專利名稱：截短的丙肝病毒ns5結(jié)構(gòu)域以及含有該截短結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙肝病毒(HCV)多肽。更具體地說，本發(fā)明涉及截短的HCVNS5多肽和含有該截短的NS5多肽的融合蛋白。這些蛋白可用于刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)(如細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng))、引發(fā)和/或激活HCV特異性T細(xì)胞、以及用于診斷試劑。
背景技術(shù)：
丙肝病毒(HCV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，世界上約有1％的人感染該病毒。超過75％的急性感染患者最終發(fā)展成可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的慢性攜帶者狀態(tài)。見，Alter等，(1992)N.Engl.J.Med.3271899-1905；Resnick和Koff.(1993)Arch.Intem.Med.1531672-1677；Seeff(1995)Gastrointest.Dis.620-27；Tong等，(1995)N.Engl.J.Med.3321463-1466。
HCV最初被Houghton等發(fā)現(xiàn)和鑒定為NANBH的病因。由于獲得序列的方法已知，HCV的病毒基因組序列已知。參見例如國際公開號WO89/04669；WO90/11089和WO90/14436。HCV有9.5kb的正義、單鏈RNA基因組且是黃病毒(Flaviridae)家族的成員。在系統(tǒng)發(fā)生分析的基礎(chǔ)上已鑒定了至少六個(gè)不同但相關(guān)的HCV基因型(Simmonds等，J.Gen.Virol.(1993)742391-2399)。這些病毒編碼具有超過3000個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)多蛋白(Choo等，Sciencel.(1989)244359-362；Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)882451-2455；Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991)881711-1715)。在翻譯中和翻譯后，該多蛋白被加工成結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白質(zhì)。
特別地，如

圖1所示，HCV基因組編碼幾個(gè)蛋白。HCV多蛋白裂解產(chǎn)物的順序和名稱如下NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。多蛋白最初的裂解由宿主蛋白酶催化，蛋白酶釋放三種結(jié)構(gòu)蛋白以及含病毒酶的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白，所述三種結(jié)構(gòu)蛋白是N-末端核殼蛋白(稱為“核心”)和兩種包膜糖蛋白“E1”(也稱為E)及“E2”(也稱為E2/NS1)。NS區(qū)域命名為NS2、NS3、NS4和NS5。NS2是具蛋白水解活性的整合膜蛋白，它與NS3一起裂解NS2-NS3 sissle鍵，從而產(chǎn)生NS3 N-末端并釋放包括絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大的多蛋白。NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。在這些反應(yīng)中，NS3釋放NS3輔因子(NS4a)、兩種蛋白(NS4b和NS5a)和RNA-依賴的RNA聚合酶(NS5b)。多蛋白成熟的完成開始于NS3絲氨酸蛋白酶催化的在NS3-NS4a連接處的自身催化裂解。
盡管在針對某些病毒例如HIV的藥物研發(fā)方面取得了很大的進(jìn)展，但是在控制急性和慢性HCV感染方面少有成功。(Hoofnagle和di Bisceglie(1997)N.Engl.J.Med.336347-356)。具體地，認(rèn)為細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)(如強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答反應(yīng))對控制和根除HCV感染非常重要。
能夠產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的免疫原性HCV融合蛋白描述于國際專利申請WO/2004/005473和美國專利號6,562,346；6,514,731和6,428,792。然而，本領(lǐng)域仍然需要刺激對HCV的免疫應(yīng)答反應(yīng)如細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的其它有效方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于刺激免疫應(yīng)答的試劑和方法，如刺激對HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的試劑和方法，例如引發(fā)和/或激活識別HCV多肽表位的T細(xì)胞的試劑和方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供防止和/或治療HCV感染的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測生物樣品中是否存在HCV的診斷檢測的試劑和方法。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及C末端截短的NS5多肽，其中所述多肽含有全長NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分。在某些實(shí)施方式中，所述多肽是在氨基酸2500和C末端之間的位置截短的多肽(編號相對于全長HCV-1多蛋白)，如在氨基酸2900和C末端之間截短，或在對應(yīng)于緊隨氨基酸2990之后的氨基酸的氨基酸處截短(編號相對于全長HCV-1多蛋白)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽由對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列組成，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種免疫原性融合蛋白，其含有上述任意實(shí)施方式的C末端截短的NS5多肽、以及衍生自HCV多蛋白非NS5區(qū)域的另一個(gè)區(qū)域的至少一種多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白還含有修飾的NS3多肽，其含有對應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代(編號相對于全長HCV-1多蛋白)，從而當(dāng)修飾的NS3多肽存在于HCV融合蛋白中時(shí)，蛋白酶活性被抑制。在某些實(shí)施方式中，修飾的NS3多肽含有在對應(yīng)于Ser-1165的氨基酸處的丙氨酸取代(編號相對于全長HCV-1多蛋白)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述蛋白含有修飾的NS3多肽、NS4多肽和任選地HCV核心多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心多肽含有C末端截短。在某些實(shí)施方式中，所述核心多肽由圖3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列組成。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白還含有E2多肽。在某些實(shí)施方式中，所述E2多肽是C末端截短的E2多肽，由對應(yīng)于氨基酸384-715的氨基酸序列組成(編號相對于全長HCV-1多蛋白)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白中的多肽衍生自相同的HCV分離物。在其它實(shí)施方式中，融合蛋白中存在的至少一種多肽與C末端截短的NS5多肽衍生自不同的分離物。
在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽組成(a)修飾的NS3多肽，其含有在對應(yīng)于Ser-1165的氨基酸處的丙氨酸取代(編號相對于全長HCV-1多蛋白)，從而抑制蛋白酶活性；(b)NS4多肽；(c)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列組成(編號相對于全長HCV-1多蛋白)；和(d)任選地，HCV核心多肽。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽組成(a)C末端截短的E2多肽，由對應(yīng)于氨基酸384-715的氨基酸序列組成(編號相對于全長HCV-1多蛋白)；
(b)修飾的NS3多肽，含有在對應(yīng)于Ser-1165的氨基酸處的丙氨酸取代(編號相對于全長HCV-1多蛋白)，從而抑制蛋白酶活性；(c)NS4多肽；(d)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列組成(編號相對于全長HCV-1多蛋白)；和(e)任選地，HCV核心多肽。
在某些實(shí)施方式中，上述融合蛋白含有HCV核心多肽。在一些實(shí)施方式中，所述核心多肽含有C末端截短，如由圖3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列組成的核心多肽。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種組合物，其含有根據(jù)上述任一實(shí)施方式的C末端截短的NS5多肽，或根據(jù)上述任一實(shí)施方式的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方式中，該組合物包含免疫原性HCV多肽，如HCV E1E2復(fù)合物。E1E2復(fù)合物可與NS5多肽分開提供，或與包含NS5多肽的融合蛋白分開提供。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種在脊椎動物對象中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的上述組合物。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生組合物的方法，所述方法包括將根據(jù)上述任意實(shí)施方式的C末端截短的NS5多肽、或根據(jù)上述任意實(shí)施方式的融合蛋白與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。
在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，其含有編碼根據(jù)上述任意實(shí)施方式的C末端截短的NS5多肽的編碼序列，或編碼根據(jù)上述任意實(shí)施方式的免疫原性融合蛋白的編碼序列。
在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種重組載體，其含有(a)上述的多核苷酸；和(b)與所述多核苷酸可操作性連接的至少一種控制元件，從而編碼序列能夠在宿主細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有上述重組載體的宿主細(xì)胞。
在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種制備免疫原性C末端截短的NS5多肽或含有該多肽的免疫原性融合蛋白的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞群。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)HCV NS5多肽的產(chǎn)量的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞群，其中與相同條件下產(chǎn)生的全長NS5多肽相比，所述蛋白的產(chǎn)量更大。
在閱讀了本發(fā)明公開內(nèi)容之后，本發(fā)明的這些和另外的實(shí)施方式對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡述圖1圖示HCV基因組，表示HCV多蛋白的各區(qū)域。
圖2(SEQ ID NO3和4)表示代表性的天然、未修飾的NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的DNA和相應(yīng)氨基酸序列。
圖3(SEQ ID NO5和6)表示代表性的修飾的融合蛋白的DNA和相應(yīng)氨基酸序列，所述修飾的融合蛋白中從N末端刪除了NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域，該修飾的融合蛋白包含C末端核心的氨基酸1-121。
圖4A和4B表示釀酒酵母(S.cerevisiae)AD3菌株中，NS5tCore121(NS5的氨基酸1973-2990和核心的1-121)和NS5Core121(全長NS5，NS5的氨基酸1973-3011和核心的1-121)表達(dá)水平的比較。圖4A表示25℃時(shí)的表達(dá)水平，圖4B表示30℃的表達(dá)水平。泳道1，標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2，質(zhì)粒對照；泳道3，編碼NS5tCore121(克隆6)的質(zhì)粒；泳道4，編碼NS5tCore121(克隆7)的質(zhì)粒；泳道5，編碼NS5Core121(克隆8)的質(zhì)粒；泳道6，編碼NS5Core121(克隆9)的質(zhì)粒；泳道7，標(biāo)準(zhǔn)品。
圖5A-5E(SEQ ID NO7和8)表示代表性融合蛋白的DNA和相應(yīng)氨基酸序列，所述融合蛋白包含C末端截短的NS5多肽，其中NS5多肽的C末端融合于核心多肽。具體地說，所述C末端截短的NS5多肽含有HCV多蛋白的氨基酸1973-2990(編號相對于HCV-1)(見，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA882451-2455)，融合于包含HCV多蛋白的氨基酸1-121的核心多肽。
發(fā)明詳述除非另外說明，本發(fā)明的實(shí)施將使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋。參見，如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，第二版，1989；《酶學(xué)方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第I卷和第II卷(D.N.Glover主編)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主編)；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames &S.J.Higgins主編)；《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture)(R.K.Freshney主編)；Perbal，B.，《分子克隆實(shí)踐指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)。
必須注意的是，如本說明書和權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”、“該”包括復(fù)數(shù)參考，除非內(nèi)容明顯說明不包括復(fù)數(shù)參考。因此，例如，“一多肽”包括兩個(gè)或多個(gè)多肽的混合物等。
文中使用了下列氨基酸縮寫丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N) 天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C) 谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M) 苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T)色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)纈氨酸Val(V)I.定義在本發(fā)明的描述中，使用了下列術(shù)語，并如下定義。
術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物，并不限于產(chǎn)物的最小長度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在該定義中。全長的蛋白質(zhì)及其片段包括在該定義中。該術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。另外，為了本發(fā)明的目的，“多肽”指包括天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常性質(zhì)保守)，只要蛋白質(zhì)維持所需活性。這些修飾可以是經(jīng)過設(shè)計(jì)的，如通過定點(diǎn)誘變，或可以是偶然的，例如通過產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主突變，或由于PCR擴(kuò)增引起的錯(cuò)誤。
HCV多肽是一種如上所述的衍生自HCV多蛋白的多肽。該多肽不需要物理衍生自HCV，可以合成或重組產(chǎn)生。另外，該多肽可衍生自任何各種HCV株和分離物，包括具有Simmonds等，J.Gen.Virol(1993)742391-2399所述的6種HCV基因型(例如株1、2、3、4等)中任意基因型的分離物，以及新發(fā)現(xiàn)的分離物，和這些分離物的亞型，如HCV1a和HCV1b等。在這些株之間已知有許多保守和可變的區(qū)域，一般當(dāng)兩條序列排列時(shí)，衍生自這些區(qū)域的表位的氨基酸序列將具有高度的序列同源性，例如高于30％，優(yōu)選高于40％的氨基酸序列同源性。因此，例如術(shù)語“NS5”多肽指任何各種HCV株的天然NS5、以及NS5類似物、突變蛋白和免疫原性片段(如下進(jìn)一步定義)。
術(shù)語“類似物”和“突變蛋白”指參照分子的保留了所需活性(如下所述的刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力)的生物活性衍生物，或這些衍生物的片段。在修飾的NS3的情況下，“類似物”或“突變蛋白”指缺乏天然蛋白水解活性的NS3分子。通常，術(shù)語“類似物”指具有天然多肽序列和結(jié)構(gòu)，以及相對于天然分子的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代(通常是性質(zhì)保守的取代，在修飾的NS3的情況下，在活性蛋白水解位點(diǎn)的性質(zhì)非保守的取代)和/或缺失的化合物，只要修飾不破壞免疫原性的活性。術(shù)語“突變蛋白”指具有一種或多種肽模擬物(“擬肽”)的肽。優(yōu)選類似物或突變蛋白至少具有與天然分子相同的免疫活性。制備多肽類似物和突變蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，如下進(jìn)一步描述。
如上所述，類似物一般包括性質(zhì)上保守的取代，即這些取代發(fā)生在與它們的側(cè)鏈有關(guān)的一類氨基酸中。具體而言，氨基酸一般被分成四類(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性--賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性--丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電荷的極性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族氨基酸。例如，有理由預(yù)測單獨(dú)用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸，或者用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸對氨基酸作出類似的保守取代，這樣的取代將不會對生物活性有重要影響。例如，感興趣的多肽可包括多達(dá)約5-10個(gè)保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多達(dá)約15-25個(gè)保守的或不保守的氨基酸取代，或5-25之間任何整數(shù)，只要該分子的所需功能仍維持完整。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可結(jié)合本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測定感興趣的分子中可耐受改變的區(qū)域。
“C末端截短的NS5多肽”指包含全長NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分、但不包含全長NS5b區(qū)域的NS5多肽。下面提供了C末端截短的NS5多肽的具體例子。
“修飾的NS3”指具有修飾從而破壞了NS3多肽的蛋白酶活性的NS3多肽。所述修飾可包括相對于天然分子的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代(通常是性質(zhì)上非保守的取代)和/或缺失，其中破壞了NS3多肽的蛋白酶活性。下面描述了檢測蛋白酶活性的方法。
術(shù)語“片段”指僅由完整的全長多肽序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成的多肽。該片段可包括該天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失。特定的HCV蛋白的“免疫原性片段”一般包括至少該全長分子的約5-10個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，較佳至少含有該全長分子的約15-25個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，最佳至少含有該全長分子的約20-50個(gè)或以上的連續(xù)的氨基酸殘基，這些氨基酸殘基限定了一個(gè)表位；或者含有5個(gè)氨基酸和全長序列之間的任何整數(shù)，只要所述的片段在下文所述的檢測中保留免疫活性。
術(shù)語“表位”在文中指至少約有3-5個(gè)、較佳地約5到10或15個(gè)、但不超過約1000個(gè)氨基酸(或其中的任何整數(shù))的序列；它定義了一條序列，該序列自身或作為較大序列的一部分與在對其應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體結(jié)合。該片段的長度沒有嚴(yán)格的上限，它幾乎可包含全長的蛋白質(zhì)序列，或甚至包括含有HCV多蛋白的兩個(gè)或多個(gè)表位的融合蛋白。用于本發(fā)明的表位并不限于具有衍生了它的母體蛋白質(zhì)部分的確切序列的多肽。實(shí)際上，病毒基因組處于恒定流動的狀態(tài)，且含有幾種在隔離種群間具有相對高度易變性的可變結(jié)構(gòu)域。因而，術(shù)語“表位”包括與天然序列相同的序列，以及該天然序列的修飾物，如缺失、添加和取代(通常性質(zhì)保守)。
可使用任何數(shù)量的本領(lǐng)域周知的表位作圖技術(shù)來鑒別包括表位在內(nèi)的給定多肽的區(qū)域。參見，如《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)中的表位作圖程序，第66卷(Glenn E.Morris編輯，1996)，Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，通過如同時(shí)在固相支持物上合成大量的肽，對應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的部分的肽，在這些肽仍連接于該支持物時(shí)使肽與抗體反應(yīng)，就可測定各線性表位。這些技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并在美國專利No.4，708，871；Geysen等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813998-4002；Geysen等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82178-182；Geysen等(1986)，Molec.Immunol.，23709-715中有所描述。類似地，通過使用如X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振法測定氨基酸的空間構(gòu)象容易地鑒定構(gòu)象表位。參見如“表位作圖流程”，同上。還可使用標(biāo)準(zhǔn)抗原性曲線圖和親水性圖(如用從Oxford Molecular Group獲得的Omiga 1.0版軟件程序計(jì)算得到的)來鑒別蛋白質(zhì)的抗原區(qū)域。此計(jì)算機(jī)程序采用Hopp/Woods方法(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)，783824-3828)確定抗原性圖譜，并用Kyte-Doolittle技術(shù)(Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)，157105-132)繪制親水性圖。
關(guān)于各種HCV表位的描述，可參見Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等，國際出版物No.WO93/00365；Chien，D.Y.，國際出版物No.WO94/01778；和美國專利6280927和6150087。
本文所用術(shù)語“T細(xì)胞表位”指肽結(jié)構(gòu)的特征，其能夠誘導(dǎo)對該肽結(jié)構(gòu)或相關(guān)半抗原的T細(xì)胞免疫。T細(xì)胞表位通常包含線形肽決定簇，設(shè)想其在MHC分子的肽結(jié)合夾縫中呈長形構(gòu)象，(Unanue等，Science(1987)236551-557)。多肽向MHC II類相關(guān)線形肽決定簇(通常長度為5-14個(gè)氨基酸)的轉(zhuǎn)變稱為“抗原加工”，該過程是由抗原呈遞細(xì)胞(APC)完成的。更具體地，T細(xì)胞表位是由短肽結(jié)構(gòu)的局部特征限定的，如涉及電荷和疏水性的主要氨基酸序列特性，以及不依賴于整個(gè)多肽折疊的某些類型的二級結(jié)構(gòu)，如螺旋結(jié)構(gòu)。另外，據(jù)信能夠被輔助性T細(xì)胞識別的短肽通常是兩親結(jié)構(gòu)，包括疏水端(與MHC分子相互作用)和親水端(與T細(xì)胞受體相互作用)(Margalit等，T細(xì)胞表位的計(jì)算機(jī)預(yù)測(Computer Predictionof T-cell Epitopes)，New Generation VaccinesMarcel-Dekker，Inc，主編，G.C.Woodrow等，(1990)109-116頁)，并且這些兩親結(jié)構(gòu)有α-螺旋構(gòu)型(見，例如，Spouge等，J.Immunol.(1987)138204-212；Berkower等，J.Immunol.(1986)1362498-2503)。
因此，可用很多計(jì)算機(jī)程序容易地預(yù)測包括T細(xì)胞表位的蛋白區(qū)段。(見例如，Margalit等，T細(xì)胞表位的計(jì)算機(jī)預(yù)測(Computer Prediction of T-cell Epitopes)，New Generation VaccinesMarcel-Dekker，Inc，主編.G.C.Woodrow等，(1990)109-116頁)。這些程序通常將肽的氨基酸序列與已知誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的序列比較，并搜索據(jù)信為T細(xì)胞表位所需的氨基酸模式。
對HCV抗原(包括體內(nèi)表達(dá)的多肽和編碼多肽的多核苷酸)或組合物的“免疫應(yīng)答反應(yīng)”是指在對象中發(fā)展出針對感興趣組合物中存在的分子的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了本發(fā)明目的，“體液免疫應(yīng)答”指抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答”由T-淋巴細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞介導(dǎo)。細(xì)胞免疫的一個(gè)重要方面包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(“CTLs”)的抗原-特異性應(yīng)答反應(yīng)。CTLs對與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼的蛋白質(zhì)一起呈遞并在細(xì)胞表面表達(dá)的肽抗原有特異性。CTLs有助于誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的胞內(nèi)破壞或感染這些微生物的細(xì)胞裂解。CD8+和CD4+T細(xì)胞兩者都能夠殺死HCV感染的細(xì)胞。細(xì)胞免疫的另一方面包括輔助性T細(xì)胞的抗原-特異性反應(yīng)。輔助性T細(xì)胞發(fā)揮作用來協(xié)助刺激非特異性效應(yīng)細(xì)胞的功能并集中其活性來對抗在其表面展示和MHC分子一起的肽抗原的細(xì)胞?！凹?xì)胞免疫應(yīng)答”也指由活化的T細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒的細(xì)胞因子、趨化因子和其它這類分子(包括那些來自于CD4+和CD8+T細(xì)胞的分子，包括但不限于IFN-γ和TNF-α)的產(chǎn)生。
引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物或疫苗可通過將MHC分子相關(guān)抗原呈遞到細(xì)胞表面來致敏脊椎動物對象。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答直接位于或接近在其表面呈遞抗原的細(xì)胞。此外，可產(chǎn)生抗原特異性T-淋巴細(xì)胞來進(jìn)一步保護(hù)免疫的宿主。
特定抗原刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力可通過許多試驗(yàn)測定，例如通過淋巴組織增生(淋巴細(xì)胞激活)試驗(yàn)、CTL細(xì)胞毒性細(xì)胞試驗(yàn)或通過測定對致敏對象中的抗原特異的T-淋巴細(xì)胞。這種試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Erickson等，J.Immunol.(1993)1514189-4199；Doe等，Eur.J.Immunol.(1994)242369-2376。
因此，本文所用免疫應(yīng)答可以是刺激CTL產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，和/或是刺激輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生或活化的免疫應(yīng)答。感興趣抗原也可引起抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，免疫應(yīng)答可包括下列效果的一種或多種B細(xì)胞產(chǎn)生抗體；和/或抑制子T細(xì)胞和/或γδT細(xì)胞的活化，這些細(xì)胞對感興趣組合物或疫苗中存在的一種或幾種抗原特異。這些應(yīng)答反應(yīng)可用于中和傳染性和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體反應(yīng)或抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)以對宿主保護(hù)(即預(yù)防)或癥狀的或緩解(即治療)。這些反應(yīng)可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測定和中和試驗(yàn)確定。
“等效抗原決定簇”指來自HCV的不同亞種或株的抗原決定簇，例如HCV株1、2、3等，因?yàn)樾蛄凶儺?，這些抗原決定簇不一定完全相同，但是這些決定簇只發(fā)生在所述HCV序列的等效位置。通常，等效抗原決定簇的氨基酸序列具有高度的序列同源性，例如當(dāng)兩個(gè)序列對比時(shí)，具有大于30％的氨基酸序列同源性，較佳地大于40％的氨基酸序列同源性，例如大于60％甚至大于80-90％的同源性。
“編碼序列”或“編碼”所選多肽的序列，是置于合適的調(diào)控序列之下時(shí)體外或體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄(對DNA而言)和翻譯(對mRNA而言)成多肽的核酸分子。編碼序列的邊界是由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定的。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列的3’末端。
“核酸”分子或“多核苷酸”可包括雙鏈-和單鏈序列，包括但不限于，從病毒、原核生物或真核生物mRNA得到的cDNA，從病毒(例如，DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)或原核生物DNA得到的基因組DNA序列，以及(尤其是)合成的DNA序列。該術(shù)語也包括含有任何已知的DNA和RNA堿基類似物的序列。
“操作性連接”指元件的排列，其中所述成分的配置使得可行使其正常功能。因此，操作性連接于編碼序列的給定啟動子在存在合適的轉(zhuǎn)錄因子時(shí)能實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。啟動子無需與編碼序列毗連，只要其能發(fā)揮指導(dǎo)該序列表達(dá)的作用。因此，例如，如轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子那樣，啟動子序列和編碼序列之間可存在插入的不翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列，該啟動子序列仍認(rèn)為是“操作性連接”于編碼序列。
本文的“重組體”用于描述核酸分子，指基因組、cDNA、病毒、半合成或合成來源的多核苷酸，由于其來源或操作，該多核苷酸不與天然狀態(tài)下與其相連的多核苷酸的全部或部分相連。本文中術(shù)語“重組體”與蛋白或多肽相關(guān)時(shí)，指由重組多核苷酸的表達(dá)而產(chǎn)生的多肽。通常，如下進(jìn)一步描述的，克隆感興趣的基因，然后在轉(zhuǎn)化的生物體中表達(dá)。宿主生物體在表達(dá)條件下表達(dá)外源基因以產(chǎn)生蛋白。
“控制元件”指有助于其連接的編碼序列表達(dá)的多核苷酸序列。該術(shù)語包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控結(jié)構(gòu)域、聚腺苷酸信號、非翻譯區(qū)(包括5′-UTRs和3′-UTRs)，合適時(shí)還包括前導(dǎo)序列和增強(qiáng)子，它們合起來提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
本文所用“啟動子”是DNA調(diào)控區(qū)，其能在宿主細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶并啟動與其可操作性連接的下游(3′方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。出于本發(fā)明的目的，啟動子序列包括在高于背景的可檢測水平啟動感興趣基因轉(zhuǎn)錄所需的最少的堿基和元件。在啟動子序列中有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合區(qū)(共有序列)。真核生物啟動子通常但并并非總是含有“TATA”盒和“CAT”盒。
當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合啟動子序列并將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA(然后被翻譯為該編碼序列編碼的多肽)時(shí)，控制序列在細(xì)胞中對編碼序列“指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄”。
“表達(dá)盒”或“表達(dá)構(gòu)建物”指能指導(dǎo)感興趣的序列或基因表達(dá)的組件。表達(dá)盒通常含有控制元件，如可操作性連接于感興趣的序列或基因(以指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄)的如上所述的啟動子，并常常含有聚核苷酸序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本文所述的表達(dá)盒可包含于質(zhì)粒構(gòu)建物中。除了表達(dá)盒的組分以外，質(zhì)粒構(gòu)建物也可含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記、允許質(zhì)粒構(gòu)建物以單鏈DNA存在的信號(例如，M13的復(fù)制起點(diǎn))、至少一個(gè)多克隆位點(diǎn)、以及“哺乳動物”的復(fù)制起點(diǎn)(例如，SV40或腺病毒的復(fù)制起點(diǎn))。
本文所用“轉(zhuǎn)化”指外源多核苷酸插入宿主細(xì)胞，與插入所用的方法無關(guān)例如，用直接攝取、轉(zhuǎn)染、感染等來轉(zhuǎn)化。對于具體的轉(zhuǎn)染方法，下面有進(jìn)一步描述。外源多核苷酸可保持為非整合載體，例如游離基因，或者可整合入宿主基因組。
“宿主細(xì)胞”是已被外源DNA序列轉(zhuǎn)化或能夠被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
術(shù)語“分離的”用于指多肽時(shí)，指所示分子與它天然存在于其中的全生物體分開或分離，或者該分子存在于基本不存在相同類型的其它生物大分子的情況下。當(dāng)術(shù)語“分離的”涉及多核苷酸時(shí)，指全部或部分缺乏在天然狀態(tài)下與其相連的序列的核酸分子；或指一序列，雖然以天然狀態(tài)存在，但連接有異源序列；或與染色體分離的分子。
本文所用術(shù)語“純化”優(yōu)選指存在至少75重量％，更優(yōu)選至少85重量％，更優(yōu)選至少95重量％，最優(yōu)選至少98重量％的相同類型的生物大分子。
“同源性”指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分間的百分比同一性。當(dāng)兩個(gè)DNA或兩個(gè)多肽序列在確定的分子長度上表現(xiàn)出至少約50％、優(yōu)選至少約75％、更優(yōu)選至少約80-85％、優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選至少約95-98％的序列同一性時(shí)，這兩個(gè)序列彼此“顯著同源”。如本文所用，顯著同源也指表現(xiàn)出與特定的DNA或多肽序列具有完全同一性的序列。
一般，“同一性”分別指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確核苷-核苷或氨基酸-氨基酸對應(yīng)。百分比同一性可通過比對序列、計(jì)算兩個(gè)比對序列間配對的確切數(shù)字、除以較短序列長度并將結(jié)果乘以100，而直接比較兩個(gè)分子間序列信息來確定。非常容易獲得的計(jì)算機(jī)程序可用于協(xié)助分析，如ALIGN，Dayhoff，M.O.，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)集(Atlas of Protein Sequence and Structure)M.O.Dayhoff編，5 Suppl.3353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC，它采用了Smith和Waterman的局部同源性算法，Advances inAppl.Math.2482-489，1981用于肽分析。確定核苷序列同一性的程序可獲自Wisconsin序列分析包，第8版(來自Genetics Computer Group，Madison，WI)例如BESTFIT、FASTA、GAP程序，它們也依賴于Smith和Waterman算法。這些程序使用廠商建議和上述Wisconsin序列分析包中所述缺省參數(shù)。例如涉及序列的具體核苷序列的百分比同一性可用Smith和Waterman同源性算法確定，采用六個(gè)核苷位置的缺省記錄表和缺口罰分(gap penalty)。
另一種在本發(fā)明中確定百分比同一性的方法是使用MPSRCH程序包，其版權(quán)屬于愛丁堡大學(xué)，由John F.Collins和Shane.S.Sturrok開發(fā)，InteliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分銷。Smith和Waterman算法可用于此程序包，其中在記錄表中使用了缺省參數(shù)(例如，缺口罰分為12，缺口延伸罰分為1，缺口為6)。從數(shù)據(jù)中產(chǎn)生的“匹配”值反映了“序列同一性”。其它計(jì)算序列間百分比同一性或類似性的適當(dāng)程序一般在本領(lǐng)域中已知，例如其它對比程序有采用缺省參數(shù)的BLAST。例如，可用采用以下缺省參數(shù)的BLASTN和BLASTP遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；濾器(filter)＝無；鏈＝兩者；截止＝60；期望值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50個(gè)序列；排序＝高分；數(shù)據(jù)庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序的詳細(xì)描述可在NCBI的網(wǎng)站上找到。
另外，可通過在同源區(qū)域間形成穩(wěn)定雙鏈的條件下雜交多核苷酸，接著用單鏈-特異核酸酶消化并確定消化片段大小來確定同源性。顯著同源的DNA序列可在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中鑒定，在例如此具體系統(tǒng)定義的嚴(yán)格條件下。定義適當(dāng)雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。參見例如Sambrook等，同上；《DNA克隆》，同上；《核酸雜交》，同上。
“核酸免疫”指將編碼一種或多種所選免疫原的核酸分子引入宿主細(xì)胞，以進(jìn)行所述一種或多種免疫原的體內(nèi)表達(dá)。核酸分子可直接引入接受者，例如通過注射、吸入、口服、鼻內(nèi)和粘膜施用等；或者可離體引入取自宿主的細(xì)胞。后一種情況中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再次引入對象從而在對象中引發(fā)抗核酸分子編碼的抗原的免疫應(yīng)答。
本文所用“治療”指下述的任何情況(i)感染或再感染的預(yù)防，如傳統(tǒng)疫苗，(ii)癥狀的減輕或消除，和(iii)感興趣病原體的基本或完全清除?？深A(yù)防性(在感染之前)或治療性(感染之后)進(jìn)行治療。
“脊椎動物對象”指脊索動物亞門的任一成員，包括(不限于)人和其它靈長類，包括非人靈長類，如猩猩和其它猿類和猴類；農(nóng)畜，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動物，如小鼠、大鼠、兔和豚鼠等嚙齒類；鳥，包括家養(yǎng)、野生和狩獵野禽，如雞、火雞和其它家禽，鴨、鵝等。該術(shù)語不指明具體的年齡。所以，包括了成年的和新生的個(gè)體。由于所有這些脊椎動物的免疫系統(tǒng)的運(yùn)作是相似的，所以本發(fā)明可用于以上任何的脊椎動物種類。
II.實(shí)施本發(fā)明的方式在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是本發(fā)明不受具體制劑或方法參數(shù)的限制，因?yàn)檫@些參數(shù)當(dāng)然是可變的。也應(yīng)該理解的是，本文使用的術(shù)語僅用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案并非限制性的。
雖然很多與本文所述組合物和材料類似或等價(jià)的組合物和材料可用于實(shí)踐本發(fā)明，但本文所述的材料和方法最佳。
本發(fā)明涉及HCV NS5多肽，所述多肽含有全長HCV NS5a多肽和C末端截短的HCV NS5b多肽的一部分。本發(fā)明還涉及融合蛋白和編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白含有截短的NS5多肽和HCV多蛋白的至少一種其它HCV多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)，例如體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，用于例如激活HCV特異性T細(xì)胞(即識別這些多肽表位的T細(xì)胞)和/或引發(fā)輔助性T細(xì)胞的產(chǎn)生、和/或刺激抗病毒的細(xì)胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生。這些融合蛋白對HCV特異性T細(xì)胞的活化提供了發(fā)展HCV疫苗的體外和體內(nèi)模型，尤其是鑒定與免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)的HCV多肽表位的模型。這些蛋白也可用于在哺乳動物中產(chǎn)生抗HCV的免疫應(yīng)答反應(yīng)，例如CTL反應(yīng)，和/或引發(fā)CD8+和CD4+T細(xì)胞以產(chǎn)生抗病毒制劑，用于治療性或預(yù)防性目的。
因此，這些蛋白可用于治療和/或預(yù)防HCV感染。這些蛋白可單獨(dú)使用或與一種或多種細(xì)菌或病毒免疫原組合。這些組合可包括來自相同病原體的多種免疫原、來自不同病原體的多種免疫原或來自相同或不同病原體的多種免疫原。因此，細(xì)菌、病毒和/或其它免疫原可與NS5多肽包括在同一組合物中，或可與NS5多肽分開給予同一對象，或甚至與NS5多肽包括在融合蛋白中。如下進(jìn)一步描述，尤其有用的是NS5多肽和其它HCV免疫原的組合。
而且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可用作診斷試劑以在生物樣品中檢測HCV感染。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下文提供更詳細(xì)的描述，涉及融合蛋白用于本發(fā)明組合物的融合蛋白、該蛋白的生產(chǎn)、包含該蛋白的組合物以及使用該蛋白的方法。
融合蛋白HCV菌株基因組含有約9,000-12,000核苷酸的一個(gè)開放閱讀框，轉(zhuǎn)錄為多蛋白。如圖1和表1所示，HCV多蛋白裂解后產(chǎn)生至少10個(gè)不同的產(chǎn)物，順序?yàn)镹H2-核心(Core)-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。核心多肽在氨基酸位置1-191處(編號相對于HCV-1)(見，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA882451-2455，HCV-1基因組)。該多肽被進(jìn)一步加工產(chǎn)生約氨基酸1-173的HCV多肽。包膜多肽，E1和E2，分別在氨基酸位置192-383和384-746處。P7結(jié)構(gòu)域在氨基酸位置747-809處。NS2是具有蛋白水解活性的整合膜蛋白，約位于多蛋白的氨基酸810-1026處。N2與NS3結(jié)合(約在氨基酸位置1027-1657處)，裂解NS2-NS3 sissle鍵，從而產(chǎn)生NS3 N-末端并釋放包括絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大的多蛋白。NS3蛋白酶約在氨基酸位置1027-1207處，用于加工剩余的多蛋白。解旋酶活性約在氨基酸位置1193-1657處。NS3釋放NS3輔因子(NS4a，約在氨基酸位置1658-1711)、兩種蛋白(NS4b，約在氨基酸位置1712-1972；和NS5a，約在氨基酸位置1973-2420)和RNA-依賴的RNA聚合酶(NS5b，約在氨基酸位置2421-3011)。多蛋白成熟的完成開始于NS3絲氨酸蛋白酶催化的在NS3-NS4a連接處的自身催化裂解。

*編號相對于HCV-1。見，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA882451-2455。
本發(fā)明的融合蛋白包括C末端截短的NS5多肽(本文也稱為“NS5t”)。具體地，所述C末端截短的NS5多肽含有全長NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分。C末端截短的多肽可在氨基酸2500和C末端之間的位置被截短(編號相對于全長HCV-1多蛋白)，如在氨基酸2505...2550...2600...2650...2700...2750...2800...2850...2900...2950...2960...2970...2975...2980...2985...2990...2995...3000等之后，編號相對于全長HCV-1序列。顯而易見的是，該分子可在2500至3010之間的任何氨基酸處截短，編號相對于全長HCV-1序列。一個(gè)尤其優(yōu)選的NS5多肽是在對應(yīng)于緊隨氨基酸2990之后的氨基酸的氨基酸處截短(編號相對于全長HCV-1多蛋白)，包含對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列(編號相對于全長HCV-1多蛋白)。這種構(gòu)建物的序列如SEQ ID NO8(標(biāo)記為圖5A-5E的氨基酸1973-2990)的氨基酸位置1-1018所示。本發(fā)明的融合蛋白任選地有N末端甲硫氨酸用于表達(dá)。
C末端截短的NS5多肽可單獨(dú)使用于下述的組合物中，或與衍生自HCV多蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域中的任何結(jié)構(gòu)域的一種或多種HCV免疫原性多肽聯(lián)用。其它的HCV多肽可分開提供或可在融合蛋白中提供。實(shí)際上，融合蛋白可包括HCV多蛋白的所有區(qū)域。這些多肽可與NS5多肽衍生自相同的HCV分離物，或來自不同的菌株和分離物，包括各種HCV基因型的任何基因型的分離物，以提供針對多種HCV基因型的增強(qiáng)的保護(hù)。此外，可根據(jù)要使用含有融合蛋白的疫苗組合的具體地理區(qū)域中地方性的、特定病毒進(jìn)化枝來選擇多肽。顯而易見的是，本發(fā)明的融合蛋白提供了廣泛意義上治療HCV感染的有效工具。
因此，NS5t可包括在融合蛋白中，所述融合蛋白包括NS5t和來自HCV多蛋白的其它結(jié)構(gòu)域的一種或多種免疫原性HCV蛋白，即NS5t與E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4和/或核心多肽組合。這些區(qū)域的順序不必與它們在天然狀態(tài)下的順序一樣。而且，各區(qū)域可來自相同或不同的HCV分離物。本文所述的各種融合蛋白中的各種HCV多肽可以是全長多肽或全長多肽的部分。組成融合蛋白的HCV多肽的部分一般包括至少一個(gè)表位，該表位被活化的T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識別，如2152-HEYPVGSQL-2160(SEQ ID NO1)和/或2224-AELIEANLLWRQEMG-2238(SEQ ID NO2)?？捎脦追N方法來鑒定表位。例如，可用某多肽或蛋白的單克隆抗體來進(jìn)行免疫親和純化，從而分離包含上述任意組合的單個(gè)多肽或融合蛋白。然后，可通過純化的蛋白的蛋白水解斷裂來制備一系列的短肽(所有這些多肽跨越了整個(gè)蛋白序列)，從而篩選分離的蛋白序列。開始時(shí)，例如，多個(gè)100-mer的多肽，可檢測各多肽上是否存在被HCV活化的T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識別的表位，然后可在已鑒定到的100-mer多肽中檢測更小的、重疊的片段，以定位感興趣的表位。
可用例如51Cr釋放試驗(yàn)或淋巴組織增生試驗(yàn)(見實(shí)施例)來鑒定被HCV活化的T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識別的表位。在51Cr釋放試驗(yàn)中，可通過將編碼表位的多核苷酸克隆到表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到靶細(xì)胞中，來構(gòu)建展示所述表位的靶細(xì)胞。HCV特異性CD8+T細(xì)胞將裂解展示(例如)來自融合蛋白中HCV多蛋白的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的一種或多種表位的靶細(xì)胞，但不裂解不展示這種表位的細(xì)胞。在淋巴組織增生試驗(yàn)中，當(dāng)與例如來自融合蛋白中HCV多蛋白的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的一種或多種表位一起培養(yǎng)時(shí)，HCV活化的CD4+T細(xì)胞將增殖，但在缺少HCV表位肽時(shí)則不增殖。
各種HCV多肽在融合蛋白中可以是各種順序。如果需要，融合蛋白中可存在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)或更多個(gè)一種或多種所述的多肽。有多個(gè)HCV病毒株，任何這些病毒株的HCV多肽都可用于融合蛋白中。
已確定了很多HCV病毒株和分離物的核酸和氨基酸序列，包括HCV多蛋白的各個(gè)區(qū)域的核酸和氨基酸序列，包括核心多肽、NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5b基因和多肽。例如，分離物HCV J1.1描述于Kubo等，(1989)日本.Nucl.Acids Res.1710367-10372；Takeuchi等，(1990)Gene 91287-291；Takeuchi等，(1990)J.Gen.Virol.713027-3033；和Takeuchi等，(1990)Nucl.Acids Res.184626。兩種獨(dú)立的分離物，HCV-J和BK的完整編碼序列分別描述于Kato等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA879524-9528和Takamizawa等，(1991)J.Virol.651105-1113。
描述HCV-1分離物的出版物包括Choo等，(1990)Brit.Med.Bull.46423-441；Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA882451-2455和Han等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA881711-1715。HCV分離物HC-J1和HC-J4描述于Okamoto等，(1991)日本J.Exp.Med.60167-177。HCV分離物HCT18～，HCT23，Th，HCT27，EC1和EC10描述于Weiner等，(1991)Virol.180842-848。HCV分離物Pt-1，HCV-K1和HCV-K2描述于Enomoto等，(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.1701021-1025。HCV分離物A，C，D & E描述于Tsukiyama-Kohara等，(1991)VirusGenes 5243-254。
如上所述，融合蛋白的各組分可獲自相同的HCV病毒株或分離物，或獲自不同的HCV病毒株或分離物。例如，NS5多肽可衍生自HCV的第一病毒株，融合蛋白中存在的其它HCV多肽可衍生自HCV的第二病毒株。或者，其它HCV多肽的一種或多種，例如NS2，NS3，NS4，核心多肽，p7，E1和/或E2，如果存在的話，可衍生自HCV的第一株，剩余的HCV多肽可衍生自HCV的第二株。另外，融合蛋白中存在的各HCV多肽可衍生自不同的HCV病毒株。
用于本發(fā)明融合蛋白的獲自HCV區(qū)域的各種HCV表位的描述見例如Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等，國際出版號WO 93/00365；Chien，D.Y.，國際出版號WO94/01778；和美國專利號6,280,927和6,150,087。
例如，融合蛋白可包括C末端截短的NS5多肽和NS3多肽。NS3多肽可被修飾以抑制其蛋白酶活性從而阻止該融合蛋白被進(jìn)一步斷裂(本文也稱為“NS3*”)。可缺失NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的全部或部分來修飾NS3多肽。或者，可在蛋白酶結(jié)構(gòu)域的活性區(qū)域進(jìn)行氨基酸取代來抑制蛋白酶活性。最后，在該結(jié)構(gòu)域的活性區(qū)域加入氨基酸從而修飾催化位點(diǎn)，也可起到抑制蛋白酶活性的作用。
如上所述，蛋白酶活性約位于氨基酸1027-1207，編號相對于全長HCV-1多蛋白(見，Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)882451-2455)，圖2的氨基酸位置2-182。NS3蛋白酶和活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)是已知的。見例如，De Francesco等，Antivir.Ther.(1998)399-109；Koch等，Biochemistry(2001)40631-640。因此，對天然序列的缺失或修飾通常發(fā)生在該分子活性位點(diǎn)處或其附近。具體地，在圖2的氨基酸位置1-或2-182、優(yōu)選1-或2-170、或1-或2-155處修飾或缺失是可得到滿意的效果。優(yōu)選的修飾是對蛋白酶活性位點(diǎn)處催化性三聯(lián)體(triad)進(jìn)行修飾，即修飾H，D和/或S殘基，以失活蛋白酶。這些殘基分別在氨基酸1083、1105和1165，編碼相對于全長HCV多蛋白(分別是圖2中的氨基酸位置58、80和140)。這些修飾將抑制蛋白水解斷裂而保持T細(xì)胞表位。一個(gè)尤其優(yōu)選的修飾是用丙氨酸取代Ser-1165。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可容易地確定為了破壞蛋白酶活性而要缺失的NS3蛋白酶的部分?？捎帽绢I(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法來測定蛋白酶活性的存在與否。
例如，可用下文實(shí)施例中所述的方法以及本領(lǐng)域熟知方法的來測定蛋白酶活性是否存在。見例如，Takeshita等，Anal.Biochem.(1997)247242-246；Kakiuchi等，J.Biochem.(1997)122749-755；Sali等，Biochemistry(1998)373392-3401；Cho等，J.Virol.Meth.(1998)72109-115；Cerretani等，Anal.Biochem.(1999)266192-197；Zhang等，Anal.Biochem.(1999)270268-275；Kakiuchi等，J.Virol.Meth.(1999)8077-84；Fowler等，J.Biomol.Screen.(2000)5153-158；和Kim等，Anal.Biochem.(2000)28442-48。
圖3表示代表性的修飾的NS3多肽，從N末端刪除了NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域，包括了C末端核心多肽的氨基酸1-121。
如上所述，在本發(fā)明融合蛋白中包括來自HCV多蛋白核心區(qū)域的多肽可能是有利的。該區(qū)域在HCV多蛋白的氨基酸1-191處，編號相對于HCV-1。全長蛋白、其片段，如氨基酸1-160，例如氨基酸1-150，1-140，1-130，1-120，例如，氨基酸1-121，1-122，1-123...1-151等、或含有全長蛋白的表位的更小的片段均可用于本發(fā)明融合蛋白中，例如在氨基酸10-53，氨基酸10-45，氨基酸67-88，氨基酸120-130發(fā)現(xiàn)的那些表位，或在例如以下出版物中鑒定到的任何核心表位Houghton等，美國專利號5,350,671；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)8910011-10015；Chien等，J. Gastroent.Hepatol.(1993)8S33-39；Chien等，國際出版號WO93/00365；Chien，D.Y.，國際出版號WO94/01778；和美國專利號6,280,927和6,150,087。而且，可用HCV多蛋白的核心區(qū)域移碼而產(chǎn)生的蛋白，如國際出版號WO99/63941中所述。一種尤其理想的用于本發(fā)明融合蛋白的核心多肽包括圖3的氨基酸1772-1892位置所示的氨基酸序列。該核心多肽包括HCV多蛋白的氨基酸1-121，以及共有氨基酸Arg-9和Thr-11(分別位于圖3的1780和1782位)。圖5A-5E(SEQ ID NO7和8)表示代表性融合蛋白的DNA和相應(yīng)氨基酸序列，所述融合蛋白包括NS5多肽的C末端融合于該核心多肽的C末端截短的NS5多肽。C末端截短的NS5多肽包括HCV多蛋白的氨基酸1973-2990，編號相對于HCV-1(見，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882451-2455)，(SEQ ID NO7的氨基酸1-1018)，融合于如上所述包括HCV多蛋白的氨基酸1-121的核心多肽(SEQ ID NO7的氨基酸1019-1139)。
如果存在核心多肽，它可存在于融合蛋白的N末端、C末端和/或中部。尤其優(yōu)選的是C末端的核心多肽，因?yàn)樗试S與某些下文進(jìn)一步描述的佐劑如ISCOM形成復(fù)合物。
其它可用于HCV融合蛋白中的多肽包括衍生自多蛋白多個(gè)區(qū)域中的任何區(qū)域的T細(xì)胞表位。在這方面，已知E1、E2、p7和NS2含有人T細(xì)胞表位(CD4+和CD8+)，并包括這些表位中的一種或多種以用于增加疫苗效力和增加抗多種HCV基因型的保護(hù)水平。而且，多拷貝的特定的、保守T細(xì)胞表位也可用于融合蛋白中，例如不同基因型的表位的組合。
例如，來自HCV E1和/或E2區(qū)的多肽可用在本發(fā)明的融合蛋白中。E2作為多個(gè)種類存在(Spaete等，Virol.(1992)188819-830；Selby等，J.Virol.(1996)705177-5182；Grakoui等，J.Virol.(1993)671385-1395；Tomei等，J.Virol.(1993)674017-4026)，剪切和蛋白水解可發(fā)生在E2多肽的N末端和C末端。因此，本文所用E2多肽可包括HCV多蛋白的氨基酸405-661，例如，400、401、402...至661，以及多肽如383或384-661，383或384-715，383或84-746，383或384-749或383或384-809，或383或384至661-809之間的任何C末端，編號相對于全長HCV-1多蛋白。同樣，本文所用E1多肽可包括HCV多蛋白的氨基酸192-326、192-330、192-333、192-360、192-363、192-383、或192至326-383之間的任何C末端。
包括表位的E1和/或E2的免疫原性片段也可用于本發(fā)明融合蛋白中。例如，E1多肽的片段可包括該分子的約5個(gè)氨基酸至幾乎全長的氨基酸，例如E1多肽的6，10，25，50，75，100，125，150，175，185或更多個(gè)氨基酸，或所述數(shù)字之間的任何整數(shù)。類似地，E2多肽的片段可包括E2多肽的6，10，25，50，75，100，150，200，250，300，或350個(gè)氨基酸，或所述數(shù)字之間的任何整數(shù)。
例如，衍生自E2高可變區(qū)如跨越氨基酸384-410或390-410的區(qū)域的表位也包括在融合蛋白中?？蓳饺隕2多肽序列的尤其有效的E2表位包括衍生自該區(qū)域的共有序列，例如共有序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn，其代表HCVI型基因組的氨基酸390-410的共有序列。E1和E2的其它表位是已知的，描述于，例如，Chien等，國際出版號WO93/00365。
而且，E1和/或E2多肽可缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的全部或部分。對E1而言，通常約在氨基酸370或氨基酸數(shù)字更大處(編號相對于HCV-1多蛋白)終止的多肽將保留在ER中，因此不分泌到培養(yǎng)基中。對E2而言，約在氨基酸731或氨基酸數(shù)字更大處終止的多肽(編號也相對于HCV-1多蛋白)將被ER保留而不分泌。(見，例如，國際出版號WO96/04301，1996年2月15日出版)。應(yīng)注意，這些氨基酸位置不是絕對的，在一定程度上可變。因此，本發(fā)明考慮使用保留跨膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的E1和/或E2多肽，以及缺乏跨膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的全部或部分的多肽，包括約在氨基酸369或數(shù)字更小處終止的E1多肽，和約在氨基酸730或數(shù)字更小處終止的E2多肽。此外，C末端截短可延伸到跨膜結(jié)構(gòu)域之外直至N末端。因此，例如，本發(fā)明也考慮發(fā)生在低于如氨基酸360處的E1截短，和發(fā)生在低于如氨基酸715處的E2截短。唯一必須保證的是截短的E1和E2多肽保留了實(shí)現(xiàn)其預(yù)設(shè)目的的功能。然而，尤其優(yōu)選的截短的E1構(gòu)建物不延伸過約氨基酸300。最優(yōu)選的是在氨基酸360處終止。優(yōu)選的截短的E2構(gòu)建物是C末端截短不超過約氨基酸715的構(gòu)建物。尤其優(yōu)選的E2截短是在氨基酸715-730的任何氨基酸例如氨基酸725之后截短的分子。
在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白包括HCV的修飾的NS3、NS4(NS4a和NS4b)、C末端截短的NS5，和任選的核心多肽(NS3*NS4NS5t或NS3*NS4NS5tCore融合蛋白，表位也稱為“NS3*45t”和“NS3*45tCore”)。這些區(qū)域的順序不一定和它們在天然HCV多蛋白中的順序一樣。因此，例如核心多肽可在融合蛋白的N-和/或C-末端。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，NS5t包括氨基酸1973-2990，編號相對于全長HCV-1多蛋白，NS3*分子包括通常在氨基酸1165處發(fā)現(xiàn)的Ser至Ala的取代，這些區(qū)域從N末端至C末端的順序?yàn)镹S3*NS4NS5t。該融合蛋白可在該分子的C末端包括核心多肽。如果存在的話，核心多肽優(yōu)選包括圖3氨基酸位置1772-1892所示氨基酸序列。該核心多肽包括HCV多蛋白的氨基酸1-121，以及共有氨基酸Arg-9和Thr-11(分別在圖3的氨基酸1780和1782)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上文剛剛描述的融合蛋白包括位于NS3*之前的N末端的E2多肽。優(yōu)選地，該E2多肽是C末端截短的多肽，并且包括氨基酸384-715，編號相對于全長HCV-1多蛋白。該融合蛋白還可任選地包括上述核心多肽。
如果需要，融合蛋白或這些蛋白質(zhì)的獨(dú)立組分也可含有其它氨基酸序列，例如氨基酸接頭或信號序列，以及可用于蛋白純化的配體，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和葡萄球菌蛋白A。
編碼融合蛋白的多核苷酸多核苷酸含有的核苷酸少于整個(gè)HCV基因組，或多核苷酸可含有上述帶有C末端截短的NS5結(jié)構(gòu)域的整個(gè)多蛋白序列。多核苷酸可以是RNA或單鏈-或雙鏈DNA。優(yōu)選地，多核苷酸被分離成不含有其它組分，例如蛋白質(zhì)和脂類。這些多核苷酸編碼上述的融合蛋白，因此含有編碼NS5t和來自HCV多蛋白的不同區(qū)域的至少一種其它HCV多肽(例如衍生自NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，核心蛋白等的多肽)的編碼序列。本發(fā)明的多核苷酸也可含有其它核苷酸序列，例如編碼接頭、信號序列、用于蛋白純化的配體(例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和葡萄球菌蛋白A)的序列。
為有助于表達(dá)產(chǎn)量，將多蛋白分裂成多個(gè)表達(dá)片段可能是有利的。這些片段可與上述的組合物組合使用?；蛘撸@些片段可連在一起依次表達(dá)。因此，例如，NS3*NS4可表達(dá)為一個(gè)構(gòu)建物，NS5tCore可表達(dá)為另一構(gòu)建物，這兩種蛋白按順序融合或分開加入到組合中。類似地，E2NS3*NS4可表達(dá)為一個(gè)構(gòu)建物，NS5tCore可表達(dá)為另一構(gòu)建物。應(yīng)理解，上述組合只是代表性的，融合蛋白的任何組合都可獨(dú)立地表達(dá)。
編碼各種HCV多肽的多核苷酸可分離自基因組文庫，所述基因組文庫衍生自存在于如HCV感染個(gè)體的血漿、血清或肝勻漿的核酸序列，或在實(shí)驗(yàn)室中合成，例如，用自動合成儀合成。擴(kuò)增方法例如PCR可用于從編碼某多核苷酸的HCV基因組DNA或cDNA擴(kuò)增所述多核苷酸。
多核苷酸可包括這些天然存在或天然條件下不存在的人工序列的多肽的編碼序列?？捎脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將這些核苷酸連接起來形成編碼融合蛋白的編碼序列?？蓪⒕幋a這些蛋白的多核苷酸引入表達(dá)載體中，表達(dá)載體可在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。本領(lǐng)域有很多細(xì)菌、酵母、哺乳動物和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，可采用任何的這些表達(dá)系統(tǒng)。任選地，可將編碼這些蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化到不含細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)中。本領(lǐng)域熟知這類方法。也可用固相蛋白質(zhì)合成來構(gòu)建蛋白。
采用標(biāo)準(zhǔn)的基因遞送方法，可將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物，包括所需的融合蛋白或包括這些融合蛋白的單獨(dú)組分的單獨(dú)的表達(dá)構(gòu)建物，用于核酸免疫，以刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)?；蜻f送的方法是本領(lǐng)域已知的。見，例如，美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466?？蓪⒒蛑苯舆f送到脊椎動物對象中，或者，離體遞送到衍生自對象的細(xì)胞中，然后將細(xì)胞再植入到該對象中。例如，構(gòu)建物可作為質(zhì)粒DNA遞送，例如包含在質(zhì)粒例如pBR322、pUC或ColE1中。
此外，本發(fā)明的表達(dá)盒在遞送至這些細(xì)胞之前可包裝在脂質(zhì)體中。一般使用能穩(wěn)定結(jié)合或截獲和保留核酸的脂質(zhì)體來實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)包囊化。濃縮的DNA與脂質(zhì)制劑之比可變，但通常在約1∶1(mg DNA∶微摩爾脂質(zhì))或更多脂質(zhì)。使用脂質(zhì)體作為遞送核酸的載體的綜述，參見，Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)10971-17；Straubinger等，《酶學(xué)方法》(Methods of Enzymology)，(1983)，第101卷，512-527頁。
用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽離子(帶正電)、陰離子(帶負(fù)電)和中性制劑，特別優(yōu)選陽離子脂質(zhì)體。陽離子脂質(zhì)體可容易地獲得。例如脂質(zhì)體N[1-2，3-二油酰氧基]丙基]-N，N，N-三乙基銨(DOTMA)以商品名Lipofectin來源于GIBCOBRL，Grand Island，NY。(也參見，F(xiàn)elgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)847413-7416)。其它市售可得的脂質(zhì)包括(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽離子脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從易得的材料制備。參見，例如描述DOTAP(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙烷)脂質(zhì)體合成的Szoka等，Proe.Natl.Acad.Sci.USA(1978)754194-4198；PCT國際公布號WO90/11092。用本領(lǐng)域已知的各種方法制備各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。見，例如，Straubinger等，METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)，第101卷，pp.512-527；Szoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)754194-4198；Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975)394483；Wilson等，Cell(1979)1777)；Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta(1976)443629；Ostro等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977)76836；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)763348)；Enoch和Strittmatter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76145)；Fraley等，J.Biol.Chem.(1980)25510431；Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75145；以及Schaefer-Ridder等，Science(1982)215166。
DNA也可在與Papahadjopoulos等，Biochem.Biophys.Acta.(1975)394483-491所述類似的蝸形脂質(zhì)組合物中遞送。也見美國專利號4,663,161和4,871,488。
已經(jīng)開發(fā)了許多將基因輸送到哺乳動物細(xì)胞的基于病毒的系統(tǒng)。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒是基因輸送系統(tǒng)的一個(gè)便捷平臺，如鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、莫羅尼氏小鼠白血病毒和魯斯氏肉瘤病毒?？蓪⑺x基因插入載體并用本領(lǐng)域已知的技術(shù)包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒。然后分離重組病毒并將在體內(nèi)或離體將其輸送到受試者細(xì)胞。已經(jīng)描述過許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(美國專利No.5,219,740；Miller& Rosman，BioTechniques(1989)7980-990；Miller，A.D.，Human GeneTherapy(1990)15-14；Scarpa等，Virology(1991)180849-852；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)908033-8037；和Boris-Lawrie & Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3102-109。簡言之，可用很多逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括例如B、C和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒以及泡沫病毒(spumaviruses)和慢病毒如FIV，HIV，HIV-1，HIV-2和SIV(見RNA Tumor Viruses，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，1985)，來容易地構(gòu)建本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒可容易地獲自保藏或儲藏機(jī)構(gòu)例如美國模式培養(yǎng)物保藏中心(″ATCC″；10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)，或用一般可獲得的技術(shù)從已知來源分離。
許多腺病毒載體也已被描述，如腺病毒2型和5型載體。與被整合入宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒保留在染色體外，因此可使與插入誘變有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)最小(Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)57267-274；Bett等，J.Virol.(1993)675911-5921；Mittereder等，Human Gene Therapy(1994)5717-729；Seth等，J.Virol.(1994)68933-940Barr等，Gene Therapy(1994)151-58；Berkner，K.L.BioTechniques(1988)6616-629；和Rich等，Human Gene Therapy(1993)4461-476)。
分子偶聯(lián)載體，如Michael等[J.Biol.Chem.(1993)2686866-6869]和Wagner等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)896099-6103]所述的腺病毒嵌合載體也可用于基因輸送。
α病毒屬的成員，例如但不限于衍生自Sindbis和Semliki Forest病毒、VEE的載體，也可用作病毒載體以遞送感興趣的基因。關(guān)于可用于實(shí)施本發(fā)明方法的Sindbis-病毒衍生的載體的描述，可見Dubensky等，J.Virol.(1996)70508-519；和國際公開號WO95/07995和WO96/17072。
也可用其它載體，包括但不限于腺病毒相關(guān)病毒載體、猿猴病毒40和細(xì)胞巨化病毒。也可用細(xì)菌載體，例如沙門氏菌(Salmonella ssp.)，小腸結(jié)腸炎耶爾森(氏)菌(Yersinia enterocolitica)，志賀氏桿菌(Shigella spp.)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，分枝桿菌(Mycobacterium)菌株BCG和單核球增多性李斯特菌(Listeriamonocytogene)。也可用微型染色體如MC和MC1、噬菌體、粘粒(插入噬菌體λcos位點(diǎn)的質(zhì)粒)和復(fù)制子(在細(xì)胞中可在它們自己的控制下進(jìn)行復(fù)制的遺傳元件)。
表達(dá)構(gòu)建物也可包囊入、吸附入顆粒載體或與之相結(jié)合。這種載體將多個(gè)拷貝的所選分子呈遞給免疫系統(tǒng)，并促進(jìn)分子在局部淋巴節(jié)中的捕獲和保留。這些顆?？捎删奘燃?xì)胞吞噬并能通過細(xì)胞因子釋放來增強(qiáng)抗原呈遞。顆粒載體的例子包括來源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及來源于聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(稱為PLG)的微粒。見，例如，Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10362-368；和McGee等，J.Microencap.(1996)。
很多其它的方法可用于遞送表達(dá)構(gòu)建物到細(xì)胞中。這些方法包括DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、多聚賴氨酸-或多聚鳥氨酸介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或用其它不溶性無機(jī)鹽沉淀，例如磷酸鍶、硅酸鋁包括膨潤土和高嶺土、氧化鉻、硅酸鎂、滑石等。其它可用于轉(zhuǎn)染的方法包括電穿孔、超聲波、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、擬肽遞送或顯微注射。見，例如，Sambrook等，同上，描述了轉(zhuǎn)化感興趣細(xì)胞的技術(shù)；和Felgner，P.L.，Advanced Drug Delivery Reviews(1990)5163-187，關(guān)于可用于基因轉(zhuǎn)移的遞送系統(tǒng)的綜述。用電穿孔遞送DNA的一種尤其有效的方法描述于國際出版號WO/0045823。
此外，采用顆粒載體如金或鎢的生物遞送系統(tǒng)在遞送本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物時(shí)尤其有用。用待遞送的構(gòu)建物涂覆顆粒，一般在減壓下用“基因槍”的彈藥排放(gunpowder discharge)將顆粒加速到高速。關(guān)于這種技術(shù)的描述以及有用的設(shè)備，參見，例如，美國專利號4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,179,022；5,371,015；和5,478,744。
含有融合蛋白或多核苷酸的組合物本發(fā)明還提供包含融合蛋白或多核苷酸的組合物。如上所述，這些組合物可用于刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)。這些組合物可包含一種或多種融合蛋白，只要其中的一種融合蛋白包含如上所述C末端截短的NS5。本發(fā)明的組合物也可包含藥學(xué)上可接受的載體。載體本身不應(yīng)該誘導(dǎo)產(chǎn)生對宿主有害的抗體。藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域熟知的。這些載體包括但不限于，大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖，例如乳膠官能化的瓊脂糖(sepharose)，瓊脂糖(agarose)，纖維素，纖維素珠等，聚乳酸，聚乙醇酸，多聚氨基酸例如多聚谷氨酸、多聚賴氨酸等，氨基酸共聚物，和滅活的病毒顆粒。
藥學(xué)上可接受的鹽也可用于本發(fā)明組合物中，例如礦物質(zhì)鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽，以及有機(jī)酸的鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。尤其有用的蛋白質(zhì)底物是血清白蛋白、鑰孔戚血藍(lán)素、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風(fēng)毒素和其它本領(lǐng)域熟知的其它蛋白質(zhì)。本發(fā)明的組合物也可含有單獨(dú)的或組合的液體或賦形劑，例如水、鹽水、甘油、葡萄糖、乙醇等，以及濕潤劑、乳化劑或pH緩沖劑等物質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多核苷酸也可吸收到、或陷入脂質(zhì)體和顆粒載體例如PLG中，或與其結(jié)合。脂質(zhì)體和其它顆粒載體如上所述。
如果需要，可在組合物中包括提高對淋巴細(xì)胞的免疫原呈遞的共刺激分子，例如B7-1或B7-2，或細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，包括但不限于細(xì)胞因子如IL-2、修飾的IL-2(cys125變?yōu)閟er125)、GM-CSF、IL-12、γ-干擾素、IP-10、MIP1β、FLP-3、病毒唑和RANTES。任選地，可在組合物中包含佐劑。可用的佐劑包括但不限于(1)鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳劑(有或沒有其它的特定免疫刺激物，例如胞壁酰肽(見下)或細(xì)菌細(xì)胞壁組分)，例如(a)MF59(PCTPubl.No.WO90/14837)，含有5％鯊烯，0.5％TWEEN 80，和0.5％SPAN 85(任選地含有各種量的MTP-PE)，用微流化器如Model 110Y微流化器(Microfluidics，Newton，MA)將其配制到亞微米顆粒中，(b)SAF，含有10％鯊烯，0.4％TWEEN 80，5％普盧蘭尼克(pluronic)-嵌段聚合物L(fēng)121，和thr-MDP(見下)，微流化成亞微米乳液或渦旋以產(chǎn)生大顆粒尺寸的乳液，和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(RibiImmunochem，Hamilton，MT)，含有2％鯊烯，0.2％TWEEN 80，和選自以下的細(xì)菌細(xì)胞壁組分的一種或多種單磷酸類脂A(MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和細(xì)胞膜骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；(3)可使用皂苷佐劑，例如QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或由其產(chǎn)生的顆粒，例如ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物)，ISCOMs可不含其它的去污劑(見，例如，國際出版號WO00/07621)；(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，如白介素，例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12等(見，例如，國際出版號WO99/44636)，干擾素，例如γ干擾素，巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素例如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)，或大腸桿菌不耐熱(LT)的去毒突變體，尤其是LT-K63(其中賴氨酸取代野生型氨基酸第63位)、LT-R72(其中精氨酸取代野生型氨基酸第72位)、CT-S109(其中絲氨酸取代野生型氨基酸第109位)、和PT-K9/G129(其中賴氨酸取代野生型氨基酸第9位，甘氨酸取代第129位)(見，例如，國際公開號W093/13202和W092/19265)；(7)單磷酸類脂A(MPL)或3-O-脫酰MPL(3dMPL)(見，例如，GB 2220221；EPA0689454)，任選地基本不含有明礬(見，例如，國際出版號WO00/56358)；(8)3dMPL和例如QS21和/或水包油乳劑的組合(見，例如，EPA 0835318；EPA0735898；EPA 0761231)；(9)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(見，例如，國際出版號WO99/52549)；(10)免疫刺激寡核苷酸如CpG寡核苷酸，或皂苷和免疫刺激寡核苷酸，如CpG寡核苷酸(見，例如，國際出版號WO00/62800)；(11)免疫刺激物和金屬鹽顆粒(見，例如，國際出版號WO00/23105)；(12)皂苷和水包油乳劑(見，例如，國際出版號WO99/11241；(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(任選地+甾醇)(見，例如，國際出版號WO 98/57659)；(14)MPL衍生物RC529；和(15)作為免疫刺激物增強(qiáng)組合物的有效性的其它物質(zhì)。優(yōu)選明礬和MF59。
如上所述，胞壁酰肽包括但不限于N-乙?；?胞壁酰基-L-蘇氨?；?D-異谷酰胺(thr-MDP)，-乙酰基-去甲(nor)胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷酰胺(CGP 11637，稱為去甲-MDP)，N-乙?；邗；?L-丙氨酰基-D-異谷氨?；?L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)，等等。
而且，融合蛋白可吸入到或陷入ISCOM中。典型的ISCOMs是通過組合膽固醇、皂苷、磷脂和免疫原而形成的。一般，免疫原(通常具有疏水區(qū))溶于去污劑中，加入反應(yīng)混合物中，從而形成摻有免疫原的ISCOMs。ISCOM基質(zhì)組合物形成的方式相同，但沒有病毒蛋白。具有高的正電荷的蛋白質(zhì)可靜電結(jié)合在ISCOM顆粒中，而非通過疏水作用。關(guān)于皂苷和ISCOM以及形成ISCOM的方法的更詳細(xì)綜述，參見Barr等，(1998)Adv.Drug Delivery Reviews32247-271(1998)。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備用于本發(fā)明的ISCOM，這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，描述于例如，美國專利號4,981,684，5,178,860，5,679,354和6,027,732；歐洲公開號EPA109,942；180,564和231,039；Coulter等，(1998)Vaccine161243。通常，術(shù)語“ISCOM”指在糖苷如三萜式皂苷(具體是Quil A)和含有疏水區(qū)的抗原之間形成的免疫原性復(fù)合物。見，例如，歐洲公開號EPA 109,942和180,564。在該實(shí)施方式中，HCV融合蛋白(通常具有疏水區(qū))溶于去污劑中，然后加入反應(yīng)混合物中，從而形成摻有融合蛋白的ISCOM?？捎蔑@示出兩親特性的HCV多肽容易地制備HCV多肽ISCOM。然而，缺少所需的疏水性的蛋白或肽在與具有疏水氨基酸、脂肪酸基、烷基等的肽偶聯(lián)之后可摻入到免疫原性復(fù)合物中。
如歐洲公開號EPA 231,039中所述，形成基礎(chǔ)的ISCOM結(jié)構(gòu)(稱為基質(zhì)或ISCOMATRIX)不一定需要存在抗原，基礎(chǔ)的ISCOM結(jié)構(gòu)可形成自甾醇如膽固醇，磷脂如磷脂酰乙醇胺，以及糖苷如Quil A。因此，感興趣的HCV融合蛋白不摻入到基質(zhì)中，而是存在于基質(zhì)外部上，例如，通過靜電相互作用吸收到基質(zhì)。例如帶有高正電荷的HCV融合蛋白可靜電結(jié)合到ISCOM顆粒上，而不是通過疏水作用力結(jié)合。關(guān)于皂苷和ISCOM以及形成ISCOM的方法的更詳細(xì)綜述，參見Barr等，(1998)Adv.Drug Delivery Reviews32247-271(1998)。
可將溶解的甾醇、糖苷和(任選的)磷脂混合在一起，制備ISCOM基質(zhì)。如果不用磷脂，則形成二維結(jié)構(gòu)。見，例如，歐洲公開號EPA 231,039。術(shù)語“ISCOM基質(zhì)”指三維和二維的結(jié)構(gòu)。使用的糖苷一般是具有兩親特性的糖苷，在其分子中包含疏水和親水區(qū)。優(yōu)選使用皂苷，如從Quillaja saponaria Molina(肥皂草)中獲得的皂苷提取物和Quil A。其它優(yōu)選的皂苷是來自七葉樹(Aesculus hippocastanum)的七葉皂甙(Patt等，(1960)Arzneimittelforschung10273-275)以及來自Gypsophillastruthium的sapoalbin(Vochten等，(1968)J.Pharm.Belg.42213-226)。
為了制備ISCOM，所用的糖苷濃度至少為形成膠束的臨界濃度。對Quil A而言，該濃度約為0.03重量％。用于制備ISCOM的甾醇可以是動物或植物來源的已知甾醇，例如膽固醇、羊毛甾醇、光甾醇、豆甾醇和谷甾醇。合適的磷脂包括磷酸卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。一般，糖苷(尤其是當(dāng)糖苷為Quil A時(shí))∶甾醇(尤其是當(dāng)甾醇為膽固醇時(shí))∶磷脂的摩爾比例是1∶1∶0-1，±20％優(yōu)選不超過±10％。這相當(dāng)于Quil A∶膽固醇的重量比約為5∶1。
也可存在增溶劑，例如可以是去污劑、尿素或胍。一般，非離子、離子或兩性離子去污劑或膽酸基去污劑如去氧膽酸鈉、膽酸鹽和CTAB(溴化十六烷基三甲基銨)可用于此目的。合適的去污劑的例子包括但不限于，辛基葡糖苷、壬基N-甲基葡萄糖胺或癸?；鵑-甲基葡萄糖胺、烷基苯基聚氧乙烯醚如具有9-10個(gè)氧乙烯基團(tuán)的聚乙二醇p-異辛基-苯基醚(商品名為TRITON X-100RTM)、?；垩跻蚁ト珲；垩跻蚁┥嚼婢厶?sorbitane)酯(商品名為TWEEN 20TM、TWEEN 80TM等)。形成ISCOM時(shí)通常去除增溶劑，如通過超濾、透析、超離心或色譜層析，然而，在某些方法中不需要該步驟。(見，例如，美國專利號4,981,684)。
一般，糖苷例如QuilA與HCV融合蛋白的重量比范圍為5∶1-0.5∶1。優(yōu)選重量比約為3∶1-1∶1，更優(yōu)選該比例為2∶1。
一旦ISCOM形成，可如本文所述將其配制到組合物中并給予動物。如果需要，可將獲得的免疫原性復(fù)合物的溶液凍干，然后用前重建。
包含上述蛋白質(zhì)和多核苷酸的NS5融合蛋白和組合物可與其它HCV免疫原性蛋白和/或包含其它HCV免疫原性蛋白的組合物聯(lián)用。例如，NS5融合蛋白可與衍生自表1所述的HCV多蛋白的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的各種HCV免疫原性蛋白的任何蛋白聯(lián)用。與本發(fā)明融合蛋白和/或包含NS5融合蛋白的組合物聯(lián)用的一個(gè)具體的HCV抗原是HCV E1E2抗原。HCV E1E2抗原是已知的，它包括HCV E1和HCV E2的復(fù)合物，任選地含有p7區(qū)的部分或全部，如PCT公開號WO 03/002065所述的HCVE1E2復(fù)合物。如上所述，其它的HCV免疫原性可與賦形劑、佐劑、免疫刺激分子等一起提供在組合物中。例如，E1E2復(fù)合物可提供在含有亞微米水包油乳劑如MF59和/或含有免疫刺激核酸序列(ISS)如CpY、CpR和非甲基化CpG基序(胞嘧啶和其后的鳥嘌呤，由磷酸鍵連接)的寡核苷酸的組合物中。這些組合物的詳細(xì)描述見PCT公開號WO 03/002065。
因此，顯而易見的是，本發(fā)明的組合物可與很多免疫刺激物一起給藥，并且通常包含佐劑。這些與本發(fā)明組合物一起使用的免疫刺激物和佐劑包括但不限于，上述描述的任何物質(zhì)以及下述物質(zhì)的一種或多種。
A.含有礦物質(zhì)的組合物適合用作本發(fā)明佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽類，如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括以下礦物鹽類，如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等(例如可見《疫苗設(shè)計(jì)亞單位和佐劑研究》(Vaccine designthesubunit and adjuvant approach)第8和9章，(1995)Powell和Newman.ISBN0-306-44867-X.)，或者不同礦物質(zhì)的混合物(如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選磷酸鹽過量)，所述化合物可以采取任何合適形式(如膠狀、晶體、無定形等)，優(yōu)選被礦物質(zhì)吸附。含有礦物質(zhì)的組合物可被制成金屬鹽顆粒。參見WO 00/23105。
鋁鹽可包括在本發(fā)明組合物中，Al3+劑量為0.2-1.0毫克/劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的鋁基佐劑是明礬(磷酸鋁鉀(AlK(SO4)2))，或明礬衍生物，如將磷酸鹽緩沖液中的抗原與明礬混合、然后用堿(如氨水或氫氧化鈉)滴定和沉淀而原位形成的明礬衍生物。
可用于本發(fā)明疫苗組合物中的另一個(gè)鋁基佐劑是氫氧化鋁佐劑(Al(OH)3)或晶體氧氫氧化鋁(AlOOH)，這是一種非常好的吸附劑，表面積約為500m2/g?；蛘?，提供磷酸鋁佐劑(AIPO4)或羥基磷酸鋁(aluminum hydroxyphosphate)，后者在氫氧化鋁佐劑的一些或全部氫氧基處含有磷酸基團(tuán)。本文提供的優(yōu)選的磷酸鋁佐劑是無定形的、可溶于酸性、堿性和中性介質(zhì)中的佐劑。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的佐劑包含磷酸鋁和氫氧化鋁。在該實(shí)施方式的更詳細(xì)實(shí)施方式中，佐劑中磷酸鋁的量大于氫氧化鋁的量，如磷酸鋁和氫氧化鋁的重量比為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1或大于9∶1。更具體地，鋁鹽存在的量可以是0.4-1.0毫克/疫苗劑量，或0.4-0.8毫克/疫苗劑量，或0.5-0.7毫克/疫苗劑量，或約0.6毫克/疫苗劑量。
一般，優(yōu)選的鋁基佐劑，或多個(gè)鋁基佐劑的比例，如磷酸鋁與氫氧化鋁的比例，是通過最優(yōu)化分子之間的靜電吸引從而使佐劑在所需的pH時(shí)抗原帶有相反電荷來選擇的。例如，在pH7.4時(shí)磷酸鋁佐劑(iep＝4)吸附溶菌酶，但不吸收白蛋白。如果白蛋白是靶抗原，則應(yīng)該選擇氫氧化鋁佐劑(iep 11.4)?；蛘哂昧姿猁}預(yù)處理氫氧化鋁降低其等電點(diǎn)，使其成為堿性更強(qiáng)的抗原的優(yōu)選佐劑。
B.油性乳劑適合用作本發(fā)明佐劑的油性乳劑組合物包括鯊烯-水乳劑。特別優(yōu)選的佐劑是亞微米水包油乳劑。用在這里的優(yōu)選的亞微米水包油乳劑是任選地含有不同量的MTP-PE的鯊烯/水乳劑，如一種亞微米水包油乳劑，其中含有4-5％w/v鯊烯、0.25-1.0％w/v Tween 80TM(聚氧乙烯山梨糖單油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85TM(去水山梨糖醇三油酸酯)，以及任選的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨?；?L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)，例如稱為“MF59”的亞微米水包油乳劑(WO 90/14837；美國專利6,299,884和6,451,325，它們被全文納入本文作為參考；和Ott等，“MF59—設(shè)計(jì)和評價(jià)安全且有效的人類疫苗佐劑”(MF59—Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines)，選自《疫苗設(shè)計(jì)亞單位和佐劑研究》(Powell，M.F.和Newman，M.J.編)Plenum Press，New York，1995，277-296)。MF59含有4-5％w/v鯊烯(例如4.3％)、0.25-0.5％w/vTween 80TM和0.5％w/v Span 85TM，并任選含有不同量的MTP-PE，用微量流化器如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亞微米顆粒。例如，MTP-PE的含量約為0-500μg/劑，更優(yōu)選0-250μg/劑，最優(yōu)選為0-100μg/劑。術(shù)語“MF59-0”在這里表示不含MTP-PE的上述亞微米水包油乳劑，而術(shù)語MF59-MTP表示含有MTP-PE的制劑。例如，“MF59-100”含有100μg MTP-PE/劑，如此類推。這里使用的另一種亞微米水包油乳劑MF69含有4.3％w/v鯊烯、0.25％w/v Tween 80TM和0.75％w/v Span 85TM，并任選含有MTP-PE。另一種亞微米水包油乳劑是MF75，也稱為SAF，含有10％鯊烯、0.4％Tween 80TM、5％普盧蘭尼克嵌段聚合物L(fēng)121以及thr-MDP，也被微流化成亞微米乳劑。MF75-MTP表示含有MTP的制劑，例如100-400μg MTP-PE/劑。
用于本發(fā)明組合物的亞微米水包油乳劑及其制造方法，以及免疫刺激劑(如胞壁酰肽)的詳細(xì)描述在WO 90/14837以及美國專利Nos.6,299,884和6,451,325。
完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)也可被用作本發(fā)明的佐劑。
C.皂苷制劑皂苷制劑也可用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是一種在許多植物種類的樹皮、葉、莖、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇苷和三萜苷的異源組。來自Quillaia saponaria Molina樹樹皮的皂苷已經(jīng)被廣泛研究作為佐劑。皂苷也可通過通過商業(yè)途徑獲自麗花菝葜(Smilax ornata)(sarsaprilla)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，如QS21，以及液體制劑，如ISCOM。
已用高效薄層色譜(HP-LC)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化了皂苷組合物。使用這些技術(shù)得到的具體的純化組分已經(jīng)被鑒定，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優(yōu)選所述皂苷是QS21。一種制造QS21的方法揭示于美國專利No.5,057,540。皂苷制劑中也可含有固醇，如膽固醇(參見PCT公開號WO 96/33739)。
皂苷和膽固醇的組合可用來形成被稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒。ISCOM通常還含有磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷都可用于ISCOM。優(yōu)選ISCOM包括Quil A、QHA和QHC中的一種或多種。ISCOM還描述在EP0109942、WO 96/11711和WO 96/33739。任選地，ISCOM可不含其它去污劑。參見WO00/07621。
為了解皂苷基佐劑的制造可參見Barr等，“ISCOM和其它皂苷基佐劑”(ISCOMs and other皂苷based adjuvants”，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32247-271。也可參見sjolander等，“口服皂苷和ISCOM疫苗的攝取和佐劑活性”(Uptake and adjuvant activity of orally delivered皂苷and ISCOM vaccines”，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32321-338。
D.病毒體和病毒樣顆粒(VLP)病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可被用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或多種病毒蛋白質(zhì)，并任選與磷脂組合或配制。它們通常是非致病和不復(fù)制的，且通常不含任何天然病毒基因組。這種病毒蛋白質(zhì)可通過重組制造或從完整病毒分離。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白質(zhì)包括以下來源的蛋白質(zhì)流感病毒(如HA或NA)，乙肝病毒(如核心蛋白或衣殼蛋白)，戊型肝炎病毒，麻疹病毒，辛德比斯病毒，輪狀病毒，口蹄疫病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，諾瓦克病毒，人乳頭瘤病毒，HIV，RNA噬菌體，Qβ噬菌體(如外被蛋白)，GA噬菌體，fr噬菌體，AP205噬菌體，以及Ty(如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白p1)。VLP還被敘述在以下文獻(xiàn)中WO03/024480，WO 03/024481，以及Niikura等，“作為口服疫苗載體的嵌合重組戊型肝炎病毒樣顆粒呈遞外源表位”(Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-LikeParticles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes)，Virology(2002)293273-280；Lenz等，“乳頭瘤病毒樣顆粒誘導(dǎo)樹突細(xì)胞極性激活”(Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells)，Journalof Immunology(2001)5246-5355；Pinto等，“用重組HPV-16 L1病毒樣顆粒免疫的健康志愿者對人乳頭瘤病毒(HPV)-16 L1的細(xì)胞免疫應(yīng)答”(Cellular ImmuneResponses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized withRecombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles)，Journal of Infectious Diseases(2003)188327-338；和Gerber等，“人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒當(dāng)與大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體R192G或CpG共同施用時(shí)是有效的口服免疫原”(Human PapillomavrisuVirus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered withEscherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG)，Journal ofVirology(2001)75(10)4752-4760。病毒體還敘述在，例如，Gluck等，“將來開發(fā)疫苗的新技術(shù)平臺”(New Technology Platforms in the Development of Vaccines for theFuture)，Vaccine(2002)20B10-B16。在鼻內(nèi)三價(jià)INFLEXALTM產(chǎn)品(Mischler &Metcalfe(2002)Vaccine 20，增刊5B17-23)和INFLUVAC PLUSTM產(chǎn)品中，免疫增強(qiáng)的重建的流感病毒體(IRIV)用作亞基抗原遞送系統(tǒng)。
E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，如(1)腸道細(xì)菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物這種衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3-O-脫酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3-O-脫酰單磷酰脂質(zhì)A和4、5或6個(gè)?；湹幕旌?。優(yōu)選的3-O-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的“小顆?！毙问浇沂驹贓P 0 689 454。3dMPL的這種“小顆?！弊銐蛐∫灾聊芡ㄟ^0.22微米無菌過濾膜(參見EP 0 689 454)。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物，例如RC-529。見Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 92273-2278。
(2)脂質(zhì)A衍生物脂質(zhì)A衍生物包括來自大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，如OM-174。OM-174描述于，例如，Meraldi等，“一種新的有可能用于人類的佐劑OM-174與合成的柏格鼠瘧原蟲環(huán)孢子蛋白的C-末端片段242-310一起施用后誘導(dǎo)保護(hù)性應(yīng)答”(OM-174，a New Adjuvant with a Potential for Human Use，Induces a Protective Response withAdministered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from thecircumsporozoite protein of Plasmodium berghei)，Vaccine(2003)212485-2491；和Pajak等，“OM-174佐劑在體內(nèi)誘導(dǎo)鼠樹突細(xì)胞的遷移和成熟”(The AdjuvantOM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo”，Vaccine(2003)21836-842。
(3)免疫刺激寡核苷酸適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序(一段含有未甲基化的胞嘧啶之后是鳥嘌呤并通過磷酸鍵連接的序列)的核苷酸序列。已證明含有回文序列或聚(dG)序列的細(xì)菌雙鏈RNA或寡核苷酸具有免疫刺激活性。
CpG可包括核苷修飾/類似物，如硫代磷酸脂修飾，并可以是雙鏈或單鏈的。任選地，鳥苷可被其類似物如2’-脫氧-7-脫氮鳥苷替代。例如可參見Kandimalla等[“趨異合成的核苷酸基序識別模式設(shè)計(jì)和建立具有不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)特性的強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)性寡脫氧核糖核酸制劑”(Divergent synthetic nucleotide motif recognitionpatterndesign and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles)，Nucleic Acids Research(2003)31(9)2393-2400]；WO 02/26757和WO 99/62923敘述了可能的類似物例子。CpG寡核苷酸的佐劑功效還描述在Krieg，“CpG基序細(xì)菌提取物中的活性成分？”(CpG motifsthe active ingredient in bacterial extracts？)，Nature Medicine(2003)9(7)831-835；McCluskie等，“在小鼠中通過腸胃外和粘膜用乙肝表面抗原和CpGDNA加強(qiáng)免疫的策略”(Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategiesin mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA)，F(xiàn)EMS Immunology andMedical Microbiology(2002)32179-185；WO 98/40100；美國專利No.6,207,646；美國專利No.6,239,116和美國專利No.6,429,199。
CpG序列可定向TLR9，如GTCGTT或TTCGTT基序。見Kandimalla等，“Toll樣受體9通過新的合成CpG DNA調(diào)節(jié)鑒定和細(xì)胞因子誘導(dǎo)”(Toll-likereceptor 9modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpGDNAs)，Biochemical Society Transactions(2003)31(第3部分)654-658。CpG序列可特異于誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，如CpG-A ODN，或者它可能更加特異于誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN敘述于Blackwell等，“CpG-A誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IFN-γ-可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)由漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞衍生的IFN-α調(diào)節(jié)”(CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulatedby Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha)，J.Immunol.(2003)170(8)4061-4068；Krieg，“CpG A-Z”(From A to Z on CpG)，TRENDS inImmunology(2002)23(2)64-65和WO 01/95935。優(yōu)選所述CpG是CpG-A ODN。
優(yōu)選CpG寡核苷酸是構(gòu)建的以使5’末端可被受體識別。任選地，兩個(gè)CpG寡核苷酸序列可在它們的3’末端相連以形成“免疫子(immunomer)”。參見例如Kandimalla等，“影響免疫刺激活性的CpG寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)”(Secondarystructures in CpG oligonucleotides affec timmunostimulatory activity)，BBRC(2003)306948-953；Kandimalla等，“Toll樣受體9通過新的合成CpG DNA調(diào)節(jié)鑒定和細(xì)胞因子誘導(dǎo)”，Biochemical Society Transactions(2003)31(第3部分)664-658；Bhagat等，“CpG五-和六脫氧核糖核酸是有效的免疫調(diào)制劑”(CpG penta-andhexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents)BBRC(2003)300853-861和WO 03/035836。
(40)ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物細(xì)菌ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選所述蛋白質(zhì)衍生自大腸桿菌(即大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。WO 95/17211描述了使用脫毒ADP核糖基化毒素作為粘膜佐劑，WO 98/42375描述了將其作為腸胃外佐劑。優(yōu)選佐劑是脫毒的LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LTR192G?？稍谝韵聟⒖假Y料中找到將ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72，用作佐劑，這些參考文獻(xiàn)內(nèi)容納入本文作為參考Beignon等，“大腸桿菌不耐熱腸毒素的LTR72突變體共施用于Bare皮膚后增強(qiáng)肽抗原激發(fā)CD4+T細(xì)胞及分泌γ干擾素的能力”(The LTR72 Mutant of Heat-LabileEnterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability of Peptide Antigen to Elicit CD4+T and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin)，Infection andImmunity(2002)70(6)3012-3019；Pizza等，“粘膜疫苗作為粘膜佐劑的LT和CT的無毒衍生物”(Mucosal vaccinesnon-toxic derivatives of LT and CT as mucosaladjuvants)，Vaccine(2001)192534-2541；Pizza等，“LTK63和LTR72，兩種將進(jìn)行臨床試驗(yàn)的粘膜佐劑”(LTK63 and LTR72，two mucosal adjuvants ready for clinicaltrials)Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)455-461；Scharton-Kersten等，“用細(xì)菌ADP核糖基化外毒素、亞單位和無關(guān)佐劑經(jīng)皮免疫”(Transcutaneous Immunizationwith Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins，Subunits and Unrelated Adjuvants)，Infection and Immunity(2000)68(9)5306-5313；Ryan等，“大腸桿菌不耐熱毒素的突變體作為經(jīng)鼻輸送無細(xì)胞百日咳疫苗的有效粘膜佐劑無毒AB復(fù)合體的不同作用以及在Th1和Th2細(xì)胞上的酶活性”(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile ToxinAct as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular PertussisVaccineDifferential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity onTh1 and Th2 Cells)Infection and Immunity(1999)67(12)6270-6280；Partidos等，“大腸桿菌不耐熱腸毒素及其定點(diǎn)突變體LTK63增強(qiáng)對鼻內(nèi)共免疫合成肽的增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)”(Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directedmutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasallyco-immunized synthetic peptides)，Immunol.Lett.(1999)67(3)209-216；Peppoloni等，“大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體是鼻內(nèi)輸送疫苗安全有效的佐劑”(Mutants ofthe Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasaldelivery of vaccines)，Vaccines(2003)2(2)285-293；和Pine等，(2002)“用流感疫苗和大腸桿菌不耐熱腸毒素的脫毒突變體(LTK63)鼻內(nèi)免疫”(Intranasalimmunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxinfrom Escherichia coli(LTK63))J.Control Release(2002)85(1-3)263-270。氨基酸替代優(yōu)選基于ADP核糖基化毒素A和B亞單位的序列對比，參見Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)1165-1167，該文獻(xiàn)被全文納入作為參考。
F.生物粘附劑和粘膜粘著劑生物粘附劑和粘膜粘著劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘附劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球體(Singh等，(2001)J.Cont.Rele.70267-276)或粘膜粘著劑，如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。脫乙酰殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑。例如，WO99/27960。
G.微粒微粒也可被用作本發(fā)明的佐劑。由生物可降解的無毒材料(例如聚(α-羥酸)、聚羥丁酸、正聚酯類、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)與聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直徑為約100nm-150μm，更優(yōu)選約200nm-30μm，最優(yōu)選約500nm-10μm的顆粒)是優(yōu)選的，可任選進(jìn)行處理以使其表面帶有負(fù)電荷(如用SDS處理)或正電荷(如用陽離子去污劑，如CTAB處理)。
H.脂質(zhì)體適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子描述在美國專利No.6,090,406，美國專利No.5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚類和聚氧乙烯酯類。WO99/52549。這類制劑還包括與辛苯聚醇混合的聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性劑(WO01/21207)，以及與至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯聚醇混合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑(WO01/21152)。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
J.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑描述于，例如，Andrianov等，“通過凝聚聚磷腈水溶液來制備水凝膠微球體”(Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueouspolyphophazene solutions)，Biomaterials(1998)19(1-3)109-115；和Payne等，“從聚磷腈基質(zhì)釋放蛋白質(zhì)”(Protein Release from Polyphosphazene Matrices)，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)185-196。
K.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-1-丙氨酰-d-異谷氨酰氨?；?1-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)。
L.咪唑并喹諾酮化合物適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物，進(jìn)一步描述于Stanley，“咪喹莫特和咪唑并喹諾酮類的作用機(jī)制和治療潛能”(Imiquimod and the imidazoquinolonesmechanism of action and theraDeuticpotential)Clin Exp Dermatol(2002)27(7)571-577；以及Jones，“瑞喹莫德3M”(Resiquimod 3M)，Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2)214-218；和美國專利號4,689,338，5,389,640，5,268,376，4,929,624，5,266,575，5,352,784，5,494,916，5,482,936，5,346,905，5,395,937，5,238,944，和5,525,612。
M.縮氨硫脲化合物縮氨硫脲化合物的例子及其配制、制備方法以及篩選適于在本發(fā)明組合物中用作佐劑的化合物的方法可參見WO04/60308。縮氨硫脲在刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-α方面尤其有效。
N.色胺酮化合物色胺酮化合物的例子及其配制、制備方法以及篩選適于在本發(fā)明組合物中用作佐劑的化合物的方法可參見WO04/64759。色胺酮化合物在刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-α方面尤其有效。
Q.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括各種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)，干擾素(例如干擾素-γ)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。
本發(fā)明組合物還包括上述一種或多種佐劑類型的組合。例如，以下佐劑組合物可用于本發(fā)明(1)皂苷和水包油乳劑(WO99/11241)；(2)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)(參見WO 94/00153)；(3)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)(WO98/57659)；(5)3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合(見歐洲專利申請0835318，0735898和0761231)；(6)SAF，含有10％角鯊?fù)椤?.4％Tween 80、5％普盧蘭尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，經(jīng)微流化制成亞微米乳劑或劇烈攪拌形成較大顆粒乳劑。
(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immunochem)，含有2％鯊烯、0.2％Tween 80以及選自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一種或多種礦物鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dPML)。
(9)一種或多種礦物鹽(如鋁鹽)+免疫刺激寡核苷酸(如包括CpG基序的核苷酸序列)。
鋁鹽和MF59是可注射疫苗的優(yōu)選佐劑。細(xì)菌毒素和生物粘附劑是用于粘膜遞送給藥的疫苗如鼻部疫苗的優(yōu)選佐劑。
制備HCV特異性抗體的方法可用HCV融合蛋白來產(chǎn)生HCV特異性多克隆抗體和單克隆抗體。HCV特異性多克隆抗體和單克隆抗體特異性結(jié)合于HCV抗原?？蓪⑷诤系鞍捉o予哺乳動物如小鼠、家兔、山羊或馬來產(chǎn)生多克隆抗體。收集被免疫動物的血清，通過如硫酸銨沉淀然后層析(優(yōu)選親和層析)從血漿中收集抗體。制備和加工多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
可容易地制備針對融合蛋白中存在的HCV特異性表位的單克隆抗體?？蓪⒂肏CV融合蛋白免疫的哺乳動物如小鼠的正常B細(xì)胞與如HAT-敏感性小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞?？捎肦IA或ELISA鑒定產(chǎn)生HCV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，并在半固體瓊脂上克隆以分離這些細(xì)胞或用有限稀釋來分離。用另一輪篩選來分離產(chǎn)生HCV特異性抗體的克隆。
針對HCV表位的單克隆或多克隆抗體對于檢測樣品(例如HCV感染的人的血清樣品)中HCV或HCV抗原的存在尤其有用。HCV抗原的免疫檢測可利用一種抗體或幾種抗體。HCV抗原的免疫檢測可利用，例如針對HCV表位的單克隆抗體，針對一種HCV多肽的表位的單克隆抗體的組合，針對不同HCV多肽的表位的單克隆抗體，針對相同HCV抗原的多克隆抗體，針對不同HCV抗原的多克隆抗體，或單克隆和多克隆抗體的組合。免疫檢測方法可基于如競爭、直接反應(yīng)、或三明治型試驗(yàn)(例如用標(biāo)記的抗體)。標(biāo)記可以是例如熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性。
多克隆或單克隆抗體可進(jìn)一步用于通過免疫親和柱來分離HCV顆粒或抗原。可通過例如吸附或共價(jià)連接等使抗體保持其免疫選擇活性的方法將抗體固定在固體支持物上。任選地，可包括間隔基團(tuán)，從而使抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可被接近。然后，固定的抗體可用于結(jié)合生物樣品例如血液或血漿中的HCV顆粒或抗原。通過例如pH的變化從柱基質(zhì)上回收結(jié)合的HCV顆?；蚩乖?br> HCV-特異性T細(xì)胞被上述有或沒有核心多肽的、體內(nèi)或體外表達(dá)的融合蛋白(包括NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白)以及本文所述的任何其它的各種融合蛋白活化的HCV特異性T細(xì)胞，優(yōu)選識別HCV多肽如NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a或NS5b多肽的表位，包括這些多肽的一種或多種與NS5t的融合蛋白(有或沒有核心多肽)的表位。HCV特異性T細(xì)胞可以是CD8+或CD4+。
HCV特異性CD8+T細(xì)胞可以是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，它可以殺傷展示與I類MHC分子復(fù)合的上述任何表位的HCV感染細(xì)胞?？捎?1Cr釋放試驗(yàn)(見實(shí)施例)來檢測HCV特異性CD8+T細(xì)胞。51Cr釋放試驗(yàn)檢測HCV特異性CD8+T細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力，所述靶細(xì)胞展示這些表位的一種或多種。表達(dá)抗病毒劑如IFN-γ的HCV特異性CD8+T細(xì)胞也在本文考慮范圍之內(nèi)，這些細(xì)胞也可用免疫方法檢測，優(yōu)選在用一種或多種HCV多肽(例如但不限于E2，NS3，NS4，NS5a，或NS5b多肽，見實(shí)施例)體外刺激之后針對IFN-γ或類似細(xì)胞因子進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)染色。
被上述有或沒有核心多肽、體內(nèi)或體外表達(dá)的融合蛋白(例如但不限于NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白)活化的HCV特異性CD4+細(xì)胞，優(yōu)選識別HCV多肽(例如但不限于NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a或NS5b多肽)的表位，包括HCV多肽的有或沒有核心多肽的融合蛋白(例如NS3*NS4NS5t或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白)的表位，所述表位結(jié)合在HCV感染的細(xì)胞的II類MHC分子上，并且HCV特異性CD4+細(xì)胞響應(yīng)于刺激而增殖。
可用淋巴組織增生試驗(yàn)(見實(shí)施例)來檢測HCV特異性CD4+細(xì)胞。淋巴組織增生試驗(yàn)檢測HCV特異性CD4+細(xì)胞響應(yīng)于例如NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a，和/或NS5b表位而增殖的能力。
活化HCV特異性T細(xì)胞的方法可用HCV融合蛋白或多核苷酸體外或體內(nèi)活化HCV特異性T細(xì)胞?；罨疕CV特異性T細(xì)胞可尤其用于提供模型系統(tǒng)以優(yōu)化對HCV的CTL應(yīng)答反應(yīng)，和提供針對HCV感染的預(yù)防性和治療性治療。對于體外活化，優(yōu)選通過質(zhì)?；虿《据d體例如如上所述的腺病毒載體將蛋白遞送到T細(xì)胞。
T細(xì)胞的多克隆群體可衍生感染了HCV的哺乳動物的血液，優(yōu)選來自外周淋巴器官，如淋巴結(jié)、脾或胸腺。優(yōu)選的哺乳動物包括小鼠、猩猩、狒狒和人。HCV用于在哺乳動物中擴(kuò)增活化的HCV特異性T細(xì)胞的數(shù)目。然后，可加入上述有或沒有核心多肽的HCV融合蛋白，例如但不限于HCV NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白，體外重新刺激衍生自哺乳動物的HCV特異性T細(xì)胞。然后檢測HCV特異性T細(xì)胞的(尤其是)增殖、IFN-γ的產(chǎn)生、以及體外裂解展示HCV表位的靶細(xì)胞的能力。
在淋巴組織增生試驗(yàn)(實(shí)施例6)中，當(dāng)與HCV多肽，例如但不限于NS3，NS4，NS5a，NS5b，NS3NS4NS5，或E2NS3NS4NS5表位多肽一起培養(yǎng)時(shí)，HCV-活化的CD4+T細(xì)胞增殖，但是在缺少表位多肽時(shí)不增殖。因此，可用淋巴組織增生試驗(yàn)來鑒定被HCV特異性CD4+T細(xì)胞識別的特定HCV表位，例如NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a，NS5b以及這些表位的融合，例如但不限于NS3NS4NS5和E2NS3NS4NS5表位。
類似地，可在用上述融合蛋白體外刺激后檢測HCV特異性CD4+和/或CD8+T細(xì)胞中的IFN-γ，來鑒定(例如)對刺激CD4+和/或CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ特別有效的融合蛋白表位，例如但不限于NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a，NS5b的表位，或這些表位的融合蛋白，例如但不限于NS3NS4NS5和E2NS3NS4NS5表位(見實(shí)施例5)。
另外，51Cr釋放試驗(yàn)可用于測定對HCV的CTL應(yīng)答反應(yīng)的水平。見Cooper等，Immunity 10439-449。例如，可從HCV感染的哺乳動物肝中衍生HCV特異性CD8+T細(xì)胞?？稍?1Cr釋放試驗(yàn)中檢測這些T細(xì)胞對抗展示如E2NS3NS4NS5或NS3NS4NS5表位的靶細(xì)胞能力。可構(gòu)建幾個(gè)表達(dá)不同NS3NS4NS5或E2NS3NS4NS5表位的靶細(xì)胞群，從而各靶細(xì)胞群展示不同的NS3NS4NS5或E2NS3NS4NS5表位。可用這些靶細(xì)胞群的每一個(gè)來檢測HCV特異性CD8+細(xì)胞。51Cr釋放試驗(yàn)的結(jié)果可用于確定NS3NS4NS5或E2NS3NS4NS5的哪些表位產(chǎn)生了對HCV最強(qiáng)的CTL應(yīng)答反應(yīng)。然后可用獲自51Cr釋放試驗(yàn)的信息，構(gòu)建含有產(chǎn)生最強(qiáng)的CTL應(yīng)答反應(yīng)的有或沒有核心多肽的NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白。
如上所述的HCV融合蛋白或編碼這些融合蛋白的多核苷酸可給予哺乳動物，如小鼠、狒狒、猩猩或人，以刺激體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，例如體內(nèi)活化HCV特異性T細(xì)胞。可用本領(lǐng)域已知的任何方法給藥，包括胃腸外、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射，包括用如上所述的生物沖擊槍(“基因槍”)。
優(yōu)選地，將HCV多核苷酸注射到活化的T細(xì)胞。除了構(gòu)建和修飾的簡單性所帶來的實(shí)際益處之外，注射多核苷酸還使融合蛋白在宿主內(nèi)合成。因此，這些免疫原以原始的翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象被宿主免疫系統(tǒng)呈遞。優(yōu)選多核苷酸肌肉內(nèi)注射到大哺乳動物體內(nèi)，如人中，劑量為0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，5或10mg/kg。
以與采用的具體組合物相容的方式給予包含HCV融合蛋白或多核苷酸的本發(fā)明組合物，給予的量如(尤其是)51Cr釋放試驗(yàn)、淋巴組織增生試驗(yàn)或?qū)FN-γ進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色所檢測，足以有效活化HCV-特異性T細(xì)胞。這些蛋白和/或多核苷酸可給予未感染HCV的哺乳動物，或給予感染HCV的哺乳動物。組合物中多核苷酸或融合蛋白的具體劑量依賴于很多因素，包括但不限于，將要給予組合物的哺乳動物的種類、年齡和總體狀況，以及給予組合物的方式。僅用常規(guī)試驗(yàn)就可容易地確定本發(fā)明組合物的有效量?？捎蒙鲜鲶w外和體內(nèi)模型鑒定合適劑量。下述實(shí)施例中所用多核苷酸的量為體內(nèi)或體外優(yōu)化HCV特異性T細(xì)胞的活化提供了一般性指導(dǎo)。一般，將0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，5或10mg有或沒有核心多肽的HCV融合蛋白或多核苷酸給予大的哺乳動物，如狒狒、猩猩或人。如果需要，也可在組合物之前、之后或同時(shí)給予共刺激分子或佐劑。
可通過改變劑量、給藥途徑或加強(qiáng)方案來增強(qiáng)由遞送本發(fā)明組合物所產(chǎn)生的哺乳動物免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括HCV特異性T細(xì)胞的活化?？捎脝蝿┝糠桨附o予本發(fā)明組合物，或優(yōu)選以多劑量方案給予，其中初次免疫接種過程包括1-10個(gè)獨(dú)立劑量，然后在后續(xù)的保持和/或加強(qiáng)免疫反應(yīng)所需的時(shí)間間隔中給予其它劑量，例如，在1-4個(gè)月給予第二劑，如果需要，可在幾個(gè)月之后給予后續(xù)一劑或多劑。
III.實(shí)驗(yàn)下文是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方式
的例子。提供這些實(shí)施例僅用于闡釋的目的，不意于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本發(fā)明可用很多方式實(shí)施。
已努力確保所用數(shù)字(例如，數(shù)目、溫度等)的精確性，但當(dāng)然允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
實(shí)施例1NS5Core和NS5tCore多核苷酸和多肽的產(chǎn)生下面實(shí)施例中的NS5t代表C末端截短的NS5分子，其包括對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)制備編碼NS5t的多核苷酸，將該構(gòu)建物與編碼核心多肽的多核苷酸融合，所述核心多肽包括全長多蛋白的氨基酸1-121，如圖3的氨基酸1772-1892，以產(chǎn)生NS5tCore121。
克隆NS5tCore121多核苷酸并在釀酒酵母中表達(dá)。具體地說，將NS5Core蛋白遺傳工程化以用酵母表達(dá)載體pBS24.1在釀酒酵母中表達(dá)。該載體含有2μ的在酵母中自主復(fù)制的序列以及作為可選擇標(biāo)記的酵母基因leu2d和URA3。該表達(dá)載體中還有β-內(nèi)酰胺酶基因和在細(xì)菌中復(fù)制質(zhì)粒所需的ColE1復(fù)制起點(diǎn)，以及α-因子終止子。重組蛋白的表達(dá)在雜合啟動子ADH2/GAPDH控制之下。
在ADH2/GAPDH啟動子和HCV-1 NS5a的接合處使用具有HindIII-EcoNI限制性末端的合成寡核苷酸(27bp)。從pd.Δns3ns5Pjcore121RT(描述于PCT公開號WO01/38360)中凝膠純化編碼NS5a和部分NS5b的2893bp的EcoNI-NdeI限制性片段。在截短的NS5b和核心多肽的結(jié)合處使用具有NdeI和NotI末端的合成寡核苷酸(205bp)。從pT7Blue2.HCV121(描述于PCT公開號WO 01/38360)中凝膠純化編碼核心多肽121的318bp的NotI-SalI限制性片段。將編碼NS5tCore121的整個(gè)3442bp的HindIII-SalI多核苷酸亞克隆入pSP72(Promeg a，Madison，WI)HindIII-SalI載體，并驗(yàn)證序列。然后，將NS5tCore121多核苷酸與ADH2/GAPDH啟動予連接到pBS24.1酵母表達(dá)載體中。
用酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母AD3株系(matα，leu2，trp1，ura3-52，prb-1122，pep4-3，prc1-407，cir°，trp+，DM15[GAP/ADR])，培養(yǎng)基中葡萄糖耗竭后檢測單個(gè)轉(zhuǎn)化子的表達(dá)。用玻璃珠裂解細(xì)胞團(tuán)塊。等份的可溶和不可溶的組分在SDS樣品緩沖液+50mM DTT中煮沸，在4-20％Tris-甘氨酸凝膠上跑膠，并用考馬斯藍(lán)染色。玻璃珠裂解后在不溶性組分中檢測到樣品中的重組蛋白。
在25℃和30℃比較NS5tCore121和NS5Core121(一種包含全長NS5序列(氨基酸1973-3011，編號相對于全長HCV-1多蛋白)的構(gòu)建物)的表達(dá)。如圖4A和4B所示，包含NS5t的構(gòu)建物表達(dá)量大于包含全長NS5序列的構(gòu)建物。
實(shí)施例2NS3*NS4NS5t和NS3*NS4NS5tCore多核苷酸和多肽的產(chǎn)生以下實(shí)施例中的NS3*代表修飾的NS3分子，其中丙氨酸取代了通常在氨基酸位置1165處發(fā)現(xiàn)的絲氨酸，編號相對于全長HCV-1多蛋白序列。
從HCV分離編碼NS3NS4(約為氨基酸1027-1972，編號相當(dāng)于HCV1)(本文也稱為“NS34”)的多核苷酸。將編碼氨基酸1165處的Ser的編碼序列突變?yōu)锳la的編碼序列，將該分子的NS3部分突變，從而使得到的分子缺乏NS3蛋白酶活性。該構(gòu)建物與實(shí)施例1所述的編碼NS5tCore121的多核苷酸融合，產(chǎn)生NS3*NS4NS5tCore121?；蛘撸摲肿优cNS5t融合產(chǎn)生NS3*NS4NS5t。將這些構(gòu)建物克隆到質(zhì)粒、疫苗病毒和腺病毒載體中。另外，將這些構(gòu)建物插入到重組表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞產(chǎn)生NS3*NS4NS5tCore121和NS3*NS4NS5t融合蛋白。
如下所述測定蛋白酶活性。將NS4A肽(KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK)和感興趣的融合蛋白稀釋在90μl反應(yīng)緩沖液(25mM Tris，pH7.5，0.15M NaCl，0.5mMEDTA，10％甘油，0.05n-十二烷基B-D-麥芽糖苷，5mM DTT)中，室溫混合30分鐘。將90μl的混合物加到微滴定板中(Costar，Inc.，Corning，NY)，加入10μl HCV底物(AnaSpec，Inc.，San Jose CA)?；旌显摪宀⒃贔luostar板讀數(shù)儀上讀數(shù)。結(jié)果表示為相對熒光單位(RFU)/分鐘。
實(shí)施例3E2NS3*NS4NS5t和E2NS3*NS4NS5tCore多核苷酸和多肽的產(chǎn)生下列實(shí)施例中的E2代表包括氨基酸384-715(編號相對于全長HCV-1多蛋白)的C末端截短的E2分子。用美國專利號6,121,020和6,326,171所述的方法制備編碼截短的E2分子的多核苷酸。如實(shí)施例2所述制備編碼NS3*NS4NS5tCore121或NS3*NS4NS5t的多核苷酸。將構(gòu)建物融合以產(chǎn)生E2NS3*NS4NS5tCore121和E2NS3*NS4NS5t。將構(gòu)建物克隆到質(zhì)粒、疫苗病毒和腺病毒載體中。另外，將構(gòu)建物插入到重組表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生E2NS3*NS4NS5tCore121和E2NS3*NS4NS5t融合蛋白。如上所述測定蛋白酶活性。
實(shí)施例4在免疫接種的動物中引發(fā)HCV特異性CTL如下所述，用如上所述制備的HCV融合蛋白NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121和E2NS3*NS4NS5t產(chǎn)生HCV融合蛋白-ISCOM。將所需的融合蛋白和預(yù)先制備的ISCOMATRIX(空ISCOMs)混合，利用離子相互作用力以使融合蛋白和佐劑之間的連接最強(qiáng)，如此制備融合蛋白-ISCOM?；救鏑oulter等，(1998)Vaccine 161243所述制備ISCOMATRIX。
麻醉下免疫恒河猴。將動物分為兩組。在第0月，第一組用2×108噬菌斑形成單位(pfu)(1×108皮內(nèi)注射，1×108通過劃痕感染)的rVVC/E1感染。該組作為引發(fā)CTL的陽性對照。在第0、1、2和6個(gè)月，在左四頭肌肌肉內(nèi)(IM)注射，用25-100μg吸附到ISCOM上的如上所述的HCV融合多肽免疫第二組的動物。如Paliard等，(2000) AIDS Res.Hum.Retroviruses 16273中所述，用標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放試驗(yàn)檢測細(xì)胞毒活性。
實(shí)施例5用融合多核苷酸免疫在一種免疫接種操作方法中，通過肌肉內(nèi)注射到脛骨前肌中，用50-250μg編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的質(zhì)粒DNA免疫動物。6周后用107pfu編碼NS5a(腹膜內(nèi))、NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的疫苗病毒(VV)、或50-250μg質(zhì)粒對照(肌肉內(nèi))進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
在另一種免疫接種操作方法中，用編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的1010腺病毒顆粒肌肉內(nèi)注射到動物的脛骨前肌。6周后用107pfu的VV-NS5a腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射，或用編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的1010腺病毒顆粒肌肉內(nèi)加強(qiáng)注射。
實(shí)施例6HCV特異性CD8+T細(xì)胞的活化51Cr釋放試驗(yàn).51Cr釋放試驗(yàn)用于檢測HCV特異性T細(xì)胞裂解展示NS5a表位的靶細(xì)胞的能力。從被免疫動物中收集脾細(xì)胞。在IL-2存在下，用來自HCV-NS5a的CTL表位多肽p214K9(2152-HEYPVGSQL-2160；SEQ ID NO1)體外重刺激這些細(xì)胞6天。然后，如Weiss(1980)J.Biol.Chem.2559912-9917所述，用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)檢測脾細(xì)胞對表達(dá)I類MHC分子但不表達(dá)II類MHC分子的肽敏化靶細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒活性。檢測效應(yīng)器(T細(xì)胞)與靶(B細(xì)胞)的比例為60∶1、20∶1和7∶1。對于各效應(yīng)器與靶的比例，計(jì)算特異性裂解百分比(percent specific lysis)。
實(shí)施例7表達(dá)IFN-γ的HCV特異性CD8+T細(xì)胞的活化干擾素-γ(IFN-γ)的細(xì)胞內(nèi)染色.干擾素-γ(IFN-γ)的細(xì)胞內(nèi)染色用于鑒定體外受NS5a表位p214K9刺激后分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞。在IL-2和莫能菌素下，體外用p214K9或非特異性肽重刺激單個(gè)被免疫動物的脾細(xì)胞6-12小時(shí)。然后對細(xì)胞表面的CD8和細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ染色，并用流式細(xì)胞術(shù)分析。然后計(jì)算IFN-γ陽性的CD8+T百分比。
實(shí)施例8HCV特異性CD4+T細(xì)胞的增殖淋巴組織增生試驗(yàn).用磁珠將富集的被免疫動物的脾細(xì)胞中的CD8+T耗竭，然后一式三份與p222D、HCV NS5a的NS5a表位肽(2224-AELIEANLLWRQEMG-2238；SEQ ID NO2)、或僅與培養(yǎng)基一起培養(yǎng)。72小時(shí)后，用1μCi/細(xì)胞的3H-胸苷脈沖細(xì)胞，6-8小時(shí)后收獲細(xì)胞。收獲后檢測摻入的放射性。計(jì)算平均cpm。
實(shí)施例9融合DNA疫苗制劑引發(fā)CTL的能力通過電穿孔遞送(關(guān)于這種遞送技術(shù)，參見例如，國際出版號WO/0045823)，用10-250μg編碼上述NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的質(zhì)粒DNA免疫動物，或用PLG連接的編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t(見下)的DNA免疫動物，或用編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的DNA免疫動物。免疫接種6周后，用編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的質(zhì)粒DNA加強(qiáng)注射。
PLG遞送的DNA.聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)聚合物獲自Boehringer Ingelheim，U.S.A。PLG聚合物是RG505，其共聚物比例為50/50，分子量為65kDa(生產(chǎn)商提供的數(shù)據(jù))。用改良的溶劑蒸發(fā)過程，基本上如Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97811-816所述，制備帶有吸附的DNA的陽離子微粒。簡言之，用IKA勻漿器高速下用1ml PBS在二氯甲烷中乳化10ml 5％w/v聚合物溶液。然后將初級乳液加到含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(0.5％w/v)的50ml蒸餾水中。上述操作形成了w/o/w乳液，室溫下6000rpm攪拌該乳液12小時(shí)，使二氯甲烷蒸發(fā)。10,000g離心用蒸餾水洗滌產(chǎn)生的微粒兩次，然后凍干。制備、洗滌和收集之后，100mg陽離子微粒在1mg/ml DNA乳液中4℃孵育6小時(shí)，使DNA構(gòu)建物吸附到微粒上。然后離心分離微粒，團(tuán)塊用TE緩沖液洗滌，微粒凍干。
用上面實(shí)施例所述的51Cr釋放試驗(yàn)或細(xì)胞內(nèi)染色來檢測CTL活性和IFN-γ表達(dá)。
實(shí)施例10免疫接種途徑和編碼融合蛋白的復(fù)制子顆粒SINCR(DC+)如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)964598-4603所述制備α病毒復(fù)制子顆粒，例如SINCR(DC+)。如上所述用編碼NS3*45tCore的5×106IU SINCR(DC+)復(fù)制子顆粒肌肉內(nèi)(IM)注射動物，或在尾根部(BoT)和足墊(FP)皮下注射(S/C)，或2/3的DNA用IM遞送，1/3的DNA用BoT途徑遞送。免疫接種后，如上所述用疫苗病毒進(jìn)行加強(qiáng)注射。如上面實(shí)施例所述用細(xì)胞內(nèi)染色檢測IFN-γ表達(dá)。
實(shí)施例11α病毒復(fù)制子引發(fā)，然后進(jìn)行各種加強(qiáng)免疫方案如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)964598-4603所述制備α病毒復(fù)制子顆粒，例如SINCR(DC+)。通過肌肉內(nèi)注射到脛骨前肌，用1.5×106IU編碼如上所述融合蛋白的SINCR(DC+)復(fù)制子顆粒免疫引發(fā)動物，然后在第6周如下所述進(jìn)行加強(qiáng)免疫10-100μg編碼NS5a、NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的質(zhì)粒DNA，或1010編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的腺病毒顆粒，或1.5×106IU編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的SINCR(DC+)復(fù)制子顆粒，或107pfu編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的疫苗病毒。如上所述細(xì)胞內(nèi)染色檢測IFN-γ表達(dá)。
實(shí)施例12表達(dá)NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的α病毒如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)964598-4603所述制備α病毒復(fù)制子顆粒，例如SINCR(DC+)和SINCR(LP)。通過組合遞送途徑(2/3 IM和1/3 S/C)以及僅通過S/C途徑用1×102-1×106IU編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的SINCR(DC+)復(fù)制子免疫動物，或通過組合遞送途徑(2/3 IM和1/3 S/C)以及僅通過S/C途徑用1×102-1×106IU編碼NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的SINCR(LP)復(fù)制子顆粒免疫動物。免疫接種后第6周用107pfu編碼NS5a、NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的疫苗病毒加強(qiáng)注射。如實(shí)施例5所述細(xì)胞內(nèi)染色檢測IFN-γ表達(dá)。
因此，公開了C末端截短的HCV NS5以及包含C末端截短的HCV NS5的融合多肽。雖然詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但應(yīng)理解可進(jìn)行各種顯而易見的變化而不偏離本發(fā)明的精神以及權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.一種C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽含有全長NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分。
2.如權(quán)利要求1所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽在氨基酸2500和C末端之間的位置被截短，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽在氨基酸2900和C末端之間的位置被截短，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽在對應(yīng)于緊隨氨基酸2990之后的氨基酸的氨基酸處被截短，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽由對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列組成，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
6.一種免疫原性融合蛋白，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述C末端截短的NS5多肽，和衍生自HCV多蛋白除NS5區(qū)域之外的區(qū)域的至少一種多肽。
7.如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白還含有修飾的NS3多肽，該修飾的NS3多肽含有對應(yīng)于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，編號相對于全長HCV-1多蛋白，從而當(dāng)所述修飾的NS3多肽存在于HCV融合蛋白中時(shí)，蛋白酶活性被抑制。
8.如權(quán)利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述修飾的NS3多肽包含對應(yīng)于Ser-1165的氨基酸的丙氨酸取代，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
9.如權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包含修飾的NS3多肽、NS4多肽和任選的HCV核心多肽。
10.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽含有C末端截短。
11.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽由圖3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列組成。
10.如權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，還含有E2多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述E2多肽是C末端截短的E2多肽，其由對應(yīng)于氨基酸384-715的氨基酸序列組成，編號相對于全長HCV-1多蛋白。
12.如權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，存在于所述融合蛋白中的各多肽衍生自相同的HCV分離物。
13.如權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，存在于所述融合蛋白中的至少一種多肽與C末端截短的NS5多肽衍生自不同的分離物。
14.一種免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽組成(a)修飾的NS3多肽，其含有在對應(yīng)于Ser-1165的氨基酸處的丙氨酸取代從而抑制蛋白酶活性，編號相對于全長HCV-1多蛋白；(b)NS4多肽；(c)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列組成，編號相對于全長HCV-1多蛋白；和(d)任選地，HCV核心多肽。
15.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有HCV核心多肽。
16.如權(quán)利要求15所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽含有C末端截短。
17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽由圖3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列組成。
18.一種免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽組成(a)C末端截短的E2多肽，由對應(yīng)于氨基酸384-715的氨基酸序列組成，編號相對于全長HCV-1多蛋白；(b)修飾的NS3多肽，含有在對應(yīng)于Ser-1165的氨基酸處的丙氨酸取代從而抑制蛋白酶活性，編號相對于全長HCV-1多蛋白；(c)NS4多肽；(d)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由對應(yīng)于氨基酸1973-2990的氨基酸序列組成，編號相對于全長HCV-1多蛋白；和(e)任選地，HCV核心多肽。
19.如權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有HCV核心多肽。
20.如權(quán)利要求19所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽含有C末端截短。
21.如權(quán)利要求20所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽由圖3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列組成。
22.一種組合物，其含有如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述C末端截短的NS5多肽以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
23.一種組合物，其含有如權(quán)利要求6-21中任一項(xiàng)所述的免疫原性融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
24.如權(quán)利要求22或23所述的組合物，還含有另外的HCV免疫原性多肽。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述另外的HCV免疫原性多肽包含E1E2復(fù)合物。
26.一種在脊椎動物對象中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的組合物。
27.如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的組合物在用于在脊椎動物對象中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法中的應(yīng)用。
28.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述C末端截短的NS5多肽或如權(quán)利要求6-21中任一項(xiàng)所述的免疫原性融合蛋白在制備用于在脊椎動物對象中刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
29.一種制備組合物的方法，所述方法包括將如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述C末端截短的NS5多肽或如權(quán)利要求6-21中任一項(xiàng)所述的免疫原性融合蛋白與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
30.一種多核苷酸，其含有編碼如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述C末端截短的NS5多肽的編碼序列、或編碼如權(quán)利要求6-21中任一項(xiàng)所述的免疫原性融合蛋白的編碼序列。
31.一種重組載體，其含有(a)如權(quán)利要求30所述的多核苷酸；和(b)與所述多核苷酸可操作性連接的至少一種控制元件，從而所述編碼序列能夠在宿主細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
32.含有權(quán)利要求31所述重組載體的宿主細(xì)胞。
33.一種制備免疫原性C末端截短的NS5多肽或含有所述多肽的免疫原性融合蛋白的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞群。
34.一種增強(qiáng)HCV NS5多肽的產(chǎn)量的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞群，其中與相同條件下產(chǎn)生的全長NS5多肽相比，所述蛋白的產(chǎn)量更大。
全文摘要
本發(fā)明提供截短的HCV NS5多肽和包含截短的NS5多肽的融合蛋白，在所述融合蛋白中截短的NS5多肽融合于衍生自HCV多蛋白的另一個(gè)區(qū)域的至少一個(gè)其它HCV表位。所述融合蛋白可用于刺激對HCV的免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法中，例如刺激對HCV的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法中，如激活丙肝病毒(HCV)特異性T細(xì)胞，包括CD文檔編號A61K39/29GK1984677SQ200580015806
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者M·霍頓 申請人:希龍公司