是特異性靶向VEGFmRNA或VEGF受體mRNA的核酶。277.權(quán)利要求276的方法，其中所述VEGF抑制劑是可溶性VEGF受體。278.權(quán)利要求266的方法，其中所述組合物是藥物可接受的組合物。279.權(quán)利要求266的方法，其中所述核酸存在于載體中。280.權(quán)利要求279的方法，其中所述載體是病毒載體。281.權(quán)利要求280的方法，其中，每次施用，給患者施用大約109至大約1013個(gè)病毒顆粒。282.權(quán)利要求280的方法，其中所述載體是腺病毒載體。283.權(quán)利要求282的方法，其中用魚(yú)精蛋白配制腺病毒載體。284.權(quán)利要求266的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用所述組合物。285.權(quán)利要求266的方法，其中所述組合物包含一種或多種脂質(zhì)。286.權(quán)利要求285的方法，其中所述組合物包含DOTAP和膽固醇或其衍生物。287.權(quán)利要求241的方法，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀胱內(nèi)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)、眼內(nèi)、口服、外用、局域、通過(guò)吸入、通過(guò)注射、通過(guò)輸注、通過(guò)連續(xù)輸注、通過(guò)導(dǎo)管或通過(guò)灌洗直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞來(lái)給患者施用生長(zhǎng)因子的抑制劑。288.權(quán)利要求241的方法，其中給患者提供至少下列物質(zhì)a)純化的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7的序列的核酸；和b)特異性結(jié)合VEGF的單克隆抗體。289.權(quán)利要求288的方法，其中所述單克隆抗體是貝伐單抗。290.權(quán)利要求289的方法，其中在提供貝伐單抗前后24小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。291.權(quán)利要求290的方法，其中在提供貝伐單抗前后2小時(shí)內(nèi)給患者提供MDA-7。292.權(quán)利要求290的方法，其中在提供貝伐單抗之前給患者提供MDA-7。293.權(quán)利要求289的方法，其中在提供MDA-7之前給患者提供貝伐單抗。294.權(quán)利要求241的方法，其中所述癌癥是黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、肝癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、牙齦癌、舌癌、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌或膀胱癌。295.權(quán)利要求241的方法，其中所述癌癥包含上皮癌細(xì)胞。296.權(quán)利要求241的方法，其還包括使患者接受放射療法和/或化學(xué)療法。297.權(quán)利要求296的方法，其中使患者接受放射療法。298.權(quán)利要求297的方法，其中在提供MDA-7和貝伐單抗各自至少一次之后使患者接受放射療法。299.權(quán)利要求297的方法，其中使患者接受亞致死劑量的放射療法。300.權(quán)利要求241的方法，其還包括切除患者的腫瘤的全部或部分。301.權(quán)利要求300的方法，其中在腫瘤切除后給患者提供MDA-7和/或生長(zhǎng)因子的抑制劑。302.權(quán)利要求300的方法，其中至少通過(guò)對(duì)所得的瘤床施用組合物來(lái)給所述患者提供MDA-7和/或生長(zhǎng)因子的抑制劑。303.權(quán)利要求241的方法，其中多次給患者提供MDA-7和/或貝伐單抗。304.藥物組合物，其包含a)VEGF抑制劑或具有編碼VEGF抑制劑的序列的核酸；和b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。305.權(quán)利要求304的藥物組合物，其中所述VEGF抑制劑是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽或小分子。306.權(quán)利要求305的藥物組合物，其中所述VEGF抑制劑是抗體。307.權(quán)利要求306的藥物組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。308.權(quán)利要求307的藥物組合物，其中所述單克隆抗體是抗VEGF或VEGF受體的單克隆抗體。309.權(quán)利要求308的藥物組合物，其中所述單克隆抗體是抗VEGF的單克隆抗體。310.權(quán)利要求309的藥物組合物，其中所述單克隆抗體是貝伐單抗。311.權(quán)利要求305的藥物組合物，其中所述VEGF抑制劑是小分子。312.權(quán)利要求311的藥物組合物，其中所述小分子是VEGF受體的酪氨酸激酶抑制劑。313.權(quán)利要求305的藥物組合物，其中所述VEGF的抑制劑是核酶。314.權(quán)利要求313的藥物組合物，其中所述核酶是特異性靶向VEGFmRNA或VEGF受體mRNA的核酶。315.權(quán)利要求305的藥物組合物，其中所述VEGF抑制劑是可溶性VEGF受體。316.權(quán)利要求304的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。317.權(quán)利要求304的藥物組合物，其中具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸是腺病毒載體。318.權(quán)利要求304的藥物組合物，其中所述組合物包含具有編碼VEGF抑制劑的序列的核酸。319.權(quán)利要求304的藥物組合物，其中具有編碼VEGF抑制劑的序列的核酸是腺病毒載體。320.藥物組合物，其包含(a)貝伐單抗，和(b)純化的且有活性的MDA-7蛋白或具有編碼MDA-7多肽的序列的核酸。全文摘要本發(fā)明涉及包含MDA-7蛋白或編碼MDA-7的核酸聯(lián)合1)COX-2的選擇性抑制劑例如塞來(lái)考昔、2)Hsp90的抑制劑例如格爾德霉素或格爾德霉素衍生物或類(lèi)似物、3)用于治療癌癥的維生素E化合物、4)TNF例如TNFα、5)VEGF抑制劑或6)IL-10的抑制劑的方法和組合物。在某些實(shí)例中，提供了對(duì)乳腺癌的治療法。在其他實(shí)例中提供了對(duì)肺癌的治療法。在一些情況下，這些實(shí)例包括表達(dá)MDA-7蛋白的腺病毒載體。文檔編號(hào)A61K38/17GK101166539SQ200680011374公開(kāi)日2008年4月23日申請(qǐng)日期2006年2月8日優(yōu)先權(quán)日2005年2月8日發(fā)明者K·K·亨特,Y-J·徐,S·G·斯威舍,A·巴特爾,R·拉米什,M·尚克申請(qǐng)人:得克薩斯大學(xué)體系董事會(huì)