專利名稱：中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列及其蛋白質(zhì)的氨基酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個由中國人基因組cDNA文庫編碼的具有潛在醫(yī)藥用途的細胞因子的基因及其cDNA序列，以及由此序列所決定的白細胞介素21的化學(xué)一級結(jié)構(gòu)序列，屬于醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類白細胞介素是人體內(nèi)細胞產(chǎn)生的一類具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的總稱，其中人類白細胞介素2、人類白細胞介素6已經(jīng)作為免疫調(diào)節(jié)類藥物使用。人類白細胞介素21是其家族中的一種蛋白質(zhì)。人類白細胞介素21具有多種生物學(xué)活性，主要表現(xiàn)在活化人體免疫系統(tǒng)的NK細胞，增強機體的特異性和非特異性免疫機能，從而發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)等作用，因此人類白細胞介素21是一種有較好開發(fā)前景的新型藥物。
在國際上已經(jīng)報道了來自美國人基因組的白細胞介素21的序列。目前尚無從中國人基因組cDNA文庫中分離、克隆編碼白細胞介素21的編碼基因，并在體外經(jīng)基因重組技術(shù)進行表達，從而獲得中國人基因組cDNA文庫編碼的重組人類白細胞介素21的報道，也無有關(guān)重組白細胞介素21生物學(xué)活性的有關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明的第三個目的是提供中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的基因工程表達產(chǎn)物制備方法，在國際上首次使用51Cr釋放試驗證明該基因工程重組的白細胞介素21在體外對NK細胞的激活作用，結(jié)果證實該基因工程重組的白細胞介素21有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，可以作為免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列，該序列如下gctgaagtgaaaacgagaccaaggtctagctctactgttggtacttatgagatccagtcctggcaacatggaga
gggttgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgcataattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatggagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatatctcctctagaacacacggaagtgaagattcctgaggatctaacttgcagttggacactatgttacatactctaatatagtagtgaaagtcatttctttgtattccaagtggaggagccctattaaattatataaagaaata。
中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的氨基酸序列，該序列如下MRSSPGNMERVVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLHNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNGGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHISSRTHGSEDS。
中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列的衍生序列。
所述衍生序列是指包括新分離的具有同樣基本結(jié)構(gòu)的基因序列及使用體外DNA操作技術(shù)通過堿基的置換、或插入、或缺失獲得的該基因序列的各種變構(gòu)體。
所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的變構(gòu)體。
所述的變構(gòu)體包括在相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)過單個或多個氨基酸的置換、或插入、或缺失等形成的各種變構(gòu)體。
所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21用于制備免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物的應(yīng)用。
所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的變構(gòu)體用于制備免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是，根據(jù)本發(fā)明的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21編碼基因的cDNA序列，可以從人類CD3+細胞的cDNA文庫中克隆人類白細胞介素21的編碼基因，該編碼基因通過基因重組技術(shù)，可以在真核表達系統(tǒng)(如酵母細胞或動物細胞)或原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌)中獲得重組表達，本發(fā)明提供了中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的基因工程表達產(chǎn)物制備方法，在國際上首次使用51Cr釋放試驗證明該基因工程重組的白細胞介素21在體外對NK細胞的激活作用，結(jié)果證實該基因工程重組的白細胞介素21有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，可以作為免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物。重組人類白細胞介素21在人體內(nèi)具有多種生物學(xué)活性，可以發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)等作用，是新的基因工程藥物。


圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
具體實施例方式
中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21編碼基因的DNA(mRNA)序列和氨基酸序列的獲得如圖1所示，該操作包括如下步驟(1)CD3+細胞的分離和活化手術(shù)取一位健康中國男子的扁桃體，置75％乙醇中浸泡消毒，在平皿中用Hanks液洗凈血液，在盛有5mlRPMI-1640細胞培養(yǎng)液的平皿中剪碎扁桃體組織制成細胞懸液，通過200目的金屬細胞篩，分離單個細胞懸液。將單個細胞懸液轉(zhuǎn)入試管中，在上層小心加入2ml淋巴細胞分離液(上海生化二廠生產(chǎn))，室溫靜止3min后，用吸管將細胞層和淋巴細胞分離液的交界處的細胞層取出。用Hanks液反復(fù)沖洗后，計數(shù)使細胞懸液為1×107/ml，加入10％的PHA放置37℃，5％CO2培養(yǎng)孵育24h后收獲細胞。
(2)活化的CD3+細胞的總RNA提取將上述得到的細胞懸液3000rpm離心，沉淀加入1ml Trizol液，充分吹打至細胞完全溶解，室溫放置5-10分鐘。加入0.2ml氯仿，冰浴放置2min。12000rpm離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)入一干凈管中，加入等量異丙醇混勻，12000rpm離心10min，棄上清，室溫干燥10min，用50μl無RNA酶的純水溶解。
(3)RT-PCR擴增國人白細胞介素21的編碼基因使用Promega公司的ReverseTranscription System(Cat.No.A3500)，以O(shè)lig(dT)6為引物對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)國際上已報道的來自美國人基因組的白細胞介素21的序列設(shè)計克隆引物序列(上游P15`GCTGAAGTGAAAACGAG 3`；下游5`TGGAATACA AAGAAATGAC3`)。PCR反應(yīng)總體系為200μl，其中上下游引物各1μmol/L，4種dNTPs各0.2μmol/L，10×buffer 20μl，1.5mol/L Mgcl2，Taq DNA聚合酶10U，cDNA模板10μl，充分混勻后置DNA擴增儀進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。PCR擴增出642 bp的白細胞介素21編碼基因。
(4)將PCR產(chǎn)物插入Promega公司生產(chǎn)的pGEM-T Easy Vector System I(Cat.No.A1360)中構(gòu)建重組克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切鑒定陽性重組克隆。將陽性重組克隆用T7通用引物進行DNA序列測定(使用ABIDNA自動序列測定儀)，得到本發(fā)明的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21編碼基因的DNA(mRNA)序列g(shù)ctgaagtgaaaacgagaccaaggtctagctctactgttggtacttatgagatccagtcctggcaacatggagagggttgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgcataattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccacc+tccacaaatggagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatatctcctctagaacacacggaagtgaagattcctgaggatctaacttgcagttggacactatgttacatactctaatatagtagtgaaagtcatttctttgtattccaagtggaggagccctattaaattatataaagaaata通過比較，該基因序列與國際上已報道的來自美國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列有5個堿基的差異，其堿基變化及位點如表1所示表1、人基因組的白細胞介素21的基因序列比較

(5)使用DNASATR軟件，根據(jù)這個中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21編碼基因的DNA(mRNA)序列，得出人類白細胞介素21的蛋白質(zhì)的化學(xué)一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)MRSSPGNMERVVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLHNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNGGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMI
HQHISSRTHGSEDS。
該氨基酸序列與國際上已報道的來自美國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列決定的氨基酸的一級序列有3個氨基酸的變異，其氨基酸變化及位點如表2所示表2、白細胞介素21的序列決定的氨基酸的一級序列比較

(6)白細胞介素21的原核表達體系的建立將白細胞介素21的PCR擴增產(chǎn)物和原核表達質(zhì)粒pGEX4T-2(Promega公司)用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI(Promega公司)37℃水浴酶切4h后，在T4連接酶(Promega公司)的作用下連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒。把插入白細胞介素21的pGEX4T-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21構(gòu)建原核表達體系。
(7)白細胞介素21的原核表達和初步純化挑取含插入白細胞介素21的pGEX4T-2重組質(zhì)粒的宿主菌BL21接種于500mlLB培養(yǎng)液中(含100μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.2。加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。收集誘導(dǎo)表達的宿主菌，6000rpm離心5min收集菌斑后加10ml無菌雙蒸水重懸菌斑，在冰浴中用超聲細胞破碎儀進行超聲破碎細菌，頻率為15kHz，每次時間為1min，重復(fù)4次，12000rpm離心10min，收集上清。用PIERCE公司生產(chǎn)的B-PER@GST Fusion Protein Purification Kit(Lot# D156592)純化蛋白。所得的融合蛋白加入凝血酶原(Sigma公司)切割融合蛋白。
(8)51Cr釋放試驗白細胞介素21對NK細胞的活性檢測1)、靶細胞的制備取經(jīng)24-48h培養(yǎng)的靶細胞(體外傳代細胞株K562)，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，1000r/min離心6min。去上清，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸后計數(shù)，將細胞數(shù)調(diào)整至4×106/ml。取上述靶細胞0.5ml，加入150μCi51Cr，置37℃水浴90min，每隔15min震搖一次。然后用含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌三次，除去游離的51Cr。計數(shù)活細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105/ml。檢測靶細胞的51Cr標(biāo)記率為0.3cpm/細胞。
2)、效應(yīng)細胞的制備用淋巴細胞分層液常規(guī)方法分離人外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成1×107/ml的細胞懸液。
3)、效應(yīng)細胞和靶細胞的作用無菌取效應(yīng)細胞和靶細胞各0.1ml(E/T＝100∶1)，加入24孔培養(yǎng)板的前4列中，每列3個復(fù)孔，在前3列中分別加入不同稀釋度的白細胞介素21，每孔5μl，其稀釋度分別為1∶10、1∶100、1∶1000，第4列為不加白細胞介素21的空白對照孔，放置37℃，5％CO2培養(yǎng)孵育4h。同時設(shè)立自然釋放對照孔(0.1ml靶細胞+0.1ml RPMI-1640培養(yǎng)液)和最大釋放孔(0.1ml靶細胞+0.1ml 2％SDS)，取出后用微量移液器吸出各孔上清液0.1ml，加入小塑料管中，用γ計數(shù)儀測量cpm值。
4)、結(jié)果計算根據(jù)公式計算51Cr自然釋放率和NK細胞的活性 檢測結(jié)果為51Cr自然釋放率為7.3％，第4列不加白細胞介素21的空白對照孔NK細胞的活性為34％，第一列加1∶10白細胞介素21的NK細胞的活性為46％，第二列加1∶100白細胞介素21的NK細胞的活性為42％，第三列加1∶1000白細胞介素21的NK細胞的活性為37％。
序列表<110>北京博泰迪生物工程科技開發(fā)有限公司<120>中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列及其蛋白質(zhì)的氨基酸序列<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>642<212>DNA<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>1gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc 60tggcaacatg gagagggttg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca 120caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat 180tgttgatcag ctgcataatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga 240agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgt tttcagaagg cccaactaaa 300gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag 360gaaaccacct tccacaaatg gagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg 420tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca 480aaagatgatt catcagcata tctcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc 540taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg 600tattccaagt ggaggagccc tattaaatta tataaagaaa ta 642<210>2<211>162<212>PRT
<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>2Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Val Val Ile Cys Leu Met1 5 10 15Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln20 25 30Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln35 40 45Leu His Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro50 55 60Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln65 70 75 80Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Ash Ash Glu Arg Ile Ile85 90 95Ash Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Gly100 105 110Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr115 120 125Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu130 135 140Gln Lys Met Ile His Gln His Ile Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160Asp Ser
權(quán)利要求
1.中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列，該序列如下gctgaagtgaaaacgagaccaaggtctagctctactgttggtacttatgagatccagtcctggcaacatggagagggttgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgcataattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatggagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatatctcctctagaacacacggaagtgaagattcctgaggatctaacttgcagttggacactatgttacatactctaatatagtagtgaaagtcatttctttgtattccaagtggaggagccctattaaattatataaagaaata。
2.中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的氨基酸序列，該序列如下MRSSPGNMERVVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLHNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNGGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHISSRTHGSEDS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列的衍生序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是指包括新分離的具有同樣基本結(jié)構(gòu)的基因序列及使用體外DNA操作技術(shù)通過堿基的置換、或插入、或缺失獲得的該基因序列的各種變構(gòu)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的變構(gòu)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的變構(gòu)體，其特征在于所述的變構(gòu)體包括在相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)過單個或多個氨基酸的置換、或插入、或缺失等形成的各種變構(gòu)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21用于制備免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的變構(gòu)體用于制備免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的編碼基因序列及其蛋白質(zhì)的氨基酸序列，屬于醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該白細胞介素21的基因序列和氨基酸序列如序列表所示。本發(fā)明的有益效果是，該編碼基因通過基因重組技術(shù)，可以在真核表達系統(tǒng)(如酵母細胞或動物細胞)或原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌)中獲得重組表達，本發(fā)明提供了中國人基因組cDNA文庫白細胞介素21的基因工程表達產(chǎn)物制備方法，在國際上首次使用51Cr釋放試驗證明該基因工程重組的白細胞介素21在體外對NK細胞的激活作用，結(jié)果證實該基因工程重組的白細胞介素21有較好的免疫調(diào)節(jié)活性，可以作為免疫調(diào)節(jié)類基因工程藥物，可以發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)等作用，是新的基因工程藥物。
文檔編號A61P37/02GK1513993SQ0312306
公開日2004年7月21日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者王斌, 錢冬萌, 閻志勇, 李方, 王 斌 申請人:北京博泰迪生物工程科技開發(fā)有限公司