專利名稱：制備無菌高分子量透明質(zhì)酸制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備無菌高分子量透明質(zhì)酸鹽作為最終藥用制劑的方法。
鹽形式的透明質(zhì)酸可以包括例如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鈣或其它透明質(zhì)酸鹽透明質(zhì)酸是一種生物來源的粘多糖，其在自然界廣泛分布。例如，已知透明質(zhì)酸存在于各種動物組織例如臍帶、滑液、玻璃體液、公雞冠和各種結(jié)締組織例如皮膚和軟骨中在化學(xué)上，透明質(zhì)酸是一種氨基葡聚糖，它由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的交替重復(fù)單元組成，形成了分子量至多13×106道爾頓的直鏈。
在本發(fā)明的含義中，高分子量透明質(zhì)酸是平均分子量不低于0.5×106道爾頓的透明質(zhì)酸。
透明質(zhì)酸或其鹽的藥學(xué)應(yīng)用在文獻(xiàn)中有大量描述。
由于透明質(zhì)酸是一種非免疫原性物質(zhì)，具有粘彈性和親水性，多年來，它被用作眼玻璃體或關(guān)節(jié)液的代替物或在眼外科中用作支持介質(zhì)，就像例如Balazs的US-A-4,141,973中公開的那樣。
在關(guān)節(jié)液中，粘性透明質(zhì)酸溶液作為潤滑液給細(xì)胞提供保護(hù)環(huán)境，由于這個原因，它被用于炎性膝關(guān)節(jié)的治療。
EP-A-0 781 547公開了用于眼外科的以透明質(zhì)酸鈉為基礎(chǔ)的眼科制劑。
EP-A-0 719 559公開了在依靠準(zhǔn)分子激光器進(jìn)行的治療性光角膜切除術(shù)中，透明質(zhì)酸鈉粘溶液用作封閉液。
EP-A-0 875 248公開了透明質(zhì)酸或其藥學(xué)可接受的一種鹽在制備用作關(guān)節(jié)內(nèi)灌洗液的水溶液中的用途。
Chemedica S.A.的EP-A-0 698 388公開了含有透明質(zhì)酸鹽作為粘度增稠劑的用作人工淚液的眼科制劑。
透明質(zhì)酸或其鹽的藥學(xué)應(yīng)用需要高純度的無菌產(chǎn)品。
可以從動物或微生物來源例如臍帶、公雞冠或從鏈球菌A和C中提純透明質(zhì)酸，就像Balazs的US-A-4,141,973、Romeo等人的US-A-5,559,104和WO 00/4925中公開的那樣。
透明質(zhì)酸的工業(yè)提純運(yùn)作通常產(chǎn)生干粉形式的透明質(zhì)酸鹽，例如透明質(zhì)酸鈉。純化的藥用級干粉可以用于制備例如用于各種藥學(xué)用途例如關(guān)節(jié)間注射液、滴眼液或玻璃體液代替物的水性藥物制劑。
制備隨時可用的藥物制劑的普通工業(yè)方法包括將給定重量的透明質(zhì)酸鈉與精確體積的水、以及根據(jù)具體情況而定的鹽例如氯化鈉和緩沖液例如磷酸鹽緩沖液和其它賦形劑混和。由于藥用制劑的濃度和組成應(yīng)該保持在精確的給定范圍之內(nèi)，制劑的各個組分要仔細(xì)度量。然后將制劑灌裝到容器例如注射器和隨時可用的給定劑量的小瓶中。裝入容器后，通常在大約121℃用高壓滅菌器將制劑滅菌十五分鐘或更久。
使用加熱滅菌透明質(zhì)酸帶來的一個問題是已知對形成HA的分子鏈的斷裂有影響，從而降低HA的平均分子量。
透明質(zhì)酸的高分子量是一種重要的藥理學(xué)性質(zhì)。
在很多制藥申請中，不希望制劑中含有低分子量透明質(zhì)酸，例如由于US 4,141,973中報道的低分子量HA的炎性作用，以及高分子量HA有益的reological性質(zhì)的喪失。為了補(bǔ)償給定濃度制劑中的HA在上述滅菌法中的降解，最初用于制備制劑的透明質(zhì)酸或其鹽具有的平均分子量要高于最終制劑需要的最低平均分子量。由于當(dāng)需要的平均分子量增加時，來源于起始原料的透明質(zhì)酸的產(chǎn)量降低了，這無論如何是不經(jīng)濟(jì)的。
另一種已知的透明質(zhì)酸滅菌方法是過濾。這項(xiàng)技術(shù)被用在制備濃縮形式、通常是干粉形式的純化透明質(zhì)酸鹽的傳統(tǒng)工業(yè)運(yùn)作中，由此通過過濾器過濾低濃度的水溶液，隨后干燥。
在例如歐洲專利申請EP 867453和PCT申請WO 00/44925中描述了這種滅菌步驟。在這些申請中，也公開了用于滅菌的孔徑小至0.22μm的過濾器。基于已知的最小細(xì)菌缺陷假單胞菌，0.22μm孔徑的過濾器具有1比107個細(xì)菌的細(xì)菌競爭性，而0.45μm孔徑的過濾器具有1比104個細(xì)菌的細(xì)菌競爭性(也基于缺陷假單胞菌)。由于這個原因，小于0.45μm孔徑的過濾器被考慮用來滅菌。
在傳統(tǒng)工業(yè)運(yùn)作中，過濾滅菌法已知不用于制備隨時可用的高粘度藥物制劑，因?yàn)楦哒扯人运幬镏苿┲行枰腍A濃度通常為1到2％wt/v，不是所有的透明質(zhì)酸都通過0.22μm的過濾器。由于這導(dǎo)致了濃度變化和/或透明質(zhì)酸損失，過濾滅菌法用來制備隨時可用的高粘度藥物制劑是有問題的。
在US 5,093,487中，描述了過0.22μm過濾器滅菌的、含有高分子量透明質(zhì)酸鈉的隨時可用的水性藥物制劑的制備。然而該專利中描述的滅菌方法依賴于透明質(zhì)酸水性制劑通過0.22μm過濾器的次數(shù)，以致于不可逆轉(zhuǎn)地降低了透明質(zhì)酸的粘度。根據(jù)該出版物，考慮到由多次通過過濾器導(dǎo)致的透明質(zhì)酸粘度的降低，含有1％或更高濃度HA的水性藥物制劑的滅菌是有可能的。該申請中還表明，粘度降低卻并沒有降低HA的分子量。不想對上述出版物中報道的結(jié)果的準(zhǔn)確性提出見解，對于很多制藥申請例如關(guān)節(jié)內(nèi)申請來說，HA粘度降低是不希望的。
本發(fā)明的一個目的是獲得含有透明質(zhì)酸鹽的隨時可用的無菌水性藥物制劑，它是無菌的、生產(chǎn)節(jié)省的，尤其在工業(yè)條件下。提供制劑成分的濃度具有狹窄規(guī)定公差的制劑是有利的。
通過制備權(quán)利要求1的高分子量透明質(zhì)酸的無菌藥用制劑的方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
此處公開的是制備含有規(guī)定最終濃度的高分子量透明質(zhì)酸鹽(HA)的隨時可用的無菌水性藥物制劑的方法，包括下列步驟-提供含有濃度低于規(guī)定最終濃度的高分子量HA的水性制劑；-使所述水性制劑通過孔徑小于0.45μm的過濾器；-真空煮沸去掉水分，濃縮所述水性制劑，直至達(dá)到規(guī)定的最終濃度。
有利地，作為分子量的函數(shù)，過濾之前水性制劑降低的濃度減小了粘度，使得全部HA通過過濾器并被滅菌成為可能，接下來的真空煮沸確保了HA的熱依賴性降解基本上沒有發(fā)生。該方法很適用于工業(yè)環(huán)境，是非常經(jīng)濟(jì)的，它允許含有HA的藥物制劑的隨時可用劑量能被裝到無菌容器中，而不用進(jìn)一步滅菌。
另一個優(yōu)點(diǎn)是，該制劑是微生物穩(wěn)定的，在用作藥物制劑前可以保持?jǐn)?shù)個星期。
HA水溶液的粘度是一種性質(zhì)，它取決于幾個參數(shù)，例如分子量、濃度、溫度、鹽的濃度和質(zhì)量、pH以及用于溶液的剪切速率。較高的分子量和濃度增大粘度，而較高的剪切速率和鹽減小粘度。關(guān)于溫度，HA具有滯后行為，就像M.Cardones等人在″HysteresisBehavior of Sodium Hyalurona te Solutions during Heating andCooling″，Clear Solutions Biotech，Inc.，Technical Rep 01中報道的那樣。升高或降低溫度會不規(guī)律地增大和減小粘度。在60℃和70℃之間，可能得到溶液的最低粘度。因此，這種滯后性質(zhì)可以用于減小或增大溶液的粘度，但必須考慮到HA鏈的降解與溫度以及該溫度的持續(xù)時間成比例。
在過濾后的濃縮步驟過程中，當(dāng)達(dá)到隨時可用藥物制劑的規(guī)定濃度時，為了停止真空煮沸，可以實(shí)時監(jiān)控HA濃度。監(jiān)控或測量過程可以有利地用帶有放在制劑中的感應(yīng)柱的分光光度計來進(jìn)行，紫外線(UV)范圍內(nèi)的放射吸收與HA濃度成比例。本發(fā)明特別有利的特征是，它不需要混和精確量的水和透明質(zhì)酸來獲得規(guī)定濃度，也不需要確保在整個過程中一直保持該濃度。相反，最初HA和水混合物具有比最終制劑低的近似濃度，從而簡化了程序。
在濃縮步驟使用的真空優(yōu)選低于200毫巴絕對壓力，優(yōu)選在30到60毫巴的范圍內(nèi)，例如40毫巴，由此，沸騰溫度大約為26到28℃。在該壓力下，工業(yè)裝置可靠地運(yùn)行是經(jīng)濟(jì)的，低溫避免了透明質(zhì)酸分子量的任何顯著或可測量的降低。
過濾器孔徑有利地為大約0.22μm或更低，從而確保高度無菌制劑的制備。從而，過濾器滅菌的、隨時可用的、HA濃度為1-3％的高粘度藥物制劑可以有利地按照本發(fā)明無菌且經(jīng)濟(jì)的方式制備。
本發(fā)明的其它有利方面從權(quán)利要求和下面的方法實(shí)例以及附圖中的詳細(xì)描述將是顯而易見的，其中

圖1代表闡明本發(fā)明方法的實(shí)施方案的具體操作步驟的流程圖；圖2和3是代表分子量分別是1.1百萬和2.2百萬道爾頓的HA通過0.22μm過濾器的百分?jǐn)?shù)對20℃、中性pH的水溶液％wt/v濃度的函數(shù)的圖表；圖4是代表用分光光度計測量的、在濃度推移過程中、制劑在230nm處的光密度(OD)對時間的函數(shù)的圖表。
提到圖1，顯示了制備含有規(guī)定藥物濃度的高分子量透明質(zhì)酸鹽的隨時可用的水性藥物制劑的過程。在制備制劑之前，用純凈水清潔設(shè)備裝置(步驟1)，用純凈蒸汽滅菌(步驟2)，并用無菌蒸餾的注射用水(WFI)洗滌(步驟3)。
水性HA制劑、例如濃度低于最終制劑的規(guī)定濃度的稀透明質(zhì)酸鈉溶液的制備是被導(dǎo)入混和反應(yīng)器中，以制備預(yù)過濾制劑(步驟4)。
可以用干燥的HA鹽或用根據(jù)PCT申請WO 00/44925制備的溶液，在干燥過程前制備HA水溶液。
為了添加與所加入的HA的量相匹配的正確的鹽量，進(jìn)行用蠕動泵計量的濃鹽溶液(25×)的添加(步驟5)。鹽溶液通常含有NaCl、緩沖液以及最終藥物制劑指定的其它賦形劑，加入它們以使pH達(dá)到生理pH，例如7.4，并使最終制劑的生理克分子滲透壓濃度例如為300mOsm/lt。
也可以在過濾步驟7之后直接將鹽溶液、緩沖液及其它賦形劑無菌地加入反應(yīng)室中。這對極高分子量的HA尤其有利，因?yàn)辂}降低了HA的濾過率，從而需要更大地稀釋預(yù)過濾溶液?？梢杂梅磻?yīng)室中的電子傳導(dǎo)傳感器(棒)實(shí)時檢測所加入的賦形劑的量。HA制劑的傳導(dǎo)性與制劑中的賦形劑的量有關(guān)，可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。因此，當(dāng)賦形劑被加到反應(yīng)室中，通過測量HA制劑的傳導(dǎo)性直至達(dá)到所需要的濃度，可以以簡單、可靠和精確的方式向制劑中加入需要量的賦形劑。尤其上述不必要事先計算和測量劑量，尤其避免了不得不考慮補(bǔ)償在過濾步驟7中被過濾器截留的一定量的HA(即使很少)的問題。
作為實(shí)施例，可以用45克平均分子量2.2百萬道爾頓的干燥透明質(zhì)酸鈉與15升WFI混和來制備制劑。在這種情況下，由于HA的高分子量，過濾后加入鹽和緩沖液，以避免預(yù)過濾溶液比需要量更大的稀釋，就像上面所提到的那樣。
反應(yīng)器中的攪拌器混和預(yù)過濾溶液(步驟6)，例如混和大約120分鐘，直至均一。在該具體實(shí)施例中，預(yù)過濾溶液具有0.3％wt/v的HA濃度。在室溫和生理pH條件下，該濃度的分子量2.2百萬道爾頓的透明質(zhì)酸具有低粘度，這使得它完全通過0.22μm孔徑的過濾器成為可能。HA制劑能全部通過0.22μm孔徑的過濾器的最大粘度是大約5Pa.s，是在20℃下，在0.1s-1剪切速率下測定的。然而該最大粘度取決于過濾孔徑較小的孔徑例如0.1um會降低HA能全部通過過濾器的最大粘度。
如上所討論的，HA水溶液的最大濃度(在該濃度下，基本上所有的HA能通過滅菌過濾器例如0.22μm過濾器)取決于透明質(zhì)酸的分子量。這可以參照圖2和3中所示的圖表所示，由此，圖2表示在基本室溫(大約20℃)和基本中性pH(大約7)下，平均分子量大約1.1百萬道爾頓的、能通過0.22μm孔徑過濾器的透明質(zhì)酸鈉的百分?jǐn)?shù)對濃度(每分升水中的透明質(zhì)酸鈉的克數(shù)＝％wt/v)的函數(shù)。
圖3表示在相同條件下(除了透明質(zhì)酸鈉的平均分子量為大約2.2百萬道爾頓以外)的類似圖表。在圖2的圖表中可以看到，分子量1.1百萬道爾頓的、濃度至多大約0.92％wt/v(或g/dl)的所有透明質(zhì)酸鈉通過了過濾器，然而，分子量2.2百萬道爾頓的、最大濃度大約0.32％wt/v的透明質(zhì)酸鈉通過了過濾器。因此，當(dāng)透明質(zhì)酸鹽的分子量從1.1增加到2.2百萬道爾頓時，100％通過0.22μm過濾器的HA水溶液的最大濃度從大約0.94％wt/v降至大約0.32％wt/v。
在工業(yè)生成過程中，考慮到過濾后溶液被濃縮了，優(yōu)選濃度稍微低于上限，以確保各批次之間在透明質(zhì)酸鈉的分子量、溫度和混和濃度方面，過濾過程有一定誤差或變化范圍地完成并且可靠。
通過引入氣體例如氮?dú)?、在壓力例如混和反?yīng)器中的壓力在大約3巴下，或依靠泵，將溶液抽濾通過滅菌過濾器(步驟7)。無菌過濾器優(yōu)選具有0.22μm孔徑，但具有小于0.45μm、大于大約0.1μm的其它孔徑的過濾器也能使用，假如這樣的過濾器是或成為可商購的。
當(dāng)所有的溶液已經(jīng)通過過濾器進(jìn)入蒸餾器后，將蒸餾器從過濾器和帶閥的混和反應(yīng)器上密封，啟動真空泵，依靠調(diào)節(jié)閥調(diào)節(jié)蒸餾器中的壓力(步驟8、9、10)。使壓力低于200毫巴，以使沸騰溫度低于60℃，但優(yōu)選壓力在30到60毫巴范圍內(nèi)，例如40毫巴，由此，水的沸騰溫度在26到28℃范圍內(nèi)，接近于室溫。
代替蒸餾器，薄膜蒸發(fā)器或任何其它在真空下濃縮器能用于HA制劑的批量、加料分批或持續(xù)濃縮。
在煮沸過程期間，蒸餾器周圍的加熱套提供熱能。有利地，低于30℃的煮沸溫度確保了基本不存在透明質(zhì)酸的降解，因此透明質(zhì)酸的分子量沒有降低。
HA濃度傳感器，有利地是帶有浸入制劑中的光纖的分光光度計的形式，能用于實(shí)時測量透明質(zhì)酸的濃度(步驟11)和當(dāng)達(dá)到規(guī)定濃度時自動停止煮沸過程。分光光度計可以例如基于放在蒸餾器中的溶液內(nèi)的紫外光束(例如波長230nm)的吸收。圖4表示在整個濃度推移(例如至多2％w/v)過程中，隨時間測量的230nm處的光密度。實(shí)時HA濃度測量避免了在稀釋的預(yù)過濾溶液的制備過程中需要混和非常精確的量，從而簡化了過程。
真空沸騰對于從制劑中脫氣也具有重要意義，由于混和過程和過濾過程中的高壓氮?dú)獾氖┯?，該制劑含有最終藥物制劑中不能被接受的氣泡、微小氣泡和溶解氣體。
當(dāng)蒸餾器中的HA濃度傳感器發(fā)出達(dá)到了規(guī)定濃度的信號時，通過引入氣體例如氮?dú)獾狡渲?，使蒸餾器中的壓力迅速增加(步驟13)，同時將蒸餾器周圍的加熱套冷卻至室溫或更低，從而立即停止制劑的濃縮過程(步驟12)。
需要注意的是，就本發(fā)明的方法，制劑中的透明質(zhì)酸濃度可能至多3％，這取決于特定的藥物應(yīng)用。
然后，可以用加壓氣體(例如氮?dú)?將制劑泵入或推入無菌水槽中(步驟28、30)，以在其它位置和/或在接下來的階段直接灌裝到無菌容器，例如隨時可用的注射器中(步驟16)。藥物制劑也可以直接灌裝到無菌藥用容器中，而不必間接儲存在無菌水槽中。
權(quán)利要求
1.一種制備含有規(guī)定濃度的高分子量透明質(zhì)酸鹽(HA)的無菌的隨時可用的水性藥物制劑的方法，包括下列步驟-提供含有濃度低于規(guī)定濃度的高分子量HA的水性制劑；-將所述水性制劑通過孔徑小于0.45μm的過濾器；-真空煮沸去掉水分，濃縮所述水性制劑，直至達(dá)到規(guī)定最終濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，在濃縮步驟以后，藥物制劑被灌裝入隨時可用的無菌容器，或倒入無菌水槽，然后灌裝入隨時可用的無菌容器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，濃縮步驟中使用的真空是絕對壓力低于200毫巴。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中，真空是壓力在30到60毫巴的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中，HA的平均分子量是800,000到5,000,000道爾頓。
6.根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中，過濾器具有0.22μm或更小的孔徑。
7.根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中，在濃縮步驟過程中，實(shí)時測量HA濃度，當(dāng)測量到規(guī)定濃度時，自動停止真空煮沸過程。
8.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中，用感應(yīng)制劑中的波輻射吸收的分光光度計測量HA濃度。
9.根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中，在過濾步驟以后將賦形劑加到制劑中，其中，實(shí)時測量HA制劑的傳導(dǎo)性，直至賦形劑的量達(dá)到需要的值。
全文摘要
一種制備含有規(guī)定濃度的高分子量透明質(zhì)酸鹽(HA)的隨時可用的無菌水性藥物制劑的方法，包括下列步驟提供含有濃度低于規(guī)定最終濃度的高分子量HA的水性制劑；將所述水性制劑通過孔徑小于0.45μm的過濾器；真空煮沸去掉水分，濃縮所述水性制劑，直至達(dá)到規(guī)定最終濃度。
文檔編號A61P19/02GK1674920SQ03818578
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月7日
發(fā)明者S·卡里諾 申請人:梅迪多姆實(shí)驗(yàn)室股份有限公司