專利名稱：柿葉提取物和它的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于植物材料的藥用提取物和制備方法及用途，具體地說是植物柿葉地提取物和它的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
柿葉味苦、性寒。具有下氣平喘、止渴生津、療瘡等功效，具有廣泛的藥理作用。國內(nèi)外研究表明，以柿葉為原料制取的柿葉制劑、柿葉茶、柿葉提取物及柿葉黃酮甙具有降血壓、抑菌、降血脂、降低膽固醇、止血， 活血化瘀、抑制癌瘤生長等多方面的生理功能。
在柿葉總黃酮中含有的化合物很多，目前已發(fā)現(xiàn)的柿葉黃酮化合物有黃芪甙、異槲皮素、山萘酚3-o-β-D-葡萄糖甙、山萘酚、槲皮素、山萘酚3-o-α-L-鼠李糖甙、山萘酚3-β-D-木糖甙、山萘酚3-o-α-L-阿拉伯糖甙、槲皮素3-o-[2″-o-(3.4.5-三羥基苯甲酰)]-葡萄糖甙(、蘆丁、金絲桃甙hyperin(槲皮素-3-半乳糖甙)、楊梅樹皮甙、紫云英甙等，采用不同的提取方法所得黃酮的成分以及含量高低均存在較大差異。
有文獻(xiàn)報(bào)道對柿葉總黃酮的乙醇提取工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明，用15倍柿葉重的50％乙醇水溶液，在75℃下浸提3h為最佳條件。但此提取方法僅得粗提取物，黃酮含量只有15％左右，難于獲得高活性和低副作用效果。無法用于人體藥用。
又有報(bào)道用水提樹酯吸附法提取分離柿葉黃酮的方法，它是通過提取溶劑和吸附樹脂的篩選，選用pH為13的堿水作溶劑，從柿葉中提取黃酮，成本低，工藝安全，然后用YF-I樹脂吸附，乙醇洗脫。提取獲得的粗黃酮，其組份具有降血壓功能及促進(jìn)植物生長活性，但此方法得到粗提取物，雜質(zhì)仍較多，無法用于人體藥用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過新的提取制備方法，獲得黃酮含量高的柿葉活性成分，用于制備能防治腦動脈硬化、冠心病心絞痛、神經(jīng)功能退化癥、腦卒中后遺癥的藥物。
為了實(shí)施本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是用柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros L.)植物柿(Diospyros Kaki L.)的葉，經(jīng)水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取、大孔樹酯吸附、乙醇洗脫，所得的乙醇液回收乙醇后的濃縮液為柿葉提取物，提取物含總黃酮為70～90％(以提取物干品計(jì))。
按本發(fā)明的提取方法，在總黃酮中含有槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempfetol)分別占提取物總重量的8～14％、12～23％(以提取物干品計(jì))。其結(jié)構(gòu)式為
R1 R2 R3 R4 R5 R
Quercetin -OH-OH-OH -OH -H -OH
Kaempfetol-OH-OH-H -OH -H -OH
柿葉提取物總黃酮和槲皮素和山奈素黃酮的含量檢測采用中國藥典附錄的高效液相色譜法(HPLC)。
本發(fā)明所說的柿葉提取物采用的制備方法是用柿科柿屬植物柿(Diospyros Kaki L.)的葉為原料，加水煎煮1～3次，每次0.2～3小時(shí)，煎液過濾，濾液濃縮至相對密度為1.05～1.2的清膏1，加乙醇沉淀，取上清液回收乙醇，所得浸膏2加水溶解后用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯后得稠膏3，用水溶解后上大孔樹酯柱吸附，用乙醇溶液洗脫，收集乙醇液，回收乙醇后的濃縮物4為柿葉提取物。提取物由于含水量高，不好保存，為此，可以將提取物進(jìn)一步干燥，得水分≤8的干燥粉，這樣用干粉制備各種制劑時(shí)更方便且可保證藥品的有效成分的含量。
大孔樹脂優(yōu)選為聚酰胺型或聚苯乙烯樹脂系列，上大孔樹酯柱吸附、洗脫、回收乙醇后濃縮液4干燥的方法很多，可用高溫烘干，也可用薄膜蒸發(fā)干燥或低溫干燥等，本發(fā)明優(yōu)選采用噴霧干燥法，其進(jìn)風(fēng)溫度60～128℃，出口溫度45～80℃，風(fēng)速5～10m/s，壓力0.02～0.1kPa。
本發(fā)明所提供的提取物其用途是制備防治腦中卒后遺癥和神經(jīng)功能退化癥、腦動脈硬化癥、冠心病、心絞痛的藥物和保健品。它可以用提取物加入各種輔料，如潤滑劑、填充劑、粘合劑、崩解劑等，以常規(guī)的藥物制劑工藝和制備食品的方法制備成顆粒劑、片劑、膠囊劑、散劑、丸劑和保健品等。
下面用本發(fā)明所制得的柿葉提取物，用HPLC方法測定其含總黃酮為77.4％，水解后，用HPLC方法測定含槲皮素、山奈酚苷元分別為提取物總重量的13.6％，16.5％的產(chǎn)品進(jìn)行如下試驗(yàn)。
一、急性毒性和長期毒性試驗(yàn)
小鼠急性毒性研究將120只19～21g NIH小鼠(雌雄各半)分成6組，每組20只，分別以五種不同濃度的柿葉提取物p.o.給藥，NS陰性對照。觀察小鼠的反應(yīng)并記錄每組小鼠的死亡數(shù)目，采用Microsoft Excel的線性回歸軟件，根據(jù)對數(shù)劑量與經(jīng)驗(yàn)概率單位繪制直線，計(jì)算LD50。柿葉提取物對小白鼠P.O的LD50分別為32.88～38.50g/Kg
大鼠長期毒性實(shí)驗(yàn)取Wistar大鼠120只雌雄各半分成4組，每組30只，分別P.O.給予250mg/Kg、50mg/Kg、10mg/Kg柿葉黃酮提取物(FLDK)，NS陰性對照P.O.生理鹽水。連續(xù)給藥90天，三個(gè)劑量組大鼠均未見明顯血象、心肺肝腎功能及神經(jīng)系統(tǒng)功異常，也未心、肺、脾、胃、大腦、腸等重要器官有明顯病理變化。
結(jié)論本發(fā)明的柿葉提取物毒性很低、安全性高。
二、藥效試驗(yàn)
(一)、柿葉提取物對前腦缺血損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用
1.實(shí)驗(yàn)材料柿葉提取物，用生理鹽水配成合適濃度的混懸液；試驗(yàn)動物用健康雌性SD大鼠90只，體重180～220g，大鼠隨機(jī)分為正常組(N組)、模型組(M組)，提取物(FLDK)低劑量、中劑量、高劑量組、對照組(天保寧)，每組10只。給藥給藥12天(缺血再灌注前4天，后7天)。腹腔灌胃水，每日2次。
2.缺血再灌注損傷模型制備參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》Pulsinelli大鼠四血管阻斷前腦缺血模型進(jìn)行。
前腦缺血再灌注用電凝椎基底動脈阻斷椎動脈血流24小時(shí)后，用動脈夾夾閉兩側(cè)頸總動脈，阻斷血流15分鐘，造成前腦缺血。前腦缺血模型成功的大鼠立即出現(xiàn)翻正反射消失，瞳孔擴(kuò)大等等。15分鐘后去除動脈夾，恢復(fù)血流供應(yīng)?；謴?fù)血流供應(yīng)后30～50分鐘內(nèi)大鼠重新站立起來，恢復(fù)自主活動，全腦缺血再灌注造型成功。將大鼠置回籠中飼養(yǎng)，按給藥方案給藥。每天觀察大鼠行為和存活情況。缺血再灌注7天后殺死動物，取大腦海馬固定切片觀察腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡和形態(tài)變化；并計(jì)算存活的錐體細(xì)胞密度(個(gè)/mm)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1.大鼠腦海馬組織光學(xué)顯微鏡下組織形態(tài)低倍鏡下，正常大鼠腦海馬組織顯“C”形，分為CA1、CA2、CA3區(qū)，CA1區(qū)有3～4層錐體細(xì)胞，排列整齊；高倍鏡下，錐體細(xì)胞核大而園，有1～2個(gè)核仁，錐體細(xì)胞密度為185.5±17.1(圖1，表1)
3.2.缺血再灌注7天，可見明顯大鼠腦海馬組織細(xì)胞損傷。生理鹽水組大鼠腦海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞已大部分死亡，細(xì)胞碎片散亂分布(圖2，表1)
3.3.給予不同劑量的柿葉提取物，對缺血再灌注所致大鼠腦海馬組織細(xì)胞損傷有一定劑量依賴性保護(hù)作用(圖3-5，表1)。
相當(dāng)于人常用量的柿葉提取物組對缺血再灌注所致大鼠腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷明顯減輕，其活錐體細(xì)胞密度比對照組大鼠明顯增加。動物整體狀況改善，大鼠外觀活動正常，皮毛光滑，體重減輕不明顯。缺血再灌注后動物存活數(shù)比對照組明顯多。表明柿葉提取物對急性缺血有保護(hù)作用。這為柿葉黃酮提取物治療腦卒中及中風(fēng)后遺癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
3.4.陽性對照藥天保寧膠囊(100mg/kg，相當(dāng)于人常用量)大鼠腦海馬組織細(xì)胞形態(tài)基本正常，錐體細(xì)胞密度比生理鹽水組明顯增加(P＜0.05，附圖天保寧，對缺血再灌注所致大鼠腦海馬組織細(xì)胞損傷也有保護(hù)作用(圖6，表1)。
表1柿葉提取物對前腦缺血再灌流
引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(x±s)
注*p＞0.05，**＜0.05，***p＜0.01與對照組比較
#p＞0.05，##＜0.05，###p＜0.01與生理鹽水組比較
結(jié)論本發(fā)明的研究表明柿葉提取物能清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗急性腦缺血，能抑制缺血再灌注引起的腦組織細(xì)胞凋亡，對缺血再灌注引起的腦組織損傷有明顯的保護(hù)作用，并能改善缺血再灌注引起的腦組織神經(jīng)功能。
(二)大鼠局灶性腦缺血再灌流損傷的保護(hù)作用
1、實(shí)驗(yàn)材料
柿葉提取物、銀可絡(luò)(銀杏提取物)，配成8.0mg/ml。
實(shí)驗(yàn)儀器Leica RM2135輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)(德國)，Olympus bx51光學(xué)顯微鏡。C63圖像分析系統(tǒng)(英國)
實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠，平均體重300±30g，由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。120只； 清潔級標(biāo)準(zhǔn)，合格證號粵檢證字第2003C013號中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
分組先將動物稱重，按體重大小排序，編號，用隨機(jī)區(qū)組分組法大鼠隨機(jī)分成6個(gè)組，每組20只，5只一籠，編號。溫度控制在25℃±2℃，燈光控制12小時(shí)光，12小時(shí)暗，自由飲水和食用動物飼料。飼養(yǎng)3天后開始給藥。六個(gè)組柿葉提取物-P70低劑量(20mg/kg)組、中劑量(40mg/kg)組、高劑量(80mg/kg組)。陽性藥物銀可絡(luò)40.0mg/kg組、假手術(shù)組、生理鹽水對照組共6組。
給藥給藥7天(術(shù)前3天，術(shù)后3天)，用生理鹽水調(diào)配至實(shí)驗(yàn)濃度，按5mL/kg/次、每天2次灌胃給藥。對照組和假手術(shù)組灌胃給予等容量生理鹽水。
2、方法
模型制備將大鼠用體積分?jǐn)?shù)為10％的水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，頸正中切口、分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動脈近心端、頸外動脈及其分支動脈。分離左側(cè)頸內(nèi)動脈，沿頸內(nèi)動脈向下分離翼顎動脈，根部結(jié)扎該分支。在頸內(nèi)動脈近端備線，遠(yuǎn)端放置動脈夾，頸總動脈分叉處切口，插入40尼龍線，其深度為20mm，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈，入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈所有血流來源。撤掉動脈夾，扎緊備線，外留1cm長線頭，縫合皮膚。繼續(xù)缺血2h后再灌注，勿需再次麻醉和切開皮膚，輕輕提拉所留線頭至有阻力時(shí)提示尼龍線頭端已至頸總動脈切口處，使血流再通。假手術(shù)組除不插栓線外，其余步驟同上。自缺血起3h后按組分別灌胃給藥，溶劑用生理鹽水。存活鼠再灌注12h、24h、48h、72h時(shí)，觀察大鼠行為變化，進(jìn)行神經(jīng)行為評分。參考Longa的五分制評分標(biāo)準(zhǔn)0分正常，無神經(jīng)損傷癥狀；1分不能完全伸展缺血腦半球支配的前爪；2分向缺血腦半球支配的前爪側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分向缺血腦半球支配的前爪側(cè)傾倒；4分不能自發(fā)行走。
存活鼠再灌注72h后，快速斷頭取實(shí)驗(yàn)鼠大腦，在前連合平面切下厚約2mm冠狀腦片，立刻置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的紅四氮唑染料(TTC)的溶液中，37℃孵育30min。梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，非梗死區(qū)呈現(xiàn)紅色。用求積儀(C63圖像分析系統(tǒng))測出各區(qū)面積，并計(jì)算缺血區(qū)水腫面積和梗死區(qū)占全腦的百分比(％)。
缺血區(qū)水腫面積＝缺血側(cè)腦半球橫斷面面積-正常側(cè)腦半球橫斷面面積。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS10.0軟件ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3結(jié)果
對神經(jīng)行為的影響假手術(shù)組大鼠均無異常行為，神經(jīng)行為學(xué)評分為0；生理鹽水陰性對照組大鼠出現(xiàn)缺血側(cè)眼睛縮小，缺血對側(cè)肢體偏癱，肢體不能完全伸展、對側(cè)前爪向外側(cè)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒的神經(jīng)損傷癥狀，缺血后12h、24h、48h、72h的行為評分平均值分別為3.0分、2.5分、2.38分和2.0分。腦缺血前后灌胃給予柿葉提取物的低、中、高3個(gè)劑量組均可顯著降低大鼠組神經(jīng)行為學(xué)評分，且降低程度有劑量依賴關(guān)系。銀可絡(luò)組行為評分也顯著低于溶媒對照組。表明柿葉提取物-P70灌胃可顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)損傷癥狀(表1)。
表2柿葉提取物對大鼠缺血再灌注后神經(jīng)行為評分的影響(x±s)
注與NS對照組比較**P＜0.05(秩和檢驗(yàn))。
對腦缺血區(qū)水腫面積的影響假手術(shù)組腦組織無梗死及水腫；生理鹽水對照組缺血側(cè)腦組織有明顯水腫現(xiàn)象，水腫面積為26.38單位；柿葉提取物小、中、大3個(gè)劑量組也均可顯著縮小缺血側(cè)腦組織水腫面積，分別縮小了21.1％、43.6％和60.2％；并且大劑量組縮小缺血側(cè)腦組織水腫面積的作用比銀可絡(luò)組相當(dāng)(表2)。表明柿葉提取物能減輕大鼠腦缺血再灌注損傷引起的腦水腫，對大鼠腦缺血再灌注損傷引起的腦梗死有顯著的保護(hù)作用。
表3柿葉提取物對大鼠腦缺血再灌注后腦水腫面積的影響(x±s)
對腦梗死面積的影響假手術(shù)組腦組織無梗死；生理鹽水對照組缺血側(cè)腦組織有梗死現(xiàn)象，梗死體積占全腦的34.93％；柿葉提取物小、中、大3個(gè)劑量組也均可顯著縮小缺血側(cè)腦組織梗死體積，分別降低了20.8％、42.3％和58.6％；縮小缺血側(cè)腦組織梗死面積的作用比同劑量銀杏提取物組相當(dāng)(表3)。表明柿葉提取物對大鼠腦缺血再灌注損傷引起的腦梗死也有顯著的保護(hù)作用。
表4 柿葉提取物對大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積的影響(x±s)
結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柿葉提取物能顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的行為癥狀，縮小腦梗死面積和水腫面積，且作用強(qiáng)度有劑量依賴關(guān)系，劑量為80mg/kg時(shí)作用最強(qiáng)。提示柿葉提取物對大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
(三)柿葉提取物對AlCl3造成AD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的影響
1、實(shí)驗(yàn)材料柿葉提取物，用生理鹽水配成合適濃度的混懸液；試驗(yàn)動物用健康雌性SD大鼠90只，體重340～360g，大鼠隨機(jī)分為正常組(N組)、模型組(M組)、柿葉提取物小劑量(FLDK低組)和柿葉提取物中劑量(FLDK中組)，柿葉提取物高劑量(FLDK高組)、加蘭他敏組(Galantamine 30mg)，每組15只。
2、AD模型制作M組、FLDK低、中、高劑量三個(gè)組和加蘭他敏組大鼠每天腹腔注射1ml濃度為9mg/ml的滅菌AlCl3溶液，連續(xù)注射3天，間隔1天，共計(jì)72天。N組大鼠腹腔注射1ml滅菌生理鹽水，注射周期和時(shí)間同上。
3、用藥柿葉提取物(FLDK)的灌胃和AD模型的制作同時(shí)進(jìn)行。
FLDK低、中、高劑量三個(gè)組、加蘭他敏組大鼠每天灌胃15ml/kg/次，每天二次，每連續(xù)灌胃7天，間隔1天，共計(jì)72天。FLDK低組每次灌胃柿葉提取物20mg/kg，相當(dāng)成人劑量的1/2倍；和FLDK中組灌胃40mg/kg(相當(dāng)成人劑量的1倍)。FLDK高組灌胃80mg/kg(相當(dāng)成人劑量的2倍)，加蘭他敏60mg/kg(相當(dāng)成人劑量的2倍)、N組和M組大鼠灌胃等量生理水，周期和時(shí)間同上。
4、記憶行為測定造模和用藥結(jié)束后，在夜晚安靜和避光的條件下，用Y型電迷宮儀訓(xùn)練和測定大鼠的學(xué)習(xí)獲得和記憶保持能力，電壓是90V，時(shí)間延遲是1s，連續(xù)訓(xùn)練和測定10次/只/天，同時(shí)記錄大鼠的逃避潛伏期和逃避正確率等，連續(xù)4天。受電刺激后，大鼠從通電臂燈源處直接逃至安全臂燈源處為正確逃避，所用時(shí)間為逃避潛伏期。如果電刺激后大鼠不逃避或逃避后在中途停止不動，則它們的逃避潛伏期按正常大鼠平均逃避潛伏期的2倍計(jì)算。
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5.1柿葉黃酮提取物對大鼠Y迷宮逃避正確率的影響
在連續(xù)前3天的測試中，M組的逃避正確率最低，F(xiàn)LDK高劑量組的最高。至第4天，M組的逃避正確率沒有再明顯升高，而其他5組的繼續(xù)升高，M組的逃避正確率明顯低于N組(P＜0.05)，F(xiàn)LDK低、中、高和加蘭他敏組明顯高于M組(P＜0.05，或P＜0.001)(見表2)。
表5各組大鼠Y迷宮逃避正確率(x±s)
注與N組比較#P＜0.05；與M組比較*P＜0.05，**P＜0.0012
5.2柿葉提取物對大鼠Y迷宮逃避潛伏期的影響
連續(xù)訓(xùn)練3天后，第4天測定各組大鼠的逃避潛伏期。M組的逃避潛伏期差異很大，比N組顯著性延長(P＜0.05)；FLDK低、中、高組和加蘭他敏組都比M組顯著性縮短(P＜0.05，或P＜0.01)，以FLDK中、高劑量組更顯著。
表6各組大鼠Y迷宮逃避潛伏期(x±s)
注與N組比較#P＜0.05；與M組比較*P＜0.05，**P＜0.0012
5.3柿葉提取物片對大鼠Y迷宮逃避行為方式的影響
M組表現(xiàn)為逃避啟動障礙，個(gè)別大鼠根本就不逃避，逃避中途停止或終點(diǎn)錯(cuò)誤。給藥后，柿葉提取物片中、高劑量和加蘭他敏組的逃避行為方式明顯改善(見表3)。
表7 各組大鼠Y迷宮逃避行為方式的差異
結(jié)論AlCl3復(fù)制的大鼠AD模型是研究AD發(fā)病機(jī)制和防治藥物篩選的動物模型之一。給AlCl3造成阿爾茨海默病模型大鼠服用柿葉提取物后以Y迷宮測試，結(jié)果大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能得以改善。其機(jī)制可能與其降低癡呆大鼠腦內(nèi)過氧化脂質(zhì)水平，減少自由基對癡呆大鼠腦的損害有關(guān)。表明柿葉提取物對老年性癡呆有治療作用。
三、防治腦動脈硬化癥、冠心病心絞痛和神經(jīng)功能退化癥的臨床驗(yàn)證
(一)、對腦動脈硬化癥和冠心病心絞痛的防治作用
對60例腦動脈硬化、冠心病心絞痛患者進(jìn)行臨床觀察，全部為住院病例，其中男性38例，女性22例，年齡46～81歲，其中50～70歲占75.6％，其中腦動脈硬化48例，冠心病心絞痛22例。
1、診斷標(biāo)準(zhǔn)排除嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者，結(jié)合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷。
2、療效標(biāo)準(zhǔn)(腦動脈硬化癥)
顯效臨床癥狀緩解，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有明顯好轉(zhuǎn)者。
有效臨床癥狀好轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)有好轉(zhuǎn)。
無效臨床癥狀無變化，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無改變。
實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括腦血流圖、腦電圖、心電圖、血壓、膽固醇等項(xiàng)目。
顯效治療后心絞痛癥狀分級降低兩級。原為I、II級心絞痛者基本消失，不用硝酸甘油。
有效治療后心絞痛癥狀降低一級，硝酸甘油減用一半以上，原為I級者心絞痛基本消失，不用硝酸甘油。
無效癥狀及硝酸甘油用量無改變，或雖有減少但不明顯者。
3、治療方法采用本發(fā)明提供的柿葉提取物(FLDK)片?？诜淮?片，一日3次，30天為一療程，全部病例至少服用一個(gè)療程以上。
4、觀察內(nèi)容
①癥候頭痛頭暈、胸痛、納差、面色暗黑，肌膚甲錯(cuò)，舌質(zhì)暗紅或瘀斑、瘀點(diǎn)，脈弦澀或弦細(xì)。
②體征及理化檢查血壓、腦血流圖、腦電圖、心電圖、血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、肝功、腎功、血脂。
5、治療結(jié)果
5.1總療效FLDK片用于治療腦動脈硬化癥、冠心病心絞痛有著較好的療效?？傆行蔬_(dá)86.67％，結(jié)果詳見表8。
表8 FLDK片臨床療效表
5.2 FLDK片尚具有降血壓及降血脂作用，治療前后對照有顯著性差異(P＜0.01)，詳見表9、10。
表9 FLDK片治療前、后血壓結(jié)果(x±s)
收縮壓(mmHg) 舒張壓(mmHg)
病種 治療前 治療后治療前 治療后
冠心病162.36+16.21131.28+13.11**106.21+10.1280.36+9.67*
腦動脈硬化168.79+12.42142.13+11.39**95.79+15.13 89.32+11.24
表10 FLDK片治療前、后血脂結(jié)果(x±s)
膽固醇(mg/dl) 甘油三酯(mg/dl)
病種 治療前 治療后治療前 治療后
冠心病189.91+31.61 175.23+26.13 165.25+19.52 142.16+18.32*
腦動脈硬化246.51+24.18 205.18+21.32**126.06+12.24 80.35+10.23**
*P＜0.05， **P＜0.01。
5.3 FLDK片能明顯改善氣滯血瘀癥狀，具有活血化瘀，通絡(luò)止痛之功效，能明顯改善頭暈頭痛，胸痛，眩暈，失眠面色暗紅或黑，舌質(zhì)暗或有瘀斑。其結(jié)果見表11。
表11FLDK片對中醫(yī)證的臨床治療療效分析
頭暈頭痛胸痛 眩暈失眠 情緒不穩(wěn)面色暗紅黑舌質(zhì)暗或有瘀斑
總例數(shù) 48 12 40 41 52 3255
有效數(shù) 45 10 36 36 45 1742
有效率％93.75 83.3390.090.8086.54 53.13 76.36
結(jié)論經(jīng)對60例腦動脈硬化及冠心病心絞痛治療結(jié)果表明，本發(fā)明的柿葉提取物片對中醫(yī)辨證屬瘀阻腦絡(luò)型眩暈證、心血瘀阻型胸痹證有較好的療效，能顯著改善頭暈、頭痛、胸痹心痛，面色暗黑，舌質(zhì)暗紅或瘀斑等癥狀，起到活血化瘀，通絡(luò)止痛之功效，總有效率為86.67％，并對高血壓及高血脂有一定的治療作用，能明顯降低血壓及血脂，治療前后對照有極顯著性差異(P＜0.01)。本藥在治療過程中未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，治療前后肝、腎功能均無異常，具有較好的安全性。
(二)對VD的防治作用
血管性癡呆屬于器質(zhì)性癡呆范疇，以智能減退為基本表現(xiàn)，并有反復(fù)腦缺血發(fā)作史，多有高血壓病史以及腦動脈硬化征象，或有糖尿病、肥胖癥、冠心病等危險(xiǎn)因素，且有中風(fēng)史，遺有輕偏癱等局灶性神經(jīng)定位障礙
1資料與方法
1.1病例情況全部病例均系神經(jīng)科住院病人，男性70例，女性20例；年齡58～76歲，平均64.9歲；病程最短1年，最長10年，平均3.9年。由主研腦血管疾病的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師作臨床檢查、神經(jīng)量表測試，并經(jīng)頭顱CT或MR證實(shí)者。
1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)1有智能損害的證據(jù)，并妨礙到工作或生活或交往；2有近記憶力缺損證據(jù)；3有認(rèn)知、判斷、定向、計(jì)算等能力減退的證據(jù)之一；4無意識障礙。
1.3排除標(biāo)準(zhǔn)有嚴(yán)重神經(jīng)、血液、內(nèi)分泌等原發(fā)性疾病。
1.4量表選擇
1美國簡易智能量表，總分30分，若得分＜16分者為智能障礙；
2日本長谷川癡呆量表，總分30分，若得分＜16分者為癡呆成立；
3海琴斯克缺血指數(shù)量表，總分18分，若得分＞7分者為血管性癡呆，得分＜7分者為老年性癡呆。
1.5中醫(yī)主要癥狀參考《老年呆病的診斷、辨證分型及療效評定標(biāo)準(zhǔn)(討論稿)》，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，將以下癥狀作為觀察指標(biāo)神情呆滯，語言不利，或寡言少語或語言倒錯(cuò)，善忘，不寐，頭暈，頭痛，舌質(zhì)瘀點(diǎn)。
1.6療效標(biāo)準(zhǔn)采用綜合評定法，以患者治療前后的智能狀態(tài)、中醫(yī)主要癥狀、體征等方面的改變作為綜評內(nèi)容，并以智能改變?yōu)橹攸c(diǎn)。痊愈者長谷川癡呆量表測試得分增加到正常值，顯效者得分增加5分以上，有效者得分增加不足5分，無效者得分不但無增加反而下降。
1.7用藥方法每天早中晚各服柿葉提取物(FLDK)片2片，每天2次，1個(gè)月為1療程，均用藥3個(gè)療程，其間停用其它腦血管擴(kuò)張藥物、腦細(xì)胞代謝藥物、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)藥物。
2療效與結(jié)果
2.1治療前后量表積分變化見表12、13。
表12治療前后簡易智能量表積分變化(x±s)
表13治療前后長谷川癡呆量表積分變化(x±s)
2.2中醫(yī)主要癥狀變化見表14。
表14治療前后主要癥狀評分變化(x±s)
從14表可見，60例經(jīng)服FLDK和腦心通3個(gè)療程后，二藥治療的量表得分均明顯增加(P＜0.01)，說明都有恢復(fù)記憶力、改善智能作用。
2.3療效分析見表15。
表15 二種藥物對血管性癡呆療效統(tǒng)計(jì)
從12表可以知，本品對血管性癡呆癥的總有效率為70.9％，盡管痊愈者為零、顯效僅5例，但有效率卻占一半多(54.8％)， 兩者療效無顯著性差異。
3結(jié)論FLDK片對血管性癡呆的智能改善作用30例經(jīng)服FLDK3個(gè)療程后，量表得分明顯增加(P＜0.01)，說明有恢復(fù)記憶力、改善智能作用，且頭暈頭痛，失眠、煩躁、易怒、等癥狀改善非常明顯，達(dá)73％以上。
(三)對老年性癡呆癥的防治作用
1資料與方法
1.1全部病例均系神經(jīng)科住院病人，男性19例，女性11例；年齡58～76歲，平均64.9歲；病程最短1年，最長10年，平均3.9年。由主研腦血管疾病的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師作臨床檢查、神經(jīng)量表測試，并經(jīng)頭顱CT或MR證實(shí)者。
1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)1是選擇有智能損害的證據(jù)，并妨礙到工作或生活或交；2是有近記憶力缺損證據(jù)；3是有認(rèn)知、判斷、定向、計(jì)算等能力減退的證據(jù)之一；4是無意識障礙。
1.3排除標(biāo)準(zhǔn)有腦血管疾病史、急怍起病、癥狀波動和神經(jīng)系統(tǒng)局灶癥狀或體征明顯的血管性癡呆、以及嚴(yán)重神經(jīng)、血液、內(nèi)分泌等原發(fā)性疾病。
1.4量表選擇(同前)
1.5中醫(yī)主要癥狀根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，將以下癥狀作為觀察指標(biāo)神情呆滯，語言不利，或寡言少語或語言倒錯(cuò)，善忘，不寐，頭暈，頭痛，舌質(zhì)瘀點(diǎn)，目眩。
1.6療效標(biāo)準(zhǔn)采用綜合評定法，以患者治療前后的智能狀態(tài)、中醫(yī)主要癥狀、體征等方面的改變作為綜評內(nèi)容，并以智能改變?yōu)橹攸c(diǎn)。
1.7用藥方法每天早晚各服FLDK膠囊2粒，每天2次2粒，1個(gè)月為1療程，均用藥3個(gè)療程，其間停用其它腦血管擴(kuò)張藥物、腦細(xì)胞代謝藥物、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)藥物。
2療效與結(jié)果
2.1治療前后量表積分變化見表13、14。
表16治療前后簡易智能量表積分變化(x±s)
表17治療前后海琴斯克缺血指數(shù)量表積分變化(x±s)
2.2中醫(yī)主要癥狀變化見表18。
表18治療前后主要癥狀變化(x±s)
2.3療效分析見表19。
表19二種藥物對老年性癡呆療效統(tǒng)計(jì)
從19表可以知道，F(xiàn)LDK對本病的總有效率為70.0％，顯效16.7％，與目前常用藥天保寧膠囊70％的總有效率相當(dāng).。而沒觀察到明顯副作用。3結(jié)論FLDK片對老年性癡呆的智能改善作用，從上述表格可以看到，痰濁阻竅，氣滯血瘀的老年性癡呆(Alzhermer‘s癥)30例病員經(jīng)服FLDK 3個(gè)療程后，量表得分明顯增加(P＜0.01)，說明有恢復(fù)記憶力、改善智能作用，且頭暈頭痛，失眠、煩躁、易怒、等癥狀改善非常明顯，達(dá)70％以上。
(四).對腦卒中后遺癥的防治作用
1資料與方法
1.1病例情況全部病例均系神經(jīng)科住院病人，男性22例，女性8例；年齡58～70歲，平均64.9歲；病程最短2個(gè)月，最長1年，平均3.9月。由主研腦血管疾病的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師作臨床檢查、神經(jīng)量表測試，并經(jīng)頭顱CT或MR證實(shí)者。
1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)中西醫(yī)結(jié)合診斷
1.3排除標(biāo)準(zhǔn)有嚴(yán)重神經(jīng)、血液、內(nèi)分泌等原發(fā)性疾?。?br> 1.4量表選擇
(1)中醫(yī)證候?qū)W(包括癥狀、舌脈象的觀察)；(2)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征(包括患者的神志、語言及運(yùn)動功能)；(3)頭顱CT掃描。
1.5療效評定標(biāo)準(zhǔn)《腦卒中患者神經(jīng)功能缺損程度評分標(biāo)準(zhǔn)》和中風(fēng)病中醫(yī)癥狀分級量化表進(jìn)行計(jì)分。
1.6療效標(biāo)準(zhǔn)采用綜合評定法，以患者治療前后的感覺、語言、運(yùn)動、記憶力中醫(yī)主要癥狀、體征等方面的改變作為綜評內(nèi)容，并以神經(jīng)功能缺損改變?yōu)橹攸c(diǎn)。
1.7用藥方法每天早中晚各服柿葉提取物(FLDK)片1片，每天3次，1個(gè)月為1療程，均用藥3個(gè)療程，其間停用其它腦血管擴(kuò)張藥物、腦細(xì)胞代謝藥物、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)藥物。
2療效與結(jié)果
2.1.FLDK中風(fēng)癥狀神經(jīng)功能缺損程度和神經(jīng)癥狀的療效，見表20、21
表20FLDK片對中風(fēng)病神經(jīng)功能缺損程度的療效(x±s)
表21FLDK片對中風(fēng)病神經(jīng)癥狀的療效(x±s)
2.2中醫(yī)主要癥狀變化見表22。
表22治療前后主要癥狀變化(x±s)
2.3療效分析見表23。
表23對腦中風(fēng)后遺癥療效統(tǒng)計(jì)
3結(jié)論
FLDK片對腦中風(fēng)后遺癥頭痛頭暈、眩暈、頸項(xiàng)強(qiáng)急、肢體強(qiáng)急、肢體麻木、情緒不穩(wěn)、記憶力減退、半身不遂、言語不清、意識障礙、肢體麻木、有顯著改善作用，總有效率為89％；顯效率50％。


圖1是正常對照對前腦缺血再灌流引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用細(xì)胞顯微圖
圖2是生理鹽水對前腦缺血再灌流引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響細(xì)胞顯微圖
圖3是腦心清片低劑量對前腦缺血再灌流引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用細(xì)胞顯微圖
圖4是腦心清片中劑量對前腦缺血再灌流引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用細(xì)胞顯微圖
圖5是腦心清片高劑量對前腦缺血再灌流引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用細(xì)胞顯微圖
圖6是天保寧對前腦缺血再灌流引起大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用細(xì)胞顯微圖
以下通過實(shí)施例來闡述本發(fā)明的柿葉提取物及制備方法。
具體實(shí)施方案
實(shí)施例1、
取干柿葉150Kg，加水3500L煎煮2次，每次1.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15(60℃)，得流浸膏40kg加乙醇120L至含醇量達(dá)65％，靜置過夜，濾取上清液備用；沉淀用85％乙醇洗滌兩次，收集洗滌液，靜置，吸取上清液與前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏6kg，加水80kg溶解，濾過，濾液用醋酸乙酯120L提取3次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，得稠膏4kg加水溶解，上大孔樹脂柱(大孔樹脂為聚酰胺型)，.用水洗至洗脫液無色，再用75％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收酒精，得相對密度為1.10(60℃)濃液進(jìn)行減壓噴霧干燥即得1800g的干粉，噴霧的條件其進(jìn)風(fēng)溫度108℃；出口溫度65℃；風(fēng)速8m/s；壓力0.05Pa，1干燥，干粉水分1.05％。柿葉提取物用HPLC方法測定含總黃酮為77.4％，水解后，槲皮素、山奈酚苷元的含量用HPLC方法測定分別為提取物總重量的13.6％，16.5％。
實(shí)施例2、
取干柿葉350Kg，加水5500L煎煮3次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.18(60℃)，得流浸膏100kg加乙醇450L至含醇量達(dá)80％，靜置過夜，濾取上清液備用；沉淀用85％乙醇洗滌兩次，收集洗滌液，靜置，吸取上清液與前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏5.6kg，加水95kg溶解，濾過，濾液用醋酸乙酯300L提取3次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，得稠膏6kg加水溶解，上大孔樹脂柱(大孔樹脂為聚酰胺型)，.用水洗至洗脫液無色，再用80％乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收酒精，得相對密度為1.18(60℃)濃液減壓噴霧干燥即得4800g，噴霧的條件其進(jìn)風(fēng)溫度100℃；出口溫度55℃；風(fēng)速7.5m/s；壓力0.05Pa，1次干燥。干粉水分為1.12％，柿葉提取物用HPLC方法測定含總黃酮為85.2％，水解后，槲皮素、山奈酚苷元的含量用HPLC方法測定分別為提取物總重量的13.9％，19.6％。
實(shí)施例3
取干柿葉500Kg，加水5500L煎煮2次，每次2.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.12(60℃)，得流浸膏100kg加乙醇320L至含醇量達(dá)75％，濾取上清液備用；沉淀用75％乙醇洗滌兩次，收集洗滌液，回收乙醇，所得浸膏11.6kg，加水150kg溶解，濾過，濾液用醋酸乙酯320L提取3次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，得稠膏14kg加水溶解，上大孔樹脂柱(大孔樹脂為AB-8型)，.用水洗至洗脫液無色，再用55％乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收酒精，得相對密度為1.13(60℃)濃液減壓噴霧干燥即得6800g，測定柿葉提取物含總黃酮為66.6％，槲皮素、山奈酚苷元的含量分別為提取物總重量的8.3％，17.6％。取干粉1000g加適量淀粉1000g，混勻，加蜂蜜20.k0g泛丸成水泛丸，干燥得2.5kg干燥丸，包裝成1萬小包的丸劑，即得0.25g/包(每包含提取干粉100mg，大約相當(dāng)于生藥20g)?？诜┝恳淮?小袋，一日3次。
權(quán)利要求
1、一種柿葉提取物，其特征在于是用柿科柿屬植物柿(DiospyrosKaki L.)的葉，經(jīng)水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取、大孔樹酯吸附、乙醇洗脫，所得的乙醇液回收乙醇后的濃縮液為柿葉提取物，提取物含總黃酮為70～90％(以提取物干品計(jì))。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉提取物，其特征在于所說的總黃酮中含有槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempfetol)分別占提取物總重量的8～14％、12～23％(以提取物干品計(jì))。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉提取物的制備方法，其特征至于用柿科柿屬植物柿(Diospyros Kaki L.)的葉為原料，加水煎煮1～3次，每次0.2～3小時(shí)，煎液過濾，濾液濃縮至相對密度為1.05～1.2的清膏(1)，加乙醇沉淀，取上清液回收乙醇，所得浸膏(2)加水溶解后用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯后的稠膏(3)用水溶解后上大孔樹酯柱吸附，用乙醇溶液洗脫，收集乙醇液，回收乙醇后的濃縮液(4)為柿葉提取物。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的柿葉提取物的制備方法，其特征在于所說的大孔樹脂為聚酰胺型或聚苯乙烯型大孔吸附樹脂；上大孔樹酯柱吸附、分離、回收乙醇后濃縮液(4)進(jìn)一步干燥得水分≤8％的干粉。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的柿葉提取物的制備方法，其特征在于所說的濃縮液(4)進(jìn)一步干燥是采用噴霧干燥法，其進(jìn)風(fēng)溫度60～128℃，出口溫度45～80℃，風(fēng)速5～10m/s，壓力0.02～0.1kPa。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的柿葉提取物的用途，其特征在于制備防治腦動脈硬化、冠心病心絞痛、神經(jīng)功能退化癥、腦卒中后遺癥的藥物和保健品。
全文摘要
柿葉提取物和它的制備方法及用途，涉及來源于植物材料的藥用提取物和制備方法及用途。它是用柿科柿屬(Diospyros)植物的葉，經(jīng)水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取、大孔樹酯吸附、乙醇洗脫，所得的乙醇液回收乙醇后的濃縮液為柿葉提取物，提取物含總黃酮為65～90％(以提取物干品計(jì))其中含槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempfetol)分別占提取物總重量的8～14％、12～23％(以提取物干品計(jì))，本發(fā)明的柿葉提取物可用于制備防治腦動脈硬化、冠心病心絞痛、神經(jīng)功能退化癥、腦卒中后遺癥的藥物和保健品。
文檔編號A61P9/00GK1546014SQ20031011242
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者徐安龍, 貝偉劍, 李楚源, 陳矛, 彭文烈, 王德勤, 陳薇, 羅杰 申請人:廣州白云山制藥股份有限公司廣州白云山中藥廠, 廣州白云山制藥股份有限公司廣州白云