專利名稱：：桑枝生物堿有效部位在制備降血糖藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及桑枝生物堿有效部位提取物在制備降血糖藥物中的應(yīng)用。背景介紹據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，國內(nèi)40歲以上人群糖尿病發(fā)病率高達(dá)4%，60歲以上人群超過11%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)，在未來15年中，中國的糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到目前的四倍。糖尿病已成為嚴(yán)重危害人民生活和健康的重大疾病。患病人群中，90%以上為2型糖尿病(非胰島素依賴型，NIDDM)，需長期服用口服降糖藥。20世紀(jì)50年代，用于治療NIDDM的口服藥物磺酰脲類和雙胍類等藥物上市，使2型糖尿病人的血糖得到了控制，壽命延長，生活質(zhì)量有所提高。但磺酰脲類易引起低血糖危險(xiǎn)，雙胍類存在嚴(yán)重的胃腸道刺激。經(jīng)過40多年的努力，科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)了一類新型的抗糖尿病藥物，即a-葡萄糖苷酶抑制劑。該種藥物作用于小腸粘膜刷狀緣的a-葡萄糖苷酶，抑制其對多糖和葡萄糖的分解，延緩葡萄糖的吸收，使餐后血糖峰值降低并后移，"血糖波動(dòng)"幅度縮小，從而起到降低血糖、防止和延緩某些糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。a-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用己被國內(nèi)外公認(rèn)為是抗糖尿病的新途徑。20世紀(jì)90年代初，德國拜爾公司推出了該類型藥物拜糖蘋(Acarbose)，并在世界50多個(gè)國家上市，獲得了良好的治療效果。1994年，該藥進(jìn)入我國市場，經(jīng)10年的臨床驗(yàn)證，表明本品用于2型糖尿病治療，有效性好，安全性高，獲得了很好的社會(huì)效益和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。我國藥用植物資源豐富，用于降血糖的粗制劑品種繁多，但均無明確作用機(jī)制，且質(zhì)量不可控。桑枝為桑科植物桑的干嫩枝，桑枝中含有上百種化合物，包括多糖、單糖、植物蛋白、酚類、黃酮類及皂苷、有機(jī)酸、氨基酸、多羥基生物堿等。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所在20世紀(jì)90年代即發(fā)現(xiàn)桑枝水和/或醇提取物具有很強(qiáng)的a-葡萄糖苷酶抑制活性。并申請了專利"桑枝的醇和/或水浸膏在制備降血糖藥物中的的應(yīng)用"，申請?zhí)枮?7112359，該篇專利己于2002年4月10日獲得國家專利局授權(quán)。由于醇和/或水浸膏粗制劑劑量過大(每次用量在3g以上)、且質(zhì)量可控性不好，為此，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所又對桑枝有效部位進(jìn)行了研究。對桑枝不同的提取部位進(jìn)行a-葡萄糖苷酶的抑制活性考察，結(jié)果表明，水溶性生物堿部分活性最強(qiáng)，即降糖活性的有效部位存在于水溶性生物堿部分。桑枝粗提物對a-葡萄糖苷酶的抑制活性IG(產(chǎn)60ug/ml，而水溶性生物堿提取部位的IC5。<0.1ug/ml。本發(fā)明是在97112359基礎(chǔ)上進(jìn)行的進(jìn)一步技術(shù)創(chuàng)新。除本所申請的97112359專利外，尚檢索到以下3篇與桑枝及具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的中藥提取物的研究報(bào)道專利01113191:"具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的中藥提取物及其制備方法和用途"，其中中藥提取物是由桑白皮、桑葉和桑葚制備而得的總生物堿，未涉及桑枝，同時(shí)對生物堿的組成未進(jìn)行描述。專利02113004:"桑提取物及其提取方法和新用途"，內(nèi)容涉及的成分為總黃酮，未涉及生物堿，用途為預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)，未涉及糖尿病。專利200410018677.4:"具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的藥物組合物及其用途"，藥物組合物是由生物堿和黃酮類成分組成，生物堿系由蠶沙或桑枝或桑白皮或桑葉中提取的總生物堿(含量未進(jìn)行明確說明)。加入的黃酮類提取物為兒茶素、槲皮素、茶多酚中的至少一種。組合物中，生物堿提取物重量比為5-95%、黃酮類提取物重量比為10-95%。從200410018677.4專利描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和附圖分析，在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，生物堿提取物與黃酮類提取物合并用藥，僅表現(xiàn)出劑量相加作用，而不具備協(xié)同作用。這與該專利的目標(biāo)和結(jié)論不一致。?？浦参锇ㄉ０灼ぁ⑸Ｖ蜕Ｈ~。桑白皮來源困難，且破壞植物再生，因此，不宜作為提取藥材；桑葉和桑枝需每年進(jìn)行修剪，其中桑葉用于養(yǎng)蠶，不易收購，而大量的桑枝則被桑農(nóng)作為燒火用的柴料。因此，以桑枝為藥材，來源廣泛，方便易得，價(jià)格便宜。對桑枝中生物堿有效部位的降糖作用進(jìn)行研究具有重大現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容以桑枝為藥材，粉碎后經(jīng)提取、分離、精制和濃縮，制備總生物堿含量在50%以上的有效部位，加入藥劑學(xué)上允許的賦形劑，制成各種口服制劑，用于糖尿病患者餐后血糖的控制。桑枝總生物物有效部位提取物對a-葡萄糖苷酶抑制活性與拜糖蘋相當(dāng)，明顯強(qiáng)于桑枝水和/或醇提取的粗制劑。1、有效部位制備桑枝中生物堿有效部位的制備方法，系將桑枝粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加熱回流提取，溶劑量為原藥材的5-12倍，重復(fù)提取1-3次，合并提取液，濃縮至一定體積，加入50-80%的乙醇，沉淀去除雜質(zhì)，離心，清液上陽離子交換樹脂，以蒸餾水洗盡不吸附的雜質(zhì)，用0.2-1N的氨水洗脫，洗脫液濃縮后上陰離子交換樹脂，收集不吸附部分，經(jīng)減壓濃縮或噴霧千燥或冷凍干燥，得淺黃色有效部位提取物千粉，收率約為1-2%。。2、有效部位含量測定有效部位中的生物堿為多羥基生物堿及其苷類，無紫外吸收，為此，發(fā)明人選擇合適的衍生化試劑，對提取物進(jìn)行衍生化處理，采用HPLC方法對處理后的樣品進(jìn)行測定。經(jīng)考察，所建立的方法專性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。研究發(fā)現(xiàn)，有效部位的一組生物堿中，1-deoxynojirimycin含量最高，且活性最強(qiáng)。為此，發(fā)明人制備了1-deoxynojirimycin精制品以期用于含量測定的對照品。通過核磁、質(zhì)譜、紅外、紫外及熱分析檢測，對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。經(jīng)HPLC測定，1-deoxynojirimycin精制品含量大于98%，符合對照品質(zhì)量要求。按上述制備方法制備桑枝有效部位提取物，經(jīng)柱前衍生化-HPLC方法測定，總生物堿占有效部位提取物的含量均在50%以上，化合物(l)即1-deoxynojirimycin占提取物的含量在27%以上。3、有效部位提取物穩(wěn)定性對中試放大提取物密封室溫保存，于不同時(shí)間取樣，HPLC法測定含量，結(jié)果表明，貯存24個(gè)月，質(zhì)量穩(wěn)定，見表l.表l:中試產(chǎn)品初步穩(wěn)定性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、有效部位提取物藥效學(xué)研究(1)離體試驗(yàn)以拜糖蘋(Arcarbose)為陽性對照藥，觀察實(shí)施例1提取物在不同濃度下對a-葡萄糖苷酶的抑制百分率，并求出IC5。。結(jié)果表明，在離體條件下，有效部位提取物對蔗糖酶的抑制作用強(qiáng)于拜糖蘋，對麥芽糖酶的抑制作用與拜糖蘋相當(dāng)，而對淀粉酶的抑制作用明顯低于拜糖蘋，提示桑枝有效部位降糖活性與拜糖蘋相當(dāng)，但胃腸道漲氣的副作用可能小于拜糖蘋。結(jié)果見表2。表2.SZ-A對a葡萄糖苷酶活性的抑制作用(invitro)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)整體動(dòng)物試驗(yàn)以拜糖蘋為對照，考察了桑枝有效部位對正常小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖曲線的影響和對四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖變化的影響。有效部位對正常小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖升高的影響有效部位試驗(yàn)組設(shè)三個(gè)劑量，即10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg;p.o.;另設(shè)陰性對照組(不用藥)和陽性對照組(陽性對照藥選用拜糖蘋，10mg/kg;p.o.)。結(jié)果表明，桑枝有效部位在10mg/kg~40mg/kg劑量范圍內(nèi)，能使正常小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖升高明顯減少，血糖曲線下面積也明顯小于對照組，試驗(yàn)組和陽性對照組結(jié)果無明顯差異(圖1)。有效部位對四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖升高的影響五組四氧嘧啶糖尿病小鼠，分別設(shè)陰性對照組、陽性對照藥拜糖蘋組(10mg/kg)以及不同劑量給藥組(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg)。結(jié)果表明，桑枝有效部位使四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖峰值降低并后移，血糖曲線下面積減少，20mg/kg與40mg/kg給藥組效果優(yōu)于陽性對照組(圖2)。圖1:桑枝有效部位對正常小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖曲線的影響圖2:桑枝有效部位對四氧嘧啶糖尿病小鼠蔗糖負(fù)荷后血糖變化的影響圖3:有效部位口嚼片對健康志愿受試者饅頭實(shí)驗(yàn)血糖變化的影響(n=8)具體實(shí)施方式以下將通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅是說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的任何限制。實(shí)施例l:總生物堿有效部位制備及測定鮮嫩桑枝,粉碎，晾干，取350kg，加去離子水2000L，加熱回流2小時(shí)，重復(fù)提取2次，合并提取液，濃縮至250L，加入700L乙醇，沉淀24小時(shí)，過濾，取上清液，上732#陽離子樹脂，以蒸餾水洗至中性，用0.5N的氨水洗脫，收集洗脫液，上DowexlX2(0H-)陰離子交換樹脂，收集不吸附部分，收集液經(jīng)減壓濃縮干燥，得淡黃色粉末530g，收率為1.51%0。取上述干燥物，加水溶解，照柱前衍生化-HPLC法測定，以化合物(1)作對照，按外標(biāo)法計(jì)算，生物堿總含量為55%，其中化合物(1)即l-deoxynojirimycin為29%。化合物(1)在一組生物堿中所占重量百分比為29%+55%=52.7%。實(shí)施例2:桑枝降糖有效部位片劑制備取實(shí)施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣5g，乳糖15g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，千燥，14目篩整粒，壓片，片重約300mg，每片含有效部位提取物100mg，總生物堿50mg。實(shí)施例3:桑枝降糖有效部位膠囊制備取實(shí)施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣5g,乳糖5g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，40目篩整粒，裝入2號(hào)硬膠囊，內(nèi)容物約200mg，每片含有效部位提取物100mg，總生物堿50mg。實(shí)施例4:桑枝降糖有效部位口服液制備取實(shí)施例1制備的有效部位10g，加蒸餾水溶解并稀釋至500ml,加入0.05%苯甲酸，亦可加入適量調(diào)味劑，分裝于5ml或10ml的小瓶中，壓蓋，即得。每瓶含有效部位提取物100-200mg,總生物堿50-lOOmg。實(shí)施例5:桑枝降糖有效部位滴丸制備取聚乙二醇6000(PEG6000)50g，加熱到IOO'C熔融，加入實(shí)施例1制備的有效部位10g，攪拌制備均勻的熔融液，恒溫條件下將熔融液傾至滴丸機(jī)貯液缸中，滴液至液體石蠟中，冷卻成形，洗去液體石蠟，千燥，即得。每粒滴丸重約30mg，含有效部位5mg，總生物堿2.5mg。實(shí)施例6:桑枝降糖有效部位分散片制備取實(shí)施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣20g，乳糖5g，甘露醇15g，交聯(lián)聚乙吡咯烷酮10g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩,混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，14目篩整粒，壓片，片重約600mg，每片含有效部位提取物100mg,總生物堿50mg。實(shí)施例7:桑枝降糖有效部位口嚼片制備及降血糖作用取實(shí)施例1制備的有效部位10g，加入磷酸二氫鈣5g，乳糖5g，甘露醇15g，硬脂酸鎂0.3g，分別過80目篩，混勻，用70%乙醇制軟材，20目篩制粒，干燥，14目篩整粒，壓片，片重約300mg，每片含有效部位提取物100mg，總生物堿50mg。本研究組8名工作人員作為健康志愿受試者，先后進(jìn)行3次饅頭實(shí)驗(yàn)，--次僅食饅頭U00g)作為對照，另兩次分別食饅頭與不同劑量(50mg/人、100mg/人)的有效部位口嚼片。實(shí)驗(yàn)前空腹過夜，食饅頭前(作為"0"時(shí))及后1小時(shí)及2小時(shí)測血糖水平。結(jié)果表明，口嚼片在每人50mg和100mg劑量下，能使健康志愿受試者饅頭餐后血糖峰值明顯降低，曲線下面積減少(圖3)。權(quán)利要求1、一種具有降血糖活性的生物堿有效部位，其特征在于，該有效部位是從桑枝中提取、分離和精制后得到的淡黃色或淺棕色粉末，有效部位中的活性成分為一組多羥基生物堿組合物，總生物堿含量占提取物的重量百分比在50％以上。2、根據(jù)權(quán)利要求1的生物堿有效部位，其特征在于，所述的多羥基生物堿組合物由1—deoxynojirimycin(1)禾口N~methly—1—deoxynojirimycin(2)、fagomine(3)、3-epi-fagomine(4)、1，4-dideoxy-1，4-imino-EKarabinitol(5)、1，4-dideoxy-1，4-imino-D~ribitol(6)、calysteginB2(7)、calysteginCi(8)、2~0~(aHD~gaIactopyranosyI)-1-deoxynojirimycin(9)、(P~D~gIucopyranosyI)—1-deoxynojirimycin(17)、1，4-dideoxy-1，4-imino-(2~0~e~0-glucopyranosyl)~D-arabinitol(18)中的至少一種組成，其中，1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于總生物堿的30%。3、根據(jù)權(quán)利要求2的生物堿有效部位，其特征在于，所述的多羥基生物堿組合物中1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于總生物堿的40%。4、根據(jù)權(quán)利要求3的生物堿有效部位，其特征在于，所述的多羥基生物堿組合物中1-deoxynojirimycin的重量百分比不得低于總生物堿的50%。5、一種具有降血糖活性的藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的權(quán)利要求l一4的生物堿有效部位和藥劑學(xué)上允許的賦形劑。6、根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括普通片、分散片、口嚼片、膠囊、顆粒劑、沖劑、滴丸或口服液。7、根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于，含有的生物堿有效部位按有效部位提取物計(jì)為25-400mg/片。8、根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其特征在于，含有的生物堿有效部位按有效部位提取物計(jì)為50-200mg/片。9、根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于，含有的生物堿有效部位按有效部位提取物計(jì)為100-200mg/片。10、制備權(quán)利要求l一4的生物堿有效部位的方法，其特征在于，制備方法系將桑枝藥材粉碎，加入水和/或醇提取，經(jīng)酒沉或絮凝除雜，再經(jīng)離子交換權(quán)脂分離和精制，收集液采用減壓濃縮或噴霧干燥，也可采用冷凍干燥方法去除溶劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有降血糖活性的有效部位，系由桑枝粉碎后用水和/或醇提取，或用酸水提取，經(jīng)酒沉或絮凝去除雜質(zhì)，濃縮，經(jīng)樹脂色譜法分離精制而得的淡黃色粉末。本發(fā)明所述的有效部位，降糖活性成分為一組多羥基生物堿，采用HPLC法測定，總生物堿占有效部位重量百分比在50％以上。降糖劑量為每人每次12.5-200mg(按總生物堿計(jì))。文檔編號(hào)A61K9/16GK101129476SQ20061011164公開日2008年2月27日申請日期2006年8月21日優(yōu)先權(quán)日2006年8月21日發(fā)明者泉?jiǎng)?劉玉玲,夏學(xué)軍,孫素娟,汪仁蕓,申竹芳,金篤嘉申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所